Nghiên cứu thành phần loài nấm Colletotrichum spp.: Tính gây bệnh và phòng chống bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN DUY HƯNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI,

TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG

NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT

TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN DUY HƯNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI,

TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG

NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT

TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

Chuyên ngành

: Bảo vệ thực vật

Mã số

: 9620112

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Hà Viết Cường

2. TS. Hoàng Chúng Lằm

HÀ NỘI - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố

hay dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn,

các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Nguyễn Duy Hưng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự

hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo; sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,

đồng nghiệp và gia đình; sự tài trợ, sự giúp đỡ cả về vật chất lẫn tinh thần của các tổ

chức và cá nhân.

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy

PGS.TS. Hà Viết Cường, TS. Hoàng Chúng Lằm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công

sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Khoa Nông học, Bộ môn Bệnh cây, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông

nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn

thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Rau quả đã giúp đỡ và tạo

điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Duy Hưng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình x

Trích yếu luận án xii

Thesis abstract xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1

Tính cấp thiết của đề tài 1.1. 1

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 1.2. 3

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3. 3

Những đóng góp mới của đề tài 1.4. 4

1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1. Nguồn gốc, tình hình sản xuất ớt trên thế giới và Việt Nam 6

2.1.1. Lược sử về cây ớt 6

2.1.2. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới 7

2.1.3. Tình hình sản xuất ớt ở Việt Nam 8

2.2. Nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt trên thế giới 9

2.2.1. Tầm quan trọng của bệnh thán thư 9

2.2.2. Phân loại nấm Colletotrichum 10

2.2.3. Thành phần nấm Colletotrichum gây hại trên ớt 13

2.2.4. Một số loài nấm Colletotrichum chính gây hại ớt 15

2.2.5. Xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 22

2.2.6. Khả năng truyền qua hạt ớt của nấm Colletotrichum 24

2.2.7. Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh trên ớt 25

2.3. Phòng chống nấm Colletotrichum trên ớt 26

2.3.1. Biện pháp canh tác 26

2.3.2. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh 26

iii

2.3.3. Biện pháp hóa học 27

2.3.4. Biện pháp sinh học 28

2.4. Những nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt tại Việt Nam 30

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 33

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 34

3.2. Nội dung nghiên cứu 35

3.2.1. Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 35

3.2.2. Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông

Hồng và một số tỉnh 35

3.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm

Colletotrichum chính phát hiện được 35

3.2.4. Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus

spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện

được trong điều kiện in vitro 36

3.3. Phương pháp nghiên cứu 36

3.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh thán thư 36

3.3.2. Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt 38

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh của

các loài Colletotrichum 41

3.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum của một số

loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng trong điều kiện

in vitro 46

3.5. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 49

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

4.1. Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 51

4.1.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng 51

4.1.2. Kết quả điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt tại các điểm thu thập mẫu 52

4.1.3. Kết quả thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 56

4.1.4. Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt 57

4.2. Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông

Hồng và một số tỉnh 59

4.2.1. Định danh nấm dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện thuộc các

nhóm hình thái xác định được 59

4.2.2. Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát hiện trên cây ớt tại đồng

bằng sông Hồng và một số tỉnh 70

4.2.3. Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum

gây hại trên cây ớt 72

4.2.4. Xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum

gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR 84

4.3. Đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum gây bệnh

thán thư ớt được thu thập 89

4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các

loài nấm Colletotrichum 89

4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm

Colletotrichum trên môi trường PDA 93

4.3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm

Colletotrichum trên môi trường PDA 97

4.3.4. Tính gây bệnh của các loài Colletotrichum thu thập 101

4.3.5. Xác định khả năng tồn tại của bào tử các loài nấm C. siamense và

C. truncatum trên lá ớt 111

4.4. Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng

Bacillus spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum được

phát hiện trong điều kiện in vitro 114

4.4.1. Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến khả năng sinh trưởng, phát triển

của các loài nấm Colletotrichum phát hiện được trong điều kiện in vitro 115

4.4.2. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh

trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 136

4.4.3. Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của

nấm C. siamense và C. truncatum trên môi trường PDA 140

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143

5.1. Kết luận 143

5.2. Kiến nghị 145

Danh mục các công trình công bố 146

Tài liệu tham khảo 147

Phụ lục 162

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

Base pair (Cặp bazơ) bp

Bảo vệ thực vật BVTV

Colletotrichum C.

Cấp bệnh trung bình CBTB

Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CRD

Chỉ số bệnh CSB

Công thức CT

cetyltrimethylammonium bromide CTAB

Đồng bằng sông Hồng ĐBSH

Deoxyrobonucleic acid DNA

Food and agriculture organization FAO (Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp Quốc)

Hecta ha

Internal transcribed spacer ITS

Kilo base kb

Potato Carrot Agar PCA

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PCR

Potato Glucose Agar PDA

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia

sensu lato = phức hợp loài s.l

sensu stricto = loài đúng s.s

Số thứ tự TT

Tỷ lệ bệnh TLB

Water agar WA

Microliter µl

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt của thế giới (năm 2009 - 2018) 7

2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt Việt Nam (năm 2009 - 2017) 8

2.3. Thành phần loài Colletotrichum trên ớt tại một số quốc gia 14

3.1. Các mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum 38

4.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong

vụ xuân hè từ năm 2015 - 2017 52

4.2. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong

vụ thu đông từ năm 2015 - 2017 52

4.3. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2015 54

4.4. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2016 55

4.5. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2017 55

4.6. Triệu chứng mẫu bệnh thán thư thu thập tại các địa điểm 56

4.7. Đặc điểm hình thái các mẫu nấm thán thư hại ớt thu thập 58

4.8. Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa

trên trình tự vùng ITS 60

4.9. Mức đồng nhất trình tự vùng ITS của 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh

thán thư ớt tại thu tại Việt Nam với các loài thuộc phức hợp loài

C. gloeosporioides s.l và các loài đã công bố gây bệnh thán thư ớt 61

4.10. Kết quả tìm kiếm trên GenBank 9 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán

thư ớt dựa trên trình tự vùng ApMat 65

4.11. Mức đồng nhất trình tự vùng ApMat của 9 mẫu Colletotrichum gây bệnh

thán thư ớt thu tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh với các loài thuộc

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 67

4.12. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. truncatum dựa trên trình tự ITS của

các loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt 73

4.13. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. gloeosporioides s.s dựa trên trình tự

ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 74

4.14. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. siamense dựa trên trình tự ApMat của

vii

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 75

4.15. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. fructicola dựa trên trình tự ApMat của

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 76

4.16. Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế nhằm phát hiện C. truncatum,

C. fructicola, C. siamense và C. gloeosporioides s.s 78

4.17. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế 80

4.18. Kết quả PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm 83

4.19. Phát hiện các loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập bằng PCR 85

4.20. Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập tại đồng

bằng sông Hồng và một số tỉnh 87

4.21. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên các môi trường

dinh dưỡng 92

4.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài

Colletotrichum 96

4.23. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các loài nấm

Colletotrichum 100

4.24. Kết quả lây nhiễm nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 106

4.25. Kết quả lây nhiễm các loài nấm Colletotrichum trên quả của một số ký chủ

hay nhiễm bệnh thán thư 109

4.26. Khả năng tồn tại của nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt sau lây

nhiễm nhân tạo bằng phương pháp gây tổn thương 111

4.27. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài

nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 118

4.28. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm bào tử của các

loài nấm Colletotrichum 120

4.29. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng sinh trưởng của các

loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 123

4.30. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng nảy mầm bào tử của

các loài nấm Colletotrichum 126

4.31. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài

nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 128

4.32. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của

viii

các loài nấm Colletotrichum 131

4.33. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài

nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 133

4.34. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các

loài nấm Colletotrichum 135

4.35. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng đến khả năng sinh trưởng

của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 138

4.36. Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của các

loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 140

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

2.1. Cây phân loại các loài nấm Colletotrichum dựa trên phân tích trình tự các

chuỗi gen CHS-1 (251 bp), ACT (305 bp), TUB2 (545 bp) và ITS (599

bp) với 9 nhóm (clade) được chỉ rõ bằng các màu khác nhau 12

2.2. Đặc điểm hình thái của nấm C. truncatum 15

2.3. Phức hợp loài C. gloeosporioides s.l gồm 23 loài 16

2.4. Đặc điểm hình thái của nấm C. siamense 18

2.5. Đặc điểm hình thái của nấm C. fructicola 19

2.6. Đặc điểm hình thái của nấm C. aeschynomenes 20

2.7. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (BRIP 52652) 21

2.8. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (CBS 112996) 22

2.9. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum 23

2.10. Cách xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum bằng cách hình thành

sợi nấm dưới biểu bì 24

2.11. Nấm C. capsici hình thành tiền đĩa cành 25

3.1. Kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum 42

4.1. Số lượng mẫu bệnh thán thư ớt thu thập tại các địa điểm từ 2015 - 2017 56

4.2. Triệu chứng bệnh thán thư điển hình do nấm Colletotrichum spp. gây hại

trên quả ớt 57

4.3. Đặc điểm bào tử phân sinh (a, b, c) và đĩa áp (d, e, f) của nấm

Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng. Đại diện 3

nhóm hình thái C4 (a,d); C29 (b,e) và C25 (c,f) 59

4.4. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu nấm

Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài

được công bố gây bệnh thán thư ớt 64

4.5. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat của các mẫu nấm

Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 69

4.6. Đặc điểm hình thái 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định

được tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 72

4.7. PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu

Colletotrichum 81

4.8. Phản ứng PCR so sánh 2 phương pháp chiết DNA (CTAB và NaOH) từ

nấm Colletotrichum với 4 cặp mồi đặc hiệu 83

4.9. Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất cả các địa

điểm (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B) 87

4.10. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên các môi trường

dinh dưỡng 93

4.11. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các điều kiện nhiệt

độ khác nhau 97

4.12. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các mức pH khác nhau 101

4.13. Lây bệnh nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 105

4.14. Lây bệnh nhân tạo các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt trên quả

chín của một số loại ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 110

4.15. Lây nhiễm nhân tạo bào tử nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt

giống Demon bằng phương pháp gây tổn thương 112

4.16. Đặc điểm của bào tử nấm C. siamense và C truncatum trên bề mặt lá ớt

giống Demon được lây nhiễm bằng phương pháp gây tổn thương 114

4.17. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường

dinh dưỡng chứa thuốc Azony 25SC ở các nồng độ khác nhau 119

4.18. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường

dinh dưỡng chứa thuốc Antracol 70WP ở các nồng độ khác nhau 124

4.19. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường

dinh dưỡng chứa thuốc Tiptop 250EC ở các nồng độ khác nhau 129

4.20. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường

dinh dưỡng chứa thuốc Score 250EC ở các nồng độ khác nhau 134

4.21. Khả năng đối kháng của 2 mẫu vi khuẩn HT1 và N2 đối với các loài nấm

Colletotrichum 139

4.22. Khả năng ức chế sinh trưởng của dịch chiết địa y đối với một số loài nấm

Colletotrichum 141

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Duy Hưng Tên Luận án: Nghiên cứu thành phần loài, tính gây bệnh và khả năng phòng chống nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng

Mã số: 9 62 01 12

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Xác định được thành phần loài, đánh giá được một số đặc điểm sinh học chủ yếu của nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông Hồng (ĐBSH).

Phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu

Luận án thực hiện 4 nội dung nghiên cứu: 1) Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt. 2) Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại ĐBSH và một số tỉnh. 3) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được. 4) Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng đối và dịch chiết địa y với các loài Colletotrichum được phát hiện trong điều kiện in vitro.

* Vật liệu

Các mẫu nấm Colletotrichum được thu thập trên đồng ruộng. Các nguồn vi khuẩn đối kháng và dịch chiết địa y được cung cấp bởi bộ môn Bệnh cây và bộ môn Hóa (Học viện Nông nghiệp Việt Nam). Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu phòng chống là các thuốc trừ nấm nằm trong danh mục được phép sử dụng tại Việt Nam.

* Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập nấm theo qui trình của Cai et al. (2009). Bảo quản mẫu nấm theo phương pháp của Abd-Elsalam et al. (2010).

- Phương pháp chiết DNA mẫu nấm được thực hiện theo Doyle & Doyle (1987) và Wang et al. (1993). Định danh mẫu nấm được thực hiện bằng cặp mồi: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) và AM-F & AM-R (Silva et al., 2012).

- Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã công bố về các loài chuẩn (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012). Các trình tự lựa chọn được phân tích bằng phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007).

- Đặc điểm tản nấm, hình dạng bào tử, đĩa áp được đánh giá theo phương pháp của Cai et al. (2009), Than et al. (2008a) và Johnston & Jones (1997).

- Xác định tính gây bệnh của các loài được thực hiện theo phương pháp của Montri et al. (2009) và Than et al. (2008b). Đánh giá khả năng tồn tại của một số loài Colletotrichum trên lá ớt được thực hiện theo phương pháp của Ranathunge et al. (2016).

xii

- Đánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng đến với các loài nấm Colletotrichum trong điều kiện invitro được thực hiện theo phương pháp của Gopinath et al. (2006) và Kumar et al. (2012). Hiệu lực ức chế được tính theo công thức Abbott (1925).

- Các số liệu thí nghiệm khác được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng phần mềm IRRISTAT 5.0.

Kết quả chính và kết luận

Điều tra đồng ruộng từ 2015 đến 2017 đã xác định được bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là bệnh phổ biến, gây hại trên tất các thời vụ trong năm trên cây ớt tại ĐBSH. Bệnh gây hại từ giai đoạn cây ớt thu hoạch quả lứa 1 và tăng nhanh ở các lứa quả tiếp theo.

Tổng số 52 mẫu nấm thán thư ớt thu thập tại 9 tỉnh ĐBSH và 4 tỉnh khác đã được phân lập thuần từ đơn bào tử. Các phân tích hình thái dựa trên đặc điểm bào tử phân sinh và đĩa áp đã xác định được chúng thuộc 3 nhóm hình thái. Các phân tích trình tự vùng ITS của 10 mẫu nấm đại diện cho 3 nhóm hình thái xác định được 2 mẫu nấm là loài C. truncatum và 8 mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Để định danh chính xác tới mức loài của các mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l, trình tự vùng liên gen ApMat của 9 mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đã được phân tích. Kết quả phân tích đã xác định được 4 loài C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes. Tất cả 4 loài này là những loài lần đầu tiên được phát hiện, công bố tại Việt Nam.

Dựa trên kết quả định danh, 4 cặp mồi đặc hiệu 4 loài Colletotrichum chính gây bệnh thán thư ớt (C. gloeosporioides s.s; C. fructicola; C. siamense; C. truncatum) đã được thiết kế. Nhiệt độ gắn mồi, thông số quan trọng nhất trong phản ứng PCR, cho từng cặp mồi đã được tối ưu. Ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu, cả 4 cặp mồi đã chứng tỏ phát hiện đặc hiệu 4 loài tương ứng. Đặc biệt phương pháp chiết nhanh DNA từ mẫu nấm dùng NaOH và đệm Tris đã lần đầu được áp dụng đối với nấm Colletotrichum. Phương pháp được chứng tỏ rất phù hợp để chuẩn bị DNA nhóm nấm này cho phản ứng PCR.

Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được áp dụng để định danh tất cả 52 mẫu nấm thu thập được. Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh gồm 5 loài, trong đó C. siamense là loài phổ biến nhất, chiếm 51,9%, tiếp theo là C. fructicola chiếm 21,2%, C. truncatum chiếm 15,4%, C. gloeosporioides s.s chiếm 9,6% và loài C. aeschynomenes chiếm 1,9%.

Các đặc điểm sinh học quan trọng của 5 loài nấm đã được đánh giá trong điều kiện in vitro. Tính gây bệnh của 5 loài Colletotrichum trên ớt và một số loại quả đã được đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo. Đặc biệt, đã xác định được bào tử phân sinh của loài C. siamense và C. truncatum có khả năng nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, duy trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau khi xâm nhập và không gây triệu chứng trên lá ớt sau lây nhiễm 6 tuần. Phát hiện này đã giúp xác định được một vị trí tồn tại quan trọng của nguồn bệnh thán thư trên đồng ruộng, đồng thời giải thích được tại sao trên đồng ruộng khó quan sát thấy bệnh thán thư trên lá ớt.

xiii

Kết quả nghiên cứu của luận án đã xác định được các hoạt chất Difenoconazole (Score 250EC) và Propiconazole (Tiptop 250EC) có hiệu lực cao đối với 5 loài nấm Colletotrichum trong điều kiện in vitro. Ở nồng độ khuyến cáo, Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm và nảy mầm bào tử của 5 loài nấm; Tiptop 250 EC có hiệu lực ức chế tản nấm đạt 82,2 - 100% và nảy mầm bào tử đạt 69,1 - 100%.

THESIS ABSTRACT

Code: 9 62 01 12

Doctoral candidate: Nguyen Duy Hung Dissertation title: Species composition, pathogenicity and prevention measures of Colletotrichum spp. causing anthracnose of chili peppers in the Red River Delta (RRD). Field: Plant Protection Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Research Objectives: To identify species composition and to characterize important biological features of Colletotrichum spp. causing anthracnose of chili peppers in the RRD. Materials and Methods * Research aspects

The dissertation studied four aspects as follow: 1) Investigating and evaluating damage of Colletotrichum and collecting pepper samples infected with anthracnose. 2) Determining the composition of Colletotrichum in chili pepper in the RRD and other provinces. 3) Studying biological characteristics, pathogenicity of detected Colletotrichum species. 4) Evaluating effectiveness of some plant protection chemicals, antagonistic bacteria and lichen extracts to detected Colletotrichum species under in vitro condition. * Materials

Colletotrichum samples were collected in chilli fields. Antagonistic bacteria and lichen extracts were provided by Departments of Plant Pathology and Chemistry (VNUA). Chemicals used in inhibition experiment were all approved by Vietnam authority. * Method

- Fungal isolation according to Cai et al. (2009); storage of samples according to

the method of Abd-Elsalam et al. (2010).

- DNA extraction according to Doyle & Doyle (1987) and Wang et al. (1993); identification of samples was carried out with primers: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) and AM-F & AM-R (Silva et al., 2012).

- Designation of specific primers according to published gene sequences on standard species (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012). Analysis of selected sequences by ClustalX 2.0 software (Larkin et al., 2007).

- Evaluation of fungal characteristics, spore and sporangium shapes according to

Cai et al. (2009), Than et al. (2008b) and Johnston and Jones (1997).

- Evaluation of inhibitory effect of plant protection chemicals, lichen extracts and antagonistic bacteria to Colletotrichum under in vitro conditions according to Gopinath et al. (2006) and Kumar et al. (2012).

- Calculation of effectiveness of plant protection chemicals, antagonistic bacteria,

lichen extract to Colletotrichum according to Abbott's formula (1925).

- Statistically processing of other experimental data by variance analysis method

xiv

and IRRISTAT 5.0 software.

Main findings and conclusions

Field surveys during period from 2015 to 2017 determined the anthracnose is the most common disease of chili, occurring in all cropping seasons in RRD. The disease occurred from the first fruit harvest and rapidly expanded in the following harvests to the end of the harvest cycle.

isolates were single spore

Total 52 Colletotrichum isolates were collected from 9 provinces of RRD and 4 other provinces. All isolated for further studies. Morphological analyses, based on conidial and appressorial characteristics grouped all isolates into 3 morphological groups. ITS sequence analyses of 10 representatives of morphological groups identified 2 isolates belonging to C. truncatum and 8 remaining isolates belonging to C. gloeosporioides s.l complex. Further sequence analyses of 9 isolates of the C. gloeosporioides s.l complex using the ApMat gene identified they belong to 4 species, C. gloeosporioides (sensu stricto), C. siamense, C. fructicola and C. aeschynomenes. All of these species are firstly identified in Vietnam.

Based on identified species, 4 sets of primers specific to 4 common Colletotrichum species (C. gloeosporioides s.s; C. fructicola; C. siamense; C. truncatum). Annealing temperature, the most important PCR parameter, of all primer sets were optimized. At optimal annealing temperatures, all 4 primer sets were demonstrated to detect specifically corresponding Colletotrichum species. Remarkably, DNA extraction technique using NaOH and Tris buffer was firstly applied for Colletotrichum. The technique demonstrated to be very suitable to prepare DNA of Colletotrichums for PCR.

PCR using the specific primer pairs were used to identify all collected 52 Coletotrichum isolates. PCR tests identified composition of Colletotrichum species causing anthracnose in chili peppers in RRD and other provinces encompassing 5 species, of which C. siamense was the most common species that accounted for 51.9%, followed by C. fructicola (21.2%), C. truncatum (15.4%), C. gloeosporioides s.s (9.6%) and C. aeschynomenes (1.9%).

The key biological characteristics of 5 species of Colletotrichum were evaluated under invitro condition. Pathogenicity of 5 species on chili and some fruits was evaluated by artificial inoculation. Particularly, inoculation experiment showed conidia of C. siamense and C. truncatum were able to germinate, form appressoria, and penetrate directly through cutin layer, remain dormant state inside leaves without causing any symptoms at 6 weeks after inoculation. The results revealed an important source of the fungal pathogen in the field.

Active ingredients Difenoconazole (Score 250EC) and Propiconazole (Tiptop 250EC) were identified to be highly effective for Colletotrichum control under in vitro conditions. At the recommended concentration, Score 250EC completely inhibited the growth and spore germination of the 5 fungal species; Tiptop 250 EC restricted 82.2 - 100% fungal growth and 69.1 - 100% spore germination of the 5 fungal species.

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây ớt (Capsicum sp) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) có xuất xứ từ Mehico, Goatemala và từ trung tâm khởi nguyên Đông Nam Á. Có hai nhóm ớt

phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.).

Trong nhóm cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), cây ớt có tầm quan trọng thứ hai chỉ sau cây cà chua. Ngày nay, ớt được trồng rộng rãi trên toàn thế giới từ 55o vĩ độ bắc đến 55o vĩ độ nam đặc biệt là ở các nước châu Mỹ và một số nước châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia.

Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) là một trong những vùng sản xuất ớt hàng

hóa tập trung lớn của nước ta. Theo Tổng cục thống kê, đến năm 2017 diện tích

trồng ớt của ĐBSH đạt 5.049 ha và sản lượng là 79.640 tấn. Hiện nay, cây ớt

được xem là một trong những cây trồng quan trọng, mang lại hiệu hiệu quả kinh

tế cao cho người sản xuất.

Cũng như nhiều cây trồng khác, cây ớt bị tấn công bởi nhiều dịch hại.

Trong số các dịch hại ớt, nấm Colletotrichum spp. (gây bệnh thán thư) được xem

là nguy hiểm nhất (Than et al., 2008a). Tại Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh

làm giảm từ 10 - 80% năng suất, cá biệt tại bang Ohio, Mỹ bệnh đã làm giảm gần

100% năng suất của cây ớt (Kumar, 2014; Sheu, 2013; Than et al., 2008a). Tại

Việt Nam, tất cả các vùng trồng ớt tập trung như Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế

... đều bị bệnh thán thư phá hại nặng.

Cho tới năm 2008, thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt công

bố trên thế giới khá đa dạng, bao gồm ít nhất 7 loài C. gloeosporioides, C. capsici, C. acutatum, C. coccodes, C. dematium, C. nigrum và C. atramentarium. Thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt ở các quốc gia, các vùng khác nhau là khác nhau. Đến nay, đã có nhiều kết quả nghiên cứu về các loài được ghi nhận song vẫn còn nhiều điều cần được nghiên cứu thêm về quá

trình lây bệnh và về mối quan hệ phức hợp giữa các loài (Than et al., 2008a).

Tại Việt Nam, trước khi thực hiện đề tài này, ít nhất 4 loài là C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum đã được công bố gây bênh thán thư ớt

(Don et al., 2007; Ngô Bích Hảo, 1991, 1992).

loài Việc định danh nấm Colletotrichum hại ớt (cũng như các Colletotrichum khác) dựa vào đặc điểm hình thái (màu sắc, tốc độ phát triển và cấu trúc tản nấm; hình dạng, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp ...) đã có quá nhiều nhầm lẫn. Nguyên nhân là do đặc điểm hình thái của các loài Colletotrichum có sự phụ thuộc cao vào điều kiện môi trường (Hyde et al., 2009a). Theo Weir et al. (2012) và Damm et al. (2012a) C. gloeosporioides và C. acutatum thực chất là các phức hợp loài, trong đó C. gloeosporioides gồm ít nhất 23 loài khác nhau và C. acutatum gồm ít nhất 31 loài khác nhau.

Đối với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt, các nghiên cứu phân loại mới gần đây, dựa trên phân tích phân tử, cho thấy đã có thay đổi lớn về thành phần loài so với công bố trước đây. Tại Ấn Độ, định danh lại 52 mẫu nấm C. gloeosporioides sensu lato (s.l) cho thấy chúng thuộc 2 loài là C. fructicola và C. siamense (Sharma & Shenoy, 2013). Tại Thái Lan, 4 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đã được xác định là C. gloeosporioides sensu stricto (s.s), C. siamense, C. acutatum và C. truncatum (Suwannarat et al., 2017). Tại Trung Quốc, phân tích trình tự của các mẫu nấm Colletotrichum thu tại 29 tỉnh đã xác định được 15 loài trong đó có 5 loài phổ biến là C. fioriniae, C. fructicola, C. gloeosporioides s.s, C. scovillei và C. truncatum (Diao et al., 2017). Tại Úc, 5 loài C. siamense, C. simmondsii, C. queenslandicum, C. truncatum và C. cairnsense đã được xác định gây bệnh thán thư ớt (De Silva et al., 2017a).

Xác định chính xác thành phần cũng như định danh đúng nấm Colltetotrichum có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn trong thực tiễn quản lý bệnh vì quan hệ giữa nấm với cây ký chủ cũng như tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài. Kim et al. (2004) đã cho thấy C. acutatum và C. gloeosporioides có thể nhiễm trên quả ớt ở mọi giai đoạn phát triển quả nhưng thường không gây bệnh trên lá và thân. Trái lại C. coccodes và C. dematium gây hại chủ yếu trên lá và thân cây ớt, đặc biệt cây con. Các loài Colltetotrichum cũng có tính gây bệnh khác nhau theo giai đoạn phát triển của quả ớt. Chẳng hạn, C. capsici gây hại phổ biến trên quả ớt đã chín đỏ, trong khi C. acutatum và C. gloeosporioides gây hại phổ biến trên cả quả ớt xanh và chín (Hong & Hwang, 1998; Kim et al., 1999). Các loài Colletotrichum có thể tồn tại ngoài tự nhiên dưới dạng các kiểu gây bệnh và chúng có tính gây bệnh khác nhau trên ớt.

Hiện tại, việc phòng trừ bệnh thán thư hại ớt ngoài sản xuất chủ yếu được thực hiện bằng thuốc hóa học và chưa thu được hiệu quả như mong muốn. Nguyên nhân chủ yếu là: (i) thiếu thông tin đầy đủ, cập nhật và chính xác về thành phần

loài Colletotrichum gây bệnh, đặc biệt khi các tiêu chí phân loại chi nấm này đang thay đổi nhanh chóng; (ii) thiếu thông tin về các đặc điểm sinh học của các loài/ kiểu gây bệnh của nấm Colletotrichum phổ biến nhất, trong đó quan trọng là tính gây bệnh trên các giống ớt và phản ứng với các thuốc trừ nấm khác nhau. Việc xác định các thông tin trên có vai trò quan trọng vì nó sẽ là cơ sở khoa học chủ yếu để đề xuất các biện pháp kỹ thuật nhằm phòng chống hiệu quả bệnh thán thư hại ớt tại Việt Nam.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

Xác định được thành phần loài cũng như đánh giá được một số đặc điểm

sinh học chủ yếu của nấm Colletotrichum hại ớt tại ĐBSH.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

- Đánh giá được hiện trạng gây hại của bệnh thán thư ớt tại ĐBSH.

- Xác định được thành phần, mức độ phổ biến và phương pháp chẩn đoán

nhanh các loài nấm Colletotrichum chính hại ớt tại ĐBSH.

- Xác định được tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát

hiện được trên cây ớt tại ĐBSH.

- Đánh giá được hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng và dịch chiết địa y đối với các loài Colletotrichum chính phát hiện được trong điều kiện in vitro.

1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu

Bệnh thán thư gây hại trên cây ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra.

1.3.2. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu về thành phần loài, một số đặc tính sinh học,

tính gây bệnh và đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng, dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum spp. chính phát hiện được trong

điều kiện in vitro.

1.3.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Điều tra, đánh giá tác hại, thu thập mẫu bệnh thán thư hại ớt tại 9 tỉnh thuộc ĐBSH (Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam) và một số tỉnh khác (Sơn La, Bắc Giang, Thái

Nguyên và Tiền Giang).

Các nghiên cứu về thành phần loài, đặc điểm sinh học và đánh giá hiệu lực của thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng, dịch chiết địa y với các loài nấm

Colletotrichum được thực hiện tại Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông

nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu Rau quả.

Đề tài được thực hiện từ năm 2015 đến năm 2019.

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

1. Đã xác định được 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh gồm C. truncatum, C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes. Ngoại trừ loài C. truncatum, 4 loài nấm còn lại đã được phát hiện gây hại trên cây ớt lần đầu tiên tại Việt Nam. Trong 5 loài nấm phát hiện, C. siamense là loài phổ biến nhất (51,9%), các loài khác: C. fructicola (21,2%), C. truncatum (15,4%), C. gloeosporioides s.s (9,6%) và C. aeschynomenes (1,9%).

2. Đã thiết kế được 4 cặp mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán các loài Colletotrichum chính gây bệnh thán thư ớt gồm C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. siamense và C. truncatum. Ngoài ra, đã hoàn thiện phương pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum bằng kỹ thuật PCR.

3. Đã xác định được bào tử của 2 loài nấm C. siamense và C. truncatum có khả năng nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, duy trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau khi xâm nhập và không gây triệu chứng trên lá ớt tới ít nhất 6 tuần sau lây nhiễm. Đây là một phát hiện mới về nơi tồn tại của nguồn bệnh thán thư ớt. Ngoài ra, kết quả cũng giúp giải thích được lý do tại sao bệnh thán thư trên lá ớt lại hiếm gặp trên đồng ruộng và lây nhiễm nhân tạo trên lá không dẫn tới hình thành vết bệnh.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các thông tin cập nhật và chính xác về phân loại, đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt. Định danh chính xác các loài Colletotrichum hại ớt có ý nghĩa khoa học quan trọng, đóng góp vào hiện trạng phân loại lại các loài Colletotrichum trên thế giới.

Đặc tính xâm nhiễm của nấm Colletotrichum trên lá ớt được xác định trong luận án đã đóng góp vào hiểu biết chung về mối quan hệ sinh học giữa nấm Colletotrichum và cây ký chủ.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Hiện nay, bệnh thán thư là một trong các nguyên nhân quan trọng nhất cản

trở sản xuất ớt tại Việt Nam. Xác định được lá không biểu hiện triệu chứng có

thể là nguồn bệnh quan trọng để tiếp tục gây hại trên quả sẽ giúp điều chỉnh kỹ thuật phòng chống phù hợp, trong đó cần chú trọng phòng trừ bệnh ngay từ giai

đoạn sinh trưởng sinh dưỡng. Các kết quả nghiên cứu phòng trừ trong phòng thí

nghiệm sẽ là tiền đề để lựa chọn các thuốc hóa học phù hợp để giảm thiểu mức

độ gây hại của bệnh trên đồng ruộng.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. NGUỒN GỐC, TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ỚT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.1.1. Lược sử về cây ớt

Cây ớt là cây gia vị, thân thảo, thân dưới hóa gỗ, có thể sống vài năm, có

nhiều cành, nhẵn; lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn; hoa mọc đơn độc ở kẽ

lá. Quả ớt có nhiều tên gọi khác nhau như Lạt tiêu, Lạt tử, Ngưu giác tiêu, Hải

tiêu ... Quả ớt mọc rủ xuống đất, chỉ riêng ở cây ớt chỉ thiên thì quả lại quay lên

trời. Các bộ phận của cây ớt như quả, rễ và lá còn được dùng làm thuốc chữa

nhiều bệnh (Trần Khắc Thi & Nguyễn Công Hoan, 2005).

Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc họ cà (Solanaceae), tộc Solaneae, tộc phụ Capsicinae. Hiện nay, chi Capsicum gồm khoảng 35 loài được ghi nhận

(Eshbaugh, 2012; Carrizo García et al., 2016), trong đó có 5 loài trồng đã được

thuần hóa là C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens và C. pubescens

(Barchenger et al., 2019). Trong số 5 loài Capsicum đã thuần hóa, C. annuum là

loài được trồng nhiều nhất trên thế giới tiếp đến là loài C. frutescens (Kraft et al.,

2014; Srivastava & Mangal, 2019).

Trung tâm khởi nguyên của cây ớt (Capsicum spp.) thuộc vùng nhiệt đới

và á nhiệt đới châu Mỹ, trải dài một vùng rộng lớn gồm Mexico, bắc Trung Mỹ,

vùng Caribe, đồng bằng Bolivia, phía bắc đồng bằng Amazon và cao nguyên

phía nam dãy Andes (Perry et al., 2007; Srivastava & Mangal, 2019; Tripodi &

Kumar, 2019). Các bằng chứng khảo cổ cho thấy cây ớt (Capsicum spp.) đã

được thuần hóa rất lâu, khoảng 6.000 năm trước công nguyên tại vùng trải dài

từ Bahamas tới nam Peru (Perry et al., 2007). Các bằng chứng khảo cổ, sinh

thái, ngôn ngữ và di truyền cho thấy cây ớt (C. annuum) đã được thuần hóa đầu

tiên tại Mexico (Kraft et al., 2014).

Từ châu Mỹ, đầu tiên, cây ớt đã được Christopher Columbus du nhập vào châu Âu sau khi ông khám phá ra châu Mỹ vào thế kỷ 15. Diego Álvarez Chanca, một dược sĩ trong chuyến đi thứ hai của Columbus đến West Indies năm 1493, đã mang những hạt ớt đầu tiên về Tây Ban Nha và đã lần đầu viết về các tác dụng dược lý của chúng vào năm 1494. Từ Mexico, Tây Ban Nha các

thương lái đã nhanh chóng chuyển ớt qua Ấn Độ, Philippines và sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản với sự trợ giúp của các thủy thủ châu Âu.

Gia vị mới này đã nhanh chóng được sử dụng trong chế biến thức ăn của các quốc gia này (Urig, 2015). Do giao thương phát triển, cây ớt đã dần phân bố

khắp thế giới, chủ yếu nhờ các nhà buôn và thủy thủ người Tây Ban Nha và Bồ

Đào Nha. Khả năng phân bố rộng của cây ớt một phần cũng nhờ khả năng thích

ứng khí hậu khá tốt của loài này (Tripodi & Kumar, 2019).

2.1.2. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới

Theo số liệu của Tổ chức Nông Lương Thế giới (2020), từ năm 2009 đến nay

diện tích, năng suất và sản lượng ớt của thế giới có sự tăng lên đáng kể (bảng 2.1).

Diện tích trồng ớt năm 2009 là 1,85 triệu ha, đến năm 2018 diện tích trồng ớt tăng lên 1,99 triệu ha. Bên cạnh việc tăng về diện tích, năng suất ớt cũng tăng đáng kể trong giai đoạn này. Năm 2009, năng suất ớt trung bình của thế giới đạt 15,34 tấn/ha, đến năm 2018 năng suất đạt 18,47 tấn/ha. Chính vì vậy sản lượng ớt trên

toàn thế giới cũng tăng từ 28,76 triệu tấn năm 2009 lên cao nhất vào năm 2018

đạt 36,77 triệu tấn (FAOSTAT, 2020).

Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt của thế giới (năm 2009 - 2018)

Diện tích Năng suất Sản lượng Năm (triệu ha) (tấn/ha) (triệu tấn)

2009 1,85 15,34 28,76

2010 1,87 15,86 29,67

2011 1,90 15,91 30,24

2012 1,94 15,92 30,90

2013 1,93 16,21 31,26

2014 1,95 16,51 32,12

2015 1,89 17,65 33,28

2016 1,94 17,79 34,50

2017 1,96 18,33 35,98

2018 1,99 18,47 36,77

Trung Quốc, Mexico, Thổ Nhĩ Kỳ, Indonesia và Tây Ban Nha. Trong đó, Trung

Quốc là quốc gia sản xuất ớt lớn nhất thế giới, chiếm khoảng 49% sản lượng ớt

của toàn cầu (FAOSTAT, 2020).

Nguồn: FAOSTAT (2020) Châu Á được xem là trung tâm lớn về sản xuất ớt của thế giới, chiếm 69% sản lượng ớt toàn cầu. Các nước có sản lượng ớt lớn nhất trong năm 2018 là

2.1.3. Tình hình sản xuất ớt ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây ớt được trồng từ lâu đời và được xem là một cây trồng có

giá trị trong nhóm cây rau. Trước năm 2000, vùng trồng ớt chuyên canh tập trung

chủ yếu ở khu vực Bắc Trung Bộ với diện tích hàng nghìn héc ta ở mỗi tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa - Thiên Huế (Trần Khắc Thi & Nguyễn Công

Hoan, 2005). Từ năm 2010 trở lại đây, cây ớt đã phát triển rộng rãi ở hầu khắp các

vùng trong cả nước. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2018), trong gần 10 năm trở lại đây diện tích, năng suất, sản lượng ớt của cả nước có xu hướng tăng

dần. Năm 2009, diện tích trồng ớt của cả nước là 9.280 ha, sản lượng đạt 90,39

nghìn tấn, đến năm 2017 diện tích trồng ớt của cả nước đã tăng hơn gần 5 lần về

diện tích và 6 lần về sản lượng so với năm 2009 với diện tích đạt 43.807 ha, sản

lượng 579,92 nghìn tấn. Bên cạnh việc gia tăng nhanh chóng về diện tích, năng suất cây ớt của cả nước cũng tăng lên đáng kể và gần tiệm cận với năng suất bình

quân của thế giới. Năm 2009, năng suất ớt của nước ta chỉ đạt trung bình 9,7

tấn/ha, đến năm 2017 năng suất trung bình đã đạt 13,2 tấn/ha.

Bảng 2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt Việt Nam (năm 2009 - 2017)

Diện tích Năng suất Sản lượng

(ha) (tấn/ha) (nghìn tấn) Năm

Cả nước ĐBSH Cả nước ĐBSH Cả nước ĐBSH

2009 9.280 930 9,7 15,9 90,39 14,84

2010 11.201 2.635 11,9 16,2 133,48 42,79

2011 18.248 3.617 11,8 15,4 216,09 55,92

2012 18.048 1.134 11,3 13,5 204,09 15,40

2013 27.760 2.411 12,5 17,3 348,17 41,94

2014 37.320 7.808 12,7 16,2 476,14 126,6

2015 33.134 2.451 13,2 15,7 440,32 38,63

2016 37.978 2.810 13,1 15,2 500,10 42,91

2017 43.807 5.049 13,2 15,8 579,92 79,64

ĐBSH, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long.

Theo tổng cục thống kê (2018), năm 2009 diện tích ớt của ĐBSH là 930 ha, sản lượng đạt 14,84 nghìn tấn, đến năm 2017 diện tích trồng ớt đã tăng lên 5.049 ha và

Nguồn: Tổng cục Thống kê (2018) Hiện tại, ĐBSH là vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung lớn nhất khu vực phía Bắc và là một trong bốn vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung của cả nước gồm:

sản lượng tương ứng là 79,64 nghìn tấn. Bên cạnh việc tăng trưởng về diện tích, năng suất ớt của vùng qua các năm luôn cao hơn năng suất trung bình của cả nước.

Điều đó chứng tỏ ĐBSH là vùng có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của cây ớt.

2.2. NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH THÁN THƯ HẠI ỚT TRÊN THẾ GIỚI

2.2.1. Tầm quan trọng của bệnh thán thư

Bệnh thán thư (anthracnose) có nguồn gốc từ một từ Hy Lạp với nghĩa ‘coal

= than đá’ để chỉ mầu đen của vết bệnh, tạo triệu chứng đặc trưng là vết bệnh

lõm, thường có các chấm đen (đĩa cành của nấm gây bệnh). Tác nhân gây bệnh

thường do nấm Colletotrichum gây ra (Than et al., 2008a).

Bệnh thán thư trên ớt được công bố lần đầu tiên tại New Jersey (Mỹ) vào

năm 1890 bởi Halsted và cho tới nay, đã được công bố ở khắp các nước trồng ớt

trên thế giới. Bệnh thán thư là bệnh phổ biến ở một số nước trồng ớt chính như

Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ, các nước Nam Mỹ,

các nước Châu Phi và một số nước vùng trung, nam Châu Âu. Đây được xem là

bệnh có ý nghĩa kinh tế quan trọng nhất trên cây ớt ở tất cả các nước. Tại Hàn

Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh làm giảm từ 10 - 80% năng suất, cá biệt tại bang

Ohio, Mỹ bệnh đã làm giảm gần 100% năng suất của cây ớt (Kumar, 2014; Sheu,

2013; Than et al., 2008a).

Các loài nấm Colletotrichum spp. có thể gây bệnh trên hầu hết các bộ phận

của cây ớt trong bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào tuy nhiên bệnh trên quả có ý

nghĩa quan trọng hơn cả. Triệu chứng trên quả lúc đầu là những vết bệnh dạng

ngậm nước và sau đó trở nên mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm nhỏ,

sạm lại. Vết bệnh có thể bao trùm hết bề mặt quả và xuất hiện những tổn thương

phức tạp. Bề mặt của vết bệnh trở nên ẩm ướt tạo thành đĩa cành với những lông

gai màu đen trông rất cứng (Than et al., 2008a).

Các loài Colletotrichum khác nhau có thể cùng kết hợp gây ra bệnh thán thư trên cùng ký chủ (Cannon et al., 2000). Các loài Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt ở các quốc gia, các vùng khác nhau là khác nhau. Mặc dù nghiên cứu về các loài đã thu được nhiều kết quả được ghi nhận trong các báo cáo song vẫn còn nhiều điều cần được nghiên cứu thêm về quá trình lây bệnh và

về mối quan hệ phức hợp giữa các loài (Than et al., 2008a).

Các loài Colltetotrichum cũng có tính gây bệnh khác nhau theo giai đoạn

phát triển của quả ớt. Chẳng hạn, C. capsici gây hại phổ biến trên quả ớt đã chín

đỏ, trong khi C. acutatum và C. gloeosporioides gây hại phổ biến trên cả quả ớt

xanh và chín (Hong & Hwang, 1998; Kim et al., 1999).

2.2.2. Phân loại nấm Colletotrichum

Colletotrichum (họ Glomerellaceae, bộ Sordariomycetidae, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota (Sutton et al., 1992) là một chi nấm lớn, có lịch sử phân loại

phức tạp và trải qua nhiều giai đoạn.

Tên nấm Colletotrichum được giới thiệu lần đầu tiên bởi Corda vào năm

1837. Từ thời điểm đó cho tới 1957, khoảng 750 loài Colletotrichum đã được công bố khắp thế giới, dựa trên 2 tiêu chí phân loại là đặc điểm hình thái và cây

ký chủ (dẫn theo Cannon et al., 2012).

Năm 1957, Von Arx đã chính thức đề xuất một phương pháp phân loại mới,

nhấn mạnh vào mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái và không quan tâm tới cây ký

chủ. Phương pháp phân loại của Von Arx đã dẫn tới giảm đáng kể số lượng loài

Colletotrichum xuống còn 23 (dẫn theo Cannon et al., 2012). Phương pháp phân

loại dựa theo đặc điểm hình thái bao gồm (i) màu sắc, tốc độ phát triển và cấu trúc

tản nấm; (ii) hình dạng và kích thước bào tử phân sinh; (iii) hình dạng và kích

thước đĩa áp, (iv) có hay không có lông gai của đĩa cành; (v) hình thành hay không

hình thành hạch nấm; (vi) hình thành hay không hình thành giai đoạn sinh sản hữu

tính. Cách phân loại này đã được chấp nhận rộng rãi trong phân loại nấm

Colletotrichum và tới năm 1992, số loài được công bố là 32 (Sutton et al., 1992).

Năm 1990, hội thảo quốc tế đầu tiên về nấm Colletotrichum được tổ chức

tại Đại học Bath (University of Bath, Anh) với sự tham gia của các chuyên gia về

phân loại, sinh học phân tử, quan hệ nấm và cây, bệnh cây học. Hội thảo đã đánh

dấu kỷ nguyên mới về phân loại nấm Colletotrichum, trong đó bắt đầu áp dụng

các kỹ thuật phân tích phân tử (Bailey & Jeger, 1992).

Phân loại nấm Colletotrichum chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái đã tạo ra quá nhiều sai lầm do sự phụ thuộc cao của các đặc điểm hình thái vào điều kiện môi trường nên vai trò của phân tích phân tử đã ngày càng trở nên quan trọng và được xem là chuẩn vàng trong phân loại nhóm nấm này (Cannon et al., 2000;

Hyde et al., 2009a).

Ứng dụng phân tích phân tử đầu tiên (Mills et al., 1992) đã xác định được các khác biệt trong trình tự chuỗi ITS1 của 6 loài Colletotrichum, cũng như chứng tỏ có sự đa hình ở vùng gen này của các mẫu C. gloeosporioides phân lập từ các

cây ký chủ khác nhau. Số lượng các nghiên cứu phân loại nấm Colletotrichum ứng dụng phân tích phân tử gia tăng nhanh chóng, tập trung vào các gen nền như gen mã hóa RNA ribosome (internal transcribed spacer (ITS)) (Crouch et al., 2009; Hsiang & Goodwin, 2001; Johnston & Jones, 1997), gen mã hóa yếu tố xác định kiểu ghép cặp (mating-type (MAT)) (Chen et al., 2002; Du et al., 2005).

Mặc dù ITS hiện được xem là gen “mã vạch” (barccode) trong phân loại

phân tử nấm (Schoch et al., 2012) nhưng vùng gen này đã chứng tỏ chưa đủ để

phân loại tới mức loài đối với một số nhóm nấm Colletotrichum. Chẳng hạn, tỷ lệ

xác định sai các mẫu nấm nhóm Colletotrichum có bào tử dạng lưỡi liềm dùng chuỗi

ITS và tìm kiếm bằng “Blast search” tại NCBI lên tới 86% (Crouch et al., 2009).

Tương tự, một phân tích đã cho thấy trong tổng số 343 mẫu ITS sẵn có trên

GenBank (tới tháng 9 năm 2009) được gán là C. gloeosporioides có tới +86% số

mẫu có trình tự khác xa so với loài C. gloeosporioides chuẩn (Cai et al., 2009).

Chính vì vậy, phân tích đa gen đã chứng tỏ ngày càng quan trọng trong phân loại

nấm Colletotrichum. Ngoài các gen ITS và MAT, một loạt các gen nền khác cũng

đã được ứng dụng trong phân loại nấm Colletotrichum bao gồm các gen mã hóa

men glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), actin (ACT), men

chitin synthase 1 (CHS-1), protein beta-tubulin (Tub2), protein histone3 (HIS3),

men glutamine synthetase (GS), protein calmodulin (CAL), men chitin synthase I

(CHS-1), men DNA lyase (APN2), men manganese superoxide dismutase (SOD2),

và yếu tố kéo dài dịch mã (translation elongation factor 1-α (EF1α)) (Damm et al.,

2012a, 2012b, 2014; Weir et al., 2012).

Hiện nay, phân loại chính xác nấm Colletotrichum, đặc biệt đối với các loài

mới, cần áp dụng nhiều tiêu chí bao gồm: (i) phân tích đa gen và phải được so

sánh với trình tự công bố của các mẫu tiêu bản chuẩn gồm tiêu bản gốc duy nhất

hoặc tiêu bản tương đương tiêu bản gốc, tiêu bản thay thế tiêu bản gốc, (ii) các

đặc điểm hình thái, (iii) đặc điểm sinh lý, (iv) đặc điểm gây bệnh, và (v) đặc

điểm chuyển hóa thứ cấp (Cai et al., 2009).

Cho tới năm 2009, dựa trên các tiêu chí trên, đặc biệt phân tích đa gen, đã

có 66 loài Colletotrichum được công nhận chính thức kèm theo 20 loài đang chờ

thông tin bổ sung (Hyde et al., 2009b).

Hình 2.1. Cây phân loại các loài nấm Colletotrichum dựa trên phân tích trình tự các chuỗi gen CHS-1 (251 bp), ACT (305 bp), TUB2 (545 bp) và ITS (599 bp) với 9 nhóm (clade) được chỉ rõ bằng các màu khác nhau

Nguồn: Cannon et al. (2012)

Đến năm 2012, tổng số 119 loài Colletotrichum đã được công nhận. Phần lớn

các loài này được được xếp vào 9 nhóm (Cannon et al., 2012) (hình 2.1) bao gồm:

Nhóm Acutatum: tổng số 30 loài với đại diện là C. acutatum s.s

Nhóm Boninense: tổng số 17 loài với đại diện là C. boninense s.s

Nhóm Dematium: tổng số 6 loài với đại diện là C. lineola

Nhóm Destructivum: tổng số 6 loài với đại diện là C. destructivum

Nhóm Gloeosporioides: tổng số 22 loài với đại diện là C. gloeosporioides s.s

Nhóm Graminicola: tổng số 13 loài với đại diện là C. graminicola

Nhóm Obiculare: tổng số 2 loài với đại diện là C. obiculare

Nhóm Spaethianum: tổng số 5 loài với đại diện là C. spaethianum

Nhóm Truncatum: tổng số 3 loài với đại diện là C. truncatum (syn. C. capsici)

Ngoài các loài xếp được xếp vào 9 nhóm trên, các loài còn lại hình thành

các loài hoặc cụm nhỏ riêng rẽ bao gồm C. coccodes, C. trichellum, C. cliviae,

C. yunnanense và C. dracaenophilum.

2.2.3. Thành phần nấm Colletotrichum gây hại trên ớt

Nấm Colletotrichum gây hại trên ớt được công bố lần đầu tiên tại New

Jersey (Mỹ) bởi Halsted vào năm 1890 với tên gọi là Gloeopsorium piperatum và

C. nigrum. Hai tên nấm này về sau, vào năm 1957, được Von Arx coi là đồng

nghĩa với C. gloeosporioides (Than et al., 2008a).

Đến năm 2008, thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt công

bố trên thế giới khá đa dạng. Than et al. (2008b) đã tổng kết các loài

Colletotrichum được công bố trên thế giới và kể cả Việt Nam từ 1965 cho tới 2008 (bảng 2.3) và cho thấy chúng gồm ít nhất 7 loài là C. gloeosporioides,

C. capsici, C. acutatum, C. coccodes, C. dematium, C. nigrum, C. atramentarium và Gloeosporium piperatum. Số liệu cho thấy 3 loài phổ biến nhất trên ớt là

C. acutatum, C. capsici và C. gloeosporioides.

Cần phải chỉ rõ ở đây rằng các loài Colletotrichum được công bố ở trên chủ yếu được xác định trên cơ sở hình thái học của nấm. Một số công bố về thành phần loài Colletotrichum trên ớt tại Việt Nam (Don et al., 2007) và tại Thái Lan

(Than et al., 2008b) có dựa trên phân tích trình tự ITS nhưng không được so sánh

với trình tự của các loài chuẩn.

Bảng 2.3. Thành phần loài Colletotrichum trên ớt tại một số quốc gia

TT

Nước

Tác nhân gây bệnh

1 Úc C. acutatum, C. atramentarium, C. dematium, C. gloeosporioides

var. minor, C. gloeosporioides var. gloeosporioides

2 Ấn Độ C. capsici

3 Indonesia C. capsici, C. gloeosporioides

4 Hàn Quốc C. acutatum, C. gloeosporioides, C. coccodes, C. dematium

5 Miến Điện Gloeosporium piperatum E. & E., C. nigrum E. & Hals

Dastur, 1920

6 Papua New Guinea C. capsici, C. gloeosporioides

7 New Zealand C. coccodes

8 Đài Loan C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

9 Thái Lan C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

10 Anh C. acutatum, Glomerella cingulata

11 Mỹ C. acutatum

12 Việt Nam C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum

Đối với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt, các nghiên cứu phân

loại mới gần đây cho thấy đã có thay đổi lớn về thành phần loài so với công bố

trước đây. Tại Ấn Độ, định danh lại 52 mẫu nấm C. gloeosporioides s.l cho thấy

chúng thuộc 2 loài là C. fructicola và C. siamense (Sharma & Shenoy, 2013).

Tương tự, 2 loài C. acutatum và C. capsici, vốn được coi là 2 loài chính gây hại

trên ớt tại Thái Lan nay được định danh lại lần lượt là C. simmondsii và

C. truncatum (Ko et al., 2011). Cũng tại Thái Lan, gần đây hơn 4 loài

Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đã được xác định là C. gloeosporioides s.s,

C. siamense, C. acutatum và C. truncatum (Suwannarat et al., 2017). Tại Trung

Quốc, phân tích trình tự của 1.285 mẫu nấm Colletotrichum thu tại 29 tỉnh đã xác

định được 15 loài trong đó có 5 loài phổ biến là C. fioriniae, C. fructicola,

C. gloeosporioides s.s, C. scovillei và C. truncatum (Diao et al., 2017). Tại Úc,

phân tích 45 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đã xác định được 5

loài C. siamense, C. simmondsii, C. queenslandicum, C. truncatum và

C. cairnsense (De Silva et al., 2017a).

Nguồn: Than et al. (2008a)

2.2.4. Một số loài nấm Colletotrichum chính gây hại ớt 2.2.4.1. Colletotrichum truncatum (syn. Colletotrichum capsici)

Trước năm 2009, C. truncatum và C. capsici được xem là 2 loài riêng biệt.

Năm 2009, một nghiên cứu phân loại dựa trên các tiêu chí phân loại mới (đặc điểm hình thái và phân tích đa gen) đã chứng tỏ C. truncatum và C. capsici thực

chất là một loài. Do C. truncatum được mô tả trước (1831) so với C. capsici

(1932) nên theo qui định phân loại khoa học, tên loài C. capsici được đổi lại là

C. truncatum (Damm et al., 2009).

Theo Damm et al. (2009), nấm C. truncatum là tác nhân gây bệnh có ý nghĩa kinh tế, gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng, hầu hết là cây 2 lá

mầm, đặc biệt trên cây họ cà, họ đậu có đặc điểm hình thái và sinh học như sau:

Chú ý i-l là đĩa áp của mẫu CBS 120709 - mẫu nấm phân lập từ cây ớt tại Ấn Độ (được xem là loài chuẩn của C. capsici trước đây) Hình 2.2. Đặc điểm hình thái của nấm C. truncatum

màu trong tới nâu nhạt, có vách ngăn, phân nhánh, mọc thành cụm dầy, dài 90 µm. Bào tử phân sinh đơn bào, phần giữa dài, cong nhẹ nhưng đều (vách bào tử vẫn song song với nhau), phần phía gốc bào tử cong ít hơn phần phía đỉnh bào tử,

Nguồn: Damm et al. (2009) Đặc điểm hình thái (trên môi trường SNA) (hình 2.2): Sợi nấm trong, có vách ngăn, phân nhánh, đường kính 1 - 8 µm. Hậu bào tử không hình thành. Đĩa cành có cành bào tử phân sinh và lông gai mọc trực tiếp từ sợi nấm. Lông gai màu trong tới nâu nhạt, dài 80 - 150 µm, 2 - 5 vách ngăn. Cành bào tử phân sinh

đỉnh bào tử thót nhọn còn gốc bào tử bằng hơi tù, kích thước 21,8 ± 1,9 × 3,8 ± 0,3 µm (kích thước bào tử có thể thay đổi tùy isolate). Đĩa áp mọc đơn hoặc

thành nhóm hoặc thành cụm, màu nâu nhạt tới nâu, mép bằng tới chẻ thùy, hình

tròn tới elips hoặc hình cốc, kích thước 9,8 ± 3,5 × 6,4 ± 1,2 µm. Tản nấm phẳng,

mép bằng, không có sợi khí sinh, màu tro, đĩa cành (ổ bào tử) màu xám oliu, mọc chậm (14 mm sau 7 ngày, 23 mm sau 10 ngày) (Damm et al., 2009).

2.4.1.2. Colletotrichum gloeosporioides

C. gloeosporioides có hiện trạng phân loại phức tạp, được sử dụng theo 2

nghĩa (Weir et al., 2012) như sau:

(1) Colletotrichum gloeosporioides s.l

C. gloeosporioides s.l là một phức hợp loài gồm 23 loài (hình 2.3). Tất cả

các loài này đều tạo bào tử phân sinh hình trụ thẳng, hai đầu tù, kích thước rất

dao động. Đặc điểm hình thái tản cũng như đĩa áp cũng rất đa dạng và thay đổi.

Có 4 loài tạo quả thể giả trên môi trường PDA là C. alienum, C. fructicola,

C. queenslandicum và C. salsolae. Nhìn chung, các mẫu nấm C. gloeosporioides

được công bố trên thế giới nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự ITS đều

được sử dụng theo nghĩa rộng (Weir et al., 2012).

Hình 2.3. Phức hợp loài C. gloeosporioides s.l gồm 23 loài

Nguồn: Weir et al. (2012)

C. gloeosporioides s.l là một trong các tác nhân gây bệnh cây phổ biến và phân bố rộng nhất trên thế giới. Nấm có phổ ký chủ rất rộng, hại ít nhất 470 chi thực vật khác nhau, phân bố khắp các vùng ôn đới, á nhiệt đới và đặc biệt vùng nhiệt đới. Nấm có thể gây bệnh trên cây ngoài đồng ruộng hoặc trong bảo quản. Nấm có thể tồn tại dưới dạng là tác nhân gây bệnh trực tiếp hoặc phổ biến nhất là thuộc nhóm cơ hội (có nghĩa nấm ở bên trong cây tồn tại dưới dạng tiềm sinh (ẩn)) và chỉ gây bệnh khi cây chuyển sang trạng thái sinh lý khác. Nấm cũng có thể tồn tại dưới dạng nội sinh không gây bệnh cho cây. Tính gây bệnh/ tính độc của nấm phụ thuộc nhiều điều kiện môi trường, chủng/ mẫu nấm và cây ký chủ (Bailey & Jeger, 1992; Hyde et al., 2009b; Weir et al., 2012; Kumar, 2014).

(2) Colletotrichum gloeosporioides s.s

Loài chuẩn của C. gloeosporioides s.s đã được đánh giá lại vào năm 2008 và có phổ ký chủ rất hẹp, chủ yếu gây hại trên cây có múi, một số isolate có thể nhiễm trên cây thuộc chi Ficus, Mangifera, Pueraria và Vitis (Cannon et al., 2008; Weir et al., 2012).

Theo Cannon et al. (2008), C. gloeosporioides s.s có đặc điểm hình thái như sau. Đặc điểm hình thái (trên môi trường PDA): Không hình thành hạch, không hình thành giai đoạn hữu tính. Đĩa cành chứa khối bào từ màu cam, gồm khối tế bào màu nâu đậm, từ đó mọc ra cành bào tử phân sinh và lông gai. Lông gai màu nâu ở phía cuống, nâu nhạt ở đỉnh, dài 40 - 120 µm, 1 - 5 vách ngăn. Cành bào tử phân sinh phân nhánh không đều, thường có màu đậm hơn ở phía cuống. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ với 2 đầu tù, hơi thắt lại ở giữa, phần phía gốc bào tử hơi bằng, kích thước 14,4 × 5,6 µm. Bào tử nảy mầm thường gần đỉnh với 1 - 2 ống mầm, từ đó hình thành bào tử thứ cấp hoặc đĩa áp. Đĩa áp mọc đơn, màu nâu, mép đều tới hơi chẻ thùy, hình cốc hơi thót về phía đỉnh, thường phình ra ở giữa, kích thước 7,2 - 8,6 × 4,7 - 6,0 µm. Tản nấm có sợi khí sinh mọc thành búi nhỏ, nhiều, màu xám xanh tới xanh xám, ở nhiệt độ tối ưu 25oC tản nấm phát triển với tốc độ 26,5 mm/ngày.

Đáng chú ý cho tới năm 2015 chưa thấy có công bố C. gloeosporioides s.s nhiễm trên cây ớt. Các đánh giá loại về hiện trạng nấm C. gloesosporioides s.s tại Thái Lan (Phoulivong et al., 2010), Ấn Độ (Sharma & Shenoy, 2013) cũng xác nhận nhận xét này.

(3) Colletotrichum siamense

C. siamense là loài nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Loài này

được mô tả lần đầu tiên vào năm 2009 bởi Prihattusi et al. với mẫu bệnh được thu thập từ cây cà phê tại Thái Lan (Prihastuti et al., 2009). Đến nay, C. siamense được

xem là loài nấm đa dạng về mặt địa lý khi chúng được ghi nhận xuất hiện ở hầu hết

các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Bên cạnh việc đa dạng về địa lý,

C. siamense còn có phạm vi ký chủ rộng khi xuất hiện và gây hại trên rất nhiều loại cây trồng như: cà phê, ca cao, bơ, điều, chè, ớt, dâu tây, hành, xoài, táo, quýt, hoa

nhài, hoa loa kèn đỏ … (Capobiango et al., 2016; Cheng et al., 2013; James et al.,

2014; Liu et al., 2015, 2017; Weir et al., 2012; Yang et al., 2009).

Hình 2.4. Đặc điểm hình thái của nấm C. siamense

loại môi trường. Đĩa cành có màu nâu đến nâu đậm. Bào tử phân sinh đơn bào, trong

suốt, dạng hình thoi, đầu hơi tròn, đôi khi bào tử có dạng hình ống, kích thước 7 -

Nguồn: Prihattusi et al. (2009) Theo Prihastuti et al. (2009), C. siamense có những đặc điểm hình thái như sau (hình 2.4): Trên môi trường PDA tản nấm lúc đầu có màu trắng, sau đó dần chuyển sang màu nâu nhạt đến phớt hồng, mặt dưới có màu vàng nhạt đến phớt hồng. Ở điều kiện nhiệt độ 28oC tốc độ phát triển của tản nấm đạt 6,58 - 11,5 mm/ ngày. Sợi nấm khí sinh màu trắng, mọc dày đặc. Hạch nấm xuất hiện trên một số

18,3 × 3 - 4,3 μm. Đĩa áp có hình bầu dục tới dạng chùy, màu nâu, kích thước 4,7 -

8,3 × 3,5 - 5 μm. Hình dạng của đĩa áp thường thay đổi theo thời gian quan sát.

(4) Colletotrichum fructicola

Giống như C. siamense, loài C. fructicola cũng được mô tả lần đầu tiên vào

năm 2009 bởi Prihattusi et al. với mẫu bệnh được thu thập từ cây cà phê tại Thái

Lan (Prihastuti et al., 2009). C. fructicola là loài nấm có phân bố địa lý và phạm

vi ký chủ rộng. Đến nay, loài này đã được ghi nhận xuất hiện ở tất cả các châu

lục gồm: Châu Mỹ, Tây và Đông Á, Tây Âu, Tây Phi và Úc. Phạm vi ký chủ của nấm cũng tương đối đa dạng gồm: cà phê, ca cao, chè, lê, táo, bơ, xoài, đu đủ,

cây có múi, chi Ficus, củ nâu, củ khởi, trám, ớt, dâu tây, đậu lima … (Diao et al.,

2017; Li et al., 2016; Lijuan et al., 2012; Paul et al., 2014; Prihastuti et al., 2009;

Saini et al., 2016; Sousa et al., 2018).

Hình 2.5. Đặc điểm hình thái của nấm C. fructicola

sau (hình 2.5): Trên môi trường PDA sợi nấm khí sinh màu xám nhạt, tản nấm

Nguồn: Prihattusi et al. (2009) Theo Prihastuti et al. (2009), C. fructicola có những đặc điểm hình thái như

bông xốp, lúc đầu màu trắng xám, sau đó phần trung tâm chuyển màu xám đậm, mặt dưới tản nấm có màu xám xanh lục ở trung tâm và màu trắng xám ở xung

quanh. Tốc độ phát triển của tản nấm đạt 10,58 - 11,5 mm/ ngày ở điều kiện nhiệt độ 28oC. Hạch nấm và lông gai không hình thành trên môi trường. Bào tử phân sinh hình thành từ sợi nấm, đơn bào, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tròn, đôi khi bào tử có dạng hình ống, kích thước 9,7 - 14 × 3 - 4,3 μm. Đĩa áp có dạng hình

trứng tới dạng chùy, màu nâu đến nâu đậm, kích thước 4,3 - 9,7 × 3,7 - 7,3 μm.

Hình dạng của đĩa áp thường thay đổi theo thời gian quan sát.

(5) Colletotrichum aeschynomenes

Loài chuẩn C. aeschynomenes đã được đánh giá lại vào năm 2012 dựa trên

mô tả của loài C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes”. Đáng chú ý đến nay

(2019) trên thế giới mới chỉ có công bố về loài này gây hại trên cây cỏ

Aeschynomene virginica tại Mỹ (Weir et al., 2012) và trên cây ca cao tại Brazil

(Nascimento et al., 2019).

Hình 2.6. Đặc điểm hình thái của nấm C. aeschynomenes

Theo Weir et al. (2012), C. aeschynomenes có những đặc điểm hình thái như sau (hình 2.6): Khi cấy đơn bào tử trên môi trường PDA sợi nấm khí sinh có

màu trắng, tản nấm bông xốp. Bào tử được hình thành trên dày đặc bề mặt tản

Nguồn: Weir et al. (2012)

nấm tạo thành màu vàng cam hoặc màu vàng cam đậm. Bào tử phân sinh hình trụ, thẳng và thon gọn ở hai đầu, kích thước trung bình 17,6 × 4,1 μm. Phần lớn

đĩa áp có hình elip đến hình thoi, chẻ thùy sâu

2.4.1.3. Colletotrichum acutatum

C. acutatum cũng có hiện trạng phân loại phức tạp và cũng được sử dụng

theo 2 nghĩa (Damm et al., 2012a) như sau:

(1) Colletotrichum acutatum s.l

C. acutatum s.l là một phức hợp 29 loài có quan hệ về mặt tiến hóa. Tất cả các loài trong phức hợp loài này đều có bảo tử phân sinh thót nhọn ở 2 đầu

(acute) (Damm et al., 2012a; Shivas & Yu, 2009).

(2) Colletotrichum acutatum s.s

C. acutatum s.s cũng là một loài đa thực, gây bệnh trên một số cây trồng

như: đu đủ, dâu tây, Pinus spp., Hakea spp. và Aspalathus linearis ... Theo

Damm et al. (2012a), đặc điểm hình thái chính của nấm (trên môi trường SNA):

Sợi nấm trong, có vách ngăn, phân nhánh, đường kính 1 - 1,5 µm. Hậu bào tử

không hình thành. Không hình thành đĩa cành và lông gai trên môi trường. Cành bào tử phân sinh hình thành trực tiếp trên sợi nấm, phần lớn đơn, đôi khi có vách

ngăn và phân nhánh, có thể dài tới 25 µm. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ

hoặc thoi, hai đầu thót nhọn (acute), kích thước 12,6 ± 1,8 × 3,9 ± 0,3 µm (kích

thước bào tử có thể thay đổi tùy isolate). Đĩa áp mọc đơn, màu nâu, mép bằng đoi

khi lượn sóng, hình tròn tới elips hoặc hình trứng ngược, kích thước 7,3 ± 2,0 ×

5,4 ± 1,2 µm. Tản nấm (trên môi trường OA) phẳng, mép bằng, màu xám tro tới

đỏ nâu, đĩa cành (ổ bào tử) màu xám oliu, tốc độ mọc (20 - 25 mm sau 7 ngày, 31

- 33 mm sau 10 ngày), có thể tạo sắc tố đỏ trong môi trường (hình 2.7, 2.8).

Hình 2.7. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (BRIP 52652)

Nguồn: Shivas & Yu (2009)

Hình 2.8. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (CBS 112996)

Nguồn: Damm et al. (2012a)

2.2.5. Xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt

Đến nay, vẫn chưa có một công bố nghiên cứu đặc điểm mô học của bệnh

thán thư trên ớt do nấm Colletotrichum gây ra.

Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum gây bệnh

cây liên quan đến một loạt các sự kiện bao gồm: (1) tiếp xúc bào tử trên bề mặt

cây, (2) gắn kết bào tử trên bề mặt cây, (3) nảy mầm bào tử, (4) hình thành đĩa

áp, (5) xâm nhập qua lớp cutin, (6) sinh trưởng - phát triển nấm trong mô, và sinh

sản hình thành đĩa cành và bảo tử. Nhìn chung quá trình gồm các sự kiện (1), (2), (3), (4) và (5) của tất cả các loài nấm Colletotrichum đều giống nhau và sự khác biệt chỉ xảy ra sau khi nấm đã xâm nhập xong qua lớp cutin (Wharton &

Diéguez-Uribeondo, 2004).

Nấm Colletotrichum gây bệnh cây thuộc nhóm bán sinh dưỡng có nghĩa có một pha sinh dưỡng ngắn, tiếp sau là pha hoại dưỡng (De Silva et al., 2017b;

Munch et al., 2008; O'Connell et al., 2012; Than et al., 2008a; Wharton & Diéguez-Uribeondo, 2004). Minh họa cho lối sống bán sinh dưỡng của các nấm

Colletotrichum được minh họa ở hình 2.9.

Chú thích: SP (spore = bào tử), AP (appres.sorium = đĩa áp), PH (biotrophic primary hyphae = sợi nấm sơ cấp), SH (necrotrophic secondary hyphae = sợi nấm thứ cấp) Hình 2.9. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum

thường phình to và có hình dạng khác nhau. Ở một số loài, nấm hình thành một

cấu trúc gọi là bóng xâm nhiễm thường hình cầu và từ bóng xâm nhiễm này hình

thành tiếp 1 - 2 sợi nấm sơ cấp. Một số loài nấm, việc hình thành sợi sơ cấp chỉ

xảy ra ở tế bào biểu bì bị nhiễm đầu tiên (hình 2.9b). Một số loài nấm khác có thể

tiếp tục xâm nhiễm sang các tế bào bên cạnh bằng sợi nấm sơ cấp (hình 2.9c).

Trạng thái hình thành các cấu trúc ở được gọi là pha sinh dưỡng của nấm, thường ngắn khoảng 24 giờ. Ở pha sinh dưỡng, tế bào ký chủ không chết (O'Connell et

al., 2012; Wharton & Diéguez-Uribeondo, 2004).

Tiếp theo pha sinh dưỡng là pha hoại dưỡng bắt đầu việc hình thành các sợi nấm thứ cấp rất mảnh từ sợi sơ cấp. Ở một số loài nấm, sợi nấm thứ cấp phân nhánh để xâm nhiễm tiếp các tế bào khác, kể cả tế bào biểu bì (hình 2.9b). Ở pha hoại dưỡng, nấm nhanh chóng giết chết tế bào bằng cách tiết ra các enzyme phân hủy. Thậm chí, do hoạt tính của enzyme, các tế bào lân cận có thể chết trước khi

nấm xâm nhiễm (De Silva et al., 2017b; O'Connell et al., 2012; Wharton &

Diéguez-Uribeondo, 2004).

Nguồn: O'Connell et al. (2012) Sau khi xâm nhập qua tầng cutin, nấm tiếp tục xâm nhập vào tế bào biểu bì. Trong tế bào biểu bì, đầu tiên, nấm hình thành một cấu trúc gọi là sợi nấm sơ cấp

Đáng chú ý, một số nấm như C. acutatum còn có một kiểu xâm nhiễm khác. Ở cách xâm nhiễm này, sau khi xâm nhập qua lớp cutin, nấm không xâm nhập

trực tiếp vào tế bào biểu bì mà hình thành sợi nấm mảnh giống như sợi nấm thứ

cấp ở phía dưới tầng cutin. Sợi nấm tiếp tục phát triển qua gian bào và cuối cùng

xâm nhập vào tiếp vào các tế bào ký chủ. Ngoại trừ 1 thời gian không biểu hiện triệu chứng ngắn ban đầu (cũng khoảng 24 giờ), nấm biểu hiện hành vi giống

như pha hoại dưỡng mô tả ở trên (Wharton & Diéguez-Uribeondo, 2004) (hình 2.10). Cần chú ý nấm C. acutatum cũng được chứng minh là thay đổi hình thức

xâm nhiễm theo cây/ giống của cây ký chủ.

Chú thích: N (necrotic = chết hoại), PH (primary hyphae = sợi nấm sơ cấp), SH (secondary hyphae = sợi nấm thứ cấp), ScH (subcutin hyphae = sợi nấm dưới tầng cutin), C (conidium = bào tử), A (appressorium = đĩa áp), Cu (cutin) Hình 2.10. Cách xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum bằng cách hình thành sợi nấm dưới biểu bì

Nguồn: Wharton & Diéguez-Uribeondo (2004)

2.2.6. Khả năng truyền qua hạt ớt của nấm Colletotrichum

Nấm Colletotrichum gây là tác nhân gây bệnh truyền qua hạt (Than et al., 2008a). Một nghiên cứu năm 2009 tại tỉnh Karnataka (Ấn Độ) cho thấy

C. capsici là loại nấm truyền qua hạt phổ biến nhất trên ớt với tỷ lệ hạt nhiễm tới 71,24% (Hemannavar et al., 2009). Tình trạng tương tự cũng được quan sát thấy

tại Nigeria với tỷ lệ nhiễm tới 54,8% (Chigoziri & Ekefan, 2013).

Cơ chế truyền qua hạt ớt của nấm Colletotrichum ít được nghiên cứu. Một nghiên cứu về cơ chế truyền qua hạt ớt của nấm C. capsici cho thấy nấm này

nhiễm vào cả bên trong hạt, thậm chí tới phôi và hình thành đĩa cành ở bên dưới

lớp vỏ hạt (hình 2.11) (Nik et al., 1988). Một nghiên cứu mô học đối với nấm

C. dematum cho thấy khi hạt ớt bị nhiễm bình thường thì nấm chỉ có mặt ở lớp vỏ hạt tới vỏ nội nhũ. Tuy nhiên khi hạt nhiễm nặng thì tất cả các bộ phận của hạt

đều bị nhiễm và sợi nấm cũng như đĩa cành đều có mặt ở mọi vị trí (Chitkara et

al., 1990).

Chú thích: Ap = Appressorium podimodium ở dưới lớp vỏ hạt, Sc = Seed cover Hình 2.11. Nấm C. capsici hình thành tiền đĩa cành

Nguồn: Nik et al. (1988)

2.2.7. Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh trên ớt

Nấm Colletotrichum spp. có thể qua đông trên các cây ký chủ khác nhau như cây họ cà hoặc các cây họ đậu, tàn dư thực vật và các quả bị bỏ lại trên trồng ruộng. Vi hạch của một số loài Colletotrichum spp. có thể tồn tại ở trạng thái ngủ nghỉ trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặp điều kiện không thuận lợi, thậm chí

có thể sống sót qua nhiều năm (Pring et al., 1995).

Các yếu tố môi trường đóng vai trò quan trọng trong phát triển bệnh thán thư. Nhìn chung, bệnh thán thư ớt phát triển thuận lợi ở điều kiện nhiệt độ ~ 27oC và độ ẩm cao (trung bình 80%) (Than et al., 2008a).

2.3. PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum TRÊN ỚT

2.3.1. Biện pháp canh tác

Theo Roberts (2001) ruộng trồng ớt đã nhiễm bệnh thán thư từ vụ trước

tránh trồng cây họ cà ít nhất là 2 năm. Thực hành vệ sinh đồng ruộng bao gồm kiểm soát cỏ dại và các cây ớt dại. Lựa chọn các giống ớt chín nhanh để tránh sự

xâm nhiễm bởi các loài nấm. Hạn chế vết thương tổn trên quả do côn trùng hoặc

các loài khác để giảm nguy cơ lây nhiễm của các loài nấm Colletotrichum spp. và

các vi khuẩn gây thối rữa khác. Đến cuối vụ các tàn dư cây trồng bị nhiễm bệnh

trên đồng ruộng cần mang khỏi đồng ruộng bị chôn vùi kết hợp với bón cân đối

Đạm - Lân - Kali và bổ sung các chất hỗ trợ.

2.3.2. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh

Sử dụng giống kháng là biện pháp hiệu quả nhất nhằm phòng chống bệnh

cây. Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về tính kháng nấm Colletotrichum trên ớt

nhưng cho tới nay (2019) vẫn chưa có một giống ớt kháng bệnh thán thư nào

được đưa ra thị trường. Lý do chủ yếu là do có nhiều loài/ kiểu gây bệnh của nấm

Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt và chúng có mối quan hệ không giống

nhau đối với cây ớt.

Các nghiên cứu đầu tiên đã đưa ra các kết quả khác nhau về tính kháng nấm

Colletotrichum trên ớt. Cheema et al. (1984) phát hiện rằng tính kháng đối với

C. capsici là tính kháng gen lặn. Park et al. (1990) công bố tính kháng

C. dematium là trội không hoàn toàn. Ahmed et al. (1991) báo cáo tính kháng đối

với C. capsici là tính kháng đa gen, trong khi theo Qing-Lin et al. (2002), tính

kháng đối với C. capsici là đơn gen trội.

Các nghiên cứu đánh giá tính kháng nấm Colletotrichum cho tới nay đã

khẳng định gen kháng nấm này không có ở các dòng ớt thuộc loài C. annuum mà

chỉ có ở C. baccatum và C. chinense (Mongkolporn, 2019).

Các nghiên cứu đã phát hiện nhiều dòng ớt vật liệu khởi đầu mang các gen kháng khác nhau đối với nấm Colletotrichum. Dòng PRI95030 (C. chinense) biểu hiện tính kháng cao đối với C. gloeosporioides và C. capsici là tính kháng QTL (Voorrips et al., 2004). Dòng PB80 (C. baccatum) chứa 2 gen kháng, co4 và co5, kháng được cả 2 loài C. capsici và C. acutatum (Mahasuk et al., 2009b).

Dòng PBC932 (C. chinense) chứa 3 gen kháng lặn, co1, co1 và co3, qui định tính kháng cao đối với C. capsici. Đáng chú ý, các gen kháng này điều khiển tính

kháng ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau, lần lượt là quả xanh, quả chín đỏ

và cây con (Mahasuk et al., 2009a).

Đáng chú ý, dòng IPB C15 (C. annuum) chứa một tỷ lệ cao gen kháng lặn

kháng được loài C. acutatum (Syukur et al., 2013). Gần đây, kết quả đánh giá tính chống chịu bệnh đồng ruộng trên 20 giống ớt C. annuum của AVRDC và

Indonesia đã xác định được 5 giống AVPP1102-B, AVPP0513, AVPP0719,

AVPP0207, AVPP1004-B có khả năng chống chịu bệnh thán thư và cho năng

suất cao. Giống AVPP0207 ngoài khả năng chống chịu bệnh thán thư còn có sức

đề kháng cao với các geminivirus, tuy nhiên quả của giống này không được thị

trường ưa chuộng (Hasyim et al., 2014).

2.3.3. Biện pháp hóa học

Do không có giống ớt kháng bệnh thán thư nên cho tới nay, biện pháp

phòng chống chủ yếu vẫn là dùng thuốc hóa học.

Các loài nấm Colletotrichum khác nhau có có phản ứng khác đối với thuốc. Ví

dụ loài C. acutatum ít mẫn cảm với các thuốc trừ nấm nhóm benzimidazole, trong

khi loài C. gloeosporioides mẫn cảm cao với hoạt chất này (Kim et al., 2007). Vì

vậy, việc xác định đúng loài nấm sẽ giúp cho việc quản lý bệnh hiệu quả hơn.

Thuốc trừ nấm truyền thống được khuyến cáo để quản lý bệnh thán thư

trên ớt là Manganese ethylenebisdithiocarbamate (Maneb), mặc dù nó không

thích hợp với phòng chống vào giai đoạn bệnh thán thư gây hại nặng trên ớt.

Các

thuốc

trừ nấm azoxystrobin (Quadris),

trifloxystrobin (Flint), và

pyraclostrobin (Cabrio) gần đây đã được đưa ra để phòng trừ bệnh thán thư ớt,

các loại thuốc này có hiệu quả chống bệnh thán thư ngay cả khi bệnh thán thư

đã gây hại nặng (Than et al., 2008a).

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, Propiconazole, Carbendazim và

Difenoconazole là các hoạt chất có hiệu lực cao đối với loài nấm C. capsici gây bệnh thán thư trên cây ớt. Trong 3 loại hoạt chất trên Propiconazole được xem là có hiệu quả nhất trong ức chế sự phát triển tản nấm trong phòng thí nghiệm và giảm tỷ lệ gây hại của C. capsici gây bệnh thán thư trên đồng ruộng (Gopinath et

al., 2006; Naik et al., 2008; Ranasingh et al., 2010; Yadav et al., 2014).

Một số loại thuốc hóa học được kết hợp các hoạt chất cũng có hiệu lực cao

trong phòng trừ bệnh thán thư. Các loại thuốc UPF-509 75WG (Azoxystrobin 8,3% + Mancozeb 66,7%) ở liều lượng 1.800g/ ha; Orion 72WP và Ridomil Gold

68WP (Mancozeb + Metalaxyl) ở nồng độ 0,2% có tác dụng tốt trong việc khống chế bệnh thán thư, nâng cao năng suất rõ rệt cho cây ớt tại Bangladesh và Ấn Độ.

Đặc biệt UPF-509 75% WG được xem là rất an toàn cho cây ớt khi không gây

ngộ độc cho cây khi sử dụng ở liều lượng 3.000 g/ha (Ajithkumar et al., 2014;

Muthukumar et al., 2016; Naznin et al., 2014).

Sử dụng thuốc liên tục, không đúng cách có thể dẫn tới tính kháng thuốc

của Colletotrichum (Staub, 1991). Chẳng hạn sử dụng liên tục benomyl,

carbendazim và thiram đã dẫn tới tính kháng 3 loại thuốc này của C. capsici

(Khilare et al., 2010). Tương tự, việc dùng thuốc nhóm benzamidazole (benomyl, thiabendazole, carbendazim) liên tục có thể làm tăng khả năng kháng thuốc của

nấm C. gloeosporioides do làm tăng áp lực chọn lọc lên các đột biến điểm của

gen beta-tubulin - vị trí tác động của thuốc (Chung et al., 2010).

Bệnh thán thư hại ớt có thể được kiểm soát trong điều kiện thời tiết bình

thường với một chương trình phun hợp lý. Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất

không kiểm soát, đặc biệt là ở các nước đang phát triển đã gây ra các tác động

tiêu cực đến chất lượng sản phẩm, sức khỏe con người và ô nhiễm đối với môi

trường (Voorrips et al., 2004).

2.3.4. Biện pháp sinh học

Việc phòng trừ bệnh thán thư gây thối quả ớt dựa vào hóa chất trong nhiều

năm đã dẫn đến nhiều vấn đề không mong muốn. Đã có nhiều nghiên cứu nhằm

phòng chống bệnh thán thư bằng dịch chiết thực vật và vi sinh vật đối kháng.

Dịch chiết xuất từ thân, rễ, lá, cành của cây thủy xương bồ (Acorus calamus

L.), sả hoa hồng (Cymbopogon martinii), từ lá của cây hương nhu tía (Ocinum

sanctum), cây Neem (Azadirachia indica) có thể hạn chế sự phát triển của nấm

gây bệnh thán thư (Jeyalakshmi et al., 1998; Korpraditskul et al., 1999). Đặc

biệt, dịch chiết của cây thủy xương bồ đã cho thấy rất hiệu quả khi phun 2 lần

trên cây ở giai đoạn ra hoa (Charigkapakorn, 2000).

Chiết xuất lá từ cây Polygala elata và Datura metel chứa các hợp chất Alkanoid, Steroids và Tannins có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm C. capsici. Trong điều kiện phòng thí nghiệm dịch chiết của các loại lá có hiệu lực ức chế 68,5 - 72,7% đến sự sinh trưởng của tản nấm trên môi trường PDA và

68,4 - 76,4% bào tử nảy mầm (Rajamanickam et al., 2012).

Dịch chiết từ tỏi (Allium sativum), cây cẩm quỳ (Malva sp.) và củ gừng

(Zingiber officinale) có tác dụng làm giảm tới 97% mức độ gây hại của bệnh thán thư do nấm C. accutatum gây hại trên giống ớt chuông tại Brazil (Alves et al.,

2015). Hỗn hợp dịch chiết neem (Azadirachta indica) + gỗ gụ (Swietenia mahagoni)

+ tỏi (Allium sativum) có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn bệnh thán thư trên cây ớt

khi phun chúng ở giai đoạn bệnh mới xuất hiện (Rashid et al., 2015).

Sản phẩm chiết bằng acetonee từ 3 loài địa y, Evernia prunastri,

Hypogymnia physodes và Cladoniaportentosa đã chứng tỏ có hoạt tính đối kháng

đối với 8 loài nấm và vi sinh vật giống nấm gây bệnh cây gồm Pythium ultimum,

Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium solani, Stagonospora nodorum và Ustilago maydis. Đặc

biệt, sản phẩm chiết từ E. prunastriand và H. physodes đã ức chế hoàn toàn hoặc ức chế mạnh sinh trưởng của P. ultimum, U. maydis và P. infestans. Các sản phẩm

chuyển hóa thứ cấp, đặc biệt là các lichenic acid như evernic acid và (−) usnic acid

là tác nhân chính có hoạt tính kháng nấm (Halama & Van Haluwin, 2004).

Sản phẩm chiết bằng các dung môi gồm ethyl acetate, acetonee và methanol

từ 10 loài địa y gồm Flavoparmelia caperata, Parmotrema austrosinensis,

Roccella montagnei, Teloschistes flavicans, Physcia aipolia, Parmotrema grayanum, Parmotrema tinctorum, Parmotrema reticulatum, Usnea sp. và Sticta

sp. đã được đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm Fusarium oxysporum f.sp.

capsici gây bệnh héo Fusarium cây ớt. Trong số 10 loài này, ngoại trừ Sticta sp.

và Parmotrema reticulatum, cả 8 loài còn lại đều có chứa các hợp chất ức chế

nấm F. oxysporum ở các mức độ khác nhau (Shivanna & Garampalli, 2014).

Các nhà khoa học Ấn Độ đã chứng tỏ dịch chiết từ 3 loài địa y Parmotrema tinctorum , Pa. grayanum và Pa. praesorediosum có thể ức chế nấm C. capsici

gây bệnh thán thư ớt với hiệu lực > 50% (Kekuda et al., 2014).

Jeger & Jeffries (1988) cho rằng sử dụng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể ngăn chặn bệnh thán thư trên quả ớt ở giai đoạn sau thu hoạch. Xử lý vi khuẩn đối kháng P. fluorescens có thể khởi động các gen phòng thủ của cấy ớt chống sự gây bệnh của C. capsici (Ramamoorthy & Samiyappan, 2001). Itanoo & Chamswarng (2007) đã tìm thấy các chủng vi khuẩn đối kháng P. fluorescens (DGg13 và BB133) có khả năng kiểm soát nấm C. capsici, đây là

tác nhân gây bệnh thán thư lớn ở Thái Lan.

Nấm đối kháng Tricoderma cũng được biết có khả năng cạnh tranh diện

tích bề mặt dẫn tới làm giảm sự xâm nhập của nấm Colletotrichum (Jeffries et al., 1992). Chủng Pm9 của nấm T. harzianum có thể ức chế tốt bệnh thán thư trên

ớt do nấm C. gloeosporioides (Boonratkwang et al., 2007).

2.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH THÁN THƯ HẠI ỚT TẠI VIỆT NAM

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây hại nặng trên hầu hết các vùng

trồng ớt ở nước ta, là nguyên nhân gây thối quả hàng loạt trên cây ớt. Tại các

vùng chuyên canh ớt khi nhiệt độ và ẩm độ lên cao bệnh này lây lan nhanh chóng

làm giảm đáng kể năng suất quả. Bệnh còn gây hại vào giai đoạn sau thu hoạch trong quá trình bảo quản và vận chuyển. Ở những ruộng bón đạm nhiều, mật độ

trồng cao bệnh nặng. Tuy là một bệnh nguy hiểm song những nghiên cứu về

bệnh thán thư ở nước ta còn chưa nhiều.

Theo Ngô Bích Hảo (1991, 1992, 1993), nguyên nhân gây bệnh thối quả ớt

là do 2 loài nấm thán thư C. nigrum và C. capsici. Hai loài nấm trên thường song

song phá hại làm quả ớt bị thối nhanh chóng. Đĩa cành của nấm C. nigrum đường

kính từ 120 - 280 µm có nhiều lông gai đen nhọn ở đỉnh, kích thước 55 - 190 ×

6,5 - 65 µm bào tử phân sinh hình bầu dục hoặc hình trụ hai đầu tròn, không

màu, đơn bào, kích thước 18 - 25 × 3 µm. Cành bào từ phân sinh ngắn hình gậy

kích thước 20 - 50 × 25 µm. Ở loài nấm Colletotrichum capsici, đĩa cành có

đường kính 70 - 100 µm có lông gai mầu nâu sẫm, đỉnh có màu hơi nhạt có nhiều

ngăn ngang và dài tới 150 µm. Bào tử phân sinh không màu, đơn bào, hơi cong

hình lưỡi liềm, kích thước 17 - 28 × 3 - 4 µm có giọt dầu bên trong.

Bệnh thán thư thường xuất hiện và gây hại nặng vào giai đoạn đang thu hoạch quả, nhiệt độ trung bình là 28 - 30oC, độ ẩm 85 - 90%, mưa nhiều. Bệnh hại nặng vào tháng 4, 5, 6 (TLB 80% - Huế), tháng 6, 7, 8 (TLB 20% - Hà Nội). Vào thời điểm nhiệt độ 20oC bào tử nấm nảy mầm với tốc độ nhanh. Khả năng nhiễm bệnh của C. nigrum trên giống Chìa vôi Huế là rất mạnh. Các Isolate nấm ở các vùng sinh thái khác nhau có khả năng nhiễm bệnh khác nhau. Sự phân bố và mức độ gây hại của hai loài nấm C. nigrum và C. capsici có sự khác nhau. Ở vùng trồng ớt tỉnh Thừa Thiên Huế và Hà Nội, loài C. nigrum là phổ biến, ngược lại ở Hải Dương, Hưng Yên, Hà Bắc loài C. capsici phổ biến hơn. Tuy nhiên cả hai loài cùng phá hại mạnh vào cuối giai đoạn sinh trưởng của ớt ở khắp các

vùng trồng. Cây ớt đặc biệt mẫn cảm với bệnh giai đoạn quả già và chín. Quả

càng già tỷ lệ nhiễm bệnh càng cao. Ở quả xanh tỷ lệ nhiễm bệnh 8,64%, quả

ương 23,9% và quả chín là 44,47%. Hai loài nấm phát triển tốt, khả năng hình

thành bào tử lớn nhất trên môi trường ớt bán tổng hợp so với hai loại môi trường kia là môi trường Mactin và môi trường khoai tây. Ở mức nhiệt độ 30 - 35oC bào tử nảy mầm với tỷ lệ cao nhất với cả hai loài nấm. Tuy nhiên ở mức nhiệt độ 18 - 20oC sau 48 giờ trên 50% số bào tử đã nảy mầm, đây chính là thời điểm cần phòng trừ để ngăn chặn khả năng xâm nhiễm và truyền lan của bệnh trên đồng ruộng. Bệnh gây hại nặng vào thời kỳ mưa nhiều và nhiệt độ cao nên biện pháp

phòng trừ bằng thuốc hoá học ít có hiệu quả, cần áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp đối với bệnh này. Theo tác giả, nấm C. nigrum và C. capsici gây bệnh

thán thư ớt có khả năng tồn tại trên hạt giống sau 16 tháng bảo quản. Xử lý hạt giống bằng KMnO4 hoặc nước nóng 52oC có thể hạn chế được bệnh và làm tăng sức sống của cây con.

Theo Trần Tú Ngà & cs. (1993), bệnh thán thư hại ớt là một loại bệnh nguy

hiểm và khó phòng trừ, do đó hướng chọn tạo giống ớt chống chịu bệnh là một

yêu cầu cấp bách hiện nay. Nghiên cứu này được triển khai từ đầu năm 1990. 73

giống được thu thập từ những giống gieo trồng trong sản xuất và cả những giống

dại. Sau khi khảo sát, các tác giả đã chọn được giống Chìa vôi là giống đang sử

dụng rộng rãi trong sản xuất ở các tỉnh miền Trung có năng suất cao, phẩm chất

ngon; các giống Chỉ thiên Huế nhỏ (dạng hoang dại) của Việt Nam và Ấn Độ có

khả năng chống chịu tốt các loại bệnh, trong đó có bệnh thán thư. Tiến hành xử lý trên hạt giống Chìa vôi Huế các tác nhân đột biến hoá học Natriazit (NaN3) và vật lý tia γ, kết quả đã thu được một số cá thể đột biến từ giống này không bị lây

nhiễm bệnh trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo (trong khi giống gốc bị lây nhiễm

nặng). Kết quả khảo sát bước đầu cho thấy giống CP-4 nhiễm nhẹ, giống Chìa

vôi nhiễm nặng ở mọi thời kỳ kiểm tra.

Theo Trần Nguyễn Hà & cs. (2005), Colletotrichum là một trong nhiều chi

gây bệnh thán thư. Bệnh đặc trưng bởi các vết lõm màu nâu đen ở các bộ phận trên mặt đất. Colletotrichum tạo ra bào tử phân sinh đơn bào đứng trong đĩa cành.

Khối bào tử màu hồng hay màu da cam và đĩa cành đôi khi nhầm lẫn với ổ bào tử của Fusarium. Đĩa cành thường có lông gai màu sẫm rõ rệt hoặc có các sợi nằm

rải rác trong đĩa cành.

Theo Trần Thanh Tùng (2002), bệnh thán thư do Colletotrichum spp. gây

nên cần có biện pháp phòng trừ tổng hợp. Trồng giống chống chịu như F1-20, H28, SG 1.2 với mật độ khoảng 30.000 cây/ha và bón phân 200 kg N, 150kg K2O/ ha. Bệnh sẽ giảm nếu mặt ruộng được che phủ nilon và loại bỏ những quả bị

bệnh ra khỏi ruộng. Phun các sản phẩm sinh học như Agrostim, EM và thuốc trừ

nấm như Score -1,5/ 1.000, Metalaxyl -3/ 1.000 cho ruộng bị bệnh tấn công.

Theo Trần Thị Thu Thủy & cs. (2010), axit salicylic có khả năng giúp hạn

chế bệnh thán thư trên cây ớt thông qua việc làm giảm sự mọc mầm của bào tử nấm gây bệnh, ức chế sự hình thành đĩa cành, kích thước đĩa cành, cho phản ứng

tế bào thể hiện sớm và gia tăng sự tích tụ polyphenol và callose.

Kết quả phân lập 341 mẫu vi khuẩn thu trên ruộng ớt tại Cần Thơ, Đồng

Tháp và Tiền Giang đã xác định được 6 dòng vi khuẩn CT6, CT10, CT15, CT17, CT21 (thuộc chi Bacillus) có khả năng đối kháng cao với nấm Colletotrichum sp.

gây bệnh thán thư ớt. Trong 6 dòng vi khuẩn trên, dòng CT10 được định danh là

loài Bacillus amyloliquefaciens có khả năng đối kháng cao nhất. Hiệu lực ức chế

với nấm Colletotrichum sp. trong điều kiện in vitro đạt 53,8% (Nguyễn Thị Liên

& cs., 2016).

Trần Ngọc Hùng & Nguyễn Thị Liên Thương (2016) đã thu thập 16 chủng

Trichoderma tại Bình Dương và xác định được 3 chủng T2.2, T4, T5.1 (cùng là

loài Trichoderma koningii) có hiệu lực ức chế cao với nấm Colletotrichum spp.

gây bệnh thán thư ớt. Trong điều kiện in vitro, hiệu lực đối kháng của 3 chủng

Trichoderma với 5 mẫu nấm Colletotrichum thu thập trên cây ớt đạt 60,1 - 100%.

Kết quả thử nghiệm trên ruộng sản xuất cho thấy, các chủng Trichoderma này đã

làm giảm 54,8% tỷ lệ cây ớt bị bệnh thán thư.

Chế phẩm oligochitosan - nano silica có khả năng ức chế khả năng sinh

trưởng của nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây ớt. Hiệu lực ức

chế sự phát triển của tản nấm trên môi trường PDA ở các nồng độ 60 và 80 ppm

đạt lần lượt là 60,4% và 67,2% (Phạm Đình Dũng & cs., 2017).

Tóm lại: Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây là đối tượng có ý nghĩa kinh tế quan trọng nhất trên cây ớt ở tất cả các nước. Đến thời điểm hiện tại trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu chi tiết về thành phần loài, tính gây bệnh

và biện pháp phòng trừ cụ thể cho từng loài nấm. Tuy nhiên, đến nay ở nước ta chưa có những nghiên cứu mang tính hệ thống về các lĩnh vực trên đối với bệnh thán thư hại ớt. Chính vì vậy, việc triển khai nghiên cứu các vấn đề trên là hết

sức cần thiết.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 3.1.1.1. Mẫu bệnh thán thư và giống ớt sử dụng trong nghiên cứu

- Giống ớt: Demon, Lai 20, Chìa vôi và Sussan’ Joy.

+ Giống ớt Demon: là giống ớt hiểm lai F1 của Công ty TNHH East-West

Seed. Giống có thời gian thu hoạch dài, dạng quả chỉ thiên, quả thẳng, chiều dài quả 5 - 7 cm màu chín đỏ đẹp. Đây là một trong những giống đang được trồng

phổ biến tại khu vực ĐBSH.

+ Giống ớt Lai 20: là giống ớt cay lai F1 của Công ty cổ phần giống cây

trồng miền nam. Giống có dạng quả chỉ địa, quả to, thẳng, chiều dài quả đạt 15 - 16 cm, thịt quả dày, cay vừa. Đây là một trong những giống đang được trồng phổ

biến tại khu vực ĐBSH.

+ Giống ớt Chìa vôi: là giống ớt địa phương có nguồn gốc tại các tỉnh miền

Trung. Giống có dạng quả chỉ địa, quả to, thẳng, chiều dài quả đạt 12 - 15 cm.

Đây là một trong những giống được trồng phổ biến lại các tỉnh Quảng Bình,

Quảng Trị, Thừa Thiên Huế.

+ Giống ớt Sussan’ Joy: là giống ớt lai của Trung tâm Rau thế giới (AVRDC). Giống có đặc điểm là ra hoa sớm (sau trồng 62 ngày), dạng quả chỉ

địa, quả to, chiều dài quả trung bình 15,3 cm. Giống ớt này hiện được sử dụng

như là giống chỉ thị trong các nghiên cứu của AVRDC.

- Mẫu bệnh: 52 mẫu quả ớt bị bệnh thán thư được thu thập tại 9 tỉnh thuộc

ĐBSH và một số tỉnh khác như Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La và Tiền Giang.

Thông tin chi tiết về thời gian, địa điểm, giống ớt của các mẫu thu thập được

trình bày tại phụ lục 1.

3.1.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

- Thiết bị nghiên cứu: máy PCR, kính hiển vi, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ

định ôn, nồi hấp khử trùng, buồng nuôi cấy vi sinh, v.v...

- Dụng cụ nghiên cứu: Pipet tự động 1 đầu côn, buồng đếm hồng cầu, đĩa

petri, ống nghiệm, que cấy nấm, lamen, lam kính, giấy thấm, đèn cồn v.v...

- Hoá chất nghiên cứu:

+ Các hoá chất thông dụng và hoá chất dùng trong kỹ thuật PCR.

+ Thuốc bảo vệ thực vật: Score 250EC (difenoconazole 250g/l), Tiptop 250EC (propiconazole 25% w/v), Antracol 70WP (propineb 700g/kg), Azony

25SC (azoxystrobin 250g/l).

+ Vi khuẩn đối kháng Bacillus spp: Sáu nguồn vi khuẩn Bacillus do Trung

tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp gồm: A15, TL4, N2, MSV4, HT1 và HT7. Đây là các mẫu vi khuẩn được thu

thập trong các mẫu đất tại một số tỉnh phía Bắc. Hai mẫu HT1 và N2 đã được

giải trình tự và xác định danh tính là B. velezensis.

+ Dịch chiết địa y: Các loài địa y và sản phẩm chiết địa y do bộ môn Hóa

(Học viện Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp. Ba loài địa y được sử dụng gồm

Parmotrema tinctorum, Usnea sp. và Parmotrema sancti - angelii. Ba dung môi

được sử dụng để chiết các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp gồm methanol, acetonee và hexan. Sản phẩm chuyển hóa thức cấp sử dụng trong thí nghiệm đã được tách

chiết dung môi chuyển hóa. Các ký hiệu sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được chiết

từ 3 dung môi bao gồm:

PT-methanol (Parmotrema tinctorum, chiết bằng methanol)

PT-acetonee (Parmotrema tinctorum, chiết bằng acetonee)

PT-hexan (Parmotrema tinctorum, chiết bằng hexan)

US-methanol (Usnea sp., chiết bằng methanol)

US-acetonee (Usnea sp., chiết bằng acetonee)

US-hexan (Usnea sp., chiết bằng hexan)

PS-acetonee (Parmotrema sancti – angelii, chiết bằng acetonee)

- Môi trường nuôi cấy: PDA, PCA, WA

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.2.1. Địa điểm nghiên cứu

- Điều tra mức độ phổ biến, mức độ gây hại và thu thập mẫu bệnh thán thư được thực hiện tại 9 tỉnh thuộc ĐBSH và một số tỉnh khác là Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La và Tiền Giang.

- Các nghiên cứu liên quan đặc điểm sinh học, tính gây bệnh và mức độ đa

dạng phân tử được thực hiện tại:

+ Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

+ Bộ môn Kiểm nghiệm chất lượng rau quả, Viện Nghiên cứu Rau quả.

3.1.2.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ năm 2015 đến năm 2019.

3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1. Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt

- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại ĐBSH.

- Điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt tại ĐBSH và một số tỉnh.

- Thu thập và phân lập các mẫu nấm Colletotrichum từ bệnh thán thư 9 tỉnh

thuộc ĐBSH và một số địa điểm khác.

- Xác định đặc điểm hình thái các mẫu nấm thu thập được.

3.2.2. Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh

- Định danh nấm (mức loài) dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện

thuộc các nhóm hình thái xác định được.

+ Định danh các loài Colletotrichum bằng giải trình tự vùng ITS.

+ Định danh các loài Colletotrichum bằng vùng liên gen ApMat.

- Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum xác

định được.

+ Thiết kế mồi đặc hiệu chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum chính

được phát hiện.

+ Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho các mồi thiết kế.

+ Tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đoán nhanh các loài

Colletotrichum.

+ Xác định thành phần loài, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum

gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh bằng PCR.

3.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ,

pH) đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum xác định được.

- Xác định tính gây bệnh của các mẫu nấm đại diện cho mỗi loài trên cây ớt.

- Xác định tính gây bệnh của các mẫu nấm đại diện cho mỗi loài trên quả của

một số cây trồng được biết hay bị nhiễm bệnh thán thư (xoài, chuối tây, chuối tiêu).

- Xác định khả năng tồn tại của bào tử một số mẫu nấm đại diện trên lá ớt.

3.2.4. Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được trong điều kiện in vitro

- Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm và ức chế nảy mầm bào tử

của một số loại thuốc hóa học trên các loài Colletotrichum xác định được.

- Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi khuẩn đối

kháng Bacillus spp trên các loài Colletotrichum xác định được.

- Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số dịch chiết địa y

trên một số loài Colletotrichum chính phát hiện được.

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh thán thư 3.3.1.1. Phương pháp điều tra mức độ phổ biến, thực trạng gây hại của bệnh thư ớt

Phương pháp điều tra mức độ phổ biến và thực trạng của bệnh thán thư

hại ớt thực hiện theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38:

2010/BNNPTNT về Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng (Bộ

Nông nghiệp và PTNT, 2010).

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh: Tiến hành điều tra trên các vùng

trồng ớt chính của 9 tỉnh thuộc ĐBSH bao gồm: Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên,

Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Hà Nam và Ninh Bình. Trên mỗi

vùng, điều tra tối thiểu 30 ruộng đại diện. Ruộng được chọn điều tra phải có diện tích từ 300 m2 trở lên. Điều tra một lần duy nhất vào thời kỳ thu hoạch quả lứa 1 và xác định số ruộng nhiễm bệnh để tính tần suất bắt gặp (A%):

Số ruộng bị bệnh

A (%) =

× 100

Tổng số ruộng điều tra

Mức độ phổ biến của bệnh được lượng hóa theo tần suất bắt gặp:

ít phổ biến (A < 10%)

++:

phổ biến (A = 10 đến 25%)

+++: rất phổ biến (A > 25%)

Điều tra tình hình bệnh thán thư: Tiến hành điều tra trên ruộng ớt trồng

sẵn tại vùng các vùng trồng ớt chính thuộc ĐBSH. Điều tra cố định theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 3 cây. Đánh giá mức độ hại của bệnh

thông qua TLB, và CBTB (cấp bệnh trung bình) trên quả bị hại. Thang phân cấp bệnh sử dụng để tính CBTB là thang 9 cấp theo Quy chuẩn quốc gia QCVN 01-

160:2014/ BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2014):

Cấp 0: cây không bị bệnh

Cấp 1: < 5% diện tích quả bị bệnh

Cấp 3: > 5 - 15% diện tích quả bị bệnh

Cấp 5: > 15 - 25% diện tích quả bị bệnh

Cấp 7: > 25 - 50% diện tích quả bị bệnh

Cấp 9: > 50% diện tích quả bị bệnh

3.3.1.2. Phương pháp thu thập, phân lập và bảo quản nguồn nấm

- Phương pháp thu thập mẫu: Mẫu quả nhiễm bệnh được thu thập trên

những cây ớt có triệu chứng bệnh thán thư điển hình tại các điểm điều tra. Quấn

bông hoặc giấy ẩm vào cuống quả và cho vào túi nilon. Mô tả triệu chứng bệnh,

ghi rõ địa điểm, thời gian, đánh dấu ký hiệu túi đựng mẫu. Sau khi đưa mẫu về

phòng thí nghiệm tiến hành chụp ảnh mẫu bệnh, sau đó cho mẫu bệnh vào các hộp

nhựa hoặc đĩa petri có lót giấy thấm, đậy nắp cẩn thận và bảo quản trong tủ lạnh.

- Phương pháp phân lập: nấm Colletotrichum được phân lập theo qui trình

của Cai et al. (2009).

+ Chọn những mẫu bệnh còn tươi mới, có triệu chứng điển hình đem về

phòng thí nghiệm.

+ Dùng que cấy vô trùng lấy bào tử từ vết bệnh, hòa vào nước cất vô trùng

và cấy ria 3 chiều trên môi trường WA bổ sung 100ppm Streptomycin và ủ ở 25 - 28oC qua đêm. Ngày hôm sau cấy chuyển nấm sang đĩa môi trường PDA cho các nghiên cứu tiếp theo.

- Phương pháp bảo quản mẫu nấm: nuôi cấy các mẫu nấm Colletotrichum thuần trên môi trường PCA cho đến khi sinh bào tử và tiến hành bảo quản theo 2 phương pháp:

+ Bảo quản trong nước cất: dùng que cấy khêu bào tử nấm trên môi trường PCA cho vào các tuýp Eppendorf chứa 1 ml nước cất vô trùng, lắc nhẹ để bào tử tan đều trong nước sau đó đậy nắp và bảo quản ở 4oC. Mọi thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng (Abd-Elsalam et al., 2010).

+ Bảo quản trong glyceron: hòa tan glyceron và nước cất vô trùng theo tỷ lệ

3:1. Lấy 3 ml dung dịch hỗn hợp cho vào các trong các tuýp Eppendorf đã được vô trùng. Dùng que cấy khêu bào tử nấm trên môi trường PCA cho vào tuýp Eppendorf, đậy lắp, lắc nhẹ để bào tử tan đều sau đó bảo quản ở 4oC. Mọi thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng (Abd-Elsalam et al., 2010).

3.3.2. Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt 3.3.2.1. Phương pháp chiết DNA mẫu nấm

Sử dụng 2 phương pháp chiết DNA mẫu nấm theo qui trình đã được công bố.

- Phương pháp 1 (CTAB): sử dụng đệm CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) theo qui trình của Doyle & Doyle (1987). Khoảng 50 mg tản nấm thuần nuôi cấy trên môi trường PDA được nghiền bằng chày nhựa chuyên dụng (Kontes™ Pellet Pestle) với 0,5 mL đệm CTAB trong ống Eppendorf loại 1,5 ml. DNA được chiết một lần với Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Cặn DNA được rửa hai lần bằng ethanol 70% và hòa trong 30 µl nước cất 2 lần vô trùng. Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC.

- Phương pháp 2 (NaOH): là phương pháp chiết nhanh bằng NaOH được biến đổi theo phương pháp của Wang et al. (1993). Tản nấm thuần (khoảng 50 mg) trên môi trường PDA được cho vào ống Eppendorf 1,5 ml chứa 50 µl NaOH 0,5 M và được nghiền bằng đầu tip loại 100 - 200 µL. Dịch nghiền, 5µl, được chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml chứa 50 µl đệm Tris 0,1M, pH 8. Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC.

3.3.2.2. Phản ứng PCR

Hai phản ứng PCR xác định thành phần loài được thực hiện bởi các cặp mồi được trình bày tại bảng 3.1. Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 25,0 μl chứa 11,0 µl nước siêu sạch (Invitrogen), 13,5 µl GoTaq Green Master Mix (Promega), 0,5 µl DNA (chiết bằng CTAB), 0,5 µl mỗi loại mồi (ITS4 & ITS5; AM-F & AM-R).

Bảng 3.1. Các mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum

Mồi Trình tự (5’-3’) Tham khảo Sản phẩm (bp) Vùng gen

AM-F TCATTCTACGTATGTGCCCG Silva et al. ~ 910 ApMat (2012)

AM-R CCAGAAATACACCGAACTTGC ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ~ 500 ITS ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al. (1990)

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút; tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 52oC (với cặp mồi ITS4 & ITS5) và 54oC với cặp mồi (AM-F & AM-R) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 1 phút. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% đươc chuẩn bị bằng đệm TAE (Tris Acetic acid EDTA) và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide. Gel được

chạy trên thiết bị điện di Mupid-exU Mini System (Helixxtec) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại

và được chụp bằng máy ảnh số.

3.3.2.3. Phương pháp tinh chiết DNA, giải trình tự và phân tích trình tự

Sau khi điện di, DNA được cắt và bảo quản trong các ống effendorf mới.

Mỗi mẫu được cắt bằng dao khác nhau thành hình chữ nhật có chứa DNA. Sử dụng kít GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) để tinh chiết

DNA từ gel agarose. Tất cả các bước tinh sạch được thực hiện ở nhiệt độ phòng.

Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều dùng mồi

PCR tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).

Các chuỗi mẫu được xác định danh tính khi so sánh với các chuỗi đã công

bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for

Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Phân tích trình tự và xây dựng cây phả hệ được thực hiện bằng phần mềm

ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007) và Mega 6.0 (Tamura et al., 2013).

3.3.2.4. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum

Dựa trên các trình tự gen đã công bố về các loài chuẩn (Cannon et al., 2012;

Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012), các mồi đặc hiệu cho các loài

nấm chính gây hại trên ớt được thiết kế.

Các trình tự lựa chọn sẽ được phân tích bằng phần mềm ClustalX 2.0

(Larkin et al., 2007) để tìm các vị trí thiết kế mồi phù hợp.

Các loài nấm được thiết kế mồi đặc hiệu gồm: C. gloeosporioides s.s,

C. truncatum, C. fructicola, C. siamense.

3.3.2.5. Phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho các mồi đặc hiệu

Các phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ được thực hiện trên các mẫu nấm đại

diện cho các loài đã được định danh. Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 15,0 μl chứa 6,6 µl nước siêu sạch (Invitrogen), 7,5 µl Itaq Green Master Mix, 0,3 µl DNA

(chiết bằng CTAB), 0,6 µl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 µl mồi F, 0,3 µl mồi R).

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở các nhiệt độ 54oC, 58oC và 62oC với cặp mồi (F & R) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm

TAE (Tris Acetic acid EDTA) và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide. Gel được

chạy trên thiết bị điện di Mupid-exU Mini System (Helixxtec) với đệm TAE ở

điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại

và được chụp bằng máy ảnh số. Xác định nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho từng

loại mồi thiết kế dựa trên hình ảnh thu được sau điện di.

3.3.2.6. Phương pháp tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum

Các phản ứng PCR tối ưu hóa phương pháp chiết được thực hiện trên các

mẫu nấm đại diện cho các loài đã được định danh. DNA của các mẫu nấm đại diện

được chiết theo 2 phương pháp (trình bày tại mục 3.3.2.1). Mỗi phản ứng PCR có

tổng thể tích 15,0 μl chứa 6,6 µl nước siêu sạch (Invitrogen), 7,5 µl Itaq Master

Mix, 0,3 µl DNA, 0,6 µl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 µl mồi F; 0,3 µl mồi R).

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở nhiệt độ 58oC (các cặp mồi C.glo-F-R và C.tru-F/-R) và 62oC (các cặp mồi C.fruc-F1/-R1 và C.sia- F1/-R1) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.

Điện di các sản phẩm PCR được thực hiện tương tự thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ. Nhiệt độ gắn mồi của các phản ứng là nhiệt độ thích hợp nhất đã được xác định cho từng mồi thiết kế. Đánh giá hiệu quả của các phương pháp chiết

thông qua hình ảnh thu được sau điện di.

3.3.2.7. Phương pháp xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR

Các phản ứng PCR xác định thành phần loài được thực hiện trên 52 mẫu nấm

thu thập tại ĐBSH và một số tỉnh. Đầu tiên, các mẫu nấm được kiểm tra PCR bằng cặp mồi C.sia-F1/-R1. Tiếp theo các mẫu nấm âm tính với cặp mồi này lại

được kiểm tra lần lượt bằng các cặp mồi C.fruc-F1/-R1, C.glo-F-R và C.tru-F/-R

theo phương pháp loại trừ. DNA của các mẫu nấm đại diện được chiết bằng

phương pháp sử dụng NaOH (trình bày tại mục 3.3.2.1). Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 15,0 μl chứa 6,6 µl nước siêu sạch (Invitrogen), 7,5 µl Itaq Master

Mix, 0,3 µl DNA, 0,6 µl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 µl mồi F; 0,3 µl mồi R).

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở nhiệt độ 58oC (các cặp mồi C.glo-F-R và C.tru-F/-R) và 62oC (các cặp mồi C.fruc-F1/-R1 và C.sia- F1/-R1) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.

Điện di các sản phẩm PCR được thực hiện tương tự thí nghiệm tối ưu hóa

nhiệt độ. Thành phần loài, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum tại

ĐBSH và một số tỉnh được xác định dựa trên kết quả điện di.

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum 3.3.3.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường

- Thành phần của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu:

+ Môi trường PDA (Potato-Glucose-Agar): 250 gam khoai tây, 20 gam

glucose, 20 gam agar và 1.000 ml nước cất.

+ Môi trường PCA (Potato-Carrot-Agar): 20 gam khoai tây, 20 gam cà rốt,

20 gam agar và 1.000 ml nước cất.

+ Môi trường WA (Water-Agar): 20 gam agar và 1.000 ml nước cất.

- Cách chế tạo môi trường PDA: Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ, cân đủ lượng rồi thái nhỏ thành miếng vuông với kích thước khoảng 1cm2. Sau đó đun khoai tây cho đến khi mềm, lọc bằng vải màn để lấy dịch chiết khoai tây. Pha 1 lít dịch nước khoai

tây với 20g đường và 20g thạch rau câu. Môi trường được đổ vào các bình tam giác, lắc đều rồi đem hấp vô trùng trong nồi hấp ở 121oC (1,5 atm) trong 45-50 phút, để môi trường nguội khoảng 60 - 65oC đem rót vào các đĩa petri đã được hấp vô trùng. Các môi trường khác được điều chế tương tự như môi trường PDA.

3.3.3.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái

a. Phương pháp đánh giá đặc điểm tản nấm và hình dạng bào tử

Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 25oC ± 2oC trong 5 ngày dưới ánh sáng huỳnh quang liên tục. Nấm đang sinh trưởng ở rìa tản nấm được cấy truyền sang đĩa PDA mới (chuyển bằng một viên tản nấm 4 mm) và ủ ở cùng điều kiện. Đường kính, màu sắc tản nấm, sự hình thành bào tử trên tản nấm được đánh giá sau cấy 3, 5, 7 và 9 ngày. Tại ngày thứ 7, kích thước và hình dạng của bào tử được kiểm tra và đánh giá. Mỗi mẫu nấm đánh giá 3 lần lặp (3 đĩa PDA); mỗi đĩa PDA đánh giá 30 bào tử (Cai et al., 2009; Than et al., 2008b).

b. Phương pháp quan sát đĩa áp (Appressoria)

Sử dụng kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp (hình 3.1). Một mảnh môi trường PDA (1 cm2) được đặt trên đĩa petri vô trùng. Cấy bào tử nấm vào cạnh của miếng môi trường và đậy một lamen vô trùng lên trên miếng môi trường. Ủ đĩa 5 - 7 ngày ở 25o C cho tới khi đĩa áp hình thành ở mặt dưới của lam. Quan sát đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước của đĩa áp) (Cai et al., 2009; Johnston & Jones, 1997).

Hình 3.1. Kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum

Các mẫu nấm được sử dụng trong nghiên cứu là 5 mẫu nấm đã được định danh gồm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).

Thí nghiệm gồm 5 công thức, từ CT1 đến CT5 tương ứng với 5 loài nấm: C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes, C. truncatum và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.

Nguồn: Cai et al. (2009) 3.3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum

Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA, PCA và WA trong điều kiện 25oC ± 2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày. Tiến hành theo dõi tốc độ phát triển tản nấm và số lượng bào tử hình thành ở các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau cấy của các

mẫu nấm để đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng trên từng loại môi trường.

Phương pháp theo dõi tốc độ phát triển tản nấm: tiến hành đo đường kính

của 3 tản nấm của 3 đĩa petri/ lần nhắc theo hai đường kính vuông góc kẻ ở mặt

sau của đĩa ở các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau cấy. Đường kính tản nấm thu

được là giá trị trung bình của các lần nhắc.

Phương pháp theo dõi số lượng bào tử hình thành:

Trên từng loại môi trường, sau cấy 3, 5, 7 và 9 ngày, lấy 1 cm2 tản nấm (từ sát mép ngoài tản nấm về phía tâm của đĩa nuôi cấy)/ 1 lần nhắc. Tản nấm sau

khi cắt được cho vào tuýp eppendorf có thể tích 1,5 ml và bổ sung 1 ml nước cất

vô trùng, ngâm khoảng 30 phút, sau đó lắc nhẹ để bào tử rời khỏi tản nấm và

phát tán vào trong nước. Đếm số lượng bào tử sinh ra trên các loại môi trường

bằng cách lấy giá trị trung bình của 3 lần quan sát.

Sử dụng buồng đếm vi sinh vật để xác định lượng bào tử trong dung dịch.

Buồng đếm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ. Buồng đếm có độ sâu 0,1mm và có diện tích 1 mm2.

Thể tích 1 ô vuông lớn = 1/25 mm2 × 1/10 mm = 1/250 mm3 = 1/250 × 10-

3 cm3 = 4. 10-6 ml.

Lấy dung dịch bào tử nấm cho vào buồng đếm, đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học, đếm tổng số bào tử của 5 ô vuông lớn theo đường chéo góc, tính số bào tử trung bình có trong 1 ô vuông lớn, ký hiệu là A.

4 x 10-6

Số bào tử/ ml (A) = = 0,25.A. 106 Số bào tử/ 1ml chính là lượng bào tử sinh ra trên tản nấm thu được trên môi

trường nuôi cấy.

3.3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên môi trường PDA

Thí nghiệm gồm 4 công thức, từ CT1 đến CT4 tương ứng với các mức nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.

Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA ở các ngưỡng nhiệt

độ khác nhau trong điều kiện 12 giờ chiếu sáng/ ngày.

Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh hưởng

của môi trường dinh dưỡng.

3.3.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên môi trường PDA

Các mẫu nấm được sử dụng trong nghiên cứu là 5 mẫu nấm đã được định

danh gồm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29),

C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).

Thí nghiệm gồm 4 công thức, từ CT1 đến CT4 tương ứng với các ngưỡng pH: 4,0; 5,0; 6,0, 7,0 và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

(completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.

Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA trong điều kiện 25oC ±

2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày.

Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh hưởng của

môi trường dinh dưỡng.

3.3.3.6. Phương pháp xác định tính gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum đại diện

Các giống ớt sử dụng lây bệnh nhân tạo (Demon, Lai 20, Chìa vôi, Sussan’Joy) được trồng trong nhà lưới. Lá ớt được lựa chọn là các lá bánh tẻ (khoảng 4 tuần tuổi). Quả ớt xanh và chín sử dụng trong lây bệnh được xác định dựa vào thời gian từ ra hoa đến thu hoạch quả. Cụ thể: Quả xanh: thu ở thời điểm 45 - 50 ngày sau đậu quả; Quả chín: thu ở thời điểm 60 - 65 ngày sau đậu quả.

Các loại quả của các cây ký chủ dễ nhiễm bệnh thán thư được sử dụng lây

bệnh: Xoài đốc, chuối tây Thái Lan và chuối tiêu hồng.

Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm là 5 loài nấm đã được định danh là C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).

Các isolate nấm đại diện sẽ được đánh giá tính gây bệnh trên quả ớt theo

phương pháp đã được mô tả của Montri et al. (2009) và Than et al. (2008b).

- Lây bệnh cho các loài Colletotrichum đại diện trên ớt: Chọn các lá, quả ớt không bị nhiễm bệnh để lây bệnh. Tiến hành lây bệnh trên lá, quả ớt xanh và chín, mỗi isolate tiến hành lây 10 quả, lá/ 1 giống ớt, 3 lần nhắc lại.

- Lây bệnh các loài Colletotrichum đại diện trên một số loại quả được xem là hay bị nhiễm bệnh thán thư: chọn các quả xoài, chuối tiêu, chuối tây không bị nhiễm bệnh để lây bệnh. Tiến hành lây bệnh trên quả xanh và quả chín, mỗi isolate tiến hành lây 3 quả/ 1 giống (xoài, chuối tây, chuối tiêu), 3 lần nhắc lại.

- Tiến hành: Nấm được nuôi cấy trên môi trường PCA ở 25 - 30oC dưới ánh sáng huỳnh quang liên tục trong 7 ngày. Bào tử nấm được thu, hòa trong nước cất vô trùng và điều chỉnh để đạt nồng độ 106 bào tử/ ml.

- Phương pháp lây bệnh:

+ Lây bệnh có tổn thương: Các bộ phận lây bệnh được khử trùng bề mặt bằng NaOCl 1% trong 5 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô. Tạo tổn

thương ở giữa quả bằng cách dùng kim đục 1 lỗ nhỏ. Nhỏ 6 µl dịch bào tử vào vị trí gây tổn thương. Ủ quả, lá lây nhiễm ở 25 - 28oC, độ ẩm 100%, 12 giờ sáng/ 12 giờ tối trong 3 ngày. Tiếp theo quả được ủ ở cùng điều kiện nhưng độ ẩm 70 - 80%.

+ Lây bệnh không tổn thương: Các bộ phận lây bệnh được khử trùng bề mặt

bằng NaOCl 1% trong 5 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô.

Nhỏ 6 µl dịch bào tử lên bề mặt bộ phận lây bệnh. Ủ quả, lá lây nhiễm ở 25 - 28oC, độ ẩm 100%, 12 giờ sáng/ 12 giờ tối trong 3 ngày. Tiếp theo quả được ủ ở cùng điều kiện nhưng độ ẩm 70 - 80%.

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Thời kỳ tiềm dục: được tính bằng thời gian từ khi lây bệnh đến khi xuất

hiện vết bệnh trên bộ phận lây nhiễm.

+ Tỷ lệ bệnh: được tính bằng số quả, lá xuất hiện triệu chứng bệnh/ tổng số

quả, lá lây nhiễm.

+ Kích thước vết bệnh: Đo kích thước vết bệnh sau 3 ngày lây bệnh trên lá và 7 ngày với lây bệnh trên quả. Kích thước vết bệnh thu được là số liệu trung

bình của các vết bệnh xuất hiện sau lây nhiễm.

3.3.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng tồn tại của một số loài Colletotrichum trên lá ớt

Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm: C4 và C30 và tương ứng với loài nấm

đã được định danh là C. siamense và C. truncatum.

Giống ớt sử dụng lây bệnh là giống ớt lai Demon. Thí nghiệm được thực

hiện theo phương pháp của Ranathunge et al. (2016).

Gieo hạt ớt vào các chậu nhựa, đặt trong lồng cách ly. Khi cây được 4 tuần tuổi tiến hành lây bệnh trên lá bằng phương pháp lây bệnh có tổn thương. Phương pháp lây bệnh được thực hiện như thí nghiệm xác định tính gây bệnh

nhân tạo của các mẫu nấm Colletotrichum. Mỗi loài nấm Colletotrichum được

lây trên 5 cây, mỗi cây lây 5 lá để theo dõi, đánh giá.

Phương pháp đánh giá sự tồn tại của bào tử nấm: Sau khi lây bệnh, thu mẫu lá định kỳ hàng tuần và xử lý để tiến hành quan sát sự tồn tại của các loài nấm trên lá.

Quá trình xử lý được thực hiện bằng cách ngắt các lá từ cây đã được lây bệnh, cắt các miếng khoảng 1 cm2 tại vị trí lây bệnh và cho vào dung dịch ethanol nguyên chất: axit acetic với tỉ lệ 1:2 trong 24 giờ để loại bỏ diệp lục, sau đó thay thế dung

dịch với thành phần tương tự và tiếp tục ngâm trong 24 giờ. Sau khi các mô được

làm sạch tiến hành rửa bằng nước cất, để khô, sau đó nhuộm bằng dung dịch

Trypan blue, đặt trên lam kính và nhỏ 1 giọt nước để quan sát bằng kính hiển vi.

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bào tử hình thành giác bám tại các vị trí lây bệnh

nhân tạo. Sử dụng kính hiển vi quan sát số lượng bào tử nảy mầm. Mỗi tuần, tiến

hành quan sát 3 lá, mỗi vị trí lây bệnh/ lá quan sát 3 quang trường. Tỷ lệ bào tử

hình thành giác bám là số liệu trung bình của các lần quan sát.

3.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum của một số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng trong điều kiện in vitro 3.3.4.1. Phương pháp đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học với các loài nấm Colletotrichum

Các loại thuốc hóa học được sử dụng trong thí nghiệm gồm Score 250EC,

Tiptop 250EC, Antracol 70WP và Azony 25SC. Nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất với các loại thuốc Score 250EC, Tiptop 250EC, Azony 25SC là 0,1%,

với thuốc Antracol 70WP là 0,3%.

Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4),

C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).

a. Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm các loài nấm

Colletotrichum của một số thuốc hóa học trên môi trường PDA

Thí nghiệm gồm 5 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3

lần lặp lại, mỗi lần lặp 5 đĩa. Mỗi loại thuốc đều được thí nghiệm trên cả 5 loài

nấm đã được định danh ở 4 nồng độ, các công thức thí nghiệm cụ thể:

CT1: nồng độ tăng gấp 2 lần so với khuyến cáo

CT2: nồng độ khuyến cáo

CT3: nồng độ giảm 2 lần so với khuyến cáo

CT4: nồng độ giảm 4 lần so với khuyến cáo

CT5 (đối chứng): môi trường không chứa thuốc hóa học

Hiệu lực của ức chế sinh trưởng của các loại thuốc hóa học với các loài nấm được thực hiện theo mô tả của Gopinath et al. (2006). Dùng pipet tự động lấy

lượng thuốc cần sử dụng theo từng nồng độ thí nghiệm. Cho lượng thuốc vào các

bình tam giác chứa 250 ml môi trường PDA đã được hấp khử trùng và để nguội (khoảng 50 - 60oC), lắc đều và đổ ra đĩa petri. Dùng que cấy vô trùng khêu những miếng nấm đã được đục sẵn (kích thước ̴ 4mm) trên đĩa nấm thuần cấy vào tâm các đĩa môi trường PDA đã chuẩn bị. Đĩa môi trường không chứa thuốc

được coi là đĩa đối chứng. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của các loại

thuốc hóa học được theo dõi định kỳ đến khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa.

Điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh

hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng nấm.

Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ tăng trưởng tản nấm, hiệu lực ức chế (%) của các

loại thuốc ở mỗi nồng độ thí nghiệm.

b. Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nảy mầm bào tử các loài nấm Colletotrichum của một số thuốc hóa học

Lấy lượng thuốc hóa học gấp 10 lần lượng cần sử dụng pha vào 10 ml

nước cất vô trùng để tạo dung dịch mẹ. Sau đó, tùy vào nồng độ cần sử dụng lấy

pipet tự động nhỏ 1 lượng nước thuốc từ dung dịch mẹ nhỏ vào lam lõm. Hòa bào tử của các loài nấm trong nước cất vô trùng (số lượng bào tử 104 bào tử/ ml). Dùng pipet tự động nhỏ 50 µl dịch bào tử vào các lam chứa thuốc sau đó phủ lamen và để ở nhiệt độ 25oC ± 2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày.

Thí nghiệm gồm 5 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 1 lam. Mỗi loại thuốc đều được thí nghiệm trên cả 5 loài

nấm đã được định danh ở 4 nồng độ, các công thức thí nghiệm cụ thể:

CT1: nồng độ tăng gấp 2 lần so với khuyến cáo

CT2: nồng độ khuyến cáo

CT3: nồng độ giảm 2 lần so với khuyến cáo

CT4: nồng độ giảm 4 lần so với khuyến cáo

CT5 (đối chứng): nhỏ nước cất vô trùng

Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ bào tử nảy mầm (%), hiệu lực ức chế của các loại

thuốc sau 12, 24 và 48 giờ.

3.3.4.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực của một số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp với các loài nấm Colletotrichum

- Các mẫu vi khuẩn Bacillus spp đối kháng được sử dụng trong thí nghiệm

gồm: A15, TL4, HT1, MSV4, N2 và HT7.

- Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm: C1, C4, C29, C30 và C44 tương ứng fructicola, C. siamense,

loài nấm đã được định danh

là C.

với 5 C. aeschynomenes, C. truncatum và C. gloeosporioides s.s.

Thí nghiệm gồm 7 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 5 đĩa. Mỗi mẫu vi khuẩn đều được thí nghiệm trên cả 5 loài nấm đã được định danh, các công thức thí nghiệm cụ thể:

CT1: mẫu vi khuẩn A15

CT2: mẫu vi khuẩn TL4

CT3: mẫu vi khuẩn N2

CT4: mẫu vi khuẩn MSV4

CT5: mẫu vi khuẩn HT1

CT6: mẫu vi khuẩn HT7

CT7 (đối chứng): cấy nấm trên môi trường PDA

Các mẫu vi khuẩn đã phân lập được kiểm tra hoạt tính đối kháng với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường PDA theo mô tả của Kumar et al. (2012). Các mẫu vi khuẩn được cấy vạch trên bề mặt đĩa thạch với khoảng cách 2,5 cm xung quanh nấm bệnh được cấy ở giữa. Đĩa không cấy vi khuẩn được coi là đĩa đối chứng. Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn được theo dõi định kỳ cho tới khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa.

Điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh

hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng nấm.

Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng

của các loại thuốc hóa học đến các loài nấm Colletotrichum.

3.3.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực của của một số dịch chiết địa y với một số loài nấm Colletotrichum

Các loài địa y được sử dụng trong thí nghiệm gồm: PT methanol:

(methanol), PT acetone: Parmotrema

tinctorum

Parmotrema tinctorum (acetone), PT hexan: Parmotrema tinctorum (hexan), Us methanol: Usnea sp.

(methanol), Us acetone: Usnea sp. (acetone), Us hexan: Usnea sp. (hexan), PS

acetone: Parmotrema sancti-angelii (acetone).

Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm: C. siamense (C4) và C. truncatum (C30).

Lấy lượng dịch chiết địa y cần sử dụng cho vào 250 ml môi trường PDA đã

được hấp khử trùng và để nguội (khoảng 50 - 60oC), lắc đều và đổ ra đĩa petri.

Thí nghiệm gồm 8 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 5 đĩa. Mỗi loại dịch chiết địa y được sử dụng ở nồng độ 100 ppm trên cả 2 loài nấm đã được định danh, các công thức thí nghiệm cụ thể:

CT1: PT metanol

CT2: PT acetonee

CT3: PT hexan

CT4: US metanol

CT5: US acetone

CT6: US hexan

CT7: PS acetone

CT8 (đối chứng): môi trường không chứa dịch chiết địa y

Điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh

hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng nấm.

Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng

của các loại thuốc hóa học đến các loài nấm Colletotrichum.

3.5. PHƯƠNG PHÁP TÍNH TOÁN VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

* Tỷ lệ bệnh:

TLB (%) =

x 100

Trong đó: A: số quả cây bị bệnh

B: Tổng số quả cây điều tra

* Cấp bệnh trung bình:

CBTB =

Tổng số cấp bệnh của các quả bị bệnh

Tổng số quả bị bệnh

* Đánh giá hiệu lực ức chế của thuốc hóa học, dịch chiết địa y, vi khuẩn đối kháng đến khả năng sinh trưởng tản nấm, khả năng nảy mầm của bào tử Colletotrichum điều kiện phòng thí nghiệm:

Áp dụng công thức Abbott

HL (%) =

x 100

Trong đó:

HL (%): hiệu lực ức chế

C: Đường kính tản nấm, số bào tử nảy mầm ở công thức đối chứng

T: Đường kính tản nấm, số bào tử nảy mầm ở công thức thí nghiệm

Số liệu điều tra được xử lý trong Microsoft Office Excel. Số liệu thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng chương trình IRRISTAT 5.0.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TÁC HẠI VÀ THU THẬP MẪU BỆNH THÁN THƯ ỚT

4.1.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng

Nhiều loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt có phổ ký chủ rộng nên

nguồn bệnh có thể được duy trì trên các cây ký chủ khác nhau. Nấm

Colletotrichum có cách sống khá đa dạng, có thể sống nội sinh trong cây hoặc hoại sinh trên tàn dư cây (Hyde et al., 2009a). Ngoài ra, vi hạch của một số loài

Colletotrichum như C. coccodes có thể tồn tại ở trạng thái ngủ nghỉ trong đất

giữa mùa đông hoặc khi gặp điều kiện không thuận lợi, thậm chí có thể sống sót

qua nhiều năm (Pring et al., 1995). Các đặc điểm trên làm cho sự có mặt của bệnh thán thư trên đồng ruộng là hiển nhiên và người dân không quan tâm đến

công tác phòng trừ bệnh trong quá trình sản xuất.

Các loài nấm Colletotrichum spp. có thể gây bệnh trên hầu hết các bộ phận

của cây ớt trong bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào tuy nhiên bệnh trên quả có ý

nghĩa quan trọng hơn cả (Than et al., 2008a). Vì vậy, để đánh giá chính xác

mức độ phổ biến của bệnh thán thư cần tiến hành điều tra ở giai đoạn cây

đang mang quả.

Để cung cấp thông tin về tình hình gây hại của nấm Colletotrichum spp.

trên đồng ruộng chúng tôi tiến hành điều tra mức độ phổ biến của bệnh tại các

tỉnh ĐBSH trong vụ xuân hè và thu đông từ năm 2015 - 2017. Quá trình điều tra

được tiến hành ở giai đoạn cây thu hoạch quả lứa 1. Kết quả thu được tại bảng

4.1 và 4.2 cho thấy:

Trong 3 năm (2015 - 2017), tại các vùng trồng ớt chính của 9 tỉnh thuộc

ĐBSH đều ghi nhận sự xuất hiện của bệnh thán thư trên đồng ruộng ở giai đoạn quả thu hoạch lứa 1. Bệnh xuất hiện trên cả 2 thời vụ chính là vụ xuân hè và thu đông. Tuy mức độ gây hại có sự khác nhau ở các địa điểm, thời vụ song tần suất bắt gặp bệnh ở tất cả các điểm điều tra đều ghi nhận được ở mức rất phổ biến (> 25%) (bảng 4.1, bảng 4.2).

Mặc dù số liệu thu được về mức độ phổ biến chưa thể hiện được mức độ

nghiêm trọng của bệnh, song kết quả thu được một lần nữa đã khẳng định bệnh thán thư là một trong những bệnh phổ biến nhất gây hại trên cây ớt tại ĐBSH.

Bảng 4.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong vụ xuân hè từ năm 2015 - 2017

Mức độ phổ biến T Tỉnh, Điểm điều tra T thành phố 2015 2016 2017

1 Hà Nội Gia Lâm, Đông Anh +++ +++ +++

2 Bắc Ninh 3 Hưng Yên Lương Tài Khoái Châu, Yên Mỹ +++ +++ +++ +++ - -

4 Hải Dương 5 Hải Phòng Thanh Hà, Kim Thành Vĩnh Bảo - +++ +++ +++ +++ -

6 Thái Bình 7 Nam Định Quỳnh Phụ Mỹ Lộc +++ - +++ +++ - +++

Chú thích: - Không điều tra; + Ít phổ biến (Tần suất bắt gặp < 10%); + + Phổ biến (Tần suất bắt gặp từ 10 - 25%); + + + Rất phổ biến (Tần suất bắt gặp > 25%)

8 Ninh Bình 9 Hà Nam Yên Khánh Lý Nhân - +++ +++ +++ +++ -

Bảng 4.2. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong vụ thu đông từ năm 2015 - 2017

Mức độ phổ biến TT Điểm điều tra Tỉnh, thành phố 2017 2015 2016

Hà Nội Bắc Ninh 1 2 Gia Lâm, Đông Anh Lương Tài +++ +++ +++ +++ +++ -

Hưng Yên Hải Dương 3 4 Khoái Châu, Yên Mỹ Thanh Hà, Kim Thành +++ - +++ +++ - +++

Hải Phòng Thái Bình 5 6 Vĩnh Bảo Quỳnh Phụ +++ +++ +++ +++ - -

Nam Định Ninh Bình 7 8 Mỹ Lộc Yên Khánh - - +++ +++ +++ +++

9 Hà Nam Lý Nhân +++ +++ -

Chú thích: - Không điều tra; + Ít phổ biến (Tần suất bắt gặp < 10%); + + Phổ biến (Tần suất bắt gặp từ 10 - 25%); + + + Rất phổ biến (Tần suất bắt gặp > 25%) 4.1.2. Kết quả điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt tại các điểm thu thập mẫu

Để đánh giá mức độ gây hại của bệnh thán thư gây hại trên cây ớt tại ĐBSH

chúng tôi tiến hành điều tra đánh giá mức độ gây hại của bệnh ở các vùng trồng ớt

tại thời điểm thu thập mẫu bệnh. Kết quả đánh giá mức độ gây hại của bệnh thán thư

tại các vùng trồng ớt từ năm 2015 - 2017 được thể hiện tại các bảng 4.3, 4.4 và 4.5.

Đồng bằng sông Hồng hiện là một vùng sản xuất ớt tương đối lớn của cả

nước với diện tích gieo trồng trên 5.000ha. Hiện tại, nhóm ớt cay chiếm đa số với

trên 90% diện tích gieo trồng. Trong nhóm ớt cay, các giống ớt chỉ thiên hiện

được xem là giống chủ đạo, chiếm trên 70% diện tích. Vì vậy, trong 3 năm,

chúng tôi tập trung điều tra thực trạng bệnh thán thư trên các giống thuộc nhóm

ớt cay (dạng chỉ thiên và chỉ địa) trồng phổ biến tại 9 tỉnh thuộc ĐBSH và một số

tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên và Sơn La. Kết quả điều tra thu được cho thấy, tất

cả các giống ớt đang được trồng phổ biến tại ĐBSH như: Demon, GS 888, Hai

mũi tên đỏ, Lai 20 … đều ghi nhận bệnh thán thư xuất hiện và gây hại. Điều đó

chứng tỏ hiện chưa có giống ớt kháng bệnh thán thư phục vụ cho sản xuất (bảng

4.3, bảng 4.4 và bảng 4.5).

Tại tất cả các điểm điều tra chúng tôi nhận thấy, trên cùng một giống, tại

cùng một địa điểm điều tra các ruộng ớt ở giai đoạn thu hoạch quả lứa 2 luôn bị

bệnh thán thư gây hại nặng hơn ruộng ớt ở giai đoạn thu hoạch quả lứa 1. Cụ thể,

năm 2015 tại Vĩnh Bảo, Hải Phòng bệnh thán thư gây hại trên giống ớt GS 888 ở

giai đoạn thu hoạch quả lứa 1 là (TLB: 18,67%; CBTB: 0,68), trong khi mức độ

gây hại trên ruộng thu quả lứa 2 là (TLB: 40,67%; CBTB: 1,84). Năm 2016, tại

Mỹ Lộc, Nam Định trên giống ớt Demon ở giai đoạn thu hoạch quả lứa 1 mức độ

gây hại của bệnh thán thư là (TLB: 4,67%; CBTB: 0,05) và giai đoạn thu quả lứa

2 là (TLB: 29,33%; CBTB: 1,09). Năm 2017, tại Thanh Hà, Hải Dương trên

giống ớt chỉ thiên mức độ gây hại của bệnh ở giai đoạn thu quả lứa 1 là (TLB:

5,33%; CBTB: 0,11) và ở giai đoạn thu quả lứa 2 (TLB: 35,33%; CBTB: 1,87).

Sở dĩ có kết quả như trên là do cây ớt thường thu hoạch quả rải rác, thời gian thu

hoạch kéo dài, khi cây già cỗi sức chống chịu của cây ngày càng giảm trong khi

nguồn nấm bệnh ngày càng tăng do có điều kiện ký chủ thuận lợi nên bệnh dễ

phát sinh và gây hại nặng (bảng 4.3, bảng 4.4 và bảng 4.5).

Từ kết quả thu được có thể thấy mức độ gây hại của bệnh thán thư phụ

thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây ớt. Bệnh thường phát triển và

gây hại nặng trên cây ớt ở giai đoạn thu hoạch lứa 2. Kết quả thu được hoàn toàn

trùng khớp với các công bố trước đây về bệnh thán thư hại ớt của Ngô Bích Hảo

(1991, 1992, 1993) là các loài nấm gây bệnh thán thư đều phá hại mạnh vào cuối

giai đoạn sinh trưởng của ớt ở khắp các vùng trồng.

Bảng 4.3. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2015

5 4

Địa điểm Giống CBTB TT

Ớt chỉ thiên (Hàn Quốc) Ớt Kim lai Ớt mần Ớt chỉ thiên Ớt chỉ thiên Ớt Demon Ớt chỉ thiên G7 GS 888 GS 888 Ớt chỉ thiên Lai 20 Ớt hai mũi tên đỏ Ớt chỉ thiên Ớt chỉ thiên Ớt chỉ thiên

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên Tiền Phong, Ân Thi, Hưng Yên An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên Ớt Demon Thị trấn Nông trường, Mộc Châu, Sơn La Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La Ớt chỉ thiên Ớt chỉ thiên Giai đoạn sinh trưởng Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 2 Diện tích ruộng điều tra (m2) 400 360 200 360 180 250 500 360 720 500 500 250 360 360 180 400 500 300 200 TLB (%) 15,33 10,67 8,67 8,00 7,33 13,33 12,00 22,67 40,67 18,67 14,67 5,33 27,33 9,33 24,00 29,33 8,67 34,67 27,33 0,36 0,40 0,27 0,39 0,38 0,45 0,18 0,66 1,84 0,68 0,12 0,54 0,82 0,15 0,74 1,12 0,15 1,53 1,03 Ngày điều tra 17/ 4/ 2015 28/ 4/ 2015 30/ 4/ 2015 30/ 4/ 2015 30/ 4/ 2015 30/ 4/ 2015 9/ 5/ 2015 9/ 5/ 2015 11/ 5/ 2015 11/ 5/ 2015 2/ 6/ 2015 4/ 6/ 2015 5/ 6/ 2015 5/ 6/ 2015 5/ 6/ 2015 1/ 7/ 2015 3/ 7/ 2015 4/ 10/ 2015 4/ 10/ 2015 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Bảng 4.4. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2016

TT Địa điểm Giống CBTB Giai đoạn sinh trưởng

1 2 3 4 5 6 Ngày điều tra 8/ 5/ 2016 5/ 6/ 2016 5/ 6/ 2016 17/ 9/ 2016 17/ 9/ 2016 2/ 10/ 2016 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Ớt chỉ thiên Ớt Demon Ớt Demon Ớt chỉ thiên Ớt hai mũi tên đỏ Ớt hai mũi tên đỏ Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Diện tích ruộng điều tra (m2) 360 180 200 400 500 200 TLB (%) 12,00 4,67 29,33 11,33 36,67 6,00 0,23 0,05 1,09 0,20 1,60 0,19

Bảng 4.5. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2017

5 5

TT Địa điểm Giống CBTB Ngày điều tra Giai đoạn sinh trưởng TLB (%)

Ớt chỉ thiên Ớt Demon Ớt Demon Ớt chỉ thiên Ớt chỉ thiên Ớt Demon

1 2 3 4 5 6 7 10/ 5/ 2017 10/ 5/ 2017 16/ 5/ 2017 20/ 5/ 2017 20/ 5/ 2017 7/ 6/ 2017 20/ 6/ 2017 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội Việt Hồng, Thanh Hà, Hải Dương Thanh Hải, Thanh Hà, Hải Dương Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương Ớt chỉ thiên Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Thu quả lứa 1 Thu quả lứa 2 Diện tích ruộng điều tra (m2) 360 450 180 300 180 500 180 7,33 8,67 8,00 5,33 35,33 9,33 32,67 0,30 0,35 0,19 0,11 1,87 0,46 1,55

4.1.3. Kết quả thu thập mẫu bệnh thán thư ớt

Để tạo nguồn vật liệu nghiên cứu chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu bệnh

thán thư gây hại trên quả ớt. Quá trình thu thập mẫu được thực hiện trong 3 năm (2015 - 2017) trên các giống ớt trồng phổ biến tại ĐBSH và một số tỉnh. Kết quả

thu thập mẫu được trình bày tại bảng 4.6 hình 4.1 và phụ lục 1.

Bảng 4.6. Triệu chứng mẫu bệnh thán thư thu thập tại các địa điểm

Dạng triệu chứng Ký hiệu mẫu Loại quả Số lượng mẫu T T

3 C18, C32, C35 Quả xanh

8 Quả chín C3, C8, C23, C27, C37, C53, C47, C30

Triệu chứng 1: Vết bệnh là các đốm tròn đồng tâm hoặc hình thoi, hơi lõm. Bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ li ti màu đen xếp thành vòng tròn đồng tâm hoặc lộn xộn. Cộng 11

6 C1, C33, C34, C36, C41, C43 Quả xanh

2 35 Quả chín

Triệu chứng 2: Vết bệnh là các đốm tròn đồng tâm hoặc hình thoi, hơi lõm. Bề mặt vết bệnh có những khối bào tử màu vàng, ẩm ướt, xung quanh vết bệnh thường có viền đen.

Cộng 41 C2, C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C19, C20, C22, C24, C25, C26, C28, C29, C31, C38, C39, C40, C45, C46, C48, C50, C51, C52

Hình 4.1. Số lượng mẫu bệnh thán thư ớt thu thập tại các địa điểm từ 2015 - 2017

Trong 3 năm (2015 - 2017) đã thu thập được 52 mẫu bệnh thán thư gây hại trên quả ớt, trong đó 41 mẫu bệnh được thu thập tại 9 tỉnh thuộc ĐBSH, 11 mẫu được thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Sơn La và Tiền Giang. Mẫu bệnh thu thập gồm các quả ớt xanh và chín, trong hai loại quả thu thập số lượng mẫu quả chín chiếm đa số với 43/52 mẫu. Triệu chứng các mẫu thu thập gồm 2 nhóm được phân biệt với nhau bởi đặc điểm bề mặt vết bệnh xuất hiện chấm đen nhỏ li ti hoặc bề mặt vết bệnh có những khối bào tử màu vàng. Trong 2 dạng triệu chứng điển hình, triệu chứng bề mặt vết bệnh có những khối bào tử màu vàng chiếm đa số với 41/52 mẫu thu thập (bảng 4.6, hình 4.1 và 4.2).

Chú thích: A - triệu chứng 1 trên quả xanh, B - triệu chứng 1 trên quả chín, C - triệu chứng 2 trên quả xanh, D - triệu chứng 2 trên quả chín

Hình 4.2. Triệu chứng bệnh thán thư điển hình do nấm Colletotrichum spp. gây hại trên quả ớt

4.1.4. Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt

Các mẫu bệnh sau khi thu thập được tiến hành phân lập, nuôi cấy và quan sát một số đặc điểm hình thái. Các đặc điểm hình thái, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp của các mẫu nấm thu thập được trình bày tại bảng 4.7 và phụ lục 1.

Dựa vào đặc điểm bào tử phân sinh và đĩa áp của các mẫu nấm, chúng tôi

xếp các mẫu nấm thu thập thành 3 nhóm hình thái. Cụ thể:

Nhóm I gồm 43 mẫu là C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11, C12, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C21, C22, C23, C24, C26, C27, C28, C31, C33, C34, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C50, C51, C52, C54. Nhóm này có bào tử phân sinh hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước dao động từ 10,6 - 12,6 × 3,6 - 5,1 µm. Đĩa áp có kích thước 6,6 - 8,8 × 4,8 - 6,2 µm, màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều (bảng 4.7, hình 4.3 a,d).

Nhóm II chỉ gồm 1 mẫu là C29. Bào tử phân sinh có kích thước 11,9 × 4,6

µm, đĩa áp có kích thước 9,7 × 5,7 µm. Nhìn chung đặc điểm hình thái bào tử của

nhóm này giống với nhóm I. Tuy nhiên một số đĩa áp của nấm có mức độ chẻ

thùy sâu hơn so với nhóm I (bảng 4.7, hình 4.3 b,e).

Nhóm III gồm 8 mẫu là C8, C13, C20, C25, C30, C35, C48 và C53. Nhóm này có bào tử phân sinh hình lưỡi liềm, kích thước dao động từ 21,5 - 22,4 × 3,5 - 3,7 µm. Đĩa áp giống nhóm I, có màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều (bảng 4.7, hình 4.3 c,f).

Bảng 4.7. Đặc điểm hình thái các mẫu nấm thán thư hại ớt thu thập

Đĩa áp

TT Mẫu nấm thuộc nhóm Hình dạng Nhóm hình thái Hình dạng

Bào tử phân sinh Kích thước (dài × rộng, µm) Kích thước (dài × rộng, µm)

1 I

hai Trụ, đầu tù tới tròn 10,6 - 12,6 ± 0,9 - 1,3 × 3,6 - 5,1 ± 0,3 - 0,6 6,6 - 8,8 ± 0,6 - 1,2 × 4,8 - 6,2 ± 0,4 - 1,1

Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11, C12, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C21, C22, C23, C24, C26, C27, C28, C31, C33, C34, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C50, C51, C52, C54

2 II C29 11,9 ± 1,1 × 4,6 ± 0,4 9,7 ± 1,4 × 5,7 ± 0,6 Trụ, hai đầu tù tới tròn

3 III Lưỡi liềm C8, C13, C20, C25, C30, C35, C48, C53

20,5 - 22,4 ± 1,0 - 1,4 × 3,5 - 3,9 ± 0,4 - 0,6 8,1 - 11,7 ± 0,2 - 2,2 × 5,1 - 6,3 ± 0,5 - 1,0

Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số chẻ thùy Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

Hình 4.3. Đặc điểm bào tử phân sinh (a, b, c) và đĩa áp (d, e, f) của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng. Đại diện 3 nhóm hình thái C4 (a,d); C29 (b,e) và C25 (c,f)

Từ kết quả quan sát thu được chúng tôi nhận thấy: Đặc điểm bào tử và đĩa áp của các mẫu nấm nhóm I và II nhìn chung giống với các loài nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Phức hợp này gồm ít nhất 23 loài, tất cả đều tạo bào tử phân sinh hình trụ thẳng, hai đầu tù, kích thước rất dao động. Đặc điểm hình thái tản cũng như đĩa áp cũng rất đa dạng và thay đổi (Weir et al., 2012). Đặc điểm bào tử và đĩa áp của các mẫu nấm nhóm III giống loài C. truncatum được mô tả bởi Damm et al. (2009).

Kết quả quan sát triệu chứng vết bệnh và đặc điểm hình thái của các mẫu nấm thu thập cũng cho thấy, triệu chứng bệnh quan sát được trên quả không thể hiện tính đặc trưng cho các loài hoặc nhóm loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên quả ớt. Chẳng hạn, các mẫu bệnh C8, C18 (bề mặt vết bệnh xuất hiện những chấm nhỏ li ti màu đen), tuy nhiên kết quả quan sát đặc điểm hình thái bào tử lại thuộc 2 nhóm hình thái khác nhau. Mẫu C8 có bào tử hình lưỡi liềm, mẫu C18 có bào tử hình trụ, hai đầu tù tới tròn. Tương tự, các mẫu bệnh C30 và C33 (bề mặt vết bệnh có những khối bào tử màu vàng) song kết quả quan sát đặc điểm hình thái bào tử thuộc 2 nhóm hình thái khác nhau. Mẫu C30 có bào tử hình lưỡi liềm, mẫu C33 có bào tử hình trụ, hai đầu tù tới tròn (bảng 4.6, bảng 4.7).

4.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI NẤM Colletotrichum HẠI ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG VÀ MỘT SỐ TỈNH

4.2.1. Định danh nấm dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện thuộc các nhóm hình thái xác định được

Do phân loại nấm Colletotrichum chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái đã tạo

ra quá nhiều sai lầm nên vai trò của phân tích phân tử đã ngày càng trở nên quan trọng và được xem là chuẩn vàng trong phân loại nhóm nấm này (Cannon et al., 2000; Hyde et al., 2009a).

4.2.1.1. Định danh các loài Colletotrichum bằng giải trình tự vùng ITS

Vùng liên gen ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA là môt trong các vùng gen phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và phân loại nấm (Schoch et al., 2012). Vùng gen này cũng đã từng được sử dụng để định danh nấm Colletotrichum (Martinez-Culebras et al., 2000).

Dựa trên đặc điểm hình thái, 10 mẫu nấm đại diện cho 3 nhóm hình thái đã được lựa chọn để giải trình tự vùng ITS. Các mẫu giải trình tự gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I), C29 (nhóm hình thái II) và C25, C30 (nhóm hình thái III).

Sản phẩm PCR của 10 mẫu được giải trình tự trực tiếp một chiều và tất cả các mẫu giải trình tự đều có chất lượng tốt. Sau khi loại bỏ các vùng nhiễu 2 đầu, trình tự đọc được vùng ITS của 10 mẫu có kích thước từ 529 đến 563 bp (bảng 4.8, phụ lục 3) và đều chứa 2 vùng ITS1 và ITS2 có giá trị phân loại.

Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST cho thấy loài trùng khớp với 2 mẫu C25 và C30 là C. truncatum. Tám mẫu còn lại đều trùng khớp với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.8).

Bảng 4.8. Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa trên trình tự vùng ITS

Địa điểm Loài xác định2 TT

Chú thích: 1 Kích thước sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu sản phẩm giải trình tự; 2 Dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST

Mẫu nấm C1 C4 C6 C9 C14 C25 C26 C29 C30 C33 Nhóm hình thái I I I I I III I II III I Hà Nội Thái Bình Hưng Yên Bắc Ninh Hải Phòng Hà Nội Hưng Yên Thái Nguyên Hà Nội Sơn La Kích thước (bp)1 548 529 548 547 549 556 560 563 556 551 C. gloeosporioides s.l C. gloeosporioides s.l C. gloeosporioides s.l C. gloeosporioides s.l C. gloeosporioides s.l C. truncatum C. gloeosporioides s.l C. gloeosporioides s.l C. truncatum C. gloeosporioides s.l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bảng 4.9. Mức đồng nhất trình tự vùng ITS của 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại thu tại Việt Nam với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài đã công bố gây bệnh thán thư ớt

Mức đồng nhất trình tự (%)

Phức hợp loài

TT

Loài

Mã GenBank

C25

C29

C26

C14

C33

C1

C9

C4

C6

C30

1 C. aenigma

2 C. aeschynomenes

JX010244 90,2 90,5 99,4 99,8 99,8 99,8 100 99,2 99,2 99,6

3 C. alatae

JX010176 90,0 90,3 99,6 99,8 98,8 98,8 99,2 100 100 100

4 C. alienum

JX010190 89,8 90,0 98,6 99,0 99,0 99,0 98,8 98,3 98,3 98,6

5 C. aotearoa

JX010251 90,2 90,5 99,4 99,8 99,8 99,8 99,2 99,2 99,6 100

6 C. asianum

JX010205 90,4 90,6 99,4 99,4 99,4 99,6 99,2 99,2 99,6 99,8

6 1

7 C. camelliae

FJ972612 89,8 89,8 99,0 99,0 99,0 99,0 98,8 98,6 98,6 99,0

8 C. clidemiae

KJ955081 88,5 88,5 96,9 97,1 97,1 97,1 97,4 97,4 97,4 97,4

9 C. cordylinicola

JX010265 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8

C. gloeosporioides s.l

10 C. fructicola

JX010226 90,2 90,5 98,6 98,6 98,6 98,6 98,8 98,8 98,8 99,0

11 C. gloeosporioides s.s

JX010165 90,0 90,3 99,6 99,8 98,8 98,8 99,2 100 100 100

12 C. henanense

JX010152 90,2 90,5 99,4 99,4 99,4 99,2 98,6 98,6 99,0 99,8

13 C. horii

KJ955109 88,3 88,3 97,1 97,4 97,4 97,4 97,6 97,4 97,4 97,6

14 C. jiangxiense

GQ329690 90,2 90,5 99,6 99,2 99,2 99,2 99,4 99,0 99,0 99,4

15 C.kahawae

KJ955201 87,8 87,8 97,1 97,4 97,4 97,4 97,6 97,4 97,4 97,6

16 C. musae

JX010231 90,4 90,6 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2

17 C. nupharicola

JX010146 90,6 90,8 98,8 98,6 98,6 98,6 98,8 98,6 98,6 99,0

JX010187 89,7 89,9 99,0 99,4 99,4 99,4 99,2 98,6 98,6 99,0

Mức đồng nhất trình tự (%)

Phức hợp loài

TT

Loài

Mã GenBank

C25

C29

C26

C14

C33

C1

C9

C4

C6

C30

18 C. psidii

19 C. queenslandicum

JX010219 90,6 90,8 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2

20 C. rhexiae

JX010276 90,3 90,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,6 99,4 99,4 99,8

21 C. siamense

JX145128 90,4 90,4 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 99,0 99,0 99,2

22 C. temperatum

JX010171 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,4 98,8 98,8 99,2

23 C. theobromicola

JX145159 90,6 90,6 99,0 99,0 99,0 99,0 99,2 99,2 99,2 99,4

24 C. ti

JX010294 90,3 90,5 98,8 98,8 98,8 98,8 99,0 98,8 98,8 99,2

25 C. tropicale

JX010269 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8

6 2

26 C. xanthorrhoeae

JX010264 90,4 90,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8 99,4 99,4 99,8

C. acutatum s.l

27 C.acutatum s.s

JX010261 89,5 89,7 98,3 98,3 98,3 98,3 98,5 98,3 98,3 98,6

28 C.coccodes

AF411700 76,1 76,1 76,5 76,5 76,5 76,5 76,5 76,6 76,6 76,8

C. dematium s.l

29 C.dematium s.s

HM171679 88,3 88,3 88,6 88,8 88,8 88,8 89,0 88,4 88,4 88,8

C. acutatum s.l

30 C.simmondsii

GU227819 88,4 88,4 87,2 87,0 87,0 87,0 87,0 86,9 86,9 87,2

C. truncatum

31 C. truncatum

JQ948276 76,9 76,9 77,9 77,7 77,7 77,7 77,9 77,7 77,7 77,9

GU227862 89,6 89,4 89,4 89,4 89,4 89,0 89,0 89,4 99,8 100

Vì rất nhiều trình tự gửi trên GenBank chưa được thẩm định nên dựa trên

kết quả tìm kiếm BLAST, trình tự vùng ITS của 10 mẫu nấm Colletotrichum

được phân tích đầy đủ hơn với trình tự của các mẫu GenBank đại diện cho loài đã được công bố. Tổng số 26 trình tự ITS đại diện cho 26 mẫu chuẩn loài (Type

specimen) của phức hợp loài C. gloeosporioides theo công bố của Liu et al. (2015) đã được sử dụng trong phân tích trình tự. Ngoài ra, các trình tự tương tự

đại diện cho 5 loài C. acutatum, C. coccodes, C. dematum, C. simmondsii và

C. truncatum cũng được sử dụng trong phân tích dựa trên công bố của Canon et

al. (2012). Kết quả so sánh trình tự tại bảng 4.9 cho thấy:

Hai mẫu C25 và C30 (nhóm hình thái III) có mức đồng nhất trình tự rất cao từ 99,8% đến 100% với loài C. truncatum giống như kết quả tìm kiếm BLAST.

Hai mẫu có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 87,8% đến 90,8% đối với

các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và từ 76,1% đến 88,4% đối

với 4 loài còn lại là C. coccodes, C. dematium s.s và C. simmondsii (bảng 4.9).

Tám mẫu còn lại gồm gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái

I) và C29 (nhóm hình thái II) có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 96,9% đến

100% đối với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l nhưng thấp hơn

nhiều, từ 76,5% đến 89,6% với 5 loài còn lại là C. coccodes, C. dematium s.s,

C. simmondsii và C. truncatum s.s (bảng 4.9).

Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS (hình 4.4) cũng cho thấy 2 mẫu

C25 và C30 thuộc cụm loài C. truncatum điển hình. Tương tự như kết quả tìm

kiếm BLAST và so sánh trình tự, phân tích phả hệ dựa trên vùng ITS cũng cho

thấy tám mẫu còn lại gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I) và C29 (nhóm hình thái II) phân nhóm rõ rệt trong cụm phức hợp loài

C. gloeosporioides s.l.

Dựa trên các kết quả phân tích vùng ITS của 10 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại miền Bắc, có thể kết luận 2 mẫu C25 và C30 là loài C. truncatum, 8 mẫu còn lại C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 và C29 thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Như vậy, vùng gen ITS chỉ xác định được chính

xác loài C. truncatum mà không định danh chính xác được các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Cannon et al. (2012) về sử dụng vùng gen ITS để xác định các loài nấm Colletotrichum.

Chú thích: Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining (NJ). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1.000 lần lặp) (chỉ trình bày các giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%). Ký tự (T) là mẫu đại diện loài (Type strain). Thanh tỷ lệ chỉ khoảng cách di truyền. Hình 4.4. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài được công bố gây bệnh thán thư ớt

4.2.1.2. Định danh phân tử các loài Colletotrichum bằng vùng liên gen ApMat

Do vùng ITS không đủ phân biệt các loài thuộc phức hợp loài

C. gloeosporioides s.l nên để định danh chính xác các loài thuộc phức hợp này,

phân tích đa gen (multigenes) thường được sử dụng (Weir et al., 2012). Tuy

nhiên, gần đây, một vùng liên gen khoảng 900 bp (ApMat) nằm giữa 2 gen Apn2

(mã hóa Apurinic-apyrimidinic endonuclease 2, một endonuclease sửa chữa

DNA, cắt ở vị trí Apurinic-apyrimidinic) và gen MAT1-2-1 (mã hóa yếu tố qui

định kiểu ghép cặp) đã được chứng tỏ rất hiệu quả nhằm phân biệt các loài trong

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (Liu et al., 2015; Silva et al., 2012).

Với giải trình tự vùng liên gen ApMat, 8 mẫu nấm đã được giải trình tự vùng

ITS (C1, C4, C6, C9, C14, C26, C29, C33) và 1 mẫu số 44 (có bào tử phân sinh

hình trụ, nhóm hình thái I, bảng 4.7) được lựa chọn để giải trình tự. Vùng gen

ApMat của chúng đã được giải trình tự cả 2 chiều bằng mồi PCR. Tất cả 9 mẫu

giải trình tự đều có chất lượng tốt và có kích thước từ 894 đến 930 bp (bảng 4.10).

Bảng 4.10. Kết quả tìm kiếm trên GenBank 9 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trên trình tự vùng ApMat

Nhóm TT Mẫu Địa điểm Loài xác định2 hình thái Kích thước (bp)1

C1 I Hà Nội 915 C. fructicola 1

C4 I Thái Bình 919 C. siamense 2

C6 I Hưng Yên 910 C. fructicola 3

C9 I Bắc Ninh 894 C. gloeosporioides s.s 4

C14 I Hải Phòng 915 C. fructicola 5

C26 I Hưng Yên 879 C. gloeosporioides s.s 6

C29 II Thái Nguyên 930 C. aeschynomenes 7

C33 I Sơn La 919 C. siamense 8

Chú thích: 1 Kích thước sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu sản phẩm giải trình tự; 2 Dựa trên kết quả tìm kiếm BLAST

Kết quả tìm kiếm BLAST (bảng 4.10) cho thấy các trình tự GenBank trùng

khớp với 3 mẫu C1, C6, C9 là loài C. fructicola, trùng khớp với 2 mẫu C4, C33

là

loài C. siamense,

trùng khớp với 3 mẫu C9, C26, C44

là

loài

C. gloeosporioides s.s, và trùng khớp với mẫu C29 là loài C. aeschynomenes.

C44 I Hà Nội 894 C. gloeosporioides s.s 9

Để xác định chính xác hơn, trình tự vùng ApMat của 9 mẫu nấm

Colletotrichum được phân tích với trình tự tương ứng của các mẫu GenBank đại

diện cho loài đã được thẩm định. Tổng số 26 trình tự ApMat đại diện cho 26 mẫu

chuẩn loài (Type specimen) của phức hợp loài C. gloeosporioides theo công bố

của Liu et al. (2015) đã được sử dụng trong phân tích trình tự. Ngoài ra, các trình

tự GenBank bổ sung cho các loài đã được xác định dựa trên kết quả tìm kiếm

BLAST gồm C. fructicola, C. siamense, C. gloeosporioides s.s cũng được phân

tích cùng nhằm đánh giá mức độ biến động trong loài.

Kết quả so sánh trình tự vùng ApMat (bảng 4.11) cho thấy:

Ba mẫu C9, C44, C26 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 98,6% đến

98,8% đối với các mẫu của loài C. gloeosporioides s.s và có mức đồng nhất trình

tự thấp hơn nhiều, từ 80,3% đến 90,3% đối với các loài trong phức hợp loài

C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).

Hai mẫu C4, C33 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 98,2% đến 99,7%

đối với các mẫu của loài C. siamense và có mức đồng nhất trình tự thấp hơn

nhiều,

từ 80,3% đến 94,3% đối với các

loài

trong phức hợp

loài

C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).

Ba mẫu C1, C6 và C14 có mức đồng nhất trình tự rất cao, từ 99,7% đến

100% đối với các mẫu của loài C. fructicola. Ba mẫu này cũng có mức đồng nhất

trình tự khá cao đối với 2 loài C. aenigma (98,2 - 98,4%) và C. alienum (99,3 -

99,5%) nhưng thấp hơn nhiều, từ 78,9% đến 96,9% đối với các loài còn lại trong

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).

Mẫu C29 có mức đồng nhất trình tự rất cao, 99,3% đối với loài

C. aeschynomenes và có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 79,6% đến

94,4% đối với các loài trong phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.11).

Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat (hình 4.5) cũng cho thấy ba

mẫu C9, C44, C26 thuộc cụm loài C. gloeosporioides s.s điển hình, hai mẫu C4,

C33 thuộc cụm loài C. siamense điển hình, ba mẫu C1, C6, C14 thuộc cụm loài

C. fructicola điển hình nhưng gần gũi với 2 loài C. aenigma và C. alienum. Riêng

mẫu C29, cùng với mẫu loài duy nhất C. aeschynomenes trên GenBank hình

thành một cụm loài đặc trưng phân biệt rõ rệt với các loài khác.

Bảng 4.11. Mức đồng nhất trình tự vùng ApMat của 9 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

6 7

TT Loài Mã GenBank C9 C44 C26 C6 C14 C1 Mức đồng nhất trình tự (%) C33 C29 C4

98,8 98,6 98,6 98,6 90,3 90,3 90,2 90,1 90,1 89,8 89,7 89,7 89,6 89,5 89,5 89,5 89,4 89,4 89,4 89,3 89,1 C. gloeosporioides s.s C. gloeosporioides s.s C. gloeosporioides s.s C. gloeosporioides s.s C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. aeschynomenes C. fructicola C. fructicola C. fructicola C. fructicola C. fructicola C. fructicola C. fructicola C. fructicola KJ954584 KJ954541 KJ954569 JQ807843 (T) KJ954494 KJ954495 JQ899283 KJ954509 KJ954508 JQ894551 JQ894562 JQ899289 (T) KM360145 (T) KJ954628 KJ954500 KJ954499 KJ954557 KJ954559 KJ954624 JQ894576 JQ807838 (T) 98,8 98,6 98,6 98,6 90,3 90,3 90,2 90,1 90,1 89,8 89,7 89,7 89,6 89,5 89,5 89,5 89,4 89,4 89,4 89,3 89,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 98,7 98,6 98,6 98,6 90,2 90,2 90,2 89,9 89,9 89,8 89,7 89,7 89,4 89,3 89,3 89,3 89,2 89,2 89,2 89,3 89,0 90,8 90,9 90,9 90,7 98,4 98,4 98,2 98,4 99,7 98,7 98,6 98,7 93,4 91,4 91,5 91,5 91,4 91,4 91,4 91,3 91,1 90,8 90,9 90,9 90,7 98,4 98,4 98,2 98,4 99,7 98,7 98,6 98,7 93,4 91,4 91,5 91,5 91,4 91,4 91,4 91,3 91,1 90,6 90,7 90,7 90,4 94,4 94,4 93,8 94,0 93,7 93,6 93,5 93,5 99,3 93,5 93,6 93,6 93,6 93,5 93,5 93,5 93,4 90,1 90,1 90,1 90,2 91,5 91,5 91,6 91,4 91,2 91,4 91,3 91,3 93,4 100,0 99,9 99,9 99,9 99,8 99,8 99,9 99,7 90,2 90,2 90,2 90,2 91,7 91,7 91,7 91,6 91,4 91,5 91,4 91,4 93,5 99,9 100,0 100,0 100,0 99,9 99,9 99,8 99,8 90,2 90,2 90,2 90,2 91,7 91,7 91,7 91,6 91,4 91,5 91,4 91,4 93,5 99,9 100,0 100,0 100,0 99,9 99,9 99,8 99,8

TT Loài Mã GenBank C9 C44 C26 C6 C14 C1 Mức đồng nhất trình tự (%) C33 C29 C4

6 8

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

Chú thích: (T): Type species: là mẫu chuẩn của loài (Liu et al., 2015)

C. aenigma C. xanthorrhoeae C. ti-ApMat C. alienum C. tropicale C. queenslandicum C. musae C. jiangxiense C. camelliae C. kahawae C. aotearoa C. clidemiae C. cordylinicola C. horii C. asianum C. alatae C. psidii C. henanense C. temperatum C. rhexiae C. theobromicola KM360143 (T) KC790689 (T) KM360146 (T) KM360144 (T) KC790728 (T) KC88892 (T) KC888926 (T) KJ954607 (T) KJ954497 (T) JQ894579 (T) KC888930 (T) KC888929 (T) JQ899274 (T) JQ807840 (T) FR718814 (T) C888932 (T) KC888931 (T) KJ954524 (T) JX145298 (T) JX145290 (T) KC790726 (T) 90,1 90,1 89,5 89,4 89,0 88,8 88,7 88,6 88,1 88,1 88,1 87,9 87,5 87,2 87,2 87,1 86,9 86,9 86,4 86,1 80,3 90,1 90,1 89,5 89,4 89,0 88,8 88,7 88,6 88,1 88,1 88,1 87,9 87,5 87,2 87,2 87,1 86,9 86,9 86,4 86,1 80,3 89,9 90,1 89,3 89,2 89,0 88,8 88,5 88,4 87,9 88,1 87,9 87,8 87,5 87,2 87,2 87,1 86,9 86,6 86,4 86,1 80,3 91,7 90,1 88,7 91,3 92,5 94,3 90,9 87,8 87,4 87,3 87,9 87,1 87,0 86,0 93,1 87,8 86,4 86,5 85,5 85,3 80,3 91,7 90,1 88,7 91,3 92,5 94,3 90,9 87,8 87,4 87,3 87,9 87,1 87,0 86,0 93,1 87,8 86,4 86,5 85,5 85,3 80,3 94,0 89,6 88,2 93,5 92,8 93,3 93,2 87,6 87,4 87,0 87,4 86,8 86,5 86,6 92,7 87,6 86,0 87,2 85,2 84,9 79,6 98,2 89,1 87,4 99,3 91,5 90,2 96,8 86,7 86,3 86,5 86,6 86,3 85,9 86,4 89,9 87,5 85,8 85,5 84,8 84,5 78,9 98,4 89,2 87,6 99,5 91,6 90,4 96,9 86,9 86,4 86,6 86,8 86,4 86,1 86,5 90,0 87,7 85,9 85,7 84,9 84,7 79,1 98,4 89,2 87,6 99,5 91,6 90,4 96,9 86,9 86,4 86,6 86,8 86,4 86,1 86,5 90,0 87,7 85,9 85,7 84,9 84,7 79,1

Chú thích: Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining (NJ). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) (chỉ trình bày các giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%). Ký tự (T) là mẫu đại diện loài (Type strain). Thanh tỷ lệ chỉ khoảng cách di truyền. Hình 4.5. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

Từ kết quả phân tích vùng ApMat của 9 mẫu nấm Colletotrichum thuộc

phức hợp loài C. gloeosporioides s.l có thể kết luận:

Hai mẫu C4 và C33 là loài C. siamense. Đây là loài được phát hiện thấy đầu

tiên trên cà phê tại Thái Lan năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và cũng có phổ ký

chủ rất rộng (Weir et al., 2012). Hiện trạng phân loại của loài này khá phức tạp.

C. siamense s.s và nhiều loài gần gũi như C. communis, C. dianesei, C. endomangiferae, C. hymenocallidis, C. jasmini-sambac, C. melanocaulon và

C. murrayae đã được phân loại là các thành viên của phức hợp loài C. siamense

s.l. Tuy nhiên, một nghiên cứu phân loại mới đây nhất, dựa trên phân tích đa gen,

giao phối chéo, hình thái học đã kết luận tất cả các loài trên đều là thành viên của

một loài duy nhất là C. siamense (Liu et al., 2016). Đây là lần đầu tiên, loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.

Ba mẫu C1, C6 và C14 là loài C. fructicola. Đây cũng là loài được phát

hiện đầu tiên trên cà phê tại Thái Lan năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và cũng

có phổ ký chủ và phân bố địa lý rất rộng (Weir et al., 2012). Đây là lần đầu tiên,

loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.

Ba mẫu C9, C26 và C44 là loài C. gloeosporioides s.s. Đây là loài có phổ

ký chủ khá hẹp, nhiễm chủ yếu trên cây có múi. Ngoài ra, loài này cũng được

phát hiện thấy trên một số cây như xoài, nho, Ficus, Pueraria, chè (Liu et al.,

2015; Udayanga et al., 2013; Weir et al., 2012). Đây là lần đầu tiên loài này được

phát hiện thấy tại Việt Nam.

Mẫu C29 là loài C. aeschynomenes. Đây là loài được định danh lại từ

C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes”. Loài này có phổ ký chủ và phân bố

rất hẹp, mới chỉ được công bố gây bệnh trên cây đậu dại (Aeschynomene

virginica) tại Mỹ (Weir et al., 2012) và cây ca cao tại Brazil (Nascimento et al.,

2019). Đây là lần đầu tiên, loài này được phát hiện thấy tại Việt Nam.

4.2.2. Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát hiện trên cây ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh

Dựa trên phân tích phân tử, ít nhất 5 loài Colletotrichum đã được phát hiện thấy gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH. Các đặc điểm tản nấm, hình thái bào tử phân sinh, đĩa áp của 5 loài được minh họa ở hình 4.6 và được mô tả tóm tắt dưới đây.

Loài C. gloeosporioides s.s. Tản nấm màu xanh xám, mặt dưới có màu xám nhạt đến hồng nhạt. Trong điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày nuôi cấy. Sợi nấm khí sinh màu trắng, mọc dày đặc. Bào tử phân sinh

đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước 11,0 - 12,0 × 3,4 - 4,3 µm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 7,3 - 9,5 × 4,5 - 5,3 µm (hình 4.6 A).

Loài C. siamense: Tản nấm lúc đầu màu trắng, bông xốp, sau đó dần chuyển sang màu phớt hồng, mặt dưới có màu vàng nhạt đến phớt hồng. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày nuôi cấy. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm và tạo thành các khối màu vàng gạch. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước kích thước 10,6 - 12,6 × 3,6 - 5,1 µm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 6,7 - 8,8 × 4,6 - 6,1 µm (hình 4.6 B).

Loài C. fructicola: Tản nấm lúc đầu màu trắng xám, bông xốp, sau đó phần trung tâm đĩa chuyển sang màu xám đậm, mặt dưới có màu xám đậm ở giữa và màu trắng xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước kích thước 11,2 - 12,5 × 3,6 - 4,9 µm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 6,7 - 8,2 × 5,1 - 6,2 µm (hình 4.6 C).

Loài C. aeschynomenes: Tản nấm màu trắng, tản nấm bông xốp, mặt dưới có vàng nhạt ở giữa và màu trắng xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm tạo thành màu vàng cam hoặc màu vàng cam đậm. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước kích thước 11,9 ± 1,1 × 4,6 ± 0,4 µm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số chẻ thùy, kích thước 9,7 ± 1,4 x 5,7 ± 0,6 µm (hình 4.6 D).

Loài C. truncatum: Tản nấm có màu xám đậm, mặt dưới có màu xám đậm ở giữa và màu xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 9 ngày. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm tạo thành khối màu nâu đậm. Bào tử phân sinh đơn bào, cong hình lưỡi liềm, thót nhọn ở hai đầu, kích thước 20,5 - 22,4 × 3,5 - 4,1 µm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 8,1 - 11,7 × 5,1 - 6,3 µm (hình 4.6 E).

Kết quả quan sát các đặc điểm hình thái của 5 loài nấm Colletotrichum phát hiện được hoàn toàn phù hợp với công bố của các tác giả Cannon et al. (2008), Damm et al. (2009), Prihattusi et al. (2009) và Weir et al. (2012).

Chú thích: A - C. gloeosporioides s.s (mẫu C44), B - C. siamense (mẫu C4), C - C. fructicola (mẫu C1), D - C. aechynomenes (mẫu C29), E - C. truncatum (mẫu C30). Ký tự a và b lần lượt là mặt trên và mặt dưới của tản nấm trên môi trường PDA sau cấy 7 ngày, c và d lần lượt là bào tử phân sinh và đĩa áp. Thanh bar: 10 µm.

Hình 4.6. Đặc điểm hình thái 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định được tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh

4.2.3. Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum gây hại trên cây ớt 4.2.3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu chẩn đoán nhanh loài Colletotrichum a. Xác định vùng thiết kế mồi phù hợp

Việc chẩn đoán đúng các loài nấm nói chung và loài Colletotrichum nói riêng có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn trong thực tiễn quản lý bệnh vì quan hệ giữa nấm với cây ký chủ cũng như tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài. Theo Cannon et al. (2000) và Hyde et al. (2009b), định danh các loài Colletotrichum dựa vào đặc điểm hình thái thường không chính xác do sự phụ thuộc cao về đặc điểm hình thái vào điều kiện môi trường. Vì vậy, phân tích phân tử đã ngày càng trở nên quan trọng và được xem là chuẩn vàng trong phân loại nhóm nấm này.

Hiện nay, các cặp mồi được sử dụng phổ biến để chẩn đoán các loài Colletotrichum là ITS, ApMat (White et al., 1990; Silva et al., 2012). Các cặp mồi này cho kết quả chẩn đoán chính xác nhưng chi phí thường cao. Vì vậy, việc thiết kế các mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán các loài Colletotrichum phổ biến tại ĐBSH nói riêng và tại Việt Nam nói chung là hết sức cần thiết.

Dựa vào mức độ phổ biến của các loài Colletotrichum phát hiện được tại ĐBSH và một số tỉnh, mồi đặc hiệu để chẩn đoán nhanh 4 loài nấm phổ biến là C. truncatum, C. gloeosporioides s.s, C. siamense và C. fructicola đã được thiết kế. Kết quả cụ thể như sau:

Đối với loài C. truncatum, kết quả giải trình tự gen vùng ITS xác định được vùng gen này hoàn toàn có thể lựa chọn để thiết kế mồi đặc hiệu vì chứa nhiều vị trí khác biệt đặc trưng cho loài này. Vùng ITS của loài này đã được căn trình tự đa chuỗi với 7 loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt và 2 vùng thiết kế mồi đã được lựa chọn (bảng 4.12).

Kết quả căn trình tự đa chuỗi thu được cho thấy, trình tự phần đầu 3’ ở vùng thiết kế mồi xuôi dòng của loài C. truncatum rất khác biệt so với trình tự tương ứng của các loài trong phân tích.

Bảng 4.12. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. truncatum dựa trên trình tự ITS của các loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt

TT

Loài

Mã GenBank

Vùng thiết kế mồi xuôi dòng

Vùng thiết kế mồi ngược dòng

HM171679 (T) GGTGCCGCCTGCGGACCC--CCC CCCTACGGTTGA-CGTAGG 1. C.coccodes GU227819 (T) GTTCCC--TCGCGGAACC---CC CCCTACGGTTAAACGTAGG 2. C.dematum JX010165 (T) GTCTCC-------GCGAC---CC CCCTACAGCTGA-TGTAGG 3. C.fructicola 4. C.gloeosporioides JX010152 (T) GTCTCC-------GCGAC---CC CCCTACAGCCGA-TGTAGG JX010171 (T) GTCTCC-------GCGAC---CC CCCTACAGCTGA-TGTAGG 5. C.siamense AF411700 (T) GAAGCCTCTCGCGGGCCT-CCCC CCCCACGG-AGA-CGTGGG 6. C.acutatum JQ948276 (T) GAAGCCTCTCGCGGGCCTTCCCC CCCCACGGCACA-CGTGGG 7. C.simmondsii GU227862 (T) GTCCCC--TAAAAAGGAC--GTC CTCTACGGTTGA-CGTAGG 8. C.truncatum

* ** * * ** * * ** **

Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất

Đối với 3 loài C. gloeosporioides s.s, C. siamense và C. fructicola của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l, do trình tự ITS của chúng quá bảo thủ nên trình tự vùng ApMat (Silva et al., 2012) đã được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu. Trình tự ApMat của 28 loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đã được căn trình tự đa chuỗi và 2 vùng thiết kế mồi phù hợp nhất cho mỗi loài đã được lựa chọn (bảng 4.13, bảng 4.14 và bảng 4.15).

Bảng 4.13. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. gloeosporioides s.s dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

7 4

C.nupharicola C.alienum C.aenigma C.musae C.aeschynomenes C.melanocaulon C.salsolae C.queensl&icum C.asianum C.tropicale C.alatae C.kahawae C.temperatum C.rhexiae C.jiangxiense C.camelliae C.clidemiae C.psidii C.cordylinicola C.ti C.aotearoa C.henanense C.horii C.xanthorrhoeae C.theobromicola C.fructicola C.siamense C.gloeosporioides

JX145319 (T) KM360144 (T) KM360143 (T) KC888926 (T) KM360145 (T) JX145313 (T) KC888925 (T) KC888928 (T) FR718814 (T) KC790728 (T) KC888932 (T) JQ894579 (T) JX145298 (T) JX145290 (T) KJ954607 (T) KJ954497 (T) KC888929 (T) KC888931 (T) JQ899274 (T) KM360146 (T) KC888930 (T) KJ954524 (T) JQ807840 (T) KC790689 (T) KC790726 (T) JQ807838 (T) JQ899289 (T) JQ807843 (T)

Loài Mã GenBank

Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất

Vùng thiết kế mồixuôi dòng ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG ACTCTTGCTACAGCATGCG-GC ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG GCTCTTGCTGCAGCATGCG-GG GCTCTTGCCGCAGCATGCGAGA ACTCTTTCCGCAGCATGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCAGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-CG AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGCAGCCCGCG-GG AGTCTTGCCGTAGCCCGCG-GG AGCCTTTCCGCAGCATGCG-GG ACTCTTGAAGCAGAATGCG-GG ACTCTTGCCGCAACATGCG-GG ACTCTAACCGCAACTTGCG-GG ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG ACTCTTGCCGCAGCATATA-GG ** Vùng thiết kế mồingược dòng CCGTTCCATGACTGATACTAC CCGTTCCATGACTGATACTAC CCGTTCCATGACTGATACTAC CAGTTCCATGACTGATACTAC TCGTTTCGTGGCTGTTGCTAC CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC CCGGTTCGTGGCTGATGCTAC CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC CTGTTTCGTGACCGATGCCAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGTTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCATGTCGTGGCTGAAGCAAC CCATGTCGTGGCTGATGCAAC CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC CGGTTTCGTGGTTGATGCCGC CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC CCGCTCTGTGGCTGATGCTAC CCGTTCCATGACTGATACTAC CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC CCAATTCGTTGCTGATGCTAC * * * * TT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

Bảng 4.14. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. siamense dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

7 5

AGACAGTGGC------TGGGCATCA AGACAGTGGC------TGGGCATCA AGACAGTGGC------TGGGCATCA AGACAGTGGC------TGGGCATCA AGACAGTGGC------TGGGCATCA TGACAGCGGC------TGCGTATCG TGACAGTGGC------TGTGTATCG TGACAGCGGC------TGTGTATCG TGACAGCGGC------TGTGTATCG TGACAGCGGC------TGTGTATCG AGACAGTGGC------TGGGCAACA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCATTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TGGCAGTGGC------TGGGCATCA TAGCAGTGGC------TAGGCATCA TGGCAGTGGCGGAGTATCGGTATCA TGACAGTGGC------CGGGTATCA TGACAGTGGC------TGGGTATCA TGATGATGGC------TACATATCG AGACAGTGGC------TGGGCATCA TGACAGCGGC------TGTGTATCG TGA----------------------

Loài Mã GenBank Vùng thiết kế mồi xuôi dòng

Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất

TT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. Vùng thiết kế mồi ngược dòng AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC AGCGTTCGCACGTCGAAGTATC TGCGTTCGCACGCCTAAGTTTC TGCATTCGTACGCCTAAGTATC TGCGTTCGTACGCCTAAGTATC TGCGTTCGCACGCCTAAGTATC TGCGTTCGTACGCCTCAGTATC AGCGTTCTTACGTTTAAGTTTC AGCGTTCGTACGTGCAAGTGTC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCATC AGCGGTCATACGCCAAAGCACC AGCGGTCGTACGCCTAAGCATC AGCGATCGTGCGCCTAGGCATC AGCGGTCGTACGCCTAAGTAGC AGCGATGGTACACCTGACCATC AGCGTTCGTACGTCTAATTATC TGCATTCGTACGCCTAAGTATC AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC ** * ** **

Bảng 4.15. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. fructicola dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

7 6

Mã GenBank

*** ** * *

* * **

Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất

Vùng thiết kế mồi xuôi dòng CATCAAATC----GAAGATCTCTGC CATCAAATC----GAAGATCTCTGC CATCAAATC----GAAGATCTCTGC CATCAAATC----GAAGATCTCTGC CATCAAATC----GAAGATCCCTGG CATTAAATC----GAAGATCTCTGG CATTAAATC----GAAGATCTCTGG CATTAAATC----GAAGATCCCTGG CATTAAATC----GAAGATCCCTGG CATTAAATC----GAAGATCCCTGG TATTAAATC----GAAGATCTCTGG CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG CATTAAATC--AAAAAAATCCCTGG CCTTAAATC-AAAAAAAATCTCTGG CATTAAATCAAAAAAAAATCTCTGG CATTAAAAC--AAAAAAATCTCTGG CATTAAATC---AAAAAATCTCTGG CATTAAATC---AAAAAATCTCTGG CATTAAATC----AAAGATCTCTGG CATCAAATC----AAATATCTCTGG TATTAAATC----AAAGATCTCTGG GACTAAATC----AAAACTCTCCGG CATCAAATC----GAAGATCTCTGC CATTAAATC----GAAGATCTCTGG CATCAAATC----GAAGATCTCTGG Vùng thiết kế mồi ngược dòng GAACACAAGGACGACCTAAAG GAACACAAGGACGACCTAAAG GAACACAAGGACGACCTAAGG GAACACAAGGACGACCTAGAG GGACACAAAGACAACCTGAGG GGACACAAAGACAACCTTAGG GGACACAAAGACAACCTGAGG GGACATAAAGACAACTTGAGG GGATACACAGACAACCTGAGG GGACACAAGGACAGCCTGAGG GGACATAGAGACAGCTTCATG GGATACAAAGACAACCTAATG GGATACAAAGACAACCTAATG AGATACAAAGACAACCTAATA GGATACAAAGACAACCTAATG GGATACAAAGACAACCTAATG GGATACAAAGACAAACTAATG GGATACAAAGACAAACTAATG GGATACAAAGACAACCTAATG GGATACAAAGACAACCTAATG GGATACAAAGACAACCTAATG GGATAAAAAGACCACCTGGTG GGATACAAAGACATTCTCATG GGATACAAAGACAGCCCAATG GGATACAAAGACAACCCAATG GAACACAAGGACGACCTAAAG GGACACAAAGACAACCTTAGG GGGCACAAAGACAACCTAAGG Loài C.nupharicola C.alienum C.aenigma C.musae C.aeschynomenes C.melanocaulon C.salsolae C.queensl&icum C.asianum C.tropicale C.alatae C.kahawae C.temperatum C.rhexiae C.jiangxiense C.camelliae C.clidemiae C.psidii C.cordylinicola C.ti C.aotearoa C.henanense C.horii C.xanthorrhoeae C.theobromicola C.fructicola C.siamense C.gloeosporioides TT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

b. Xác định các tham số của các mồi được thiết kế

Dựa trên trình tự của các vùng lựa chọn, các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài Colletotrichum đã được thiết kế (bảng 4.16). Một loạt các tham số liên quan đến

chất lượng của mồi cũng đã được xác định dựa theo các hướng dẫn về thiết kế

mồi PCR (Dieffenbach et al., 1993; Judelson, 2006; Rychlik et al., 1990).

Độ dài mồi: Tất cả các mồi đều có kích thước 18 - 22 nucleotide. Các kích

thước này nằm trong phạm vi phù hợp của mồi: đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu

và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn (bảng 4.16).

Nhiệt độ tách sợi: (Tm = Melting Temperature). Hai cặp mồi C.sia-F1/-R1 và C.glo-F/-R có nhiệt độ tách chuỗi từ 51,6 - 53,8oC, nằm trong phạm vi phù hợp 50 - 60oC. Hai cặp mồi còn lại, C-tru-F-/R và C.fru-F1/-R1 có nhiệt độ tách sợi thấp hơn từ 41,2 - 49oC (bảng 4.16).

Nhiệt độ gắn mồi: (Ta = annealing temperature). Nhiệt độ gắn mồi là một

trong các tiêu chí quan trọng, được tính dựa trên nhiệt độ tách sợi. Nhiệt độ gắn

mồi quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng suất PCR thấp. Nhiệt độ

gắn mồi quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản

phẩm không đặc hiệu. Một trong các công thức phổ biến nhất nhằm xác định

nhiệt độ gắn mồi tối ưu của cặp mồi là: Ta = 0,3 × Tm (của mồi có nhiệt độ

tách sợi thấp hơn) + 0,7 Tm (của sản phẩm) -14,9 (Rychlik et al., 1990). Sử

dụng công thức này trong phần mền PrimerSelect (DNASTAR inc.), nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 4 cặp mồi thiết kế đã được xác định là từ 53 - 55,9oC, nằm trong phạm vi phù hợp 50 - 60oC (bảng 4.16).

Hàm lượng GC: Hàm lượng các gốc G và C của các mồi thiết kế từ 42,9 -

57,9% nằm trong phạm vi phù hợp 40 - 60% (bảng 4.16).

Mấu GC đầu 3’: Tất cả 7 mồi thiết kế ngoại trừ mồi C.sia-R1 đều có ở đầu 3’ là G hoặc C hoặc GC hoặc CG hoặc GG. Mấu GC cho phép mồi bám đặc hiệu vào khuôn (bảng 4.16).

Độ ổn định đầu 3’: Khoảng 5 nucleotide (pentamer) đầu 3’ cần có độ ổn định phù hợp để gắn đặc hiệu vào khuôn. Giá trị ΔG của 5 nucleotide đầu 3’ của tất cả các mồi thiết kế có giá trị từ -10,5 kcal/mol đến -7,1 kcal/mol, nằm trong

ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -12 kcal/mol (bảng 4.16).

Bảng 4.16. Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế nhằm phát hiện C. truncatum, C. fructicola, C. siamense và C. gloeosporioides s.s

Độ dài mồi

Mấu GC đầu 3’

Hàm lượng GC

Nhiệt độ tách mồi

ΔG pentamer đầu 3'

ΔG cấu trúc kẹp tóc tối đa

ΔG tự mồi chéo tối đa

ΔG tự mồi tối đa

Mồi

Trình tự (5’-3’)

Nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Độ dài sản phẩm

(nu)

(%)

(OC)

(kcal/mol)

(OC)

(bp)

(kcal/ mol)

C.tru-F

GTCCCCTAAAAAGGACGTC

52,6

47,7

-9,4

-1,9

-4,4

-2,9

321

C.tru-R

CCTACGTCAACCGTAGAG

55,6

42,2

-7,1

-3,1

-2,5

C.fruc-F1 CATCAAATCGAAGATCTCTGC

42,9

49,0

-9,9

1,1

-2,8

7 8

-0,2

55,3

307

C.fruc-R1 CTTTAGGTCGTCCTTGTGTTC

47,6

48,2

-8,2

1,2

0,3

C.sia-F1

TGACAGCGGCTGTGTATCG

57,9

52,8

-9

0,8

-3

-0,4

54,2

345

C.sia-R1 GATACTTAGGCGTACGAATGCA

Không

45,5

51,6

-10,5

-5,9

C.glo-F

ACTCTTGCCGCAGCATATAGG

52,4

53,8

-8,1

0,8

-0,1

-2

55,9

211

C.glo-R

GTAGCATCAGCAACGAATTGG

47,6

52,5

-10,4

-0,4

Chú thích: Các tham số nhiệt động học của mồi gồm nhiệt độ tách mồi, ΔG pentamer đầu 3’, ΔG cấu trúc kẹp tóc tối đa, ΔG tự mồi tối đa và ΔG tự mồi chéo tối đa được xác

định dùng phần mềm VectorNTI Advance 11.5 (Invitrogen), trong đó ΔG là năng lượng tự do Gibbs. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định bằng phần mềm PrimerSelect

(DNASTAR, Inc.).

Cấu trúc thứ cấp: Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi

hoặc giữa 2 mồi. Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thường dẫn tới năng suất PCR bị

giảm, thậm chí không có sản phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp được đo

bằng năng lượng tự do Gibbs ΔG (là năng lượng cần để phá vỡ cấu trúc thứ cấp).

Các loại cấu trúc thứ cấp là:

+ Cấu trúc kẹp tóc (Hairpins). Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ

mồi. Tất cả các mồi thiết kế đều có giá trị ΔG tối đa từ -3 kcal/mol đến 2

kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -5 kcal/mol (bảng 4.16).

+ Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của cùng

loại mồi. Tất cả các mồi thiết kế đều có giá trị ΔG tối đa từ -5,9 kcal/mol đến 0,3

kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -6 kcal/mol (bảng 4.16).

+ Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của

2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Tất cả các mồi thiết kế đều có

giá trị ΔG tối đa từ -0,4 kcal/mol đến -0,2 kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn

tối đa ≥ -6 kcal/mol (bảng 4.16).

Như vậy, dựa vào vùng trình tự ITS và ApMat đã thiết kế được 4 cặp mồi

C.sia-F1/-R1, C.glo-F/-R, C-tru-F-/R và C.fru-F1/-R1. Các cặp mồi này sẽ được

dùng để xác định các loài nấm C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. siamense

và C. truncatum gây bệnh thán thư ớt.

4.2.3.2. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho các cặp mồi thiết kế

Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu suất

của mồi là nhiệt độ gắn mồi. Mặc dù nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho 4 cặp mồi đã

được xác định bằng phần mềm nhưng chúng cần phải được xác định bằng thực

nghiệm. Sử dụng DNA được chiết từ các mẫu nấm đã được xác định danh tính, phản ứng PCR đã được thực hiện ở 3 ngưỡng nhiệt độ là 54oC, 58oC và 62oC nhằm xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi thiết kế. Kết quả kiểm

tra PCR (bảng 4.17, hình 4.7 và phụ lục 2) cho thấy:

Cặp mồi C.tru-F và C.tru-R (đặc hiệu loài C. truncatum) có khả năng phát

hiện đặc hiệu loài này ở phạm vi nhiệt độ rất rộng. Ở cả 3 ngưỡng nhiệt độ, cặp

mồi này chỉ tạo băng sản phẩm mong muốn 321 bp đối với 2 mẫu C30 và C25 (C. truncatum). Băng đặc hiệu tạo ra ở nhiệt độ 58oC và 62oC đậm hơn 54oC (bảng 4.17, hình 4.7).

Bảng 4.17. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế

C. truncatum

Cặp mồi Loài nấm kiểm tra

C. fructicola

C.tru-F/-R

C. siamense

C. gloeosporioides s.s

C. aeschynomenes

C. truncatum

+++

C. fructicola

C.fruc-F1/-R1

C. siamense

C. gloeosporioides s.s

C. aeschynomenes

C. truncatum

+++

C. fructicola

+++

C.sia-F1/-R1

C. siamense

+++

C. gloeosporioides s.s

+++

C. aeschynomenes

+++

C. truncatum

C. fructicola

C.glo-F/-R

C. siamense

C. gloeosporioides s.s

+++

C. aeschynomenes

Chú thích: (-): không xuất hiện băng đặc hiệu; (+, ++, +++): mức độ đậm của băng đặc hiệu

Tương tự, cặp mồi C.glo-F và C.glo-R (đặc hiệu loài C. gloeosporioides s.s)

cũng có khả năng phát hiện đặc hiệu loài nấm này ở cả 3 ngưỡng nhiệt độ, chỉ tạo

băng sản phẩm mong muốn 211 bp đối với 2 mẫu C9 và C44 (C. gloeosporioides s.s). Băng đặc hiệu tạo ra ở nhiệt độ 58oC và 62oC đậm hơn 54oC (bảng 4.17, hình 4.7).

Đối với cặp mồi C.fruc-F1 và C.fruc-R1 (đặc hiệu loài C. fructicola), ở nhiệt độ gắn mồi 54oC, băng đặc hiệu 307 bp mặc dù chỉ hình thành ở 2 mẫu C1 và C14 (C. fructicola) nhưng mờ, có lẽ do hình thành nhiều sản phẩm tự mồi hoặc tự mồi chéo (dimer). Ngoài ra, ở ngưỡng nhiệt độ này, cặp mồi cũng tạo sản phẩm không đặc hiệu ~ 800 bp đối với mẫu C29 (C. aeschynomenes) và ~150 bp đối với mẫu C25 (C. truncatum). Ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, cặp mồi đã tạo băng đặc hiệu rõ đối với 2 mẫu C1 và C14 (C. fructicola) chứng tỏ mức độ hình thành dimer đã

Băng PCR đặc hiệu ở các ngưỡng nhiệt độ 58oC +++ 62oC +++ 54oC ++

giảm. Tuy nhiên, ở ngưỡng nhiệt độ 58oC, cặp mồi cũng tạo băng sản phẩm đặc hiệu rất mờ đối với mẫu C44 (C. gloeosporioides s.s). Khi tăng nhiệt độ lên 62oC, cặp mồi này chỉ tạo băng đặc hiệu và rõ đối với 2 mẫu C1 và C14 và không tạo bất

kỳ băng sản phẩm nào đối với các mẫu Colletotrichum khác (bảng 4.17, hình 4.7).

Đối với cặp mồi C.sia-F1 và C.sia-R1 (đặc hiệu loài C. siamense), phản ứng PCR ở nhiệt độ gắn mồi 54oC đã tạo băng đặc hiệu 345 bp với tất cả các mẫu nấm. Ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, cặp mồi này đã tạo băng đặc hiệu rõ đối với 2 mẫu C4 và C33 (C. siamense) và rất mờ đối với mẫu C30 (C. truncatum). Ở ngưỡng nhiệt độ 58oC, cặp mồi cũng tạo băng sản phẩm không đặc hiệu đối với mẫu C1 (C. fructicola) và C44 (C. gloeosporioides s.s). Khi tăng nhiệt độ gắn mồi lên 62oC, cặp mồi này đã tạo băng đặc hiệu, rõ đối với 2 mẫu C4 và C33 (C. siamense). Ở nhiệt độ gắn mồi 62oC, cặp mồi vẫn tạo băng không đặc hiệu đối với mẫu C1 (C. fructicola), tuy nhiên băng này có thể phân biệt được với băng

đặc hiệu (bảng 4.17, hình 4.7).

Dựa vào các kết quả trên, nhiệt độ gắn mồi tối ưu đối với các cặp mồi C.tru-F/- R, C.glo-F/-R được xác định là 58 - 62oC, đối với các cặp mồi C.fru-F1/-R1, C.sia- F1/-R1 là 62oC.

Chú thích: Mũi tên chỉ băng sản phẩm mong muốn cho từng cặp mồi Các giếng là các mẫu nấm đã xác định danh tính: C25 và C30 (C. truncatum), C1 và C14 (C. fructicola), C4 và C33 (C. siamense), C9 và C44 (C. gloeosporioides s.s), C29 (C. aeschynomenes) Hình 4.7. PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum

4.2.3.3. Tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum

Chuẩn bị khuôn DNA cho phản ứng PCR là công đoạn tốn thời gian và công sức. Mục tiêu của thí nghiệm này là đánh giá liệu phương pháp chiết nhanh bằng NaOH có phù hợp để chiết DNA từ nấm Colletotrichum cho phản ứng PCR hay không.

Có rất nhiều qui trình chiết tách DNA cho phản ứng PCR từ các loại sinh vật và vi sinh vật gồm thực vật, động vật (côn trùng, nhện, tuyến trùng), nấm và vi khuẩn. Thông thường, có 3 nhóm kỹ thuật chiết DNA gồm:

1. Dùng kít chiết thương mại. Có rất nhiều các kít chiết thương mại trên thị trường. Chất lượng DNA rất tốt nhưng chi phí chẩn đoán cao do giá các kít chiết thường rất đắt. Để hoàn thành chiết DNA cho 1 mẫu nấm bằng kít chiết thương mại cần thời gian là 75 phút.

2. Dùng các kỹ thuật chiết thủ công. Có rất nhiều qui trình chiết DNA thủ công, trong đó, người sử dụng tự pha chế các đệm và dung dịch cần thiết. Một ví dụ là kỹ thuật chiết sử dụng CTAB. Các kỹ thuật chiết thủ công thường gồm nhiều bước, liên quan đến sử dụng dung môi độc hại và lượng DNA thu được không được tinh khiết bằng dùng kít chiết thương mại. Thời gian để hoàn thành chiết DNA cho 1 mẫu nấm bằng kỹ thuật chiết sử dụng CTAB là 75 phút.

3. Chiết nhanh. Trong các trường hợp không yêu cầu độ tinh khiết của DNA cao, chẳng hạn phản ứng PCR, kỹ thuật chiết nhanh như công phá tế bào bằng NaOH sau đó trung hòa bằng hòa loãng hoặc sử dụng đệm có pH thấp có thể được áp dụng. Để hoàn thành chiết DNA cho 1 mẫu nấm bằng cách sử dụng NaOH chỉ cần thời gian là 5 phút.

Trong nghiên cứu này, để tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum, NaOH đã được sử dụng dựa trên qui trình chiết DNA từ mô thực vật được công bố bởi Wang et al. (1993). Nguyên lý của kỹ thuật rất đơn giản: NaOH công phá vách, màng tế bào, màng nhân, màng cơ quan tử như ty thể và giải phóng DNA. Dịch nghiền được trung hòa bằng cách hòa loãng với đệm Tris.

Bốn cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho 4 loài Collettotrichum đã được kiểm tra PCR trên các mẫu nấm đã được định danh loài. DNA của mỗi mẫu nấm được chiết bằng cả 2 phương pháp là CTAB và chiết nhanh bằng NaOH. Kết quả kiểm tra PCR cho thấy băng PCR đặc hiệu hình thành ở 8 mẫu nấm đại diện cho 4 loài nấm nhìn chung đều rõ tương đương nhau ở 2 phương pháp (bảng 4.18 và hình 4.8).

Gần đây, Osmundson et al. (2013) đã đánh giá phương pháp chiết nhanh DNA của nhiều loài nấm thật và Phytophthora bằng NaOH cho phản ứng PCR và đã chứng tỏ phương pháp rất hiệu quả, tin cậy mặc dù năng suất DNA thu được không cao bằng các phương pháp chiết khác. Trong qui trình của Wang et al. (1993) và Osmundson et al. (2013), dịch nghiền mô thực vật hoặc nấm trong NaOH 0.5 M được hòa loãng 500 lần với đệm Tris 0.1 M, pH8. Trong nghiên cứu này, dịch nghiền nấm Colletotrichum trong NaOH chỉ được hòa loãng 11 lần trong đệm Tris, do đó làm tăng nồng độ DNA của mẫu chiết. Kết quả so sánh phản ứng PCR giữa 2 phương pháp cũng chứng tỏ nấm Colletotrichum không tạo các chất ức chế phản ứng PCR và độ hòa loãng thấp của dịch NaOH trong đệm Tris không làm thay đổi nồng độ ion Na+ và pH tới mức ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng PCR.

Bảng 4.18. Kết quả PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm

C.glo-F/-R

C. gloeosporioides s.s

C.fruc-F1/-R1

C. fructicola

C.sia-F1/-R1

C. siamense

C.tru-F/-R

C. truncatum

Băng PCR đặc hiệu ở hai phương pháp chiết DNA nấm Cặp mồi Loài

CTAB +++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ NaOH +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ Mẫu kiểm tra C9 C44 C1 C14 C4 C33 C25 C30 Chú thích: ++, +++: mức độ đậm của băng đặc hiệu

Chú thích: M là thang DNA 100 bp (Generuler 100 bp, Thermo Scientific) với các băng từ 100 - 500 bp được chỉ bằng mũi tên. Các giếng là các mẫu nấm đã xác định danh tính: C25 và C30 (C. truncatum), C1 và C14 (C. fructicola), C4 và C33 (C. siamense), C9 và C44 (C. gloeosporioides s.s) Hình 4.8. Phản ứng PCR so sánh 2 phương pháp chiết DNA (CTAB và NaOH) từ nấm Colletotrichum với 4 cặp mồi đặc hiệu

Sử dụng NaOH để chiết có rất nhiều ưu điểm: (1) Cực kỳ nhanh chóng, chỉ gồm 2 bước là nghiền sợi nấm hoặc bào tử trong NaOH và sau đó hòa loãng bằng

đệm Tris; (2) giảm thiểu nhiễm chéo giữa các mẫu do số bước chiết ít; (3) bảo vệ

DNA khỏi bị phân hủy bởi enzyme do NaOH phân hủy ngay lập tức các nuclease

được giải phóng trong quá trình nghiền.

Do các ưu điểm trên, chiết bằng kỹ thuật NaOH ngày càng được ưa chuộng

đối với các ứng dụng PCR thông thường vì lượng DNA không cần nhiều và

DNA không cần quá sạch.

Kết quả thu được của thí nghiệm cho thấy, phương pháp chiết nhanh

bằng NaOH biến đổi hoàn toàn phù hợp để chiết DNA từ mẫu nấm

Colletotrichum cho phản ứng PCR.

4.2.4. Xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR 4.2.4.1. Xác định thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR

Sau khi xác định được nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho 4 cặp mồi thiết kế và

phương pháp chiết DNA phù hợp từ mẫu nấm Colletotrichum, phản ứng PCR đã

được thực hiện trên 52 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại 9

tỉnh thuộc ĐBSH và 4 tỉnh khác gồm Bắc Giang, Thái Nguyên, Sơn La và Tiền

Giang. Đầu tiên, các mẫu nấm được kiểm tra PCR bằng cặp mồi C.sia-F1/-R1.

Tiếp theo các mẫu nấm âm tính với cặp mồi này lại được kiểm tra lần lượt bằng

các cặp mồi C.fruc-F1/-R1, C.glo-F-R và C.tru-F/-R theo phương pháp loại trừ.

Kết quả kiểm tra được tổng hợp và trình bày tại bảng 4.19, hình ảnh các sản

phẩm PCR được trình bày tại phụ lục 2.

Kết quả kiểm tra PCR các mẫu nấm Colletotrichum thu thập (bảng 4.19) đã

xác định được 27 mẫu nấm là loài C. siamense (C2, C4, C5, C7, C11, C12, C16,

C17, C18, C19, C22, C23, C24, C27, C28, C31, C33, C36, C37, C38, C40, C41, C42, C47, C50, C51, C54), 11 mẫu nấm là loài C. fructicola (C1, C3, C6, C10, C14, C32, C34, C43, C45, C46, C52), 5 mẫu nấm là loài C. gloeosporioides s.s (C9, C15, C26, C39, C44) và 8 mẫu nấm là loài C. truncatum (C8, C13, C20, C25, C30, C35, C48, C53). Riêng mẫu C29 phản ứng âm tính với cả 4 cặp mồi, mẫu này đã được giải trình tự vùng ApMat và được xác định là loài

C. aeschynomenes.

Bảng 4.19. Phát hiện các loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập bằng PCR

TT Mẫu

Địa điểm thu thập

Loài xác định

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

C1 Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội C2 Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội C3 Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình C4 Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình C5 Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên C6 Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên C7 Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên C8 Tiền Phong, Ân Thi, Hưng Yên An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh C9 C10 An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh C11 Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh C12 Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh C13 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C14 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C15 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C16 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C17 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C18 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng C19 Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình C20 Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình C22 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam C23 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam C24 Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên C25 Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội C26 Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên C27 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam C28 Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên C29 Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên C30 Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội C31 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam C32 Thị trấn Nông trường, Mộc Châu, Sơn La C33 Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La C34 Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La C35 Long Thành, Long Định, Tiền Giang C36 Long Thành, Long Định, Tiền Giang C37 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam C38 Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định C39 Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định C40 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang C41 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang C42

C.sia- F1/-R1 - + - + + - + - - - + + - - - + + + + 0 + + + - - + + - - + - + - - + + + - + + +

Phản ứng PCR C.glo- C.fruc- F/-R F1/-R1 - + - 0 - + 0 - 0 0 - + 0 0 0 0 + 0 - + 0 0 0 0 0 0 0 + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0 0 0 0 - 0 + 0 0 0 0 0 - - 0 - - 0 - + 0 0 - + 0 0 0 0 - 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0

C.tru- F/R - 0 0 - 0 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 + 0 0 0 - + 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0

C. fructicola C. siamense C. fructicola C. siamense C. siamense C. fructicola C. siamense C. truncatum C. gloeosporioides s.s C. fructicola C. siamense C. siamense C. truncatum C. fructicola C. gloeosporioides s.s C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense C. truncatum C. siamense C. siamense C. siamense C. truncatum C. gloeosporioides s.s C. siamense C. siamense C. aeschynomenes C. truncatum C. siamense C. fructicola C. siamense C. fructicola C. truncatum C. siamense C. siamense C. siamense C. gloeosporioides s.s C. siamense C. siamense C. siamense

TT Mẫu

Địa điểm thu thập

Loài xác định

Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang

42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

C43 C44 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội C45 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội C46 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình C47 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình C48 Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội C50 Việt Hồng, Thanh Hà, Hải Dương C51 Thanh Hải, Thanh Hà, Hải Dương C52 Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương C53 Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương C54 Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương

C.sia- F1/-R1 - - - - + 0 + + - - +

Phản ứng PCR C.glo- C.fruc- F/-R F1/-R1 - + + - - + - + 0 0 0 0 0 0 - - - + 0 0 0 0

C.tru- F/R 0 - 0 0 0 + 0 0 0 + 0

C. fructicola C. gloeosporioides s.s C. fructicola C. fructicola C. siamense C. truncatum C. siamense C. siamense C. fructicola C. truncatum C. siamense

Chú thích: +: phản ứng PCR dương tính; -: phản ứng PCR âm tính; 0: Không kiểm tra

Theo Don et al. (2007) và Ngô Bích Hảo (1991, 1992, 1993), thành phần nấm gây bệnh thán thư ớt tại Việt Nam gồm 4 loài: C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum. So sánh kết quả thu được với các công bố trước đây chúng tôi nhận thấy, thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh có sự sai khác đáng kể khi không ghi nhận sự xuất hiện của 2 loài C. acutatum và C. nigrum. Ba loài nấm được xem là phát hiện mới tại Việt Nam gồm C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes thực chất là các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l - đây là các loài chỉ được xác định chính xác khi phân tích trình tự gen. Sở dĩ có sự sai khác trên là do các công bố thành phần loài trước đây có thể chỉ được thực hiện dựa trên đặc điểm hình thái nên không thể xác định được chính xác tới mức loài của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l.

4.2.4.2. Phân bố và mức độ đa dạng của các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh

Dựa trên kết quả PCR, phân bố và mức độ đa dạng các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh đã được xác định. Kết quả được thể hiện tại bảng bảng 4.20 và hình 4.9.

a. Phân bố của C. siamense

C. siamense là loài nấm phổ biến nhất, phát hiện thấy ở tất cả 13 tỉnh thu thập mẫu gồm 9 tỉnh ĐBSH, 3 tỉnh trung du miền núi phía Bắc (Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La) và 1 tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long (Tiền Giang). Số lượng loài này được phát hiện cũng nhiều nhất, chiếm 51,9% tổng số mẫu thu thập tại 13 tỉnh (tổng mẫu = 52) và 51,2% tổng số mẫu thu thập tại ĐBSH (tổng mẫu = 41) (bảng 4.20, hình 4.9).

Bảng 4.20. Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh

Số lượng mẫu nấm theo loài

TT Tỉnh

C. siamense

C. fructicola

C. truncatum

C. aeschynomenes

Số mẫu nấm

1 Bắc Ninh 2 Hà Nam 3 Hà Nội 4 Hải Dương 5 Hải Phòng 6 Hưng Yên 7 Nam Định 8 Ninh Bình Thái Bình 9 4 5 7 5 6 6 2 2 4 2 5 1 3 3 3 1 1 2

C. gloeosporioides s.s 1 0 1 0 1 1 1 0 0

1 0 2 1 1 1 0 1 1 0 0 3 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ĐBSH 41 21 5 8 7 0

10 Bắc Giang 11 Thái Nguyên 12 Sơn La 13 Tiền Giang Tổng 4 2 3 2 52 3 1 1 1 27 0 0 0 0 5 1 0 2 0 11 0 0 0 1 8 0 1 0 0 1

Hình 4.9. Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất cả các địa điểm (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B)

C. siamense là loài được phát hiện thấy đầu tiên trên cà phê tại Thái Lan năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và có phổ ký chủ rất rộng (Weir et al., 2012). Mặc dù loài này đã được phát hiện thấy gây hại trên ớt tại Thái Lan (Suwannarat et al., 2017) và Ấn Độ (Sharma & Shenoy, 2013), Úc (De Silva et al., 2017a) nhưng lại

không được liệt kê trong thành phần loài hại ớt tại Trung Quốc (Diao et al., 2017). Loài C. hymenocallidis, một trong các loài được phát hiện trên ớt tại Trung Quốc

(Diao et al., 2017) cũng chính là C. siamense theo nghiên cứu của Liu et al. (2016).

b. Phân bố của C. fructicola

Loài C. fructicola là loài nấm phổ biến thứ hai, được phát hiện ở 9/13 tỉnh

thu thập mẫu, gồm 7 tỉnh ĐBSH và 2 tỉnh trung du miền núi phía Bắc (Thái Nguyên, Sơn La). Số lượng loài này được phát hiện nhiều thứ hai, chiếm 21,2%

tổng số mẫu thu thập tại 13 tỉnh và 19,5% tổng số mẫu thu thập ĐBSH (bảng

4.20, hình 4.9).

C. fructicola cũng là loài được phát hiện đầu tiên trên cà phê tại Thái Lan

năm 2009 (Prihastuti et al., 2009) và cũng có phổ ký chủ và phân bố địa lý rất

rộng (Weir et al., 2012). Giống như tại Việt Nam, loài này cũng phổ biến trên ớt

tại Ấn Độ (Sharma & Shenoy, 2013) và Trung Quốc (Diao et al., 2017).

c. Phân bố của C. truncatum

Loài C. truncatum là loài nấm phổ biến thứ ba, phát hiện thấy ở 6/13 tỉnh

thu thập mẫu gồm 5 tỉnh ĐBSH và Tiền Giang. Số lượng loài này được phát hiện

nhiều thứ ba, chiếm 15,4% tổng số mẫu thu thập tại 13 tỉnh và 17,1% tổng số

mẫu thu thập tại ĐBSH (bảng 4.20, hình 4.9).

C. truncatum, trước kia được gọi là C. capsici (Damm et al., 2010) là một

trong các loài Colletotrichum có ý nghĩa kinh tế với phổ ký chủ và tính gây bệnh

rất đa dạng (Ranathunge et al., 2012). Loài này cũng là loài phổ biến trên ớt tại

Ấn Độ (Sharma and Shenoy, 2013), Thái Lan (Ko et al., 2011; Suwannarat et al.,

2017), Úc (De Silva et al., 2017a) và là loài phổ biến nhất trên ớt tại Trung Quốc

(Diao et al., 2017).

d. Phân bố của C. gloeosporioides s.s

Loài C. gloeosporioides s.s là loài phổ biến thứ tư, phát hiện thấy ở 5 tỉnh ĐBSH là Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hưng Yên và Nam Định. Số lượng loài này được phát hiện là 5 mẫu, chiếm 9,6% tổng số mẫu thu thập tại 13 tỉnh và

12,2% tổng số mẫu thu thập tại ĐBSH (bảng 4.20, hình 4.9).

C. gloeosporioides s.s ban đầu được biết có phổ ký chủ khá hẹp, nhiễm chủ yếu trên cây có múi. Tuy nhiên gần đây, loài này cũng được phát hiện thấy trên

một số cây như xoài, nho, Ficus, Pueraria, chè (Liu et al., 2015; Udayanga et al.,

2013; Weir et al., 2012). Đáng chú ý, loài này đã được xác định phổ biến thứ hai

trên ớt tại Trung Quốc (Diao et al., 2017).

e. Phân bố của C. aeschynomenes

Riêng loài C. aeschynomenes chỉ phát hiện duy nhất 1 mẫu thu tại Thái Nguyên. C. aeschynomenes là loài được định danh lại từ C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes”. Loài này có phổ ký chủ và phân bố rất hẹp, mới chỉ được công bố gây bệnh trên cây đậu dại (Aeschynomene virginica) tại Mỹ (Weir et al., 2012) và rất gần đây, trên cây ca cao tại Brazil (Nascimento et al., 2019) (bảng 4.20, hình 4.9).

f. Mức độ đa dạng các loài Colletotrichum tại các tỉnh

Nhìn chung, mức độ đa dạng loài Colletotrichum tại ĐBSH là khá cao. Trong số các tỉnh thu thập mẫu, Hà Nội, Hưng Yên và Hải Phòng là 3 tỉnh có thành phần loài đa dạng nhất khi có sự xuất hiện của cả 4 loài nấm là C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola và C. truncatum tại mỗi tỉnh. Hai tỉnh Hải Dương và Thái Bình cũng ghi nhận sự xuất hiện của 3 loài nấm là C. siamense, C. fructicola và C. truncatum. Tỉnh Bắc Ninh xuất hiện 3 loài nấm C. siamense, C. fructicola và C. gloeosporioides s.s. Tỉnh Nam Định xuất hiện 2 loài nấm C. siamense và C. gloeosporioides s.s. Tỉnh Thái Nguyên xuất hiện 2 loài nấm C. siamense và C. aeschynomenes. Tỉnh Tiền Giang xuất hiện 2 loài nấm C. siamense và C. truncatum. Các tỉnh Ninh Bình, Bắc Giang và Sơn La ghi nhận sự xuất hiện chỉ 2 loài là C. siamense và C. fructicola. Duy nhất, tỉnh Hà Nam ghi nhận 100% số mẫu thu thập là loài C. siamense.

4.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH GÂY BỆNH CỦA CÁC LOÀI Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT ĐƯỢC THU THẬP

4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum

Môi trường là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu các đặc điểm của nấm. Việc lựa chọn môi trường thích hợp để nấm sinh trưởng, phát triển tốt, có màu sắc đặc trưng, đồng thời cho số lượng bào tử hình thành cao, giúp cho công tác bảo tồn nguồn nấm phục vụ cho các nghiên cứu trong phòng cũng như cho các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo là rất cần thiết. Các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây về nuôi cấy các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng cho thấy: trên môi trường PDA, loài C. gloeosporioides s.s có tốc độ phát triển tản nấm trung bình 11,2 mm/ ngày, loài C. fructicola đạt 10,3 - 13,4 mm/ ngày, loài C.

siamense đạt 10,5 - 12,4 mm/ ngày và loài C. truncatum đạt 6,5 - 0,5 mm/ ngày (Than et al., 2008b; Yang et al., 2009; Chethana et al., 2015; Kommula et al., 2017).

Để tìm hiểu khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum thu thập, 5 loài nấm phát hiện được nuôi cấy trên 3 loại môi trường PDA, PCA, WA. Kết quả đánh giá tốc độ phát triển tản nấm, khả năng hình thành bào tử của các loài nấm được trình bày tại bảng 4.21 và hình 4.10.

Trong 3 loại môi trường nuôi cấy, PDA là môi trường thuận lợi nhất để phát triển tản nấm của 5 loài Colletotrichum. Đường kính tản nấm của 4 loài (C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes) đạt 90 mm sau 7 ngày nuôi cấy, loài C. truncatum đạt kích thước tương tự sau 9 ngày. Tiếp đến là môi trường PCA, đường kính tản nấm sau 9 ngày nuôi cấy của các loài đạt 67,7 - 81,1 mm và thấp nhất trên môi trường WA, đường kính tản nấm chỉ đạt 60,7 - 70,7 mm sau 9 ngày nuôi cấy (bảng 4.21 và hình 4.10).

Trong 5 loài nấm, tốc độ phát triển tản nấm của loài C. truncatum chậm hơn 4 mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes) ở 3 loại môi trường tại tất cả các thời điểm theo dõi. Trên môi trường PDA, sau 7 ngày đường kính tản nấm của loài C. truncatum đạt 67,3 mm (tương đương 9,6 mm/ ngày); 4 loài còn lại đường kính tản nấm đều đạt 90 mm sau 7 ngày (tương đương 12,8 mm/ ngày) (bảng 4.20). Như vậy, kết quả thu được về tốc độ phát triển tản nấm của các loài nấm thí nghiệm là phù hợp với các công bố của Than et al. (2008a), Yang et al. (2009), Chethana et al. (2015), và Kommula et al. (2017).

Khả năng sinh bào tử của nấm trong điều kiện tự nhiên cũng như nuôi cấy nhân tạo bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm nguồn dinh dưỡng, nhịp điệu sinh học và di truyền. Nhiều loài nấm thuộc nhóm sinh dưỡng rất khó sinh bào tử trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo và để sinh bào tử chúng yêu cầu một số kích thích đặc biệt bao gồm cơ chất và chế độ chiếu sáng. Nấm Colletotrichum được xem là nhóm nấm sinh bào tử tương đối dễ dàng trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Tuy nhiên mức độ sinh bào tử của nhóm nấm này cũng không đồng nhất, tùy thuộc nguồn nấm và điều kiện nuôi cấy, chủ yếu là nguồn dinh dưỡng (Su et al., 2012).

Kết quả thu được của thí nghiệm cho thấy, môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng đến thời điểm và số lượng bào tử hình thành của các loài nấm thí nghiệm. Bào tử của các loài nấm xuất hiện sớm nhất ở thời điểm sau 5 ngày nuôi cấy trên 2 môi trường PDA, PCA và muộn nhất trên môi trường WA sau 9 ngày nuôi cấy. Trong 3 loại môi trường sử dụng, môi trường PDA và PCA có 5 loài nấm hình

thành bào tử, trên môi trường WA chỉ có 4 loài (C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes và C. truncatum) hình thành bào tử, loài C. gloeosporioides s.s không hình thành bào tử sau 9 ngày theo dõi (bảng 4.21, hình 4.10).

Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, điều kiện dinh dưỡng có ảnh hưởng đến số lượng bào tử hình thành của các loài nấm. Trong các loại môi trường thí nghiệm, tất cả 5 loài nấm đều sinh bào tử nhiều nhất môi trường PCA, tiếp đến là môi trường PDA và thấp nhất là môi trường WA. Có một xu thế chung là nấm Colletotrichum sinh bào tử tốt hơn trên môi trường nghèo dinh dưỡng. Su et al. (2012) khi đánh giá khả năng sinh bào tử của 14 mẫu nấm Colletotrichum đã cho thấy, nấm sinh bào tử tốt trên môi trường PDA 1/4. Tương tự, nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, PDA, Oat mild agar (OMA) và Carrot juice agar (JCA), đến sinh bào tử của 3 mẫu nấm C. gloeosporioides s.l gây bệnh thán thư nho, ký hiệu là 08080601, 08090102 và No. 123), được thực hiện bởi Suzaki (2011) cho thấy, chỉ có 01 mẫu nấm sinh bào tử trên môi trường OMA nhưng cả 3 mẫu nấm đều sinh bào tử trên môi trường chứa nồng độ dinh dưỡng thấp hơn (OMA 10, 15 và 20%). Su et al. (2012) cũng đã gợi ý rằng prolamin trong môi trường OMA, một chất kích thích sinh bào tử nấm, chỉ phát huy hiệu quả trong điều kiện hàm lượng carbonhydrate trong môi trường nuôi cấy thấp. Như vậy, kết quả thu được về số lượng bào tử hình thành của 5 loài nấm trên môi trường dinh dưỡng hoàn toàn phù hợp với kết quả của Su et al. (2012) và Suzaki (2011) khi hàm lượng carbonhydrate từ khoai tây (20g) trong môi trường PCA thấp hơn nhiều so với trong môi trường PDA (250g).

Ngoài ra, số liệu thu được cũng cho thấy có sự khác nhau đáng kể về khả năng sinh bào tử trong số 5 loài nấm. Loài C. gloeosporioides s.s sinh bào tử kém nhất trên tất cả 3 loại môi trường. Trái lại, loài C. siamense, C. truncatum và C. fructicola lại sinh bào tử dễ dàng trên cả 3 loại môi trường. Khả năng sinh bào tử đóng vai trò quan trọng đến mức độ phổ biến của mỗi loài nấm. Kết quả thu được là hoàn toàn phù hợp khi các nghiên cứu đã chỉ ra rằng C. gloeosporioides s.s có phạm vi ký chủ khá hẹp (Cannon et al., 2008; Weir et al., 2012), trong khi đó các loài C. siamense, C. truncatum và C. fructicola lại có phạm vi ký chủ rất rộng (Capobiango et al., 2016; Cheng et al., 2013; James et al., 2014; Liu et al., 2015; Liu et al., 2017; Weir et al., 2012; Yang et al., 2009).

Từ kết quả thu được của thí nghiệm có thể khẳng định, PDA là môi trường thích hợp nhất cho phát triển tản nấm và PCA là môi trường thích hợp nhất cho việc hình thành bào tử của 5 loài nấm Colletotrichum được phát hiện.

Bảng 4.21. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên các môi trường dinh dưỡng

Đường kính tản nấm (mm) Số lượng bào tử hình thành Mẫu Môi TT Loài nấm nấm trường 9 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày

C. gloeosporioides s.s C44 - - - - +

C. siamense C4 - - + ++ +++

PDA C. fructicola C1 - - - + ++ 1 C. aeschynomenes C29 - - + ++ ++

C. truncatum C30 90,0 - + ++ +++

LSD0,05

C. gloeosporioides s.s C44 - - + ++

9 2

C. siamense C4 - + ++ +++

PCA C. fructicola C1 - + ++ ++ 2 C. aeschynomenes C29 - + ++ +++

C. truncatum C30 - + ++ +++

LSD0,05

C. gloeosporioides s.s C44 - - - -

C. siamense C4 - - - +

WA C. fructicola C1 - - - + 3 C. aeschynomenes C29 - - - +

C. truncatum C30 - - - +

Chú thích: -: không hình thành bào tử , +: Số lượng bào tử ít (<1 x 106 bào tử/ ml), ++: Số lượng bào tử trung bình (1 - 2 x 106 bào tử/ ml), +++: Số lượng bào tử nhiều (> 2 x 106 bào tử/ ml)

3 ngày 31,13c 35,66b 37,26b 41,33a 28,20d 2,89 21,26b 19,26bc 24,73a 26,00a 18,20c 2,75 18,13ab 15,33b 16,40b 19,66a 12,13c 2,41 5 ngày 58,13b 62,93ab 64,80a 69,07a 47,07c 4,66 39,33b 36,73bc 41,26ab 42,66a 33,46c 3,64 32,86ab 31,13b 34,20ab 35,33a 26,26c 3,95 7 ngày 90,0a 90,0a 90,0a 90,0a 67,60b 1,98 59,66b 54,33c 63,33ab 66,73a 51,40c 4,36 50,66ab 48,40b 51,93ab 54,46a 43,66c 4,58 77,86a 72,66b 79,73a 81,33a 67,13c 4,74 65,20b 62,26b 66,06ab 70,26a 57,53c 4,51 LSD0,05

Chú thích: Ký hiệu các loài nấm: a - C. fructicola (C1), b - C. siamense (C4), c - C. aeschynomenes (C29), d - C. truncatum (C30) và e - C. gloeosporioides s.s (C44)

Hình 4.10. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên các môi trường dinh dưỡng

4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Nhiệt độ là yếu tố sinh thái quan trọng cho sự phát sinh, gây hại của nấm

gây bệnh cây. Mỗi loài nấm đều có khả năng phát triển tốt hoặc bị ức chế ở một

ngưỡng nhiệt độ nhất định, việc nắm được ngưỡng nhiệt độ thích hợp của từng

loài sẽ giúp ích nhiều cho việc dự báo quy luật phát sinh, gây hại của đối tượng

để đề xuất biện pháp phòng trừ hiệu quả. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ

đến Vì vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 5 loài nấm Colletotrichum thu thập được trên môi trường PDA ở 4 ngưỡng nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC và 35 C. Kết quả thí nghiệm thu được tại bảng 4.22 và hình 4.11 cho thấy:

Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến tốc độ phát triển tản nấm của các loài

Colletotrichum. Ba loài nấm C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes và C. truncatum phát triển tản nấm tốt nhất ở 25oC, tiếp đến là 30oC, 20oC và thấp nhất ở 35oC. Ở 25oC, đường kính tản nấm đạt 90 mm sau 7 ngày trên 2 loài C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes và sau 9 ngày trên loài C. truncatum. Ở 30oC, sau 9 ngày, đường kính tản nấm của loài C. gloeosporioides s.s và C. aeschynomenes đạt 90mm, loài C. truncatum đạt 81,20 mm. Ở 20oC, sau 9 ngày đường kính tản nấm của các loài C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes

và C. truncatum đạt lần lượt 75,40 mm, 72,26 mm và 61,40 mm. Trong khi đó, ở 35oC cũng sau 9 ngày đường kính tản nấm của các loài chỉ đạt lần lượt là 59,53 mm, 51,80 mm và 52,40 mm (bảng 4.22, hình 4.11).

Trên loài C. siamense, tản nấm phát triển tốt nhất ở 30oC sau 3 ngày theo dõi, tuy nhiên từ thời điểm 5 ngày đường kính tản nấm ở 25oC và 30oC là tương đương nhau. Tiếp đến là 20oC và tản nấm phát triển chậm nhất ở 35oC. Ở 25 - 30oC, sau 3 ngày đường kính tản nấm đạt 34,73 - 38,53 mm, sau 5 ngày đạt 58,46 - 61,20 mm và sau 7 ngày đạt 90 mm. Ở hai ngưỡng nhiệt độ còn lại, đường kính tản nấm sau 9 ngày đạt 67,20 mm ở 20oC và thấp nhất ở 35oC, chỉ đạt 48,66 mm (bảng 4.22, hình 4.11).

Trên loài C. fructicola, tản nấm phát triển tốt nhất ở 25oC sau 5 ngày, tuy nhiên từ 7 ngày kích thước tản nấm ở 25oC và 30oC là tương đương nhau. Tiếp đến là 20o C và tản nấm phát triển chậm nhất ở 35oC. Đường kính tản nấm ở 25 - 30oC đạt 35,86 - 38,46 mm sau 3 ngày, 62,60 - 67,40 mm sau 5 ngày và đạt 90 mm sau 7 ngày. Tại hai ngưỡng nhiệt độ còn lại, sau 9 ngày, đường kính tản nấm đạt 71,06 mm ở 20oC và chỉ đạt 58,33 mm ở 35oC (bảng 4.22, hình 4.11).

Bên cạnh sự sai khác về tốc độ phát triển tản nấm, giữa các loài còn có sự

sai khác về thời gian xuất hiện và số lượng bào tử hình thành trên môi trường.

Trong 5 loài nấm nghiên cứu, loài C. gloeosporioides s.s chỉ hình thành bào tử trên môi trường ở nhiệt độ 25oC và 30oC. Bốn loài nấm còn lại đều hình thành bào tử trên môi trường ở cả 4 ngưỡng nhiệt độ sau 9 ngày theo dõi.

Loài C. gloeosporioides s.s chỉ hình thành bào tử sau 9 ngày nuôi cấy ở 25oC và 30oC, số lượng bào tử hình thành ít (<1 × 106 bào tử/ ml). Ở hai ngưỡng nhiệt độ còn lại là 20oC và 35oC không ghi nhận được sự xuất hiện của bào tử nấm trên môi trường sau 9 ngày theo dõi (bảng 4.22, hình 4.11).

Hai loài C. siamense và C. fructicola hình thành bào tử thuận lợi nhất ở 25 - 30oC. Loài C. siamense xuất hiện bào tử sau 3 ngày, số lượng bào tử hình thành nhiều (> 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày). Tương tự, loài C. fructicola xuất hiện bào tử sau 5 ngày, số lượng bào tử hình thành trung bình (1 - 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày). Ở hai ngưỡng nhiệt độ còn lại là 20oC và 35oC, bào tử của 2 loài nấm xuất hiện muộn hơn 2 - 4 ngày, số lượng bào tử hình thành ít hơn (<1 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày) so với nhiệt độ 25 - 30oC (bảng 4.22, hình 4.11).

Loài C. aeschynomenes xuất hiện bào tử trên môi trường sớm và nhiều nhất ở 20 - 25oC. Tại các ngưỡng nhiệt độ này, bào tử xuất hiện sau 5 ngày, số lượng bào tử đạt 1 - 2 x 106 bào tử/ ml sau 9 ngày. Trên hai ngưỡng nhiệt độ còn lại, bào tử nấm xuất hiện sau 7 ngày ở 30oC và 9 ngày ở 35oC, số lượng bào tử hình thành ít, sau 9 ngày chỉ đạt <1 × 106 bào tử/ ml (bảng 4.22, hình 4.11).

Loài C. truncatum hình thành bào tử thuận lợi trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng, từ 25 - 35oC. Tại 3 ngưỡng nhiệt độ này, bào tử nấm xuất hiện sau 5 ngày, số lượng bào tử hình thành nhiều (> 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày). Ở nhiệt độ 20oC bào tử xuất hiện sau 7 ngày, số lượng bào tử hình thành ở mức trung bình (1 - 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày) (bảng 4.22, hình 4.11).

Từ kết quả thu được về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng,

phát triển của các loài Colletotrichum trên môi trường PDA có thể kết luận: loài C. gloeosporioides s.s phát triển tản nấm thuận lợi nhất ở 25oC, bào tử chỉ hình thành trên môi trường nuôi cấy ở 25 - 30oC. Loài C. siamense và C. fructicola phát triển tản nấm và hình thành bào tử thuận lợi nhất ở 25 - 30oC. Loài C. aeschynomenes phát triển tản nấm thuận lợi nhất ở 25oC, bào tử hình thành thuận lợi ở 20 - 25oC. Loài C. truncatum phát triển tản nấm thuận lợi nhất ở 25oC, bào tử hình thành thuận lợi ở 25 - 35oC.

Bảng 4.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum

Số lượng bào tử hình thành Đường kính tản nấm (mm) TT Loài nấm Mẫu nấm

C. gloeosporioides s.s C44 1

LSD0,05

2 C. siamense C4

9 6

LSD0,05

C. fructicola C1 3

LSD0,05

C29 C. aeschynomenes 4

LSD0,05

C30 C. truncatum 5

Nhiệt độ (oC) 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 5 ngày 36,60c 66,73a 43,26b 26,66d 4,17 35,80b 58,46a 61,20a 19,33c 4,05 39,33c 67,40a 62,60b 26,13d 4,12 37,73c 74,66a 54,40b 16,66d 4,05 27,73c 48,06a 43,80b 21,40d 2,58 5 ngày - - - - - + + - - - - - + + - - - + + + 9 ngày 75,40b 90,00a 90,00a 59,53c 4,41 67,20b 90,00a 90,00a 48,66c 2,94 71,06b 90,00a 90,00a 58,33c 3,24 72,26b 90,00a 90,00a 51,80c 2,71 61,40c 90,00a 81,20b 52,40d 3,54 7 ngày 56,46c 90,00a 67,33b 41,93d 4,35 51,33b 90,00a 90,00a 34,73c 2,57 56,53b 90,00a 90,00a 41,80c 2,33 55,33c 90,00a 75,53b 33,46d 4,72 42,00c 67,13a 60,66b 35,73d 4,75 3 ngày 20,26c 33,46a 28,40b 14,73d 2,21 19,26c 34,73b 38,53a 8,26d 2,54 21,66c 38,46a 35,86a 10,67d 2,60 21,00c 43,26a 37,33b 6,80d 2,17 15,60b 29,26a 27,00a 10,66c 2,32 3 ngày - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 9 ngày - + + - + +++ +++ + + ++ ++ + ++ ++ + + ++ +++ +++ +++ LSD0,05

7 ngày - - - - + ++ ++ - - + + - ++ ++ + - + ++ ++ ++ Chú thích: -: không hình thành bào tử , +: Số lượng bào tử ít (<1 x 106 bào tử/ ml), ++: Số lượng bào tử trung bình (1 - 2 x 106 bào tử/ ml), +++: Số lượng bào tử nhiều (> 2 x 106 bào tử/ ml)

Chú thích: Ký hiệu các loài nấm: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b - C. siamense (C4), c - C. fructicola (C1), d - C. aeschynomenes (C29) và e - C. truncatum (C30) Hình 4.11. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum

ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

4.3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Một trong những nguyên lý phòng trừ bệnh hại nói chung, bệnh nấm nói riêng là tạo ra điều kiện môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của nấm

bệnh. Trong các yếu tố môi trường tác động đến sự phát triển của nấm bệnh, pH

môi trường giữ một vai trò quan trọng. Nguồn bệnh thán thư gây hại trên cây ớt

tồn tại trong đất, tàn dư thực vật chịu sự tác động của pH đất, nguồn bệnh tồn tại trên thân, lá, quả sẽ chịu tác động của pH trong nước tưới. Việc xác định pH

thích hợp cho quá trình sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum sẽ giúp

chúng ta xây dựng biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả. Xuất phát từ thực tế trên

5 loài nấm Colletotrichum thu thập được nuôi cấy trên môi trường PDA ở các mức pH 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0 trong điều kiện 25oC ± 2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày. Kết quả theo dõi thí nghiệm được ghi tại bảng 4.23 và hình 4.12.

Loài C. gloeosporioides s.s phát triển tản nấm nhanh nhất ở pH 6,0, tiếp đến

là pH 5,0; 7,0 và chậm nhất ở pH 4,0. Đường kính tản nấm đạt 90 mm sau 7 ngày ở pH 6,0 và sau 9 ngày ở pH 5,0. Trên hai ngưỡng pH còn lại, sau 9 ngày đường

kính tản nấm chỉ đạt 66,06 - 74,33 mm. Trong 4 mức pH thí nghiệm, bào tử chỉ xuất hiện sau 9 ngày ở pH 6,0. Số lượng bào tử hình thành ít, chỉ đạt <1 × 106 bào tử/ ml. Như vậy, loài C. gloeosporioides s.s sinh trưởng, phát triển thuận

lợi nhất ở pH 6,0 (bảng 4.23, hình 4.12). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với

các nghiên cứu của Patel (2004), Deshmukh et al. (2012) khi nghiên cứu về

loài C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây ớt và đậu lima.

Loài C. siamense phát triển tản nấm thuận lợi nhất ở pH 5,0; 6,0, tiếp đến là pH 4,0 và chậm nhất ở pH 7,0. Đường kính tản nấm đạt 90 mm sau 7 ngày ở pH

5,0 và 6,0 trong khi sau 9 ngày đường kính tản nấm ở pH 4,0 và 7,0 chỉ đạt 72,06

- 78,0 mm. Mặc dù tản nấm của 2 ngưỡng pH 5,0 và 6,0 đều phát triển kín đĩa

sau 7 ngày, tuy nhiên trước thời điểm này (3 ngày, 5 ngày) đường kính tản nấm ở

pH 5,0 có kích thước lớn hơn pH 6,0 rõ rệt. Bào tử của loài C. siamense xuất hiện sớm nhất sau 5 ngày, số lượng bào tử hình thành nhiều (> 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày) ở các ngưỡng pH 5,0; 6,0. Tiếp đến là pH 4,0, bào tử hình thành sau 7 ngày, số lượng đạt mức trung bình (1 - 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày). Bào tử xuất hiện muộn nhất sau 9 ngày với số lượng ít (<1 × 106 bào tử/ ml) ở pH 7,0 (bảng 4.23, hình 4.12).

Tản nấm của loài C. fructicola phát triển nhanh nhất ở pH 6,0, tiếp đến là pH 5,0; 7,0 và chậm nhất ở pH 4,0. Đường kính tản nấm đạt 90 mm sau 7 ngày ở pH 6,0 và sau 9 ngày ở pH 5,0. Trên 2 ngưỡng pH còn lại đường kính tản nấm

sau 9 ngày nuôi cấy đạt 72,33 - 79,73 mm. Bào tử của loài C. fructicola xuất hiện sớm nhất sau 7 ngày, số lượng bào tử hình thành đạt mức trung bình (1 - 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày) ở các mức pH 5,0 và 6,0. Hai mức pH còn lại là 4,0 và 7,0

bào tử nấm xuất hiện muộn hơn 2 ngày, số lượng bào tử hình thành ít, sau 9 ngày

chỉ đạt <1 × 106 bào tử/ ml (bảng 4.23, hình 4.12).

Trên loài C. aeschynomenes, tản nấm đạt kích thước 90 mm ở pH 6,0 sau 7 ngày và sau 9 ngày ở pH 5,0. Ở 2 mức pH còn lại, tản nấm ở pH 4,0 phát triển nhanh hơn pH 7,0. Sau 9 ngày, đường kính tản nấm ở pH 4,0 đạt 79,53 mm trong khi pH 7,0 chỉ đạt và 66,33 mm. Quan sát thực tế trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy, ở pH 4,0 mặc dù tản nấm phát triển nhanh hơn pH 7,0 tuy nhiên, tản nấm chỉ mọc sát trên bề mặt môi trường chứ không mọc dày đặc, bông xốp như các mức pH còn lại. Bào tử của loài C. aeschynomenes xuất hiện sớm nhất ở thời điểm sau 5 ngày và đạt số lượng ở mức trung bình (1 - 2 × 106 bào tử/ ml sau 9 ngày) ở các mức pH 4,0; 5,0; 6,0. Tại pH 7,0, bào tử nấm chỉ xuất hiện trên môi trường ở thời điểm sau 9 ngày nuôi cấy với số lượng ít, chỉ đạt <1 × 106 bào tử/ ml (bảng 4.23, hình 4.12).

Loài C. truncatum phát triển tản nấm tốt nhất ở pH 6,0 tiếp đến là pH 7,0; 5,0 và kém nhất ở pH 4,0. Trong 4 mức pH nghiên cứu, đường kính tản nấm chỉ đạt 90 mm ở pH 6,0 sau 9 ngày. Ở các mức pH còn lại, sau nuôi cấy 9 ngày đường kín tản nấm lớn nhất ở pH 7,0 đạt 77,60 mm, tiếp đến là pH 5,0 đạt 68,20 mm và nhỏ nhất ở pH 4,0 chỉ đạt 58,06 mm. Bên cạnh sự khác nhau về tốc độ phát triển tản nấm chúng tôi còn nhận thấy sự sai khác về đặc điểm tản nấm của các mức pH nghiên cứu. Tại pH 6,0 và 7,0, tản nấm phát triển bông xốp, mép tản nấm bằng phẳng tạo thành hình tròn, trong khi ở 2 ngưỡng pH còn lại là 5,0 và 4,0 tản nấm mỏng, mép tản không bằng phẳng mà tạo ra các vết khảm. Bào tử xuất hiện trên môi trường xuất hiện sớm nhất, sau 5 ngày ở các mức pH 4,0; 5,0; 6,0 và muộn nhất ở pH 7,0 sau 7 ngày nuôi cấy. Số lượng bào tử hình thành nhiều nhất ở pH 5,0; 6,0, tiếp đến là pH 4,0 và ít nhất ở pH 7,0. Sau 9 ngày, số lượng bào tử hình thành ở pH 5,0 và 6,0 là >2 × 106 bào tử/ ml, pH 4,0 là 1 - 2 × 106 bào tử/ ml, trong khi pH 7,0 là <1 × 106 bào tử/ ml (bảng 4.23, hình 4.12).

Từ kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của pH môi trường có thể kết luận: các loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. aeschynomenes C. truncatum có khả năng sinh trưởng, phát triển, sinh bào tử thuận lợi nhất ở pH 6,0. Riêng loài C. siamense có khả năng sinh trưởng, phát triển, sinh bào tử thuận lợi trong khoảng pH rộng hơn, từ 5,0 - 6,0. Trong 5 loài nấm nghiên cứu các loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. truncatum có xu hướng phát triển thuận lợi hơn trong môi trường có tính kiềm, các loài C. siamense và C. aeschynomenes có xu hướng phát triển thuận lợi hơn trong môi trường có tính axit yếu.

Bảng 4.23. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum

Đường kính tản nấm (mm)

Số lượng bào tử hình thành

TT

Loài nấm

pH

Mẫu nấm

C. gloeosporioides s.s

C44

LSD0,05

C. siamense

LSD0,05

1 0 0

C. fructicola

LSD0,05

C29

C. aeschynomenes

LSD0,05

C30

C. truncatum

9 ngày 66,06c 90,00a 90,00a 74,33b 4,38 78,00b 90,00a 90,00a 72,06c 2,88 72,33c 90,00a 90,00a 79,73b 2,33 79,53b 90,00a 90,00a 66,33c 2,69 58,06d 68,20c 90,00a 77,60b 5,00

5 ngày - - - - - + + - - - - - + + + - + + + -

7 ngày 52,26d 67,46b 90,00a 60,22c 6,63 61,93b 90,00a 90,00a 56,86c 3,15 57,93d 72,20b 90,00a 62,13c 3,90 63,80c 74,20b 90,00a 51,80d 4,81 44,13d 53,93c 71,73a 61,13b 4,13

3 ngày 20,06d 27,33b 32,20a 24,06c 3,12 24,86c 40,86a 36,06b 22,33c 2,77 25,40c 36,13b 39,26a 26,80c 2,03 30,93c 35,40b 41,53a 19,93d 2,46 17,33d 21,33c 30,73a 27,66b 1,77

3 ngày - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

4 5 6 7 4 5 6 7 4 5 6 7 4 5 6 7 4 5 6 7

7 ngày - - - - + ++ ++ - - + + - + ++ ++ - ++ ++ ++ +

9 ngày - - + - ++ +++ +++ + + ++ ++ + ++ ++ ++ + ++ +++ +++ +

LSD0,05

5 ngày 35,00d 46,20b 58,73a 41,02c 5,00 43,13c 62,60a 56,40b 39,20d 3,89 42,86c 55,46b 64,06a 45,06c 4,27 46,73c 53,86b 69,86a 33,26d 3,95 30,60d 36,46c 51,40a 44,06b 3,13 Chú thích: -: không hình thành bào tử, +: Số lượng bào tử ít (<1 x 106 bào tử/ ml), ++: Số lượng bào tử trung bình (1 - 2 x 106 bào tử/ ml), +++: Số lượng bào tử nhiều (> 2 x 106 bào tử/ ml)

Chú thích: Ký hiệu các loài nấm: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b – C. siamense (C4), c - C. fructicola (C1), d - C. aeschynomenes (C29) và e - C. truncatum (C30) Hình 4.12. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các mức pH khác nhau

4.3.4. Tính gây bệnh của các loài Colletotrichum thu thập

Xác định tính gây bệnh của các loài nấm nói chung và loài Colletotrichum

gây bệnh thán thư ớt là một vấn đề rất quan trọng. Việc xác định tính gây bệnh sẽ

đánh giá được mức độ nhiễm bệnh nhanh hay chậm của từng loài nấm đối với từng

loại ký chủ, trên cơ sở đó sẽ đưa ra được biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả.

101

4.3.4.1. Tính gây bệnh của các mẫu nấm đại diện cho mỗi loài trên cây ớt

Để tìm hiểu tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum trên cây ớt

chúng tôi tiến hành lây bệnh nhân tạo các loài nấm đại diện trên các giống ớt

khác nhau. Bốn giống ớt được lựa chọn để lây bệnh gồm: 02 giống đang được trồng đại trà ngoài sản xuất (Demon, Lai 20), 01 giống địa phương (Chìa vôi) và 01 giống ớt của Trung tâm Nghiên cứu rau thế giới (Susan’ Joy). Tiến hành lây bệnh nhân tạo trên lá, quả xanh và quả chín của mỗi giống ớt bằng 2 phương pháp lây bệnh có tổn thương và không tổn thương, kết quả thí nghiệm được trình

bày tại bảng 4.24 và hình 4.13.

Toàn bộ lá và quả xanh của 4 giống ớt thí nghiệm đều không xuất hiện triệu chứng bệnh sau lây nhiễm bằng cả hai phương pháp có và không tổn thương. Triệu chứng bệnh chỉ xuất hiện trên quả chín khi lây bệnh bằng phương

pháp có tổn thương (bảng 4.24, hình 4.13).

Khả năng gây bệnh của các loài nấm có sự khác nhau tương đối rõ rệt trên các giống ớt thí nghiệm. Trong 5 loài nấm sử dụng lây bệnh nhân tạo, loài C. truncatum gây bệnh trên tất cả 4 giống ớt, loài C. siamense và C. aeschynomenes gây bệnh trên 3 giống ớt, 2 loài nấm còn lại là C. gloeosporioides s.s và C. fructicola chỉ gây bệnh ở 2 giống ớt. Kết quả lây nhiễm nhân tạo cũng cho thấy, giống Demon nhiễm bệnh với cả 5 loài nấm, 3 giống ớt còn lại đều nhiễm bệnh với 3 loài nấm. Điều đó chứng tỏ, trong số 4 giống ớt sử dụng không có giống ớt nào kháng hoàn toàn với 5 loài nấm Colletotrichum (bảng 4.24).

Tỷ lệ bệnh sau lây nhiễm của các loài nấm trên các giống ớt từ 40,0 -

93,3% và có sự sai khác đáng kể giữa các loài nấm khi lây bệnh trên cùng một

giống ớt. Trong 5 loài nấm lây bệnh, 2 loài nấm C. siamense và C. truncatum có

tỷ lệ bệnh xuất hiện sau lây nhiễm cao nhất trên tất cả các giống ớt thí nghiệm,

đạt 66,7 - 93,3%. Tiếp đến là các loài C. gloeosporioides s.s và C. fructicola, tỷ lệ bệnh xuất hiện sau lây nhiễm đạt 66,7 - 80,0%, loài C. aeschynomenes có tỷ lệ

bệnh xuất hiện ở mức thấp nhất, chỉ đạt 40,0 - 53,3% (bảng 4.24).

Thời kỳ tiềm dục của các loài nấm trên các giống ớt là 3,1 - 4,8 ngày. Ngoại trừ loài C. gloeosporioides s.s có thời kỳ tiềm dục dài hơn (3,7 ngày trên giống ớt Demon và 4,8 ngày trên giống ớt Lai 20), các loài nấm còn lại gần như

không có sự sai khác về thời gian xuất hiện vết bệnh trên quả khi lây bệnh trên quả của các giống ớt khác nhau. Thời kỳ tiềm dục của các loài này chỉ dao động

trong khoảng 3,1 - 3,4 ngày (bảng 4.24).

102

Kích thước vết bệnh sau lây nhiễm có sự dao động tương đối lớn, từ 3,2 - 13,2 mm và có sự sai khác đáng kể giữa các loài khi lây nhiễm trên cùng một

giống ớt. Trên giống ớt Lai 20, vết bệnh có kích thước lớn nhất khi lây bằng loài

C. siamense đạt 10,1 mm, tiếp đến là loài C. truncatum đạt 5,6 mm và nhỏ nhất

ở loài C. gloeosporioides s.s đạt 4,7 mm. Trên giống ớt Demon, kích thước vết bệnh lớn nhất khi lây bệnh bằng loài C. aeschynomenes đạt 12,5 mm, tiếp đến là

loài C. siamense đạt 10,5 mm, kích thước vết bệnh giảm dần ở các loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola đạt 7,5 - 8,6 mm và nhỏ nhất trên loài

C. truncatum đạt 6,1 mm. Trên giống ớt Chìa vôi, kích thước vết lớn nhất khi lây

bệnh bằng loài C. aeschynomenes đạt 13,2 mm, tiếp đến là loài C. fructicola đạt 11,2 mm và nhỏ nhất ở loài C. truncatum đạt 6,0 mm. Tương tự, giống ớt Susan’ Joy, kích thước vết bệnh lớn nhất khi lây bệnh bằng loài C. aeschynomenes đạt 8,1 mm, tiếp đến là loài C. truncatum đạt 5,4 mm và nhỏ nhất khi lây bằng loài

C. siamense đạt 3,2 mm (bảng 4.24, hình 4.13).

Sau lây nhiễm 7 ngày, các loài nấm tạo vết bệnh có đặc điểm tương đối

giống triệu chứng bệnh ghi nhận được trong quá trình thu thập mẫu trên đồng

ruộng. Các vết bệnh có hình tròn hoặc không định hình, hơi lõm, bề mặt vết bệnh

có màu đen hoặc màu vàng nhạt. Hình dạng và màu sắc vết bệnh của mỗi loài

nấm tạo ra trên các giống ớt không đồng nhất. Chẳng hạn, loài C. truncatum tạo

vết bệnh không định hình, bề mặt vết bệnh màu đen trên giống ớt Demon và Chìa

vôi nhưng lại tạo vết bệnh hình tròn, bề mặt vết bệnh màu vàng nhạt trên giống ớt Lai 20 và Susan’ Joy. Loài C. fructicola tạo vết bệnh màu đen trên giống ớt Demon nhưng lại tạo vết bệnh màu vàng nhạt trên giống ớt Chìa vôi. Tương tự,

loài C. aeschynomenes tạo vết bệnh màu vàng nhạt trên giống ớt Demon và giống ớt Susan’ Joy nhưng lại tạo vết bệnh màu đen trên giống ớt Chìa vôi. Từ kết quả thu được của thí nghiệm có thể nhận thấy, triệu chứng bệnh tạo ra trên

quả không mang tính đặc trưng cho các loài nấm Colletotrichum (hình 4.13).

Trong các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, tất cả 5 mẫu nấm đại diện cho 5 loài Colletotrichum đều không tạo vết bệnh trên lá, quả ớt xanh và chín ở phương pháp không gây tổn thương sau 7 ngày sau lây nhiễm. Kết quả này có thể được lý giải như sau:

Tầng cutin trên bề mặt quả là rào cản vật lý đầu tiên mà nấm Colletotrichum khó có thể vượt qua, chưa kể 2 phản ứng phòng thủ chủ động là sự hóa dày của tầng cutin và phản ứng tự chết tế bào được lập trình (Programmed Cell death -

103

PCD) - một dạng phản ứng siêu nhạy, đã được chứng minh trên quả ớt (Kim et al., 2004). Để xâm nhiễm chủ động qua lớp cutin, trước hết bào tử nấm phải nảy

mầm và hình thành được đĩa áp. Cả 2 quá trình sinh lý này yêu cầu một số điều

kiện vật lý và hóa học đặc biệt như nhiệt độ, độ ẩm, đặc điểm bề mặt (thigmo-

signals) và kích thích hóa học. Đối với nấm Colletotrichum, đặc tính ghét nước hay ưa nước của bề mặt không phải là điều kiện quan trọng để nấm nảy mầm

bào tử và hình thành giác bám, có nghĩa chỉ cần tiếp xúc với bề mặt như vỏ quả, bào tử Colltotrichum đã có thể nảy mầm và hình thành giác bám (Ahn et al.,

2003). Tuy nhiên, cả 2 quá trình này đã được chứng minh cần kích thích hóa học,

ít nhất là đường hướng dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc calcium/ calmodulin (Ahn et

al., 2003). Đây có thể là một lý do dẫn tới việc khó lây nhiễm thành công nấm

Colletotrichum trên bề mặt quả không gây tổn thương. Trong một nghiên cứu gần đây về đánh giá tính gây bệnh của nấm Colletotrichum hại ớt, Noor & Zakaria

(2018) đã lây nhiễm 130 mẫu nấm Colletotrichum bao gồm C. acutatum s.l (62

mẫu), C. truncatum (54 mẫu) và C. gloeosporioides s.l (14 mẫu) trên quả ớt. Kết

quả cho thấy tất cả 130 mẫu đều gây bệnh trên quả khi lây nhiễm bào tử qua tổn

thương nhưng chỉ có 5 mẫu C. truncatum và 7 mẫu C. acutatum có thể gây bệnh trên

quả ớt không gây tổn thương.

Để cải thiện khả năng lây nhiễm nấm Colletotrichum trên quả ớt trong điều

kiện không tạo tổn thương, Akhtra et al. (2016) đã chuẩn bị dịch bào tử

C. truncatum trong nước chứa 2% gelatin. Các quả ớt lây nhiễm bằng phương

pháp này đều biểu hiện triệu chứng mặc dù thời gian ủ bệnh vẫn khá lâu (4 - 7

ngày sau lây nhiễm). Bổ sung gelatin vào dịch bào tử nhằm giảm sự phân tán của

bào tử trên vết lây (Akhtra et al., 2016), có lẽ vì quá trình xâm nhiễm của nấm thán

thư trên ớt là một quá trình phụ thuộc mật độ (Ranathunge & Sandani, 2016).

Do nấm Colletotrichum thường không xâm nhiễm trên quả ớt nếu không

gây tổn thương nên cho tới nay, qui trình lây nhiễm chuẩn để đánh giá tính gây

bệnh của nấm Colletotrichum đối với các giống ớt đều yêu cầu phải gây tổn

thương trên quả ớt (Mongkolporn, 2019).

Như vậy, từ kết quả thu được của thí nghiệm bước đầu có thể khẳng định để

đánh giá chính xác tính gây bệnh của các loài Colletotrichum thì việc lây nhiễm

cần được thực hiện bằng phương pháp gây tổn thương trên quả chín.

104

Chú thích: A, B - lây nhiễm trên lá, quả xanh, C - lây nhiễm trên quả chín (giống Lai 20), D - lây nhiễm trên quả chín (giống Demon), E - lây nhiễm trên quả chín (giống Chìa vôi), F - lây nhiễm trên quả chín (giống Susan’ Joy). Ký hiệu a - C. fructicola (C14), b - C. siamense (C4), c - C. aeschynomenes (C29), d - C. truncatum (C30), e - C. gloeosporioides s.s (C44) Hình 4.13. Lây bệnh nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt

105

Bảng 4.24. Kết quả lây nhiễm nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt

Thời kỳ tiềm dục (ngày)

Kích thước vết bệnh sau 7 ngày (mm)

Tỷ lệ bệnh (%)

Phương pháp lây

Giống ớt

C.g C.s

C.f C.a

C.t Đ/C C.g C.s C.f C.a C.t Đ/C C.g C.s

C.f C.a

C.t Đ/C

Bộ phân lây nhiễm

Lá

Lai 20

- - - -

66,7 93,3

Quả xanh Quả chín

Lá

Demon

- - - - -

- - - - - - - - - -

- - - - 86,7 - - - - -

1 0 6

Quả xanh Quả chín

Lá

Chìa Vôi

- - - - - - - - - - 80,0 86,7 66,7 53,3 93,3 - - - - -

- - - - -

- - - - - - - - - - 7,5 - - - - -

- - - - - - - - - - 12,5 - - - - -

11,4 13,2

Quả xanh Quả chín

Lá

Susan’ Joy

- - - - - 66,7 40,0 93,3 - - - - -

- - - - -

46,7 66,7

Quả xanh Quả chín

Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương Có tổn thương Không tổn thương

- - - - - - - - - - - 73,3 -

- - - - - - - - - - - - -

- - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - 4,8 3,4 - - - - - - - - - - - - - - - - 3,7 3,2 3,1 - - - - - - - - - - - - - - - 3,1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3,1 - - - -

- - - - - - - - - 3,2 - - - - - - - - - - 3,3 3,1 - - - - - - - - - - 3,2 3,1 - - - - - - - - - - 3,3 3,2 - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - 4,7 - - - - - 8,1 - - - - - - - - - - - - -

- - - - 10,1 - - - - - 10,5 - - - - - - - - - - - 3,2 -

- - - - - - -

- - - - - 8,1 -

- - - - 5,6 - - - - - 6,1 - - - - - 6,0 - - - - - 5,4 -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Chú thích: - Biểu thị số 0; Các ký hiệu C.g, C.s, C.f, C.a, C.t tương ứng với các loài nấm lần lượt là: C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes và C. truncatum

4.3.4.2. Tính gây bệnh của các mẫu nấm đại diện cho mỗi loài trên quả của một số cây trồng hay bị nhiễm bệnh thán thư

Mỗi loài nấm đều có khả năng gây hại trên một số loại cây trồng, việc xác

định được phổ ký chủ gây hại của mỗi loài nấm đóng vai trò rất quan trọng trong

việc bố trí cơ cấu cây trồng để giảm thiểu mức độ gây hại của chúng. Các kết quả

công bố đến nay cho thấy các loài Colletotrichum có phổ ký chủ khá rộng, ngoài

gây hại trên cây ớt, nấm còn gây hại trên rất nhiều loại cây trồng như: chuối,

xoài, nho, đu đủ, dâu tây, đậu đỗ, chè, cà phê, cam quýt …. (Prihastuti et al.,

2009; Weir et al., 2012; Udayanga et al., 2013; Liu et al., 2015). Để đánh giá

mức độ gây bệnh của các loài Colletotrichum thu thập được chúng tôi tiến hành

lây bệnh nhân tạo trên quả của 3 đối tượng là xoài, chuối tây và chuối tiêu. Kết

quả thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.25 và hình 4.14.

Tương tự như kết quả thu được khi lây nhiễm trên các giống ớt, các mẫu

nấm Colletotrichum sử dụng chỉ gây bệnh trên các quả chín bằng phương pháp

lây bệnh có tổn thương. Triệu chứng bệnh không xuất hiện khi lây nhiễm trên các

quả xanh sau 7 ngày theo dõi (bảng 4.25, hình 4.14).

Khả năng gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum có sự khác nhau trên

từng loại ký chủ. Trong 5 loài nấm sử dụng, loài C. siamense và C. fructicola gây

bệnh trên cả 3 loại quả, loài C. gloeosporioides s.s gây bệnh trên chuối tây và

chuối tiêu, loài C. aeschynomenes gây bệnh trên xoài và chuối tiêu, riêng loài

C. truncatum không xuất hiện triệu chứng bệnh trên cả 3 loại quả sau 7 ngày theo

dõi (bảng 4.25, hình 4.14).

Ngoài cạnh sự khác nhau về khả năng gây bệnh, trên từng loại ký chủ của

các loài chúng tôi còn nhận thấy có sự khác nhau về mức độ gây bệnh của các

loài nấm thí nghiệm. Trong 4 loài nấm xuất hiện vết bệnh sau lây nhiễm khi lây

bệnh trên 3 loại quả, loài C. siamense có tỷ lệ bệnh cao nhất và đường kính vết

bệnh lớn nhất trên tất cả các loại quả, tiếp đến là loài C. fructicola và thấp nhất

trên các loài C. gloeosporioides s.s và C. aeschynomenes (bảng 4.25, hình 4.14).

Trên quả xoài chín, vết bệnh xuất hiện sau lây nhiễm khi lây bệnh bằng 3

loài nấm C. fructicola, C. siamense và C. aeschynomenes. Tỷ lệ bệnh và kích

thước vết bệnh có sự sai khác rõ rệt giữa các loài nấm. Loài C. siamense có tỷ lệ

bệnh và kích thước vết bệnh lớn nhất khi 100% số quả nhiễm bệnh và vết bệnh

có kích thước 13,3 mm sau 7 ngày, tiếp đến là loài C. fructicola có 66,7% quả

107

nhiễm bệnh và kích thước vết bệnh đạt 4,5 mm, loài C. aeschynomenes có các

chỉ tiêu theo dõi thấp nhất khi tỷ lệ bệnh chỉ đạt 33,3% và kích thước vết bệnh

đạt 4,0 mm. Tuy có sự sai khác về tỷ lệ bệnh và kích thước vết bệnh, song thời

kỳ tiềm dục không có sự khác nhau giữa các loài. Thời kỳ tiềm dục của cả 3 loài

nấm gây bệnh trên quả xoài chín đều là 3,0 ngày (bảng 4.25, hình 4.14).

Trên quả chuối tiêu chín, vết bệnh xuất hiện sau lây nhiễm bởi 4 loài nấm

C. fructicola, C. siamense, C. aeschynomenes và C. gloeosporioides s.s. Tỷ lệ

bệnh sau lây nhiễm của loài C. fructicola và C. siamense đạt 100%, 2 loài còn lại

là C. gloeosporioides s.s và C. aeschynomenes có tỷ lệ bệnh đạt 66,7%. Thời kỳ

tiềm dục và đường kính vết bệnh sau lây nhiễm 7 ngày không có sự sai khác

đáng kể giữa các loài nấm. Thời kỳ tiềm dục của 4 loài nấm khi lây bệnh trên quả

chuối tiêu chín là 3,0 - 3,5 ngày, đường kính vết bệnh sau 7 ngày đạt 3,0 - 4,3

mm (bảng 4.25, hình 4.14).

Trên quả chuối tây chín, 3 loài nấm C. fructicola, C. siamense và

C. gloeosporioides s.s xuất hiện vết bệnh sau lây nhiễm. Hai loài nấm

C. fructicola và C. siamense cùng có tỷ lệ bệnh là 100% và thời gian tiềm dục là

3 ngày. Loài C. gloeosporioides s.s có tỷ lệ bệnh thấp hơn, chỉ đạt 66,7% tuy

nhiên thời kỳ tiềm dục dài hơn (3,7 ngày). Sau lây nhiễm 7 ngày, kích thước vết

bệnh của 3 loài là 12,5 - 20,3 mm, vết bệnh tạo ra trên quả chuối tây lớn hơn rõ

rệt so với quả xoài chín và chuối tiêu chín. Trong 3 loài nấm lây bệnh, loài

C. siamense tạo vết bệnh lớn nhất, sau 7 ngày vết bệnh có kích thước 20,3 mm,

tiếp đến là loài C. fructicola, kích thước vết bệnh là 13,7 mm và nhỏ nhất trên

loài C. gloeosporioides s.s, đạt 12,5 mm (bảng 4.25, hình 4.14).

Từ kết quả thu được khi lây bệnh nhân tạo trên quả xoài, chuối tiêu và

chuối tây có thể nhận thấy. Các loài nấm Colletotrichum không gây bệnh trên các

quả xanh, vết bệnh chỉ xuất hiện trên quả chín khi lây bệnh bằng phương pháp

gây tổn thương. Trong 5 loài nấm sử dụng lây bệnh, vết bệnh chỉ xuất hiện trên

các loài nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l, loài C. truncatum không

xuất hiện vết bệnh trên cả 3 loại quả thí nghiệm. Thời kỳ tiềm dục của các loài

nấm Colletotrichum được xác định là 3,0 - 3,7 ngày tùy thuộc vào loài nấm và

loại quả. Loài C. siamense có tỷ lệ quả nhiễm bệnh và đường kính vết bệnh sau

lây nhiễm lớn nhất trong số 4 loài nấm Colletotrichum gây bệnh trên 3 loại quả.

108

Bảng 4.25. Kết quả lây nhiễm các loài nấm Colletotrichum trên quả của một số ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư

Bộ Tỷ lệ bệnh Thời kỳ tiềm dục Kích thước vết bệnh

phân Phương pháp Loại (%) (ngày) sau 7 ngày (mm) lây quả C.g C.s C.f C.a C.t Đ/C C.g C.s C.f C.a C.t Đ/C C.g C.s C.f C.a C.t Đ/C lây nhiễm

Quả Có tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

xanh Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - - Xoài Có tổn thương 100,0 66,7 33,3 3,0 3,0 3,0 13,3 4,5 4,0 Quả - - - - - - - - -

chín Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

1 0 9

Quả Có tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

xanh Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Chuối tiêu Quả - - - - - - Có tổn thương 66,7 100,0 100,0 66,7 3,5 3,3 3,0 3,0 3,0 4,3 3,7 3,5

chín Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Quả Có tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

xanh Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Chuối tây Quả - - - - - - - - - Có tổn thương 66,7 100,0 100,0 3,7 3,0 3,0 12,5 20,3 13,7

chín Không tổn thương - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Chú thích: A - Xoài Đốc, B - Chuối tiêu hồng, C - Chuối tây Thái Lan. Ký hiệu a - C. fructicola (C14),

b - C. siamense (C4), c - C. aeschynomenes (C29), d - C. truncatum (C30), e - C. gloeosporioides s.s (C44) Hình 4.14. Lây bệnh nhân tạo các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt trên quả chín của một số loại ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư

110

4.3.5. Xác định khả năng tồn tại của bào tử các loài nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt

Trong quá trình lây nhiễm nhân tạo, tất cả 5 loài Colletotrichum đều không

biểu hiện triệu chứng trên lá ớt bằng cả 2 phương pháp tạo tổn thương và không tạo tổn thương. Ngoài ra, trong quá trình điều tra đồng ruộng, chúng tôi chỉ quan

sát thấy bệnh thán thư trên quả ớt.

Để tìm hiểu tại sao có hiện tượng trên, thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bào tử

của 2 loài nấm là C. siamense (mẫu C4, đại diện cho phức hợp loài

C. gloeosporeioides s.l) và C. truncatum (mẫu C30) trên lá của giống ớt Demon

được thực hiện. Tiến hành lây nhiễm bằng phương pháp lây bệnh có gây tổn

thương trên lá của cây ớt (4 tuần tuổi) được trồng trong chậu và đặt trong lồng

cách ly. Sau khi lây bệnh, mẫu lá lây nhiễm được thu thập định kỳ hàng tuần từ tuần thứ nhất đến tuần thứ sáu. Các mảnh mô lá (~1cm2) chứa vị trí lây bệnh được làm trong bằng cách ngâm trong dung dịch Ethanol tuyệt đối : axit acetic

(tỷ lệ 1:2) trong 24 giờ để loại bỏ diệp lục, sau đó thay thế dung dịch với thành

phần tương tự và tiếp tục ngâm trong 24 giờ. Các mảnh mô, tiếp theo, được rửa

bằng nước cất, để khô, sau đó được nhuộm bằng dung dịch Trypan blue. Bào tử

trên vết lây nhiễm được quan sát trực tiếp từ mô lá đã được nhuộm. Kết quả thí

nghiệm được trình bày tại bảng 4.26, hình 4.15 và hình 4.16.

Bảng 4.26. Khả năng tồn tại của nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt sau lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp gây tổn thương

TT Thời điểm quan sát Tỷ lệ bào tử hình thành giác bám (%)

sau lây nhiễm C. siamense C. truncatum

1 1 tuần 62,7 ± 9,7 67,1 ± 5,7

2 2 tuần 70,7 ± 7,1 77,3 ± 5,2

3 3 tuần 72,4 ± 6,7 81,8 ± 4,5

4 4 tuần 76,5 ± 5,6 87,6 ± 6,4

5 5 tuần 80,4 ± 6,9 89,2 ± 4,2

Tương tự như kết quả thu được khi lây bệnh nhân tạo trên lá ớt ở phần

4.2.4.1, sau lây nhiễm nhân tạo 6 tuần toàn bộ lá được lây nhiễm bằng 2 loài nấm

C. siamense và C. truncatum đều không xuất hiện triệu chứng bệnh (hình 4.15).

111

6 6 tuần 81,4 ± 6,6 90,8 ± 4,6

Chú thích: Vị trí lây nhiễm được chỉ bằng mũi tên đỏ

Hình 4.15. Lây nhiễm nhân tạo bào tử nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt giống Demon bằng phương pháp gây tổn thương

Tuy không tạo ra vết bệnh trên lá song kết quả quan sát mảnh mô chứa vị trí lây nhiễm cho thấy, bào tử của 2 loài nấm vẫn nảy mầm và hình thành giác bám

(hình 4.16). Tỷ lệ bào tử hình thành giác bám của 2 loài nấm đều tăng dần và đạt

mức cao nhất ở thời điểm sau lây bệnh nhân tạo 6 tuần. Sau lây bệnh 1 tuần, tỷ lệ

bào tử và hình thành giác bám của loài C. siamense đạt 67,1%, loài C. truncatum

là 62,7%. Tỷ lệ bào tử hình thành giá bám tăng dần qua các lần theo dõi, sau 6

tuần tỷ lệ bào tử hình thành giác bám quan sát được trên loài C. siamense đạt

90,8%, loài C. truncatum đạt 81,4% (bảng 4.26).

Đáng chú ý, mặc dù sợi nấm trong mô không thể được quan sát thấy bằng

kỹ thuật nhuộm Trypan blue trong nghiên cứu này nhưng các “lỗ sáng” quan sát thấy ở một số đĩa áp của cả 2 loài nấm ngay từ lần quan sát đầu tiên sau lây nhiễm 1 tuần (hình 4.16) đã chứng tỏ các đĩa áp đã hình thành “đế xâm nhiễm - penetration peg” để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin vào trong mô. Sự xâm nhập trực tiếp qua bề mặt lá ớt của cả 2 loài nấm cũng đã được quan sát ở thời điểm sau lây nhiễm 6 tuần (hình 4.16). Chúng tôi cũng quan sát thấy sự hình

thành bào tử thứ cấp và đĩa áp thứ cấp của cả 2 loài từ sợi nấm bề mặt. Kết quả quan sát thu được tương tự với công bố của (Ranathunge et al., 2012) khi lây

nhiễm nhân tạo loài C.truncatum trên lá ớt.

112

Một đặc điểm khác biệt giữa 2 loài khi quan sát vị trí lây nhiễm là: loài C. siamense không tạo bất cứ triệu chứng chết hoại tế bào nào và không tạo đĩa

cành thậm chí tại vị trí tổn thương (hình 4.16). Trái lại, loài C. truncatum đã hình

thành khá nhiều đĩa cành, tuy nhiên chỉ tại đúng mép của các vết tổn thương

(hình 4.16). Kết quả quan sát này gợi ý sau khi xâm nhập vào bên trong, loài C. siamense duy trì trạng thái ngủ nghỉ (quiescent) hoặc nội sinh (endophytic)

nghiêm ngặt còn loài C. truncatum chỉ có thể duy trì trạng thái như vậy ở các vị

trí không bị tổn thương.

Theo De Silva et al. (2017b), đặc điểm sinh học của Colletotrichum trên thực vật khá phức tạp, có thể được chia thành 4 kiểu sống khác nhau là hoại

dưỡng (necrotrophic), sinh dưỡng (biotrophic), ngủ nghỉ và nội sinh. Nhìn chung, nấm Colletotrichum hại ớt có thể được xếp vào nhóm bán sinh dưỡng và bao

gồm hỗn hợp 4 pha khác nhau kể trên gồm hoại dưỡng, sinh dưỡng, ngủ nghỉ và

nội sinh (Auyong et al., 2012; Kim et al., 2004; O'Connell et al., 2012;

Ranathunge et al., 2012; Ranathunge & Sandani, 2016).

Nghiên cứu về quá trình xâm nhập và tính gây bệnh của nấm Colletotrichum

trên lá cây trồng có khá nhiều nhưng chỉ có 2 nghiên cứu tương tự trên lá cây ớt và đều là được thực hiện với loài C. truncatum (Ranathunge et al., 2012; Ranathunge

& Sandani, 2016). Cả 2 nghiên cứu đều chứng tỏ rằng bào tử nấm C. truncatum

hình thành đĩa áp trên lá ớt, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, hình thành sợi nấm

bên dưới tầng cutin và duy trì trạng thái ngủ nghỉ tới khi lá chuyển sang trạng thái

già sinh lý. Khi lá chuyển sang trạng thái già sinh lý, nấm bắt đầu sinh sản, tạo đĩa

cành và bào tử làm nguồn bệnh sơ cấp nhiễm trên quả.

Nhiều loài Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioide s.l như

C. siamense, C. fructicola đã được chứng tỏ là các loài nội sinh, có nghĩa chúng

sống trong mô cây, không gây bệnh cho cây, thậm chí có lợi cho cây và thường

có tính đặc hiệu ký chủ thấp (De Silva et al., 2017b; Lisboa et al., 2018). Kết quả quan sát mô lá sau lây nhiễm bào tử nấm C. siamense trên lá ớt đã không thấy sự hình thành đĩa cành trên vết lây nhiễm, kể cả vị trí tổn thương cũng cho thấy loài

này có lẽ sống nội sinh trên lá ớt sau khi xâm nhiễm.

Như vậy, kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm này đã xác định thêm một vị

trí tồn tại của nguồn bệnh thán thư ớt. Phát hiện này đã đóng góp thêm vào hiểu biết chung về mối quan hệ sinh học giữa nấm Colletotrichum và cây ký chủ. Qua

113

đó đề xuất các biện pháp kỹ thuật quản lý hiệu quả bệnh thán thư. Ngoài ra, kết quả cũng giúp giải thích được lý do tại sao bệnh thán thư trên lá ớt lại hiếm gặp trên

đồng ruộng và lây nhiễm nhân tạo trên lá không dẫn tới hình thành vết bệnh.

Chú thích: Các đặc điểm quan trọng được chỉ bằng mũi tên đỏ

Hình 4.16. Đặc điểm của bào tử nấm C. siamense và C truncatum trên bề mặt lá ớt giống Demon được lây nhiễm bằng phương pháp gây tổn thương

4.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ LOẠI THUỐC HÓA HỌC, VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG Bacillus spp VÀ DỊCH CHIẾT ĐỊA Y VỚI CÁC LOÀI NẤM Colletotrichum ĐƯỢC PHÁT HIỆN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra hiện được xem là một trong những bệnh nguy hiểm nhất trên cây ớt (Mongkolporn, 2019; Than et al., 2008a). Ở nước ta bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là đối tượng gây hại nặng trên tất cả các vùng trồng ớt chính. Tuy được xem là đối tượng gây hại

chính nhưng đến nay việc phòng trừ bệnh trong sản xuất vẫn gặp rất nhiều khó khăn. Nguyên nhân chính của vấn đề này là do thành phần loài Colletotrichum gây hại trên cây ớt tương đối đa dạng, trong khi các loài nấm Colletotrichum

114

khác nhau có có phản ứng khác đối với thuốc (Kim et al., 2007). Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học, vi

khuẩn đối kháng và dịch chiết địa y đối với từng loài nấm Colletotrichum phát

hiện được nhằm đưa ra những khuyến cáo về biện pháp phòng trừ cụ thể cho từng

loài, từ đó giúp khống chế sự phát triển của bệnh trên đồng ruộng, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng ớt.

4.4.1. Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum phát hiện được trong điều kiện in vitro Do ưu điểm trừ bệnh nhanh chóng, ngay cả khi bệnh phát triển mạnh và

thuận tiện khi sử dụng nên biện pháp hóa học hiện nay vẫn là biện pháp được lựa

chọn nhiều nhất trong sản xuất. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu quả phòng trừ, giảm

thiểu chi phí cũng như giảm những tác động xấu của thuốc hóa học đến môi trường cần xác định đúng thuốc, đúng liều lượng và nồng độ nhằm khống chế

bệnh hiệu quả nhất. Các loại thuốc hóa học được lựa chọn sử dụng trong nghiên

cứu là các loại thuốc phổ biến tại Việt Nam, bao gồm Azony 25SC, Score 250

EC, Tiptop 250EC và Antracol 70WP để xác định loại thuốc hiệu quả nhất đối

với từng loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt.

Các loại thuốc lựa chọn được đánh giá hiệu lực bằng 2 phương pháp. Phương

pháp thứ nhất, đánh giá khả năng ức chế của thuốc đến khả năng sinh trưởng của

các loài nấm trên môi trường PDA. Thuốc thí nghiệm được pha thành các nồng độ

khác nhau trong môi trường PDA, nấm được cấy trên môi trường và đánh giá khả

năng sinh trưởng tản nấm của mỗi nồng độ thuốc so với đối chứng. Phương pháp

thứ hai, đánh giá khả năng ức chế của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử các

loài nấm. Thuốc thí nghiệm được pha trong nước cất vô trùng ở các nồng độ khác

nhau, bào tử nấm của các loài nấm được cho vào các nồng độ thuốc được pha sẵn.

Hiệu lực của thuốc được đánh giá bằng cách so sánh tỷ lệ bào tử nảy mầm của mỗi

nồng độ thuốc sử dụng với đối chứng. Nồng độ sử dụng của mỗi loại thuốc gồm:

nồng độ gấp 2 lần khuyến cáo, khuyến cáo, 1/2 khuyến cáo, 1/4 khuyến cáo.

4.4.1.1. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum

Thuốc Azony 25SC có hoạt chất chính là azoxystrobin, thuộc nhóm thuốc trừ nấm Strobilurin. Nhóm thuốc này ra đời vào năm 1996 dựa trên sự phát triển

từ các hợp chất được tìm thấy trong quá trình chuyển hóa tự nhiên của nấm ăn

Stobilurus tenacellus. Đến năm 2002, đã có 6 hợp chất thuộc nhóm Strobilurin

115

được thương mại hóa để sử dụng trong nông nghiệp (Bartlett et al., 2002). Nhóm thuốc Strobilurin có hoạt động phổ rộng chống lại bốn nhóm nấm chính gây bệnh

thực vật bao gồm: Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycetes và Oomycetes.

Có nhiều báo cáo về hiệu quả của azoxystrobin chống lại bệnh cây như nấm thối

xám (Botrytis cinerea) của rau và quả, đốm lá (Cercospora beticola), phấn trắng (Erysiphe betae) trên củ cải đường, đốm đen (Guignardia citricarpa) trên cây có

múi, thối sau thu hoạch (Colletotrichum gloeosporioides) trên quả bơ (dẫn theo

Sundravadana et al., (2007)).

a. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Có rất nhiều kết quả khác nhau về hiệu lực ức chế sự phát triển tản nấm của azoxystrobin đối với loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt. Theo Linu et al. (2006) và Chacko & Gokulapalan (2014), hiệu lực ức chế của azoxystrobin nồng độ 0,1% trên loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt đạt 62,2 - 67,5%. Theo Arunakumara & Satyanarayana (2016), hiệu lực ức chế của azoxystrobin nồng độ 0,1% trên loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt đạt 87,16%. Tuy nhiên, theo Jagtap et al. (2013), hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của azoxystrobin đối với nấm C. capsici gây bệnh trên cây nghệ đạt 76,30%, 82,77% và 100% ở các nồng độ 500 ppm, 1.000 ppm và 1.500 ppm. Đối với loài C. gloeosporioides gây bệnh thán thư xoài, kết quả nghiên cứu của Sundravadana et al. (2007) cho thấy, azoxystrobin ở nồng độ 1 ppm trở lên sẽ ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của nấm trên môi trường PDA.

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập tại ĐBSH và một số tỉnh trên môi trường PDA được ghi tại bảng 4.27 và hình 4.17.

Thuốc Azony 25SC có khả năng ức chế sinh trưởng ở mức độ nhất định đến sự phát triển của các loài nấm Colletotrichum. Trong 4 nồng độ thuốc thí nghiệm, không có nồng độ nào của thuốc ức chế hoàn toàn sự phát triển tản nấm của các loài nấm thí nghiệm. Hiệu lực của thuốc đạt 6,3 - 57,4% tùy thuộc vào loài nấm và có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ thuốc sử dụng trên mỗi loài nấm (bảng 4.27, hình 4.17).

Đối với loài C. gloeosporioides s.s và C. fructicola ở thời điểm sau 7 ngày, hiệu lực của thuốc có sự sai khác rõ rệt giữa 4 nồng độ thuốc thí nghiệm. Hiệu lực đạt cao nhất ở nồng độ tăng 2 lần so với khuyến cáo, kế tiếp là nồng độ khuyến

116

cáo, nồng độ giảm 1/2 so với khuyến cáo và thấp nhất ở nồng độ giảm 1/4 so với khuyến cáo. Trên loài C. gloeosporioides s.s, hiệu lực của thuốc ở nồng độ 0,2% đạt 54,8%, tiếp đến là nồng độ 0,1% đạt 43,0%, kế tiếp là nồng độ 0,05% đạt 31,8% và nồng độ 0,025% hiệu lực chỉ đạt 24,8%. Trên loài C. fructicola, nồng độ 0,2% có hiệu lực đạt 57,4%, tiếp đến nồng độ 0,1% đạt 50,4%, nồng độ 0,05% đạt 43,7% và nồng độ 0,025% hiệu lực của thuốc chỉ đạt 38,5% (bảng 4.27, hình 4.17).

Trên 3 loài nấm C. siamense, C. aeschynomenes và C. truncatum, hiệu lực

của thuốc có sự sai khác rõ rệt giữa nồng độ thí nghiệm. Sau 7 ngày, hiệu lực của

thuốc đạt cao nhất ở nồng độ 0,2%, kế tiếp là nồng độ 0,1% và thấp nhất ở 2

nồng độ còn lại. Không có sự sai khác về hiệu lực ức chế ở hai nồng độ 0,05% và 0,025% trên cả 3 loài nấm. Hiệu lực của thuốc ở nồng độ 0,2% trên loài

C. siamense đạt 55,9%, tiếp đến nồng độ 0,1% đạt 41,5% và thấp nhất ở 2 nồng

độ còn lại, chỉ đạt 31,5 - 35,2%. Trên loài C. aeschynomenes, hiệu lực của thuốc

ở nồng độ 0,2% đạt 53,0%, tiếp đến nồng độ 0,1% đạt 45,2% và thấp nhất ở 2

nồng độ còn lại, chỉ đạt 28,5 - 32,6%. Trên loài C. truncatum, nồng độ 0,2% có

hiệu lực đạt 37,9%, tiếp đến là nồng độ 0,1% đạt 17,8% và thấp nhất ở nồng độ

0,05% và 0,025%, hiệu lực chỉ đạt 6,3 - 9,6% (bảng 4.27, hình 4.17).

Kết quả thu được cho thấy, khả năng ức chế sinh trưởng tản nấm trên môi

trường PDA của thuốc Azony 25SC đối với các loài nấm thí nghiệm là tương đối

thấp. Ở nồng độ tăng 2 lần so với khuyến cáo (0,2%) hiệu lực của thuốc chỉ đạt

37,8 - 57,4% tùy thuộc vào loài nấm. Trong 5 loài nấm nghiên cứu, hiệu lực của

thuốc đối với các loài nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l

(C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes) cao hơn

rõ rệt so với loài C. truncatum ở tất cả các nồng độ thí nghiệm. Cụ thể, ở nồng độ

0,2%, hiệu lực của thuốc đối với phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đạt 53,0 - 57,4% trong khi trên loài C. truncatum hiệu lực chỉ đạt 37,8%. Các nồng độ 0,1%,

0,05% cũng thu được kết quả tương tự và đến nồng độ 0,025% hiệu lực của thuốc đối với phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đạt 24,8 - 31,5 % trong khi trên loài C.

truncatum hiệu lực chỉ đạt 6,3% (bảng 4.27, hình 4.17).

Như vậy, kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng trên môi trường PDA của thuốc Azony 25SC (hoạt chất azoxystrobin) đối với loài nấm C. truncatum và C. gloeosporioides s.s gây bệnh thán thư ớt được thu thập tại ĐBSH và một số tỉnh là thấp hơn rõ rệt so với các công bố của Sundravadana et al. (2007), Jagtap et al. (2013) và Arunakumara & Satyanarayana (2016).

117

Bảng 4.27. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Đường kính tản nấm (mm)

Loài nấm Nồng độ T T

3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày

C. gloeosporioides s.s 1

LSD0,05

C. siamense 2

LSD0,05

C. fructicola 3

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - LSD0,05

C. truncatum 5

Chú thích: * Hiệu lực ức chế các mẫu nấm được tính khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm). Các giá trị trong cùng một cột có những chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

118

2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 18,0 28,3 40,7 24,0 37,3 51,3 26,7 45,0 61,3 30,0 48,3 67,7 31,3 57,3 90,0 2,36 2,09 2,80 8,3 23,3 39,7 15,3 32,0 52,7 19,3 38,0 58,3 22,7 40,3 61,7 37,3 56,7 90,0 3,80 5,63 3,75 12,7 24,7 38,3 15,7 29,3 44,7 20,7 35,3 50,7 24,3 38,3 55,3 40,3 64,7 90,0 2,95 3,44 3,54 11,3 26,7 42,3 16,3 32,7 49,3 25,3 42,0 60,7 29,7 48,3 64,3 41,3 65,3 90,0 2,12 4,05 3,93 18,7 31,3 45,3 56,0 26,7 40,3 59,0 74,0 30,7 46,7 67,0 81,3 31,7 49,3 69,0 84,3 29,3 49,3 71,0 90,0 3,70 4,54 4,15 2,98 Hiệu lực ức chế* (%) 54,8a 43,0b 31,8c 24,8d - 3,11 55,9a 41,5b 35,2c 31,5c - 4,17 57,4a 50,4b 43,7c 38,5d - 3,93 53,0a 45,2b 32,6c 28,5c - 4,37 37,8a 17,8b 9,6c 6,3c - 5,53 LSD0,05

Chú thích: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b - C. siamense (C4), c - C. fructicola (C14), d - C. aeschynomenes (C29), e - C. truncatum (C30) Hình 4.17. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Azony 25SC ở các nồng độ khác nhau

b. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm

bào tử các loài nấm Colletotrichum thu được tại bảng 4.28 cho thấy.

119

Bảng 4.28. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) Hiệu lực ức chế (%) TT Loài nấm Nồng độ

12 giờ 24 giờ 12 giờ 48 giờ

1 C. gloeosporioides s.s

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

LSD0,05

C. siamense

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

LSD0,05 - - - - - - - - - - - -

C. fructicola 3

0,0 0,0 0,0 0,0 4,1

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

0,0 0,0 0,0 0,0 6,1

LSD0,05

C. truncatum 5 0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

48 24 giờ giờ 100,0a 72,3a 0,0 6,1 0,2% 52,8b 71,4b 0,1% 4,6 10,4 40,4c 48,0c 0,05% 13,1 8,2 22,6d 29,0d 0,025% 11,1 16,9 - - 15,8 21,9 9,67 8,33 0,00 1,81 2,43 56,5a 63,7a 0,2% 8,3 5,7 45,2b 51,5b 0,1% 10,5 7,7 32,5c 35,9c 0,05% 10,2 13,0 12,2d 18,3d 0,025% 13,0 16,9 - - 15,9 19,3 11,99 6,40 0,00 1,56 1,58 100,0a 100,0a 82,2a 0,2% 3,7 0,0 100,0a 100,0a 68,2b 0,1% 6,8 0,0 49,3c 10,8 100,0a 56,1b 0,05% 4,1 27,1d 15,6 100,0a 33,8c 0,025% 6,3 - - - 21,5 9,7 9,92 11,08 0,84 1,59 2,34 0,00 100,0a 100,0a 73,2a 0,2% 6,0 0,0 56,6b 100,0a 75,2b 0,1% 9,8 3,9 41,5c 13,4 100,0a 51,1c 0,05% 7,9 21,7d 11,4 17,9 100,0a 28,9d 0,025% - - 16,1 22,9 - 12,09 7,73 1,37 1,82 3,73 0,00 66,3a 12,7 100,0a 71,5a 6,4 57,8a 15,7 100,0a 65,6a 7,7 39,7b 11,2 22,9 100,0a 50,2b 18,7c 15,1 31,0 100,0a 33,3c - -

Chú thích: Hiệu lực ức chế với mỗi loài nấm thu được tại mỗi cột mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

120

Sau 12 giờ theo dõi chỉ xuất hiện bào tử nấm nảy mầm tại công thức đối chứng của ba loài nấm C. fructicola, C. aeschynomenes và C. truncatum. Hiệu lực của thuốc đạt 100% trên cả 3 loài ở tất cả các nồng độ thuốc thí nghiệm. Trên 2 loài còn lại là C. siamense và C. gloeosporioides s.s không ghi nhận bào tử nảy mầm ở tất cả các công thức thí nghiệm và đối chứng (bảng 4.28).

Sau 24 giờ, bào tử tất cả các loài nấm đều nảy mầm. Tỷ lệ này tăng dần ở thời điểm sau 48 giờ và có sự khác giữa các nồng độ thuốc sử dụng và loài nấm. Trên tất các loài nấm, hiệu lực của thuốc Azony 25SC đều đạt cao nhất ở nồng độ 0,2%, đạt 56,5 - 82,2%. Tiếp đến là nồng độ 0,1%, đạt 45,2 - 68,2%, hiệu lực của thuốc giảm dần ở nồng độ 0,05% và thấp nhất ở nồng độ 0,025%, chỉ đạt 12,2 - 27,1% (bảng 4.28).

Khả năng ức chế bào tử nảy mầm của thuốc Azony 25SC có sự khác nhau giữa các loài nấm. Trong 5 loài nấm, hiệu lực của thuốc đạt cao nhất trên loài C. fructicola, tiếp đến là các loài C. gloeosporioides s.s và C. aeschynomenes, loài C. truncatum và thấp nhất trên loài C. siamense. Cụ thể, ở nồng độ tăng 2 lần khuyến cáo, hiệu lực của thuốc trên loài C. fructicola đạt 82,2%, trên loài C. gloeosporioides s.s và C. aeschynomenes đạt 72,3 - 73,2%, loài C. truncatum đạt 66,3% và loài C. siamense chỉ đạt 56,5%. Tại nồng độ khuyến cáo, hiệu lực của thuốc trên loài C. fructicola đạt 68,2%, trên loài C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes và C. truncatum 52,8 - 57,8% và loài C. siamense chỉ đạt 45,2%. Ở nồng độ tăng 1/2 khuyến cáo, hiệu lực của thuốc trên loài C. fructicola đạt 49,3%, trên loài C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes và C. truncatum 39,7 - 41,5% và loài C. siamense chỉ đạt 32,5%. Tương tự, nồng độ 1/4 khuyến cáo, hiệu lực của thuốc trên loài C. fructicola đạt 27,1%, trên loài C. gloeosporioides s.s, C. aeschynomenes và C. truncatum 18,7 - 22,6% và loài C. siamense chỉ đạt 12,2% (bảng 4.28).

4.4.4.2. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum

Antracol 70WP là thuốc trừ nấm thuộc nhóm thuốc Dithiocarbamate có hoạt chất chính là propineb. Hoạt chất này là hỗn hợp giữa các hợp chất kẽm với dithiocarbamate. Nhóm thuốc này đã có từ lâu, phổ tác động rộng, được sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng nấm bệnh hại cây trồng như: nấm Spongospora subterranea gây bệnh vảy phấn trên khoai tây, Glomerella bệnh đốm lá táo… (Kowata et al., 2010). Riêng với bệnh thán thư, propineb đã được sử dụng để phòng trừ bệnh trên các loại cây ớt, đậu ván, lựu, óc chó … (Rajamanickam et al., 2012; Pandey & Gupta, 2016; Hassan et al., 2017).

121

a. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Kết quả nghiên cứu của Arunakumara & Satyanarayana (2016) cho thấy, hiệu lực ức chế sinh trưởng của propineb đối với sự phát triển tản nấm trên môi

trường PDA của loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt ở nồng độ 0,2% là 77,94%.

Trên loài C. capsici gây bệnh thán thư ở cây nghệ, hiệu lực ức chế sinh trưởng

của propineb đối với sự phát triển tản nấm trên môi trường PDA đạt 65,55%, 70,55% và 85,18% tương ứng với các nồng độ 500 ppm, 1.000 ppm và 1.500

ppm (Jagtap et al., 2013). Đối với loài C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên

cây lựu, hiệu lực ức chế sinh trưởng của propineb đối với với sự phát triển tản

nấm trên môi trường PDA ở các nồng độ 0,1%, 0,2% và 0,3% lần lượt là

14,83%, 20,22% và 38,29% (Rajamanickam et al., 2012).

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng

sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum thu được tại bảng 4.29 và hình 4.18

cho thấy.

Thuốc Antracol 70WP đạt hiệu lực cao nhất trên 2 loài nấm C. fructicola

và C. aeschynomenes. Hiệu lực của thuốc đạt 100% ở nồng độ 0,6%, tiếp đến

nồng độ 0,3% đạt 59,6 - 65,9%, nồng độ 0,15% đạt 51,8 - 54,1% và thấp nhất

nồng độ 0,075%, hiệu lực chỉ đạt 36,3 - 43,3%. Giữa hai loài nấm, ở các nồng độ

0,3% và 0,15% hiệu lực của thuốc Antracol 70WP thu được trên loài

C. aeschynomenes cao hơn trên loài C. fructicola. Tuy nhiên ở nồng độ 0,075%

kết quả thu được lại hoàn toàn ngược lại, hiệu lực ức chế đạt 36,3% trên loài

C. aeschynomenes và 43,3% trên loài C. fructicola (bảng 4.29 và hình 4.18).

Trên loài nấm C. gloeosporioides s.s, hiệu lực của thuốc Antracol 70WP đạt

97,4% ở nồng độ 0,6%, tiếp đến là nồng độ 0,3% đạt 78,5%, nồng độ 0,15% đạt

67,0% và thấp nhất ở nồng độ 0,075%, chỉ đạt 37,4%. Kết quả thu được về hiệu lực của thuốc Antracol 70WP trên loài C. gloeosporioides cao hơn rõ rệt so với công bố của Jayalakshmi et al. (2012). Theo chúng tôi, sở dĩ có sự sai khác này là do chủng nấm thu thập trên 2 đối tượng cây trồng và sinh thái khác nhau. Hơn nữa, loài C. gloeosporioides dùng trong thí nghiệm này đã được xác định là C. gloeosporioides s.s, trong khi loài C. gloeosporioides sử dụng trong thí

nghiệm của Jayalakshmi không được trình bày cụ thể. Có thể mẫu nấm thí

nghiệm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l (bảng 4.29 và hình 4.18).

122

Bảng 4.29. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

TT Loài nấm Nồng độ

1 C. gloeosporioides s.s

LSD0,05

C. siamense 2

LSD0,05

C. fructicola 3

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

9 ngày - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - LSD0,05

C. truncatum 5

Chú thích: * Hiệu lực ức chế các mẫu nấm được tính khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm); Các giá trị trong cùng một cột có những chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

123

2 lần khuyến cáo 0,6% khuyến cáo 0,3% 1/2 khuyến cáo 0,15% 1/4 khuyến cáo 0,075% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,6% khuyến cáo 0,3% 1/2 khuyến cáo 0,15% 1/4 khuyến cáo 0,075% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,6% khuyến cáo 0,3% 1/2 khuyến cáo 0,15% 1/4 khuyến cáo 0,075% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,6% 0,3% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,15% 1/4 khuyến cáo 0,075% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,6% 0,3% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,15% 1/4 khuyến cáo 0,075% Đ/C Đường kính tản nấm (mm) 3 7 5 ngày ngày ngày 0,0 0,0 2,3 4,3 10,7 19,3 16,3 29,7 9,0 20,3 38,0 56,3 31,3 57,3 90,0 2,79 3,65 2,71 18,7 30,3 7,3 13,3 29,0 48,3 17,3 35,7 56,0 27,7 46,7 66,7 37,3 56,7 90,0 3,70 4,32 3,46 0,0 0,0 0,0 13,3 23,3 36,3 19,3 30,7 43,3 23,0 35,7 51,0 40,3 64,7 90,0 2,92 4,11 3,67 0,0 0,0 0,0 19,0 30,7 8,3 14,7 28,3 41,3 23,7 41,7 57,3 41,3 65,3 90,0 1,61 4,78 3,61 11,7 20,3 31,3 5,7 18,0 29,7 41,7 9,7 16,7 28,3 43,7 59,7 22,7 36,7 53,7 74,7 29,3 49,3 71,0 90,0 2,16 2,84 3,58 3,91 Hiệu lực ức chế* (%) 97,4a 78,5b 67,0c 37,4d - 3,01 66,3a 46,3b 37,8c 25,9d - 3,85 100,0a 59,6b 51,8c 43,3d - 4,08 100,0a 65,9b 54,1c 36,3d - 4,01 65,2a 53,7b 33,7c 17,0d - 4,35 LSD0,05

Hiệu lực của thuốc Antracol 70WP đạt thấp nhất trên 2 loài C. siamense và C. truncatum. Ở nồng độ 0,6% hiệu lực của thuốc đạt 65,2 - 66,3%, hiệu lực

giảm dần ở các nồng độ 0,3%, 0,15% và thấp nhất ở nồng độ 0,075%, chỉ đạt

17,0 - 25,9% (bảng 4.29 và hình 4.18). Kết quả thu được cho thấy, hiệu lực của

thuốc Antracol 70WP trên loài C. truncatum được thu thập tại ĐBSH thấp hơn công bố của Arunakumara & Satyanarayana (2016) về hiệu lực của propineb với

loài C. capsici gây hại trên cây ớt tại Ấn Độ.

Chú thích: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b - C. siamense (C4), c - C. fructicola (C14), d - C. aeschynomenes (C29), e - C. truncatum (C30) Hình 4.18. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Antracol 70WP ở các nồng độ khác nhau

124

b. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

Kết quả theo dõi tỷ lệ nảy mầm bào tử của các loài Colletotrichum ở các

nồng độ thuốc Antracol 70WP tại bảng 4.30 cho thấy.

Sau 12 giờ, hiệu lực của thuốc Antracol 70WP đạt 100% ở tất cả các nồng

độ thuốc thí nghiệm trên 3 loài nấm có bào tử nảy mầm tại công thức đối chứng

là C. fructicola, C. aeschynomenes và C. truncatum. Sau 24 giờ, tất các loài nấm

thí nghiệm đều có bào tử nảy mầm, số lượng này tăng dần sau 48 giờ, dẫn tới

hiệu lực ức chế của các loại thuốc giảm. Trên tất cả các loài nấm đều ghi nhận sự khác nhau rõ rệt về hiệu lực của các nồng độ thuốc sử dụng ở thời điểm các thời

điểm theo dõi. Nồng độ 0,6% có hiệu lực cao nhất, đạt 100% sau 24 giờ và 80,7 - 1 00% sau 48 giờ. Tiếp đến, nồng độ 0,3% có hiệu lực đạt 55,8 - 79,7% sau 24

giờ và 47,7 - 73,2% sau 48 giờ. Nồng độ 0,15% có hiệu lực đạt 43,8 - 65,2% sau

24 giờ và 34,6 - 57,4% sau 48 giờ. Hiệu lực của thuốc đạt thấp nhất ở nồng độ

0,075%, sau 24 giờ và 48 giờ hiệu lực của thuốc chỉ đạt 22,9 - 42,6% và 17,3 -

32,4% (bảng 4.30).

Ngoài sự khác nhau về hiệu lực ức chế giữa các nồng độ thuốc trên các loài,

chúng tôi nhận thấy có sự sai khác đáng kể về hiệu lực ức chế của thuốc với từng

loài nấm. Hiệu lực ức chế của thuốc Antracol 70WP trên 5 loài nấm thí nghiệm

được chia thành 2 nhóm.

Nhóm 1, gồm 3 loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola và C. aeschynomenes. Sau 48 giờ, bào tử nấm bị ức chế hoàn toàn sự nảy mầm ở nồng

độ 0,6%. Tiếp theo, hiệu lực ức chế đạt 61,2 - 73,2% ở nồng độ 0,3%. Nồng độ

0,15%, hiệu lực đạt 47,7 - 57,4%. Hiệu lực ức chế của thuốc thấp nhất ở nồng độ

0,075%, chỉ đạt 28,2 - 32,4%. Trong 3 loài nấm chúng tôi nhận thấy, hiệu lực ức

chế của thuốc trên loài C. gloeosporioides s.s cao hơn 2 loài còn lại (bảng 4.30).

Nhóm 2, gồm 2 loài C. siamense và C. truncatum. Hiệu lực ức chế của thuốc với các loài nấm trong nhóm này thấp hơn các loài thuộc nhóm 1. Không có nồng độ nào của thuốc ức chế hoàn toàn bào tử nảy mầm trên 2 loài nấm. Sau 48 giờ, hiệu lực ức chế đạt 80,7 - 84,3% ở nồng độ 0,6%. Nồng độ 0,3%, hiệu lực ức chế đạt 50,4 - 57,4%, tiếp đến nồng độ 0,15% có hiệu lực ức chế đạt 34,6 -

38,7%. Hiệu lực ức chế của thuốc thấp nhất ở nồng độ 0,075%, chỉ đạt 17,3 -

17,5% (bảng 4.30).

125

Bảng 4.30. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

TT Loài nấm Nồng độ

1 C. gloeosporioides s.s

LSD0,05

C. siamense 2

12 giờ - - - - - - - - - - LSD0,05

C. fructicola 3

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

LSD0,05

C. truncatum 5

Chú thích: Hiệu lực ức chế với mỗi loài nấm thu được tại mỗi cột mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

126

Hiệu lực ức chế Tỷ lệ bào tử nảy (%) mầm (%) 24 48 48 24 12 giờ giờ giờ giờ giờ 100,0a 100,0a 0,0 0,0 2 lần khuyến cáo 0,6 % 0,0 73,2b 79,7b 5,8 3,1 khuyến cáo 0,3 % 0,0 57,4c 65,2c 9,3 5,5 0,15 % 0,0 1/2 khuyến cáo 32,4d 42,6d 9,1 14,7 1/4 khuyến cáo 0,075 % 0,0 - - 0,0 Đ/C 15,8 21,9 8,67 7,92 0,00 2,27 2,55 100,0a 84,3a 0,6 % 0,0 3,0 0,0 2 lần khuyến cáo 50,4b 55,8b 0,3 % 0,0 9,5 6,9 khuyến cáo 34,6c 43,3c 9,0 1/2 khuyến cáo 12,6 0,15 % 0,0 17,5d 24,2d 12,0 15,8 1/4 khuyến cáo 0,075 % 0,0 - - 15,9 19,3 0,0 Đ/C 9,12 7,67 0,00 1,56 2,39 100,0a 100,0a 100,0a 0,6 % 0,0 0,0 0,0 2 lần khuyến cáo 61,2b 100,0a 72,4b 0,3 % 0,0 8,3 2,7 khuyến cáo 47,7c 11,3 100,0a 54,8c 4,3 1/2 khuyến cáo 0,15 % 0,0 29,5d 15,2 100,0a 36,7d 6,2 1/4 khuyến cáo 0,075 % 0,0 - - - 21,5 9,7 4,1 Đ/C 0,00 0,84 1,59 2,74 10,76 9,86 100,0a 100,0a 100,0a 0,6 % 0,0 0,0 0,0 2 lần khuyến cáo 64,8b 100,0a 77,9b 0,3 % 0,0 8,0 3,6 khuyến cáo 51,2c 11,3 100,0a 59,8c 6,4 1/2 khuyến cáo 0,15 % 0,0 28,2d 16,7 100,0a 38,5d 1/4 khuyến cáo 0,075 % 0,0 9,9 - - - 16,1 22,9 6,1 Đ/C 0,00 1,37 2,24 3,52 8,58 8,28 100,0a 100,0a 80,7a 0,6 % 0,0 0,0 2 lần khuyến cáo 7,4 57,4b 16,4 100,0a 59,1b 0,3 % 0,0 9,3 khuyến cáo 38,7c 12,9 23,5 100,0a 43,0c 1/2 khuyến cáo 0,15 % 0,0 17,3d 17,4 31,7 100,0a 22,9d 1/4 khuyến cáo 0,075 % 0,0 - Đ/C 6,32 11,5 22,7 38,2 1,66 2,23 4,53 - 0,00 - 7,79 LSD0,05

4.4.1.3. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum

Tiptop 250EC là thuốc trừ nấm thuộc nhóm Triazole với hoạt chất chính là propiconazole. Đây là nhóm thuốc trừ nấm trừ nấm nội hấp, phổ rộng, được phát triển từ những năm 70 của thế kỷ 20 cho đến nay. Cơ chế tác động của nhóm thuốc này là kìm hãm tác động sự tách metyl của steroid dẫn đến kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol. Một số thuốc còn kìm hãm sinh tổng hợp gibbellelin và ergosterol (Triadimenol). Hậu quả, làm ngừng sự phát triển của ống mầm và sợi nấm, ngăn cản hình thành giác bám hay giác mút và kìm hãm bào tử nảy mầm. Hiện có rất nhiều hoạt chất trong nhóm triazole được sử dụng trong nông nghiệp, các hoạt chất phổ biến gồm: Azaconazole; Cypro-conazole; Difenoconazole; Hexaconazole; Ipconazole; Penconazole; Propiconazole; Simeconazole; Tebuconazole; Tetraconazole; Triadimefon; Triadimenol; Triticonazole…

Mặc dù xuất hiện từ lâu, nhưng đến nay propiconazole vẫn được sử dụng rộng rãi và mang lại hiệu quả trên nhiều đối tượng nấm hại cây trồng như: nấm Cercospora spp. gây bệnh đốm lá lạc, các loài nấm Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, F. solani và Rhizoctonia solani gây bệnh héo trên cây đậu gà; bệnh nấm than trên cây ngô ngọt do nấm Sporisorium reilianum … (Wright et al., 2006; Andrabi et al., 2011). Riêng với bệnh thán thư, đến nay propiconazole đã được sử dụng để phòng trừ hiệu quả bệnh trên các cây ớt, xoài, đậu ván, đậu tương … (Gawade et al., 2009; Shukla et al., 2010; Singh, 2011; Chacko & Gokulapalan, 2014).

a. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài

nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Kết quả nghiên cứu của Chacko & Gokulapalan (2014) trên loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt tại Ấn Độ cho thấy, loài C. capsici bị ức chế hoàn toàn sinh trưởng trên môi trường PDA khi sử dụng propiconazole ở nồng độ 0,05%. Tuy nhiên, cũng trên loài C. capsici gây bệnh thán thư ớt, kết quả nghiên cứu của Arunakumara & Satyanarayana (2016) lại xác định hiệu lực ức chế sinh trưởng của propiconazole nồng độ 0,1% đối với sự phát triển tản nấm trên môi trường PDA là 97,54%. Đối với loài C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây điều, hiệu lực ức chế sinh trưởng của propiconazole ở nồng độ 50 ppm đạt 100% (Nakpalo et al., 2017).

Kết quả đánh giá hiệu lực của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng tản nấm của các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh tại bảng 4.31 và hình 4.19 cho thấy.

127

Bảng 4.31. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

TT Loài nấm Nồng độ

3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày

C. gloeosporioides s.s 1

0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

LSD0,05

C. siamense 2

0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

LSD0,05

C. fructicola 3

0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

LSD0,05

C. truncatum 5

0,2% 0,1% 0,05% 0,025%

128

Đường kính tản nấm (mm) Hiệu lực ức chế* (%) 100,0a - 91,5b - 83,7c - 74,1d - - - 2,67 - 93,7a - 87,0b - 80,7c - 76,3c - - - 4,76 - 100,0a - 100,0a - 100,0a - 100,0a - - - 0,0 - 100,0a - 100,0a - 100,0a - 100,0a - - - 0,0 - 100,0a 0,0 16,0 82,2b 69,6c 27,3 33,7 62,6d 90,0 3,51 0,0 7,7 14,7 23,3 90,0 2,41 5,7 11,7 17,3 21,3 90,0 4,29 0,0 0,0 0,0 0,0 90,0 0,15 0,0 0,0 0,0 0,0 90,0 0,15 0,0 12,3 22,7 27,0 71,0 4,24 0,0 4,0 8,7 13,3 57,3 2,33 0,0 6,3 9,0 12,3 56,7 3,46 0,0 0,0 0,0 0,0 64,7 2,12 0,0 0,0 0,0 0,0 65,3 3,40 0,0 5,7 14,0 17,3 49,3 2,75 0,0 0,0 5,3 7,0 31,3 1,97 0,0 0,0 4,0 6,0 37,3 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 40,3 1,28 0,0 0,0 0,0 0,0 41,3 1,75 0,0 0,0 8,3 11,7 29,3 2,65 - 3,89 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C 2 lần khuyến cáo khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 1/4 khuyến cáo Đ/C LSD0,05

Thuốc Tiptop 250EC đạt hiệu lực cao nhất trên 2 loài nấm C. fructicola và C. aeschynomenes. Sau 7 ngày, hiệu lực của thuốc đạt 100% ở tất cả các nồng độ

thí nghiệm (bảng 4.31, hình 4.19).

Chú thích: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b - C. siamense (C4), c - C. fructicola (C14), d - C. aeschynomenes (C29), e - C. truncatum (C30) Hình 4.19. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Tiptop 250EC ở các nồng độ khác nhau

Trên 3 loài nấm còn lại là C. gloeosporioides s.s, C. siamense và

C. truncatum, hiệu lực thu được của thuốc thấp hơn 2 loài C. fructicola và

C. aeschynomenes. Tại nồng độ 0,2%, hiệu lực của thuốc đạt 100% trên loài

129

C. gloeosporioides s.s, C. truncatum và 93,7% trên loài C. siamense. Nồng độ 0,1%, hiệu lực đạt 82,2 - 91,5%. Nồng độ 0,05%, hiệu lực đạt 69,6 - 83,7%. Hiệu

lực của thuốc thấp nhất ở nồng độ 0,025%, chỉ đạt 62,6 - 76,3%. Ngoài ra, chúng

tôi nhận thấy có sự sai khác đáng kể về nồng độ thuốc sử dụng đến hiệu lực đối

với 3 loài nấm. Nồng độ 0,2%, hiệu lực ức chế đạt 100% trên loài C. gloeosporioides s.s và C. truncatum, 93,7% trên loài C. siamense. Tuy nhiên,

ở các nồng độ còn lại hiệu lực thu được của thuốc trên loài C. truncatum luôn thấp hơn 2 loài C. gloeosporioides s.s và C. siamense. Cụ thể, hiệu lực ở các

nồng độ 0,1%, 0,05% và 0,025% lần lượt đạt 87,0 - 91,5%, 80,7 - 83,7% và 74,1

- 76,3% trên loài C. gloeosporioides s.s và C. siamense. Tương tự, ở các nồng độ

tương ứng hiệu lực của thuốc trên loài C. truncatum chỉ đạt lần lượt 82,2%,

69,6% và 62,6% (bảng 4.31, hình 4.19).

Từ kết quả thu được của thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy hiệu lực ức chế

sinh trưởng tản nấm của thuốc Tiptop 250EC trên loài C. truncatum thu thập tại

ĐBSH và một số tỉnh thấp hơn rõ rệt với các kết quả công bố của Chacko &

Gokulapalan (2014) và Arunakumara & Satyanarayana (2016). Như vậy, bước

đầu có thể nhận thấy loài C. truncatum gây bệnh trên ớt ở ĐBSH có tính chống chịu với propiconazole cao hơn loài C. capsici gây hại trên cây ớt tại Ấn Độ.

b. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các

loài nấm Colletotrichum

Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy

mầm bào tử của các loài Colletotrichum thu được tại bảng 4.32 cho thấy.

Thuốc Tiptop 250EC có hiệu lực cao trên 3 loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola và C. aeschynomenes. Sau 48 giờ, hiệu lực của thuốc đạt 100% ở

các nồng độ 0,2% và 0,1%. Nồng độ 0,05%, hiệu lực đạt 75,4 - 88,6% sau 24 giờ

và 66,6 - 67,7% sau 48 giờ. Hiệu lực của thuốc thấp nhất ở nồng độ 0,025%, chỉ

đạt 50,6 - 57,9% sau 24 giờ và 42,3 - 49,4% sau 48 giờ (bảng 4.32).

Hiệu lực ức chế bào tử nảy mầm của thuốc Tiptop 250EC thu được trên loài C. siamense và C. truncatum là tương đương nhau và thấp hơn trên các loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. aeschynomenes. Trên loài C. siamense và C. truncatum, chỉ duy nhất nồng độ 0,2% ức chế hoàn toàn sự nảy mầm hình thành giác bám của bào tử. Tiếp đến, nồng độ 0,1% có hiệu lực đạt 69,1 - 70,8%. Hiệu lực của thuốc đạt 54,8 - 56,9% ở nồng độ 0,05% và thấp nhất ở nồng độ 0,025%, chỉ đạt 30,2 - 31,1% (bảng 4.32).

130

Bảng 4.32. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) Hiệu lực ức chế (%) TT Loài nấm Nồng độ

12 giờ 24 giờ 12 giờ 48 giờ

1 C. gloeosporioides s.s

LSD0,05

C. siamense 2

- - - - - - - - - - LSD0,05

C. fructicola 3

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

LSD0,05

C. truncatum 5

Chú thích: Hiệu lực ức chế với mỗi loài nấm thu được tại mỗi cột mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

131

2 lần khuyến cáo 0,2% khuyến cáo 0,1% 1/2 khuyến cáo 0,05% 1/4 khuyến cáo 0,025% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,2% khuyến cáo 0,1% 1/2 khuyến cáo 0,05% 1/4 khuyến cáo 0,025% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,2% 0,1% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,05% 1/4 khuyến cáo 0,025% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,2% 0,1% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,05% 1/4 khuyến cáo 0,025% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,2% 0,1% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,05% 1/4 khuyến cáo 0,025% Đ/C 24 48 giờ giờ 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 5,3 0,0 0,0 59,7b 75,4b 8,9 3,9 0,0 42,3c 56,9c 6,7 13,9 0,0 - - 0,0 15,8 21,9 5,72 7,88 0,00 2,04 2,01 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 69,1b 5,8 0,0 0,0 56,9c 79,7b 8,2 3,1 0,0 30,2d 54,9c 7,1 0,0 13,5 - - 15,9 19,3 0,0 14,37 8,06 0,00 1,81 3,51 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 100,0b 0,0 0,0 0,0 67,7c 76,5b 100,0a 6,9 2,3 0,0 43,4d 50,6c 12,1 100,0a 4,6 0,0 - - 21,5 9,7 4,1 - 0,00 0,84 1,70 1,89 6,96 12,94 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 66,6c 88,6b 100,0a 7,6 1,8 0,0 49,4d 57,9c 11,6 100,0a 6,7 0,0 - - 16,1 22,9 6,1 - 0,00 2,18 3,65 1,3 9,03 6,87 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 10,9 100,0a 100,0a 70,8b 0,0 0,0 54,8c 17,3 100,0a 6,1 0,0 31,1d 11,1 26,2 100,0a 0,0 - 11,5 22,7 38,2 12,45 1,66 2,38 5,61 73,1b 50,7c - 6,63 - 0,00 LSD0,05

4.4.1.4. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum

Score 250EC là thuốc trừ nấm có hoạt chất chính là difenoconazole. Tương

tự như Tiptop 250EC, Score 250EC cũng là thuốc trừ nấm thuộc nhóm thuốc trừ

nấm Triazole.

Giống như các thuốc thuộc nhóm Triazole, hiện nay difenoconazole được sử

dụng để phòng trừ hiệu quả nhiều đối tượng nấm bệnh hại cây trồng như: bệnh

đốm vòng lá khoai tây (Alternaria solani), bệnh đốm đen trên quả hồng, nấm

Fusarium gây hại trên cây thông lá dài, xử lý hạt giống để kiểm ngăn chặn bệnh

thán thư gây hại trên các cây ớt, xoài, cây có múi… (Horsfield et al., 2010; Chacko

& Gokulapalan, 2014; Jairo et al., 2012; Rajesha et al., 2010; Silva et al., 2014) .

a. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài

nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Các kết quả nghiên cứu về hiệu lực của difenoconazole đối với các loài

nấm Colletotrichum cho thấy: difenoconazole ở nồng độ 0,05% ức chế 100% khả

năng phát triển tản nấm C. capsici gây bệnh thán thư ớt (Chacko & Gokulapalan,

2014). Đối với nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư xoài, difenoconazole

là thuốc có hiệu lực cao nhất trong số 10 loại thuốc hóa học thử nghiệm đối

với sự ức chế sinh trưởng tản nấm trên môi trường PDA (Jairo et al,. 2012). Kết quả đánh giá hiệu lực của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng

của các loài nấm Colletotrichum được trình bày tại bảng 4.33 và hình 4.20.

Thuốc Score 250EC đã ức chế hoàn toàn sự phát triển tản nấm của 2 loài

C. fructicola và C. aeschynomenes ở tất cả các nồng độ thuốc thí nghiệm. Sau 7

ngày theo dõi, hiệu lực của thuốc đều đạt 100% ở 4 nồng độ thí nghiệm (bảng

4.33, hình 4.20).

Trên loài nấm C. gloeosporioides s.s, thuốc Score 250EC cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển tản nấm các nồng độ 0,1%, 0,05% và 0,025%. Tản nấm chỉ phát triển được ở nồng độ 0,0125%, sau 7 ngày theo dõi kích thước tản nấm đạt

7,3 mm và hiệu lực đạt 91,8% (bảng 4.33, hình 4.20).

Trên 2 loài nấm C. siamense và C. truncatum hiệu lực thu được của thuốc Score 250EC là tương đương nhau. Hiệu lực của thuốc đều đạt 100% ở nồng độ

0,1% và 0,05%. Tiếp đến là nồng độ 0,025%, hiệu lực đạt 90,0 - 91,8% và thấp

nhất ở nồng độ 0,125%, hiệu lực đạt 87,4 - 88,1% (bảng 4.33, hình 4.20).

132

Bảng 4.33. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

TT Loài nấm Nồng độ

1 C. gloeosporioides s.s

LSD0,05

C. siamense 2

LSD0,05

C. fructicola 3

LSD0,05

C. aeschynomenes 4

LSD0,05

C. truncatum 5

133

2 lần khuyến cáo 0,1% khuyến cáo 0,05% 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% khuyến cáo 0,05% 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% khuyến cáo 0,05% 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C Đường kính tản nấm (mm) 9 7 5 3 ngày ngày ngày ngày 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 7,3 0,0 - 31,3 57,3 90,0 - 1,28 0,48 1,28 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 7,3 4,0 0,0 - 0,0 9,7 4,3 - 37,3 56,7 90,0 - 1,75 2,32 1,99 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 40,3 64,7 90,0 - 1,29 1,12 0,15 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 - 41,3 65,3 90,0 - 1,75 3,40 0,15 - 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,3 3,3 0,0 9,0 0,0 8,7 11,3 5,3 29,3 49,3 71,0 90,0 1,29 1,19 1,75 1,85 Hiệu lực ức chế* (%) 100,0a 100,0a 100,0a 91,8b - 1,43 100,0a 100,0a 91,8b 88,1c - 2,21 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a - 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a - 0,0 100,0a 100,0a 90,0b 87,4c - 2,06 LSD0,05

Như vậy, kết quả thu được của thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum là tương tự với

các kết quả nghiên cứu của Chacko & Gokulapalan (2014), Jairo et al. (2012).

Chú thích: a - C. gloeosporioides s.s (C44), b - C. siamense (C4), c - C. fructicola (C14), d - C. aeschynomenes (C29), e - C. truncatum (C30) Hình 4.20. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Score 250EC ở các nồng độ khác nhau

b. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm của bào tử các loài

nấm Colletotrichum

Kết quả đánh giá hiệu lực của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm

bào tử của các loài nấm Colletotrichum được tổng hợp tại bảng 4.34.

134

Bảng 4.34. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum

Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) Hiệu lực ức chế (%) TT Loài nấm Nồng độ

24 giờ 48 giờ 12 giờ 12 giờ

1 C. gloeosporioides s.s 48 24 giờ giờ 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a

LSD0,05

C. siamense 2

- - - - - - - - - - LSD0,05

C. fructicola 3

- 0,00 - 0,00 LSD0,05

C. aeschynomenes 4 - 0,00 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 100,0a 100,0a 100,0a

- 0,00 - 0,00 LSD0,05

C. truncatum 5

Chú thích: Hiệu lực ức chế với mỗi loài nấm thu được tại mỗi cột mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

135

2 lần khuyến cáo 0,1% khuyến cáo 0,05% 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 2 lần khuyến cáo 0,1% 0,05% khuyến cáo 1/2 khuyến cáo 0,025% 1/4 khuyến cáo 0,0125% Đ/C 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - - 15,8 21,9 0,0 0,00 0,00 0,00 1,90 1,99 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 93,9b 100,0a 1,2 0,0 0,0 65,9c 89,5b 1,6 0,0 6,6 - - 15,9 19,3 0,0 6,88 8,67 0,00 1,99 2,01 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 0,0 21,5 9,7 4,1 0,84 1,41 1,42 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,1 22,9 6,1 1,37 1,96 3,29 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,2 11,5 22,7 38,2 1,65 2,22 4,08 - 0,00 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 0,0 100,0a 100,0a 100,0a 95,4b 1,8 100,0a 100,0a 77,6c 8,5 100,0a 90,3b - - 4,30 0,00 - 1,96 LSD0,05

Thuốc Score 250EC ức chế hoàn toàn sự nảy mầm bào tử của các loài C. gloeosporioides s.s, C. fructicola và C. aeschynomenes. Sau 48 giờ, hiệu lực

của thuốc đạt 100% ở tất cả các nồng độ thí nghiệm trên 3 loài nấm (bảng 4.34).

Trên 2 loài C. siamense và C. truncatum, thuốc Score 250EC ức chế hoàn toàn bào tử nảy mầm ở các nồng độ 0,2% và 0,1%. Ở nồng độ 0,05%, bào tử nấm

của 2 loài chỉ nảy mầm sau 48 giờ, hiệu lực của thuốc đạt 93,4 - 95,9%. Tại nồng

độ thấp nhất 0,025%, hiệu lực của thuốc đạt 89,9 - 90,3% sau 24 giờ và 65,6 -

77,6% sau 48 giờ (bảng 4.34).

Nhận xét chung về hiệu lực của các loại thuốc hóa học:

Trong 4 loại thuốc thí nghiệm, Score 250EC (difenoconazole) là thuốc có

hiệu lực ức chế sinh trưởng sản nấm và bào tử nảy mầm cao nhất. Tiếp đến là

thuốc Tiptop 250 EC (propiconazole), hiệu lực ức chế giảm dần trên thuốc

Antracol 70WP (propineb) và thấp nhất trên thuốc Azony 25SC (azoxystrobin).

Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm và nảy mầm bào tử của các loại thuốc

hóa học là khác nhau đối với các loài nấm. Trên tất cả các các loại thuốc thí

nghiệm, hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm và nảy mầm bào tử thu được trên 3

loài nấm C. fructicola, C. aeschynomenes và C. gloeosporioides s.s luôn cao hơn

2 loài C. siamense và C. truncatum. Điều đó chứng tỏ trong 5 loài nấm được phát

hiện, 2 loài C. truncatum và C. siamense có khả năng chống chịu với các loại

thuốc thí nghiệm cao hơn 3 loài còn lại.

4.4.2. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Biện pháp sử dụng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum spp. đã được nghiên cứu, ứng dụng và thu được một số kết quả

bước đầu. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Liên & cs. (2016) đã xác định

được hiệu lực ức chế của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (CT10) với nấm Colletotrichum SP. Gây bệnh thán thư ớt đạt 53,34%. Ashwini & Srividya (2014) đã công bố, hiệu lực ức chế của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis với nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư ớt đạt 57%. Trong khi đó, trên loài C. truncatum gây bệnh thán thư đậu tương, chủng vi khuẩn Burkholderia glumae

và Serratia marcescens có hiệu lực ức chế đạt lần lượt là 61,80% và 35,77% (Begum

et al., 2008).

Trong thời gian gần đây, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (Học viện Nông

136

nghiệp Việt Nam) đã thu thập được một số chủng vi khuẩn đối kháng Bacillus spp có tác dụng ức chế nấm. Dựa trên các mẫu vi khuẩn sẵn có, chúng tôi lựa

chọn 6 mẫu vi khuẩn để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng với các loài nấm

Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt được thu thập. Kết quả thí nghiệm được

trình bày tại bảng 4.35 và hình 4.21.

Kết quả thử nghiệm đã cho thấy cả 6 mẫu vi khuẩn Bacillus spp được kí

hiệu là A15, TL4, N2, MSV4, HT1 và HT7 đều có khả năng ức chế với các loài

nấm thí nghiệm. Hiệu lực ức chế của các mẫu vi khuẩn đạt 55,2 - 87,8% tùy

thuộc vào mẫu vi khuẩn và loài nấm (bảng 4.35, hình 4.21).

Trên loài C. gloeosporioides s.s, hiệu lực của các mẫu vi khuẩn đạt 77,4 -

84,1%. Các mẫu vi khuẩn HT, N2, MSV4 có hiệu lực cao nhất, đạt 83,7 - 84,1%,

tiếp đến là mẫu vi khuẩn HT7, hiệu lực đạt 79,6%. Hiệu lực ức chế thấp nhất, chỉ

đạt 77,4% trên các mẫu vi khuẩn TL4 và A15 (bảng 4.35, hình 4.21A).

Trên loài C. siamense, hiệu lực ức chế của 6 mẫu vi khuẩn đạt 66,3 -

87,8%. Mẫu vi khuẩn HT1 có khả năng ức chế cao nhất, hiệu lực đạt 87,8%. Tiếp

theo là mẫu vi khuẩn N2, hiệu lực đạt 82,6%. Hiệu lực ức chế giảm dần ở các

mẫu vi khuẩn MSV4, HT7 và thấp nhất ở 2 mẫu còn lại là TL4, A15, chỉ đạt 66,3

- 66,7% (bảng 4.35, hình 4.21B).

Hiệu lực ức chế của các mẫu vi khuẩn đạt 55,2 - 84,4% trên loài nấm

C. fructicola. Các mẫu vi khuẩn HT1, N2 có hiệu lực ức chế cao nhất, đạt 83,3 -

84,4%. Tiếp đến là các mẫu vi khuẩn HT7 và MSV4, hiệu lực đạt 76,3 - 76,7%.

Hiệu lực ức chế giảm ở mẫu vi khuẩn A15, đạt 67,4% và thấp nhất trên mẫu vi

khuẩn TL4, đạt 55,2% (bảng 4.35, hình 4.21C).

Trên loài C. aeschynomenes, hiệu lực ức chế của các mẫu vi khuẩn đạt 63,7

- 79,3%. Hai mẫu vi khuẩn HT1 và N2 có hiệu lực ức chế cao nhất, đạt 79,3%. Kế tiếp là mẫu vi khuẩn MSV4, hiệu lực đạt 77,0%, các mẫu vi khuẩn HT7 và A15 có hiệu lực đạt 69,6 - 71,1%. Hiệu lực ức chế đạt thấp nhất trên mẫu vi

khuẩn TL4, chỉ đạt 63,7% (bảng 4.35, hình 4.21D).

Trên loài C. truncatum, hiệu lực ức chế của các mẫu vi khuẩn đạt 78,1 - 84,8%. Hiệu lực ức chế đạt cao nhất trên các mẫu vi khuẩn HT1, N2 và MSV4, đạt 84,1 -

84,8%. Tiếp đến là các mẫu vi khuẩn HT7 và A15, hiệu lực đạt 81,5 - 81,9%. Hiệu

lực ức chế thấp nhất trên mẫu vi khuẩn TL4, chỉ đạt 78,1% (bảng 4.35, hình 4.21E).

137

Bảng 4.35. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Đường kính tản nấm (mm)

TT

Loài nấm

C. gloeosporioides s.s

LSD0,05

C. siamense

LSD0,05

3 C. fructicola

LSD0,05

C. aeschynomenes

LSD0,05

C. truncatum

Mẫu vi khuẩn HT1 HT7 MSV4 N2 TL4 A15 ĐC HT1 HT7 MSV4 N2 TL4 A15 ĐC HT1 HT7 MSV4 N2 TL4 A15 ĐC HT1 HT7 MSV4 N2 TL4 A15 ĐC HT1 HT7 MSV4 N2 TL4 A15 ĐC

3 ngày 6,3 7,0 6,7 5,7 7,7 8,3 32,3 1,92 4,7 8,0 7,0 5,7 11,3 12,0 38,7 2,30 5,7 9,0 9,3 6,3 19,7 14,7 41,7 2,39 7,7 11,3 8,0 8,3 10,7 9,0 40,7 2,20 5,3 6,7 5,0 4,3 7,3 6,3 28,3 1,73

5 ngày 11,0 12,3 11,0 10,3 15,3 15,0 60,7 2,36 7,3 16,0 12,3 11,3 22,7 21,7 61,3 2,58 10,3 15,7 15,0 11,3 32,0 22,3 62,3 3,10 13,3 19,7 15,3 14,0 23,3 20,7 63,7 3,22 8,0 9,3 8,7 7,3 10,7 10,7 48,3 2,28

7 ngày 9 ngày 14,3 18,3 14,7 14,3 20,3 20,3 90,0 1,39 11,0 22,3 18,3 15,7 30,0 30,3 90,0 2,28 14,0 21,3 21,0 15,0 40,3 29,3 90,0 2,68 18,7 26,0 20,7 18,7 32,7 27,3 90,0 1,81 12,0 14,0 12,7 11,0 16,0 14,0 70,7 2,79

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14,0 16,3 14,3 13,7 19,7 16,7 90,0 1,38

Hiệu lực ức chế* (%) 84,1a 79,6b 83,7a 84,1a 77,4c 77,4c - 1,55 87,8a 75,2d 79,6c 82,6b 66,7e 66,3e - 2,53 84,4a 76,3b 76,7b 83,3a 55,2d 67,4c - 2,97 79,3a 71,1c 77,0b 79,3a 63,7d 69,6c - 2,01 84,4a 81,9b 84,1a 84,8a 78,1c 81,5b - 1,54

LSD0,05

Chú thích: Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm). Các giá trị thu được trên cột của cùng 1 loài mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

138

Chú thích: A - C. fructicola (C14), B - C. siamense (C4), C - C. aeschynomenes (C29), D - C. truncatum (C30), E - C. gloeosporioides s.s (C44)

Hình 4.21. Khả năng đối kháng của 2 mẫu vi khuẩn HT1 và N2 đối với các loài nấm Colletotrichum

Từ kết quả thu được có thể nhận thấy, các mẫu vi khuẩn thí nghiệm có khả năng ức chế cao hơn rõ rệt so với các công bố trước đây của Nguyễn Thị Liên & cs. (2016), Ashwini & Srividya (2014) và Begum et al. (2008). Trong 6 mẫu vi khuẩn sử dụng, hai mẫu HT1 và N2 (đã được xác định là Bacillus velezensis) có khả năng ức chế cao nhất với tất cả các loài nấm thí nghiệm. Với kết quả thử nghiệm thu được như trên, các mẫu vi khuẩn này hoàn toàn có thể sử dụng rộng

rãi trong phòng trừ bệnh thán thư ớt nếu được đầu tư nghiên cứu để phát triển

thành sản phẩm thuốc BVTV.

139

4.4.3. Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của nấm C. siamense và C. truncatum trên môi trường PDA

Với mục đích xác định được các hoạt chất sử dụng an toàn và hiệu quả

trong việc phòng trừ bệnh thán thư ớt. Bên cạnh thử nghiệm các chất hóa học, vi khuẩn đối kháng chúng tôi tiến hành thử nghiệm hiệu lực ức chế của dịch chiết

địa y với một số loài Colletotrichum phổ biến thu thập được. Kết quả đánh giá

hiệu lực của 7 loại dịch chiết địa y trên 2 loài C. siamense và C. truncatum được

trình bày tại bảng 4.36 và hình 4.22.

Bảng 4.36. Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA

Đường kính tản nấm (mm)

TT Loài nấm Loại dịch chiết địa y1 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày

56,7 70,3 - PT metanol 37,3

52,7 64,0 - PT acetone 33,0

49,0 58,3 - PT hexan 32,3

37,3 51,0 - US metanol 23,3 C. siamense 1 42,0 58,3 - US acetone 24,7

39,7 54,3 - US hexan 24,0

Hiệu lực ức chế* (%) 21,8e 28,9d 35,2c 43,3a 35,2c 39,6b 27,4d 50,7 65,3 - PS acetone 33,7

- 59,3 90,0 - ĐC 38,7

3,18 3,02 - 2,45 LSD0,05

26,3 40,0 58,3 PT metanol 16,0

34,0 49,7 68,3 PT acetone 19,7

27,7 39,3 56,0 PT hexan 15,3

28,3 41,0 57,3 US metanol 17,3 C. truncatum 2 32,3 45,0 60,3 US acetone 18,3

25,3 35,7 52,0 US hexan 14,7

3,36 35,2bc 24,1e 37,8b 36,3b 33,0c 42,2a 35,2bc 27,7 42,7 58,3 PS acetone 16,7

- 47,3 69,7 90,0 ĐC 28,7

Chú thích: 1: nồng độ các loại dịch chiết là 100ppm; Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm). Các giá trị thu được trên cột của cùng 1 loài mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

140

2,77 3,92 3,43 2,49 2,58 LSD0,05

Chú thích: A - C. siamense (C4), B - C. truncatum (C30). a - PT metanol, b - PT acetone, c - PT hexan, d - US acetone, e - US metanol, f - PS acetone f, g - US hexan Hình 4.22. Khả năng ức chế sinh trưởng của dịch chiết địa y đối với một số loài nấm Colletotrichum

Trên loài C. siamense, các loại dịch chiết sử dụng đều có khả năng ức chế sinh trưởng tản nấm trên môi trường PDA ở mức độ khác nhau. Hiệu lực ức chế của 7 loại dịch chiết đạt 21,8 - 43,3% và có sự sai khác rõ rệt giữa các loại. US metanol là dịch chiết có hiệu lực ức chế cao nhất, đạt 43,3%. Tiếp theo, US hexan có hiệu lực đạt 39,6%. Hai loại dịch chiết PT hexan và US acetone cùng có

hiệu lực đạt 35,2%. Dịch chiết PT metanol và PS acetone có hiệu lực tương

141

đương nhau, đạt 27,4 - 28,9%. Dịch chiết PT metanol có hiệu lực ức chế thấp

nhất trong 7 loại dịch chiết có tác dụng, chỉ đạt 21,8% (bảng 4.36, hình 4.22A).

Tương tự, trên loài C. truncatum, các loại dịch chiết có hiệu lực ức chế sinh

trưởng tản nấm trên môi trường PDA đạt 24,1 - 42,2% và có sự sai khác rõ rệt giữa các loại dịch chiết. US hexan là dịch chiết có hiệu lực ức chế cao nhất, đạt

42,2%. Tiếp theo, US Metanol và PS hexan có hiệu lực ức chế tương đương

nhau, đạt 36,3 - 37,8%. Hai loại dịch chiết PT metanol và PS acetone cùng có

hiệu lực đạt 35,2%. Dịch chiết US acetone có hiệu lực đạt 33,0%. PT acetone là

dịch chiết có hiệu lực ức chế thấp nhất, chỉ đạt 24,1% (bảng 4.36, hình 4.22B).

Hiệu lực ức chế của từng loại dịch chiết địa y có sự khác biệt trên 2 loài

nấm. Trên loài C. siamense, US metanol là dịch chiết có hiệu lực cao nhất, tiếp

đến là US hexan và thấp nhất trên dịch chiết PS metanol. Tuy nhiên trên loài

C. truncatum, US hexan là dịch chiết có hiệu lực cao nhất, tiếp đến là US metanol,

PT hexan và thấp nhất trên dịch chiết PT acetone (bảng 4.36, hình 4.22).

Từ kết quả thu được có thể thấy, hiệu lực ức chế của các loại dịch chiết địa

y đối với 2 loài C. siamense và C. truncatum là không cao. Trong số 7 loại dịch

chiết sử dụng, US hexan và US metanol (dịch chiết từ loài Usnea sp. bằng hexan

và metanol) có hiệu lực ức chế cao đối với 2 loài nấm. Tuy hiệu lực ức chế

không cao nhưng chúng có thể sử dụng để xử lý bệnh cho giai đoạn sau thu

hoạch vì đa số các loại dịch chiết địa y đều có thời gian cách ly ngắn và an toàn

đối với con người.

142

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1) Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là bệnh rất phổ biến gây hại trên cây ớt tại ĐBSH với tần suất phát hiện ruộng bệnh > 25%. Bệnh gây hại trên

tất cả các giống ớt trồng phổ biến ở các thời vụ trong năm. Mức độ gây hại của

bệnh trên ruộng thu quả lứa 2 nặng hơn so với ruộng thu quả lứa 1.

2) Tổng số 52 mẫu nấm thán thư ớt thu thập tại 9 tỉnh ĐBSH và 4 tỉnh khác

đã được phân lập thuần từ đơn bào tử. Các phân tích hình thái dựa trên đặc điểm bào tử phân sinh và đĩa áp đã xác định được chúng thuộc 3 nhóm hình thái. Các

đặc điểm đặc trưng về hình thái không xác định được loài nấm Colletotrichum thu thập.

3) Phân tích trình tự vùng ITS của các mẫu nấm đại diện cho 3 nhóm hình

thái đã xác định được 2 loài là C. truncatum và phức hợp loài C. gloeosporioides

s.l. Phân tích trình tự vùng liên gen ApMat các mẫu nấm đại diện thuộc phức hợp

loài C. gloeosporioides s.l đã xác định được 4 loài C. gloeosporioides s.s,

C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes. Tất cả 4 loài này là những loài

lần đầu tiên được phát hiện, công bố tại Việt Nam.

4) Đã thiết kế được 4 cặp mồi đặc hiệu chẩn đoán 4 loài Colletotrichum

chính gây bệnh thán thư ớt (C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. siamense và

C. truncatum). Ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu, cả 4 cặp mồi đã chứng tỏ

phát hiện đặc hiệu 4 loài tương ứng. Đặc biệt phương pháp chiết nhanh DNA từ

mẫu nấm dùng NaOH và đệm Tris lần đầu được áp dụng đối với nấm

Colletotrichum đã chứng tỏ rất phù hợp để chuẩn bị DNA nhóm nấm này cho

phản ứng PCR.

5) Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được áp dụng để định danh tất cả 52 mẫu nấm thu thập. Kết quả đã xác định được thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh gồm 5 loài, trong đó C. siamense là loài phổ biến nhất (phát hiện thấy ở tất cả 13 tỉnh và chiếm 51,9%); C. fructicola là loài phổ biến thứ hai (phát hiện thấy ở 9/13 tỉnh, chiếm 19,5%);

C. truncatum là loài phổ biến thứ ba (phát hiện thấy ở 6/13 tỉnh, chiếm 15,4%); C. gloeosporioides s.s là loài phổ biến thứ tư (phát hiện thấy ở 5/13 tỉnh, chiếm

9,6%); riêng loài C. aeschynomenes chỉ phát hiện được 1 mẫu tại Thái Nghuyên,

chiếm 1,9%.

143

6) Các loài nấm Colletotrichum thu thập phát triển tản nấm thuận lợi trên môi trường PDA và hình thành bào tử thuận trên môi trường PCA. Nhiệt độ thích

hợp nhất để phát triển tản nấm và hình thành bào tử của các loài Colletotrichum là 25oC. Ngoại trừ loài C. siamense phát triển thuận lợi ở pH từ 5,0 - 6,0, các loài nấm còn lại phát triển thuận lợi ở pH 6,0.

7) Kết quả lây bệnh nhân tạo trên lá, quả xanh, quả chín của 4 giống ớt

(Demon, Lai 20, Chìa vôi và Susan ̓ Joy) và 3 loại quả (xoài, chuối tây và chuối tiêu)

cho thấy các loài nấm chỉ tạo vết bệnh trên các loại quả chín bằng phương pháp có gây tổn thương.

Trên quả ớt chín, thời kỳ tiềm dục, tỷ lệ nhiễm và kích thước vết bệnh thay

đổi tùy theo tổ hợp loài nấm và giống ớt. Loài C. truncatum gây bệnh trên cả 4

giống ớt; loài C. siamense và C. aeschynomenes gây bệnh trên 3 giống ớt; loài

C. gloeosporioides s.s và C. fructicola chỉ gây bệnh trên 2 giống ớt. Triệu chứng vết

bệnh tạo ra sau lây nhiễm không đặc trưng theo loài và không có giá trị chẩn đoán.

Trên 3 loại quả chín còn lại, thời kỳ tiềm dục, tỷ lệ nhiễm và kích thước vết

bệnh thay đổi tùy theo tổ hợp loài nấm và loại quả. Loài C. siamense và

C. fructicola gây bệnh trên cả 3 loại quả; loài C. gloeosporioides s.s nhiễm trên

chuối tây và chuối tiêu; loài C. aeschynomenes gây bệnh trên xoài và chuối tây.

Đáng chú ý, loài C truncatum không gây bệnh trên cả 3 loại quả.

8) Xác định được bào tử cả 2 loài nấm C. truncatum và C. siamense có khả

nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, duy trì trạng thái

ngủ nghỉ/ nội sinh sau khi xâm nhập và không gây triệu chứng trên lá tới ít nhất 6

tuần sau lây nhiễm. Nghiên cứu này đã xác định thêm một vị trí tồn tại quan trọng

của nguồn bệnh trên đồng ruộng. Ngoài ra, nghiên cứu cũng giúp giải thích tại sao

bệnh thán thư trên lá ớt hiếm gặp trên đồng ruộng và tại sao không thể lây nhiễm

nấm trên lá dù bằng phương pháp có gây tổn thương.

9) Thuốc Score 250 EC (difenoconazole) và Tiptop 250EC (propiconazole) có hiệu lực cao với 5 loài nấm Colletotrichum trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tại nồng độ khuyến cáo, thuốc Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm và nảy mầm bào tử của 5 loài nấm. Thuốc Tiptop 250EC đạt hiệu lực 100% trên 2 loài nấm C. fructicola, C. aeschynomenes và trên 69% với 3 loài nấm còn lại.

Các loài nấm có mức độ mẫn cảm khác nhau với các loại thuốc. Trên cả 4 loại thuốc thí nghiệm, hiệu lực của thuốc trên 2 loài C. truncatum và C. siamense luôn thấp hơn 3 loài còn lại.

144

Hai mẫu N2 và HT1 (được xác định là Bacillus velezensis) có khả năng ức chế sinh trưởng cao với các loài nấm, hiệu lực đạt 79,3 - 87,8%. Các loại dịch chiết bằng dung môi từ 3 loài địa y có khả năng ức chế sinh trưởng rất thấp đối với 2 loài nấm C. siamense và C. truncatum. Hiệu lực tối đa chỉ đạt 43,3%.

5.2. KIẾN NGHỊ

1) Để phòng trừ hiệu quả bệnh thán thư trên đồng ruộng nên phun thuốc

ngăn chặn nguồn bệnh tồn tại trên lá trước thời điểm thu hoạch quả lứa 1 khoảng

1 tháng.

2) Tiếp tục thu thập, nghiên cứu và xác định đặc điểm sinh học, tính gây bệnh các loài Colletotrichum khác gây bệnh thán thư ớt để cung cấp đầy đủ thông

tin về thành phần loài nấm Colletotrichum gây hại trên cây ớt tại Việt Nam.

2) Bổ sung các kết quả nghiên cứu về phương pháp phân loại, đặc điểm

sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt

mới phát hiện vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành.

145

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm & Nguyễn Đức Huy

(2017). Xác định nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ở đồng bằng sông

Hồng. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 12 (85): 87-93.

2. Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường & Hoàng Chúng Lằm (2018). Phát hiện

loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase.

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 16 (12): 1025-1038.

146

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010). QCVN 01-38:2010/BNNPTNT,

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng.

NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2014). QCVN 01-160:2014/BNNPTNT,

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ

bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại cây ớt trên đồng ruộng. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

3. Ngô Bích Hảo (1991). Kết quả bước đầu nghiên cứu về thành phần bệnh hại ớt và

một số đặc điểm sinh học của nấm thán thư hại ớt Colletotrichum spp. Kết quả

nghiên cứu khoa học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 86-91. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội: 106-109.

4. Ngô Bích Hảo (1992). Bệnh thán thư hại ớt. Tạp chí Bảo vệ thực vật T.124, số 4:

15-17.

5. Ngô Bích Hảo (1993). Nguồn bệnh thán thư trên hạt giống và biện pháp phòng trừ.

Kết quả nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. NXB Nông

nghiệp: 64-67.

6. Nguyễn Thị Liên, Nguyễn Thị Yến Như, Trần Thị Xuân Mai & Nguyễn Thị Pha

(2016). Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả năng đối kháng

với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên ớt. Tạp chí Khoa học, Trường

Đại học Cần Thơ, 47, 16-23.

7. Phạm Đình Dũng, Đặng Hữu Nghĩa, Lê Thành Hưng, Hoàng Đắc Việt, Bùi Văn Lệ

& Lê Tiến Thắng (2017). Nghiên cứu khả năng kháng nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) của chế

phẩm oligochitosan-nano silica (SiO2). Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần

Thơ, 48, (B). 66-70.

8. Tổng cục Thống kê (2018). Số liệu Nông Lâm Thuỷ sản. NXB Thống kê, Hà Nội.

9. Trần Khắc Thi & Nguyễn Công Hoan (2005). Kỹ thuật trồng rau sạch - rau an toàn

và chế biến rau xuất khẩu. NXB Thanh Hóa: 79-91.

10. Trần Ngọc Hùng & Nguyễn Thị Liên Thương (2016). Nghiên cứu tạo chế phẩm từ

Trichoderma sp. kiểm soát bệnh thán thư do Colletotrichum spp. gây ra trên cây ớt

147

(Capsicum frutescens). Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 45, 86-92.

11. Trần Nguyễn Hà, Nguyễn Kim Vân, Ngô Bích Hảo & Đặng Lưu Hoa (2005). Nấm

bệnh hại cây trồng. NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

12. Trần Thanh Tùng (2002). Nghiên cứu xây dựng quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh

thán thư trên ớt cay tại Thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn, 10/2002: 879-880.

13. Trần Thị Thu Thủy, Huỳnh Minh Châu, Ngô Thành Trí, Lê Thanh Toàn, Phan Thị

Hồng Thúy, Lê Thị Ngọc Xuân & Phạm Hoàng Oanh (2010). Kích thích tính

kháng bệnh thán thư trên rau khi được xử lý bởi một số hóa chất. Tạp chí Khoa học

Trường Đại học Cần Thơ, 16, 138-146.

14. Trần Tú Ngà, Đoàn Văn Lư, Phạm Thị Hương & Ngô Bích Hảo (1993). Kết quả

bước đầu nghiên cứu khoa học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội: 82-83.

Tài liệu tiếng Anh

15. Abd-Elsalam, K. A., Yas.sin, M. A., Moslem, M. A., Bahkali, A. H., de Wit, P. J.,

McKenzie, E. H., Stephenson, S. L., Cai, L., & Hyde, K. D. (2010). Culture

collections, the new herbaria for fungal pathogens. Fungal Diversity 45, 21-32.

16. Ahmed, N., Dey, S., & Hundal, J. (1991). Inheritance of resistance to anthracnose

in chilli. Indian Phytopathol 44, 402-403.

17. Ahn, I.-P., Uhm, K.-H., Kim, S., & Lee, Y.-H. (2003). Signaling pathways involved

in preinfection development of Colletotrichum gloeosporioides, C. coccodes, and

C. dematium pathogenic on red pepper. Physiological and molecular plant

pathology 63, 281-289.

18. Ajithkumar, K., Savitha, A., Biradar, S., Rajanna, B., & Ramesh, G. (2014).

Management of powdery mildew and anthracnose diseases of chilli (Capsicum

annuum L.). Pest Management in Horticultural Ecosystems 20, 80-83.

19. Akhtar, J., Kandan, A., Singh, B., Kumar, P., & Dubey, S. (2016). Detached non-

wounded fruit inoculation technique for pathogenicity of Colletotrichum capsici on

chilli. Indian Phytopathology 69, 200-201.

20. Alves, K. F., Laranjeira, D., Camara, M. P., Camara, C. A., & Michereff, S. J.

(2015). Efficacy of plant extracts for anthracnose control in bell pepper fruits under

controlled conditions. Horticultura Brasileira 33, 332-338.

21. Andrabi, M., Vaid, A., & Razdan, V. (2011). Evaluation of different measures to

control wilt causing pathogens in chickpea. Journal of plant protection

148

research, 51(1), 55-59.

22. Arunakumara, K. T., & Satyanarayana, C. (2016). Screening of chilli genotypes

against Colletotrichum capsici causing anthracnose and its management. The

Bioscan. 11(4): 2877-2881.

23. Ashwini, N., & Srividya, S. (2014). Potentiality of Bacillus subtilis as biocontrol

agent for management of anthracnose disease of chilli caused by Colletotrichum

gloeosporioides OGC1. 3 Biotech, 4(2), 127-136.

24. Auyong, A. S. M., Ford, R., & Taylor, P. W. J. (2012). Genetic transformation of

Colletotrichum truncatum associated with anthracnose disease of chili by random

insertional mutagenesis. Journal of basic Microbiology 52, 372-382.

25. Bailey, J. A., & Jeger, M. J. (1992). Colletotrichum: biology, pathology and

control. Colletotrichum: biology, pathology and control.

26. Barchenger, D. W., Naresh, P., & Kumar, S. (2019). Genetic Resources of

Capsicum. In "The Capsicum Genome" (N. Ramchiary and C. Kole, eds.), pp. 9-23.

Springer International Publishing, Cham.

27. Bartlett, D. W., Clough, J. M., Godwin, J. R., Hall, A. A., Hamer, M., & Parr‐

Dobrzanski, B. (2002). The strobilurin fungicides. Pest Management Science:

formerly Pesticide Science 58, 649-662.

28. Begum, M. M., Sariah, M., Abidin, Z. M. A., Puteh, A. B., & Rahman, M. A.

(2008). Antagonistic potential of selected fungal and bacterial biocontrol agents

against Colletotrichum truncatum of soybean seeds. Pertanica J. Trop. Agric.

Sci, 31, 45-53.

29. Boonratkwang, C., Chamswarng, C., Intanoo, W., & Juntharasri, V. (2007). Effect

of Secondary Metabolites from Trichoderma Harzianum Strain Pm9 on Growth

Inhibition of Colletotrichum gloeosporioides and Chilli Anthracnose Control. In

"Proceeding of the 8th National Plant Protection Conference. Naresuan University,

Phisanulok, Thailand", pp. 323-336.

30. Cai, L., Hyde, K., Taylor, P., Weir, B., Waller, J., Abang, M., Zhang, J., Yang, Y.,

Phoulivong, S., & Liu, Z. (2009). A polyphasic approach for studying

Colletotrichum. Fungal Diversity 39, 183-204.

31. Cannon, P. F., Bridge, P. D., & Monte, E. (2000). Linking the past, present, and

future of Colletotrichum systematics. In: Colletotrichum Host Specificity,

Pathology and Host-pathogen Interaction (eds. D. Prusky, S. Freeman and M.B.

Dickman). APS Pres.s, St Paul, Minnesota. pp. 1-20.

32. Cannon, P. F., Buddie, A. G., & Bridge, P. D. (2008). The typification of

149

Colletotrichum gloeosporioides. Mycotaxon 104, 189-204.

33. Cannon, P. F., Damm, U., Johnston, P. R., & Weir, B. S. (2012). Colletotrichum –

current status and future directions. Studies in Mycology 73, 181-213.

34. Capobiango, N., Pinho, D., Zambolim, L., Pereira, O., & Lopes, U. (2016).

Anthracnose on strawberry fruits caused by Colletotrichum siamense in Brazil.

Plant Disease 100, 859-859.

35. Carrizo García, C., Barfus.s, M. H., Sehr, E. M., Barboza, G. E., Samuel, R.,

Moscone, E. A., & Ehrendorfer, F. (2016). Phylogenetic relationships, diversification

and expansion of chili peppers (Capsicum, Solanaceae). Annals of botany 118, 35-51.

36. Chacko, S. T., & Gokulapalan, C. (2014). In vitro study of fungicides and

biocontrol agents against Colletotrichum capsici causing anthracnose of chilli

(Capsicum annuumm L.). Int. J. Applied Pure Sci. Agric, 1, 93-98.

37. Charigkapakorn, N. (2000). Control of Chilli Anthracnose by Different

Biofungicides. Thailand Available from http://www.arc-avrdc.org/pdf_files/029-

Charigkapakorn_18th.

38. Cheema, D., Singh, D., Rawal, R., & Deshpande, A. (1984). Inheritance of

resistance to anthracnose disease in chillies. Capsicum Eggplant Newsl 3, 44.

39. Chen, F., Goodwin, P. H., Khan, A., & Hsiang, T. (2002). Population structure and

mating-type genes of Colletotrichum graminicola from Agrostis palustris.

Canadian journal of microbiology 48, 427-436.

40. Cheng, B., Huang, Y., Song, X., Peng, A., Ling, J., & Chen, X. (2013). First report

of Colletotrichum siamense causing leaf drop and fruit spot of Citrus reticulata

Blanco cv. Shiyue Ju in China. Plant disease 97, 1508-1508.

41. Chethana, C. S., Chowdappa, P., & Pavani, K. V. (2015). Colletotrichum truncatum

and C. fructicola causing anthracnose on chilli in Karnataka state of India. Indian

Phytopathol, 68, 270-278.

42. Chigoziri, E., and Ekefan, E. J. (2013). Seed borne fungi of Chilli Pepper

(Capsicum frutescens) from pepper producing areas of Benue State Nigeria.

Agricultura and Journal of North America 4(4), 370-374.

43. Chitkara, S., Singh, T., & Singh, D. (1990). Histopathology of Colletotrichum

dematium infected chilli seeds. Acta Botanica Indica 18, 226-230.

44. Chung, W. H., Chung, W. C., Peng, M. T., Yang, H. R., & Huang, J. W. (2010).

Specific detection of benzimidazole resistance in Colletotrichum gloeosporioides

from fruit crops by PCR-RFLP. N Biotechnol 27, 17-24.

150

45. Crouch, J. A., Clarke, B. B., & Hillman, B. I. (2009). What is the value of ITS

sequence data in Colletotrichum systematics and species diagnosis? A case study using

the falcate-spored graminicolous Colletotrichum group. Mycologia 101, 648-56.

46. Damm, U., Baroncelli, R., Cai, L., Kubo, Y., O’Connell, R., Weir, B., Yoshino, K.,

& Cannon, P. F. (2010). Colletotrichum: species, ecology and interactions. IMA

Fungus : The Global Mycological Journal 1, 161-165.

47. Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., & Crous, P. W. (2012a). The

Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology 73, 37-113.

48. Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Johnston, P. R., Weir, B. S., Tan,

Y. P., Shivas, R. G., & Crous, P. W. (2012b). The Colletotrichum boninense

species complex. Studies in Mycology 73, 1-36.

49. Damm, U., O'Connell, R. J., Groenewald, J. Z., & Crous, P. W. (2014). The

Colletotrichum destructivum species complex – hemibiotrophic pathogens of forage

and field crops. Studies in Mycology 79, 49-84.

50. Damm, U., Woudenberg, J., Cannon, P., & Crous, P. (2009). Colletotrichum

species with curved conidia from herbaceous hosts. Fungal Diversity 39, 45.

51. De Silva, D., Ades, P., Crous, P., & Taylor, P. (2017a). Colletotrichum species

associated with chili anthracnose in Australia. Plant pathology 66, 254-267.

52. De Silva, D. D., Crous, P. W., Ades, P. K., Hyde, K. D., & Taylor, P. W. (2017b).

Life styles of Colletotrichum species and implications for plant biosecurity. Fungal

Biology Reviews 31, 155-168.

53. Deshmukh, A. J., Mehta, B. P., Sabalpara, A. N., & Patil, V. A. (2012). In vitro

effect of various nitrogen, carbon sources and pH regimes on the growth and

sporulation of Colletotrichum gloeosporioides Penz. and Sacc causing anthracnose

of Indian bean. Journal of Biopesticides, 5, 46.

54. Diao, Y.-Z., Zhang, C., Liu, F., Wang, W.-Z., Liu, L., Cai, L., & Liu, X.-L. (2017).

Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China. Persoonia:

Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 38, 20.

55. Dieffenbach, C., Lowe, T., & Dveksler, G. (1993). General concepts for PCR

primer design. PCR methods appl 3, S30-S37.

56. Don, L. D., Van, T. T., Phuong Vy, T. T., & Kieu, P. T. M. (2007). Colletotrichum

spp. Attacking on Chilli Pepper Growing in Vietnam. Country Report. In: Oh,

D.G., Kim, K.T. (Eds.), Abstracts of the First International Symposium on Chilli

Anthracnose. National Horticultural Research Institute, Rural Development of

151

Administration, Republicof Korea, 24.

57. Doyle, J. J. & Doyle, J. L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15.

58. Du, M., Schardl, C. L., Nuckles, E. M., & Vaillancourt, L. J. (2005). Using mating-

type gene sequences for improved phylogenetic resolution of Collectotrichum

species complexes. Mycologia 97, 641-658.

59. Eshbaugh, W. H. (2012). The taxonomy of the genus Capsicum. Peppers: Botany,

Production and Uses, 14.

60. FAO (2020). FAO database. Retrieved on 6 May 2020 at

http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC

61. Gawade, D. B., Suryawanshi, A. P., Pawar, A. K., Apet, K. T., & Devgire, S. S.

(2009). Field evaluation of fungicides, botanicals and bioagents against anthracnose

of soybean. Agricultural Science Digest, 29(3), 174-177.

62. Gopinath, K., Radhakrishnan, N., & Jayaraj, J. (2006). Effect of propiconazole and

difenoconazole on the control of anthracnose of chilli fruits caused by

Colletotrichum capsici. Crop Protection 25, 1024-1031.

63. Halama, P., & Van Haluwin, C. (2004). Antifungal activity of lichen extracts and

lichenic acids. BioControl 49, 95-107.

64. Hassan, M., Ahmad, K., & Khan, N. A. (2017). Disease Prevalence and Evaluation

of Fungitoxicants against Marsonina juglandis Causing Anthracnose of Walnut

(Juglans regia L.). Research Journal of Agricultural Sciences, 8(4), 917-922.

65. Hasyim, A., Setiawati, W., & Sutarya, R. (2014). Screening for resistance to

Anthracnose caused by Colletotrichum acutatum in chili pepper (Capsicum annuum

L.) in Kediri, East Java. Advances in Agriculture & Botanics; 6, 104-118.

66. Hemannavar, V., Rao, M., Hegde, Y., & Mohankumar, H. (2009). Status of seed

borne incidence of anthracnose of chilli in northern Karnataka and evaluation of

seed health testing methods for the detection of Colletotrichum capsici. Karnataka

Journal of Agricultural Sciences 22.

67. Hong, J. K., and Hwang, B. K. (1998). Influence of inoculum density, wetnes.s

duration, plant age, inoculation method, and cultivar resistance on infection of

pepper plants by Colletotrichum coccodes. Plant Disease 82, 1079-1083.

68. Horsfield, A., Wicks, T., Davies, K., Wilson, D., & Paton, S. (2010). Effect of

fungicide use strategies on the control of early blight (Alternaria solani) and potato

yield. Australasian Plant Pathology, 39(4), 368-375.

152

69. Hsiang, T., and Goodwin, P. (2001). Ribosomal DNA sequence comparisons of

Colletotrichum graminicola from turfgrasses and other hosts. European Journal of

Plant Pathology 107, 593-599.

70. Hyde, K., Cai, L., McKenzie, E., Yang, Y., Zhang, J., & Prihastuti, H. (2009a).

Colletotrichum: a catalogue of confusion. Fungal Diversity 39, 1.

71. Hyde, K., Cai, L., Cannon, P., Crouch, J., Crous, P., Damm, U., Goodwin, P.,

Chen, H., Johnston, P., & Jones, E. (2009b). Colletotrichum - names in current use.

Fungal Diversity 39, 147-182.

72. Intanoo, W., & Chamswarng, C. (2007). Effect of antagonistic bacterial formulations

for control of anthracnose on chilli fruits. In "Proceeding of the 8th National Plant

Protection Conference. Naresuan University, Phisanulok, Thailand", pp. 309-322.

73. Jagtap, G. P., Mali, A. K., & Dey, U. (2013). Bioefficacy of fungicides, bio-control

agents and botanicals against leaf spot of turmeric incited by Colletortricum

capsici. African journal of microbiology research, 7(18), 1865-1873.

74. Jairo, A., Martínez, E. P., & Hío, J. C. (2012). Screening of microbial culture

filtrates, plant extracts and fungicides for control of mango anthracnose. Agronomía

Colombiana, 30(2), 222-229.

75. James, R., Ray, J., Tan, Y., & Shivas, R. (2014). Colletotrichum siamense,

C. theobromicola and C. queenslandicum from several plant species and the

identification of C. asianum in the Northern Territory, Australia. Australasian plant

disease notes 9, 138.

76. Jeffries, P., Koomen, I., Bailey, J., & Jeger, M. (1992). Strategies and prospects for

biological control of diseases caused by Colletotrichum. Colletotrichum: biology,

pathology and control., 337-357.

77. Jeger, M., & Jeffries, P. (1988). Alternatives to chemical usage for disease

management in the post-harvest environment. Aspects of Applied Biology 17, 47-57.

78. Jeyalakshmi, C., Durairaj, P., Seetharaman, K., & Sivaprakasam, K. (1998).

Biocontrol of fruit rot and die-back of chilli using antagonistic microorganisms.

Indian Phytopathology 51, 180-183.

79. Johnston, P. R., & Jones, D. (1997). Relationships among Colletotrichum isolates

from fruit-rots as.ses.sed using rDNA sequences. Mycologia, 420-430.

80. Judelson, H. (2006). Guidelines For Designing Primers. Primer Guidelines 10, 1-5.

81. Kekuda, P., Vivek, M., Kambar, Y., & Manasa, M. (2014). Biocontrol potential of

Parmotrema species against Colletotrichum capsici isolated from anthracnose of

153

chilli. Journal of Biological and Scientific opinion 2, 166-169.

82. Khilare, V., Kale, S., & Chavan, S. (2010). Development of Benzimidazole and

Dithiocarbamate Resistance in Colletotrichum capsici Causing Fruit Rot of Chilli.

Indian Journal of Plant Protection 38, 87-91.

83. Kim, K., Oh, B., & Yang, J. (1999). Differential Interactions of a Colletotrichum

gloeosporioides isolate with green and red pepper fruits. Phytoparasitica 27, 97-106.

84. Kim, K.-H., Yoon, J.-B., Park, H.-G., Park, E. W., & Kim, Y. H. (2004). Structural

modifications and programmed cell death of chili pepper fruit related to resistance

responses to Colletotrichum gloeosporioides infection. Phytopathology 94, 1295-1304.

85. Kim, Y., Min, J. Y., Kang, B. K., Van Bach, N., Choi, W. B., Park, E. W., & Kim,

H. T. (2007). Analyses of the les.s benzimidazole-sensitivity of the isolates of

Colletotrichum spp. causing the anthracnose in pepper and strawberry. Plant

Pathology Journal 23, 187.

86. Ko, T. W. K., McKenzie, E. H. C., Bahkali, A. H., To-anun, C., Chukeatirote, E.,

Promputtha, I., Ahmed, K., Wikee, S., Chamyuang, S., & Hyde, K. D. (2011). The need

for re-inventory of Thai phytopathogens. Chiang Mai Journal of Science 38, 625-637.

87. Kommula, S.K., Reddy, G.P.D., Undrajavarapu, P., & Kanchana, K.S., (2017). Effect

of Various Factors (Temperature, pH and Light Intensity) on Growth of Colletotrichum

capsici Isolated from Infected Chilli. Int. J. Pure App. Biosci. (6): 535-543.

88. Korpraditskul, V., Rattanakreetakul, C., Korpraditskul, R., & Pasabutra, T. (1999).

Development of plant active substances from sweetflag to control fruit rot of mango

for export. In "Proceeding of Kasetsart University Annual Conference. Kasetsart

University, Bangkok", pp. 34.

89. Kowata, L. S., Strapasson, M., Challiol, M. A., Mio, M. D., & Larissa, L. (2010).

Glomerella leaf spot in apple: validation of proposed diagrammatic scale and

efficiency of fungicides. Ciência Rural, 40(7), 1502-1508.

90. Kraft, K. H., Brown, C. H., Nabhan, G. P., Luedeling, E., Ruiz, J. d. J. L.,

d’Eeckenbrugge, G. C., Hijmans, R. J., & Gepts, P. (2014). Multiple lines of

evidence for the origin of domesticated chili pepper, Capsicum annuum, in Mexico.

Proceedings of the National Academy of Sciences 111, 6165-6170.

91. Kumar P, Dubey R, Maheshwari D, 2012. Bacillus strains isolated from

rhizosphere showed plant growth promoting and antagonistic activity against

phytopathogens. Microbiological Research 167, 493-9.

92. Kumar, G. A. (2014). Colletotrichum gloeosporioides: Biology, Pathogenicity and

154

Management in India. J Plant Physiol Pathol 2 2, 2.

93. Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A.,

McWilliam, H., ... & Thompson, J. D. (2007). Clustal W and Clustal X version

2.0. Bioinformatics, 23(21): 2947-2948.

94. Li, H., Zhou, G.-Y., Liu, J.-A., & Xu, J. (2016). Population genetic analyses of the fungal

pathogen Colletotrichum fructicola on tea-oil trees in China. PloS one 11, e0156841.

95. Lijuan, P., Youlian, Y., Kevin, D. H., Bahkali, A. H., & Zuoyi, L. (2012).

Colletotrichum species on Citrus leaves in Guizhou and Yunnan provinces, China.

Cryptogamie, Mycologie 33, 267-284.

96. Lin, Q., Kanchana-udomkarn, C., Jaunet, T., & Mongkolporn, O. (2002). Genetic

analysis of resistance to pepper anthracnose caused by Colletotrichum capsici.

Thai Journal of Agricultural Science (Thailand).

97. Linu, M. S., Jisha, M. S., & Jisha, M. S. (2006). In vitro control of Colletotrichum

capsici induced chilli anthracnose by fungicides and biocontrol agent. Int. J. Appl.

Pure Sci. Agric, 3, 27-33.

98. Lisboa, D. O., Silva, M. A., Pinho, D. B., Pereira, O. L., & Furtado, G. Q. (2018).

Diversity of pathogenic and endophytic Colletotrichum isolates from Licania

tomentosa in Brazil. Forest pathology 48, e12448.

99. Liu, F., Wang, M., Damm, U., Crous, P. W., & Cai, L. (2016). Species boundaries in

plant pathogenic fungi: a Colletotrichum case study. BMC Evolutionary Biology 16, 81.

100. Liu, F., Weir, B., Damm, U., Crous, P. W., Wang, Y., Liu, B., Wang, M., Zhang, M.,

& Cai, L. (2015). Unravelling Colletotrichum species as sociated with Camellia:

employing ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex.

Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 35, 63.

101. Liu, L., Shu, J., Zhang, L., Hu, R., Chen, C., Yang, L., Lu, B., Liu, Y., Yu, L., &

Wang, X. (2017). First report of post-harvest anthracnose on mango (Mangifera

indica) caused by Colletotrichum siamense in China. Plant Disease 101, 833-833.

102. Mahasuk, P., Khumpeng, N., Wasee, S., Taylor, P., & Mongkolporn, O. (2009a).

Inheritance of resistance to anthracnose (Colletotrichum capsici) at seedling and

fruiting stages in chili pepper (Capsicum spp.). Plant breeding 128, 701-706.

103. Mahasuk, P., Taylor, P., and Mongkolporn, O. (2009b). Identification of two new

genes conferring resistance to Colletotrichum acutatum in Capsicum baccatum.

Phytopathology 99, 1100-1104.

104. Martinez-Culebras, P. V., Barrio, E., Garcia, M. D., & Querol, A. (2000).

155

Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose of strawberry

based on the internal transcribed spacers of the ribosomal region. FEMS

Microbiol Lett 189, 97-101.

105. Mills, P. R., Sreenivasaprasad, S., & Brown, A. E. (1992). Detection and

differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates using PCR. FEMS

Microbiol Lett 77, 137-43.

106. Mongkolporn, O. (2019). "Capsicum: Breeding Strategies for Anthracnose

Resistance," CRC Pres.s.

107. Montri, P., Taylor, P., & Mongkolporn, O. (2009). Pathotypes of Colletotrichum

capsici, the causal agent of chili anthracnose, in Thailand. Plant Disease 93, 17-20.

108. Munch, S., Lingner, U., Flos.s, D. S., Ludwig, N., Sauer, N., & Deising, H. B. (2008).

The hemibiotrophic lifestyle of Colletotrichum species. J Plant Physiol 165, 41-51.

109. Muthukumar, A., Udhayakumar, R., & Naveenkumar, R. (2016). Evaluation of

Bioefficacy and phytotoxicity studies of Ridomyl Gold 68 WP (Metalaxyl 4% +

Mancozeb 64%) again chilli anthracnose. The Bioscan 11, 2817-2820.

110. Naik, M., Angadi, H., Devikarani, G., & Patil, M. (2008). Evaluation of chilli

(Capsicum annuum L.) genotypes, fungicides and plant products for management

of anthracnose disease. Journal of Mycopathological Research 46, 213-219.

111. Nakasone, K. K., Peterson, S. W., & Jong, S. C. (2004). Preservation and

distribution of fungal cultures. Biodiversity of fungi, 37-47.

112. Nascimento, A. D., Lima, M. O., Feijó, F. M., Júnior, J. H., Sobrinho, R. R.,

As.sunção, I. P., & Lima, G. S. (2019). First Report of Colletotrichum

aeschynomenes Causing Anthracnose in Cacao (Theobroma cacao) in Brazil.

Plant Disease 103, 3284-3284.

113. Naznin, S., Khalequzzaman, K., & Khair, A. (2014). Effect of New Fungicides in

Controlling Anthracnose/Die Back Disease of Chilli. Asian Journal of Applied

Science and Engineering, 5, 117-124.

114. Nik, W., Zainun, W., & Meon, S. (1988). Seed-borne infection and development

of Colletotrichum capsici in naturally infected chili seed. Pertanika 11, 341-344.

115. Noor, N. M., & Zakaria, L. (2018). Identification and characterization of

Colletotrichum spp. associated with chili anthracnose in peninsular Malaysia.

European Journal of Plant Pathology 151, 961-973.

116. O'Connell, R. J., Thon, M. R., Hacquard, S., Amyotte, S. G., Kleemann, J.,

156

Torres, M. F., Damm, U., Buiate, E. A., Epstein, L., & Alkan, N. (2012). Lifestyle

transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and

transcriptome analyses. Nature genetics 44, 1060-1065.

117. Osmundson, T. W., Eyre, C. A., Hayden, K. M., Dhillon, J., & Garbelotto, M. M.

(2013). Back to basics: an evaluation of NaOH and alternative rapid DNA

extraction protocols for DNA barcoding, genotyping, and disease diagnostics

from fungal and oomycete samples. Molecular ecology resources 13, 66-74.

118. Pandey, K. K., & Gupta, R. C. (2016). Management of anthracnose

(Colletotrichum capsici) in chilli (Capsicum annuum L.) through fungicides,

bioagents and hand picking methods. Journal of Spices and Aromatic

Crops, 24(2), 141-144.

119. Park, H., Kim, B., & Lee, W. (1990). Inheritance of resistance to anthracnose

(Colletotrichum spp.) in pepper (Capsicum annuum L.) I. Genetic analysis of

anthracnose resistance by diallel cros.ses. Journal of the Korean Society for

Horticultural Science 31, 91-105.

120. Park, K. S., & Kim, C. H. (1992). Identification, distribution and etiological

characteristics of anthracnose fungi of red pepper in Korea. The Plant Pathology

Journal 8, 61-69.

121. Patel, V. R. (2004). Investigation on dieback and fruit rot (Colletotrichum

gloeosporioides Penz. and Sacc.) of chilli (Capsicum annuum L.) under south

Gujarat condition. M. Sc. (Agri.) Thesis. Navsari Agricultural University,Navsari.

122. Paul, N., Lee, H., Lee, J., Shin, K., Ryu, T., Kwon, H., Kim, Y., Youn, Y., & Yu,

S. (2014). Endophytic fungi from Lycium chinense Mill and characterization of

two new Korean records of Colletotrichum. International Journal of Molecular

Sciences 15, 15272-15286.

123. Perry, L., Dickau, R., Zarrillo, S., Holst, I., Pearsall, D. M., Piperno, D. R.,

Berman, M. J., Cooke, R. G., Rademaker, K., & Ranere, A. J. (2007). Starch

fossils and the domestication and dispersal of chili peppers (Capsicum spp. L.) in

the Americas. Science 315, 986-988.

124. Phoulivong, S., Cai, L., Chen, H., McKenzie, E. H., Abdelsalam, K.,

Chukeatirote, E., & Hyde, K. D. (2010). Colletotrichum gloeosporioides is not a

common pathogen on tropical fruits. Fungal Diversity 44, 33-43.

125. Prihastuti, H., Cai, L., Chen, H., McKenzie, E., & Hyde, K. (2009).

Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in

157

northern Thailand. Fungal Diversity 39, 89-109.

126. Pring, R., Nash, C., Zakaria, M., & Bailey, J. (1995). Infection proces.s and host

range of Colletotrichum capsici. Physiological and Molecular Plant Pathology 46,

137-152.

127. Rajamanickam, S., Sethuraman, K., & Sadasakthi, A. (2012). Exploitation of

phytochemicals from plants extracts and its effect on growth of Colletotrichum

capsici (Syd.) Butler and Bisby causing anthracnose of chilli (Capsicum annuum

L.). Plant Pathology Journal 11, 87-92.

128. Rajesha, G., Mantur, S. G., Shankar, M. R., Boranayaka, M. B., & Shadakshari, T.

V. (2010). In vitro evaluation of fungicides and biocontrol agents against

Colletotrichum lindemuthianum causing anthracnose of Dolichos

bean. International Journal of Plant Protection, 3(1), 114-116.

129. Ramamoorthy, V., and Samiyappan, R. (2001). Induction of defense-related genes

in Pseudomonas fluorescens treated chilli plants in response to infection by

Colletotrichum capsici. Journal of Mycology and Plant Pathology 31, 146-155.

130. Ranasingh, N., Beura, S., & Das, R. (2010). In vitro efficacy of fungicides against

Colletotrichum capsici causing die-back and fruit rot of chilli. Journal of

Mycopathological Research 48, 379-382.

131. Ranathunge, N. P., & Sandani, H. B. P. (2016). Deceptive behaviour of

Colletotrichum truncatum: strategic survival as an asymptomatic endophyte on

non-host species. Journal of plant protection research 56, 157-162.

132. Ranathunge, N., Mongkolporn, O., Ford, R., & Taylor, P. (2012). Colletotrichum

truncatum Pathosystem on Capsicum spp: infection, colonization and defence

mechanisms. Australasian Plant Pathology 41, 463-473.

133. Rashid, M. M., Kabir, M. H., Hos.sain, M. M., Bhuiyan, M. R., & Khan, M. A. I.

(2015). Eco-friendly management of chilli anthracnose (Colletotrichum capsici).

Int. J. Plant Pathol 6, 1-11.

134. Roberts, P. (2001). Anthracnose caused by Colletotrichum sp. on pepper,

University of Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and

Agricultural Sciences, EDIS.

135. Rychlik, W., Spencer, W., & Rhoads, R. (1990). Optimization of the annealing

temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic acids research 18, 6409-6412.

136. Saini, T., Gupta, S., & Anandalakshmi, R. (2016). First report of papaya

anthracnose caused by Colletotrichum fructicola in India. New Disease Reports 34,

158

27-27.

137. Schoch, C. L., Seifert, K. A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J. L., Levesque, C.

A., Chen, W., Bolchacova, E., Voigt, K., & Crous, P. W. (2012). Nuclear ribosomal

internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for

Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 6241-6246.

138. Sharma, G., & Shenoy, B. D. (2013). Colletotrichum fructicola and C. siamense

are involved in chilli anthracnose in India. Archives Of Phytopathology And Plant

Protection 47, 1179-1194.

139. Sheu, Z.-m. (2013). Pepper anthracnose. Screening for Insect and Disease

Resistance in Vegetable Breeding. GIZ/BMZ Whorkshop at AVRDC-the Word

Vegetable Center.

140. Shivanna, R., & Garampalli, R. H. (2014). Efficacy of lichen extracts as biocontrol

agents against Fusarium oxysporum F. sp. capsici. Adv. Appl. Sci. Res 5, 273-277.

141. Shivas, R., & Yu, Y. (2009). A taxonomic re-assessment of Colletotrichum

acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov. and C. simmondsii sp. nov.

Fungal Diversity 39, 111.

142. Shukla, R. S., Khaliq, A., & Alam, M. (2010). Chemical control of blossom blight

disease of sarpagandha caused by Colletotrichum capsici. African Journal of

Biotechnology, 9(38), 6397-6400.

143. Silva, D. N., Talhinhas, P., Várzea, V., Cai, L., Paulo, O. S., & Batista, D. (2012).

Application of the Apn2/MAT locus to improve the systematics of the

Colletotrichum gloeosporioides complex: an example from coffee (Coffea spp.)

hosts. Mycologia 104, 396-409.

144. Silva-Junior, G. J., Spósito, M. B., Marin, D. R., & Amorim, L. (2014). Efficacy

and timing of application of fungicides for control of citrus postbloom fruit

drop. Crop Protection, 59, 51-56.

145. Sousa, E. S., Silva, J. R. A., As.sunção, I. P., de Melo, M. P., Feijó, F. M., da Silva

Matos, K., de Andrade Lima, G. S., & Beserra, J. E. A. (2018). Colletotrichum species

causing anthracnose on lima bean in Brazil. Tropical plant pathology 43, 78-84.

146. Srivastava, A., & Mangal, M. (2019). Capsicum Breeding: History and

Development. In "The Capsicum Genome" (N. Ramchiary and C. Kole, eds.), pp.

25-55. Springer International Publishing, Cham.

147. Staub, T. (1991). Fungicide resistance: practical experience with antiresistance

strategies and the role of integrated use. Annual review of phytopathology 29, 421-442.

148. Su, Y.-Y., Qi, Y.-L., & Cai, L. (2012). Induction of sporulation in plant

159

pathogenic fungi. Mycology 3, 195-200.

149. Sundravadana, S., Alice, D., Kuttalam, S., & Samiyappan, R. (2007). Efficacy of

azoxystrobin on Colletotrichum gloeosporiodes Penz growth and on controlling

Mango anthracnose. Journal of Agricultural and Biological Science 2, 10-15.

150. Sutton, B., Bailey, J., & Jeger, M. (1992). The genus Glomerella and its anamorph

Colletotrichum. Colletotrichum: biology, pathology and control., 1-26.

151. Suwannarat, S., Steinkellner, S., Songkumarn, P., & Sangchote, S. (2017).

Diversity of Colletotrichum spp. isolated from chili pepper fruit exhibiting

symptoms of anthracnose in Thailand. Mycological progress 16, 677-686.

152. Suzaki, K. (2011). Improved method to induce sporulation of Colletotrichum

gloeosporioides, causal fungus of grape ripe rot. Journal of General Plant

Pathology 77, 81-84.

153. Syukur, M., Sujiprihati, S., & Koswara, J. (2013). Genetic analysis for resistance to

anthracnose caused by Colletotrichum acutatum in chili pepper (Capsicum annuum

L.) using diallel cros.ses. SABRAO Journal of Breeding and Genetics 45, 400-408.

154. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., & Kumar, S. (2013). MEGA6:

molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular biology and

evolution, 30(12), 2725-2729.

155. Than, P. P., Prihastuti, H., Phoulivong, S., Taylor, P. W., & Hyde, K. D. (2008a). Chilli

anthracnose disease caused by Colletotrichum species. J Zhejiang Univ Sci B 9, 764-78.

156. Than, P.P., Jeewon, R., Hyde, K., Pongsupasamit, S., Mongkolporn, O., & Taylor, P.

(2008b). Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species as.sociated

with anthracnose on chilli (Capsicum spp.) in Thailand. Plant Pathology 57, 562-572.

157. Tripodi, P., & Kumar, S. (2019). The Capsicum Crop: An Introduction. In "The

Capsicum Genome" (N. Ramchiary and C. Kole, eds.), pp. 1-8. Springer

International Publishing, Cham.

158. Udayanga, D., Manamgoda, D. S., Liu, X., Chukeatirote, E., & Hyde, K. D.

(2013). What are the common anthracnose pathogens of tropical fruits?. Fungal

Diversity 61, 165-179.

159. Urig, K. (2015). "New Mexico Chiles: History, Legend and Lore," Arcadia

Publishing.

160. Voorrips, R., Finkers, R., Sanjaya, L., & Groenwold, R. (2004). QTL mapping of

anthracnose (Colletotrichum spp.) resistance in a cros.s between Capsicum

annuum and C. chinense. Theoretical and Applied Genetics 109, 1275-1282.

161. Wang, H., Qi, M., & Cutler, A. J. (1993). A simple method of preparing plant

160

samples for PCR. Nucleic acids research 21, 4153.

162. Weir, B. S., Johnston, P. R., & Damm, U. (2012). The Colletotrichum

gloeosporioides species complex. Studies in Mycology 73, 115-180.

163. Wharton, P. S., & Diéguez-Uribeondo, J. (2004). The biology of Colletotrichum

acutatum. In "Anales del Jardín Botánico de Madrid", Vol. 61, pp. 3-22.

164. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. (1990). Amplification and direct

sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a

guide to methods and applications 18, 315-322.

165. Wright, P. J., Fullerton, R. A., & Koolaard, J. P. (2006). Fungicide control of head

smut (Sporisorium reilianum) of sweetcorn (Zea mays). New Zealand journal of

crop and horticultural science, 34(1), 23-26.

166. Yadav, O., Gaur, L., & Gaur, S. (2014). Chemical management of anthracnose of

chilli (Capsicum annuum L.). Int. J. Plant Prot 7, 96-98.

167. Yang, Y., Liu, Z., Cai, L., Hyde, K., Yu, Z., & McKenzie, E. (2009).

161

Colletotrichum anthracnose of Amaryllidaceae. Fungal Diversity 39, 123-146.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH MẪU THU THẬP, ĐẶC ĐIỂM BÀO TỬ, ĐĨA ÁP CỦA CÁC MẪU NẤM

1. Danh sách mẫu bệnh thán thư ớt thu thập từ 2015-2017

TT Năm Địa điểm Giống Loại quả thu thập Dạng triệu chứng Ký hiệu mẫu

1 2015 Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Quả xanh Triệu chứng 2 Ớt Hàn Quốc C1

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C2

Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình Ớt Kim lai Quả chín Triệu chứng 1 C3

Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình Ớt Kim lai Quả chín Triệu chứng 2 C4

1 6 2

Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên Ớt Mần Quả chín Triệu chứng 2 C5

Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C6

Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C7

Tiền Phong, Ân Thi, Hưng Yên G7 Quả chín Triệu chứng 1 C8

An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C9

An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh G7 Quả chín Triệu chứng 2 C10

Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C11

Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C12

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng GS 888 Quả chín Triệu chứng 2 C13

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng GS 888 Quả chín Triệu chứng 2 C14

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng GF 888 Quả chín Triệu chứng 2 C15

TT Năm Địa điểm Giống Loại quả thu thập Dạng triệu chứng Ký hiệu mẫu

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng Ớt hiểm lai 207 Quả chín Triệu chứng 2 C16

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng Ớt hiểm lai 207 Quả chín Triệu chứng 2 C17

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng Ớt hiểm lai 207 Quả xanh Triệu chứng 1 C18

Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C19

Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình Lai 20 Quả chín Triệu chứng 2 C20

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C22

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 1 C23

Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên Ớt hai mũi tên đỏ Quả chín Triệu chứng 2 C24

1 6 3

Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C25

Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C26

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 1 C27

Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên Lai 20 Quả chín Triệu chứng 2 C28

Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C29

Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C30

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 1 C31

C32 Thị trấn Nông trường, Mộc Châu, Sơn La Ớt chỉ thiên Quả xanh Triệu chứng 2

Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La Ớt chỉ thiên Quả xanh Triệu chứng 2 C33

Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La Ớt chỉ thiên Quả xanh Triệu chứng 2 C34

TT Năm Địa điểm Giống Loại quả thu thập Dạng triệu chứng Ký hiệu mẫu

2 2016 Long Thành, Long Định, Tiền Giang Ớt F1 Long Định Quả xanh Triệu chứng 1 C35

Long Thành, Long Định, Tiền Giang Ớt F1 Long Định Quả xanh Triệu chứng 2 C36

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 1 C37

Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C38

Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C39

Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C40

Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang Ớt chỉ thiên Quả xanh Triệu chứng 2 C41

Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang Ớt hai mũi tên đỏ Quả chín Triệu chứng 2 C42

Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang Ớt hai mũi tên đỏ Quả xanh Triệu chứng 2 C43

1 6 4

Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Ớt hai mũi tên đỏ Quả chín Triệu chứng 2 C44

Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Ớt hai mũi tên đỏ Quả chín Triệu chứng 2 C45

3 2017 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C46

Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 1 C47

Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C48

Việt Hồng, Thanh Hà, Hải Dương Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C50

Thanh Hải, Thanh Hà, Hải Dương Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C51

Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 2 C52

Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương Ớt Demon Quả chín Triệu chứng 1 C53

Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương Ớt chỉ thiên Quả chín Triệu chứng 2 C54

2. Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm thu thập

Hình thái

Bào tử phân sinh Đĩa áp TT Mẫu nấm Địa điểm thu thập Nhóm hình Kích thước Kích thước Màu sắc, hình dạng Hình dạng thái (dài x rộng, µm) (µm)

1 C1 8,2 ± 1,3 × 6,1 ± 0,7 I

2 C2 7,1 ± 0,8 × 5,6 ± 0,4 I

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

3 C3 Quỳnh Hội, Quỳnh 7,8 ± 0,9 × 5,9 ± 0,8 I

Phụ, Thái Bình

4 C4 Quỳnh Hội, Quỳnh 6,7 ± 0,7 × 5,7 ± 0,6 I

1 6 5

Phụ, Thái Bình

5 C5 Hoàn Long, Yên 7,5 ± 0,8 × 6,0 ± 0,7 I

Mỹ, Hưng Yên

6 6,7 ± 0,8 × 5,1 ± 1,5 I

7 7,8 ± 1,1 × 5,8 ± 0,9 I

8 C8 Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Lưỡi liềm 8,8 ± 0,9 × 5,1 ± 0,5 III

9 C6 Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên C7 Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên Tiền Phong, Ân Thi, Hưng Yên C9 An Bình, Lương 9,5 ± 1,3 × 5,2 ± 0,5 I

Tài, Bắc Ninh

10 C10 An Bình, Lương 8,5 ± 1,1 × 5,8 ± 0,6 I

Tài, Bắc Ninh Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn 11,6 ± 0,8 × 4,9 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,8 ± 1,1 × 5,0 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 0,6 × 4,7 ± 0,3 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,9 ± 1,2 × 3,9 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 0,7 × 4,3 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,7 ± 1,3 × 3,9 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,4 ± 0,8 × 4,1 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 20,5 ± 1,2 × 3,9 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 12,0 ± 0,9 × 3,9 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 0,7 × 4,6 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

Hình thái

Bào tử phân sinh Đĩa áp Nhóm TT Mẫu nấm Địa điểm thu thập Màu sắc, hình dạng Hình dạng hình thái Kích thước (dài x rộng, µm) Kích thước (µm)

11 7,3 ± 1,1 × 5,1 ± 0,8 I

12 7,7 ± 1,2 × 6,1 ± 0,7 I

C11 Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh C12 Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh

13 C13 Trấn Dương, Vĩnh Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Lưỡi liềm 9,3 ± 1,1 × 5,7 ± 0,6 III

Bảo, Hải Phòng

14 C14 Trấn Dương, Vĩnh 7,8 ± 1,3 x 6,0 ± 0,9 I

1 6 6

Bảo, Hải Phòng

15 C15 Trấn Dương, Vĩnh 7,8 ± 1,1 × 4,5 ± 0,7 I

Bảo, Hải Phòng

16 C16 Trấn Dương, Vĩnh 7,2 ± 0,8 × 5,1 ± 0,4 I

Bảo, Hải Phòng

17 C17 Trấn Dương, Vĩnh 7,9 ± 1,1 × 5,3 ± 0,6 I

Bảo, Hải Phòng

18 C18 Trấn Dương, Vĩnh 8,1 ± 1,2 × 5,4 ± 0,6 I

Bảo, Hải Phòng

19 C19 Quỳnh Hải, Quỳnh 7,9 ± 1,1 × 5,0 ± 0,3 I

Phụ, Thái Bình

20 C20 Quỳnh Hải, Quỳnh Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Lưỡi liềm 8,6 ± 1,1 × 5,3 ± 0,6 III

21 7,7 ± 1,1 × 5,1 ± 0,5 I

Phụ, Thái Bình C22 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam Trụ, hai đầu tù tới tròn 12,5 ± 0,8 × 4,7 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,1 ± 1,2 × 5,1 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 21,2 ± 1,4 × 3,5 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 12,5 ± 0,8 × 4,4 ± 0,3 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,3 ± 1,2 × 3,6 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,3 ± 1,1 × 4,1 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,6 ± 1,3 ×4,4 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,9 ± 1,2 × 4,2 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 1,3 × 4,5 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 21,3 ± 1,4 × 3,7 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,6 ± 1,2 × 4,3 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

Hình thái

Bào tử phân sinh Đĩa áp Nhóm TT Mẫu nấm Địa điểm thu thập Hình dạng Màu sắc, hình dạng hình thái Kích thước (dài x rộng, µm) Kích thước (µm)

22 7,4 ± 0,9 × 4,8 ± 0,4 I

C23 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

23 8,8 ± 1,2 × 4,9 ± 0,4 I

C24 Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên

24 C25 Văn Đức, Gia Lâm, Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Lưỡi liềm III

Hà Nội 11,1 ± 1,0 × 4,5 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 12,6 ± 0,9 × 3,8 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 21,5 ± 1,2 ×3,5 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,7 ± 1,4 × 6,3 ± 1,0

7,3 ± 1,0 × 4,8 ± 0,8 25 C26 Hoàn Long, Yên I

1 6 7

Mỹ, Hưng Yên Trụ, hai đầu tù tới tròn 11,0 ± 1,1 × 4,3 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

26 8,6 ± 1,1 × 5,1 ± 0,7 I

C27 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

27 C28 Thanh Ninh, Phú Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu 11,6 ± 1,2 × 4,7 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,7 ± 0,9 × 4,5 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới 8,3 ± 1,2 × 4,7 ± 0,5 I

Bình, Thái Nguyên

28 C29 Thanh Ninh, Phú tù tới tròn Trụ, hai đầu gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,9 ± 1,1 × 4,6 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới 9,7 ± 1,4 × 5,7 ± 0,6 II

Bình, Thái Nguyên gần hình thoi, một số chẻ thùy

tù tới tròn Lưỡi liềm 29 C30 Vân Nội, Đông 21,9 ± 1,0 × 3,7 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới 8,1 ± 1,3 × 5,3 ± 0,7 III

Anh, Hà Nội

30 C31 Nhân Hưng, Lý Trụ, hai đầu gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,7 ± 1,1 × 4,1 ± 0,7 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới 6,9 ± 0,8 × 5,2 ± 0,5 I

Nhân, Hà Nam C32 Thị trấn Nông 31 tù tới tròn Trụ, hai đầu gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,8 ± 1,3 × 4,7 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới 8,0 ± 1,2 × 5,8 ± 0,6 I

tù tới tròn gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

trường, Mộc Châu, Sơn La

Hình thái

Bào tử phân sinh Đĩa áp Nhóm TT Mẫu nấm Địa điểm thu thập Hình dạng Màu sắc, hình dạng hình thái Kích thước (dài x rộng, µm) Kích thước (µm)

32 C33 Đông Sang, Mộc 8,2 ± 1,0 × 5,3 ± 0,6 I

Châu, Sơn La Trụ, hai đầu tù tới tròn 11,9 ± 1,0 × 4,5 ± 0,7 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

33 C34 Đông Sang, Mộc 7,6 ± 0,9 × 6,2 ± 0,5 I

Châu, Sơn La Trụ, hai đầu tù tới tròn 12,2 ± 1,1 × 4,7 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

8,3 ± 1,2 × 5,2 ± 0,6 III 34 C35 Long Thành, Long Lưỡi liềm

Định, Tiền Giang

35 C36 Long Thành, Long 8,6 ± 1,2 × 4,9 ± 0,7 I

1 6 8

Định, Tiền Giang

36 8,8 ± 1,3 × 5,4 ± 0,5 I

C37 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

37 8,4 ± 1,1 × 5,1 ± 0,6 I

38 8,6 ± 1,1 × 5,3 ± 0,4 I

39 8,8 ± 1,2 × 4,8 ± 0,4 I

40 7,7 ± 0,9 × 4,6 ± 0,5 I

C42 41 7,0 ± 0,6 × 4,7 ± 0,6 I

C43 42 7,7 ± 1,1 × 5,6 ± 0,7 I

C38 Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định C39 Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định C40 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang C41 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn 22,4 ± 1,4 × 3,9 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,5 ± 1,1 × 4,8 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,8 ± 0,9 × 4,6 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,4 ± 1,1 × 4,8 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,4 ± 1,2 × 3,8 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,7 ± 1,1 × 4,9 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 1,1 × 4,7 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 12,6 ± 1,2 × 3,6 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,9 ± 1,1 × 4,1 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

Hình thái

Bào tử phân sinh Đĩa áp Nhóm TT Mẫu nấm Địa điểm thu thập Hình dạng Màu sắc, hình dạng hình thái Kích thước (dài x rộng, µm) Kích thước (µm)

43 C44 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà 7,3 ± 1,0 × 4,8 ± 0,8 I

Nội

44 C45 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà 6,6 ± 0,6 × 5,4 ± 1,3 I

Nội

45 C46 Khánh Vân, Yên 7,1 ± 0,9 × 5,1 ± 0,8 I

Khánh, Ninh Bình

1 6 9

46 C47 Khánh Vân, Yên 7,9 ± 1,2 × 5,6 ± 0,5 I

Khánh, Ninh Bình

47 C48 Văn Đức, Gia Lâm, Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn Lưỡi liềm III

Hà Nội

48 C50 Việt Hồng, Thanh 11,7 ± 2,2 × 6,3 ± 1,0 8,3 ± 1,1 × 5,8 ± 0,6 I

Hà, Hải Dương

49 C51 Thanh Hải, Thanh 7,9 ± 0,8 × 5,5 ± 0,7 I

Hà, Hải Dương Trụ, hai đầu tù tới tròn Trụ, hai đầu tù tới tròn 11,0 ± 1,1 × 3,4 ± 0,2 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 12,3 ± 1,3 × 3,6 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,9 ± 1,2 × 3,9 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,2 ± 1,1 × 4,6 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 22,4 ± 1,2 × 3,6 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 10,8 ± 0,8 × 4,8 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều 11,3 ± 1,2 × 4,5 ± 0,4 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

50 C52 Kim Tân, Kim I 7,4 ± 0,6 × 5,7 ± 0,5

Thành, Hải Dương Trụ, hai đầu tù tới tròn 11,9 ± 1,1 × 4,1 ± 0,6 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

51 C53 Kim Tân, Kim Lưỡi liềm 9,7 ± 0,8 × 5,6 ± 0,4 III

Thành, Hải Dương 21,7 ± 1,2 × 4,1 ± 0,3 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

8,1 ± 1,2 × 5,1 ± 0,7 I 52

C54 Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương Trụ, hai đầu tù tới tròn 12,1 ± 1,3 × 4,4 ± 0,5 Màu nâu đến nâu đậm; hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều

PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH CÁC SẢN PHẨM PCR

1. Sản phẩm PCR 10 mẫu nấm Colletotrichum bằng cặp mồi ITS

2. Sản phẩm PCR 9 mẫu nấm Colletotrichum bằng cặp mồi ApMat

3. Sản phẩm PCR tối ưu phương pháp chiết DNA các mẫu nấm Colletotrichum

170

3. Sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho 4 cặp mồi tự thiết kế phục vụ chẩn

đoán các loài nấm Colletotrichum

171

4. Sản phẩm PCR xác định thành phần loài Colletotrichum bằng các cặp mồi đặc

hiệu tự thiết kế

172

173

PHỤ LỤC 3. TRÌNH TỰ ĐOẠN ĐỌC ĐƯỢC CỦA CÁC MẪU NẤM 1. Giải trình tự vùng gen ITS 10 mẫu nấm

 C1-17B4ZAB008 - (548 nts)

TTGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT

CATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG

TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG

GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG CCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC

TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC CGTAAAACCCCCCAATTTCCAAAGGTGACCT

 C4-17B4ZAB009 - (529 nts)

AAAAAAAAACAACAAACAACAAGACCAAATGGAAGTAAAAGTCGTAACAA GGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTATACA

ACCCTTTGTGGACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTG ACCCTCCCGGCCTCCCGCCCCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAAC

CAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAA ACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA

ATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCAT

TTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACACGCTGATGTAGGCC CTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTAC

GTCTCGCACTGGGA

 C6-17B4ZAB010 - (548 nts)

174

TTGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT CATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG CCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC CGTAAAACCCCCCAATTTCCAAAGGTGACCT

 C9-17B4ZAB011 - (547 nts)

TTGGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT

CATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG

TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG

GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG CCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC

TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC CGTAAAACCCCCAATTTCCAAAGGTGACCT

 C14-17B4ZAB012 (549)

TTGGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT

CATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG

TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG

CCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC

CGTAAAACCCCCCAATTTCCAAAGGTGACCTC

 C25-17B4ZAB013 - (556 nts)

TTGGAAGGTAAAAAGTGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGA TCATTACTGAGTTACCGCTCATCAACCCTTTGTGAACATACCTTAACTGTTG

CTTCGGCGGGTAGGCGTCCCCTGAAAAGGACGTCTCCCGGCCCTCTCCCGTC CGCGGGTGGGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTT

TCTTCTGAGTGACACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG

CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCAT TCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGG

TGTTGGGGCTCTACGGTTGACGTAGGCCCTTAAAGGTAGTGGCGGACCCTCT CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACATTTCGTCTCGCATTGGGATTCGGAGGGA

175

CTCTAGCCGTAAAACCCCCAATTTTACTAAGGTGACCTC

 C26-17B4ZAB014 - (560 nts)

TTGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT

CATTACTGAGTTTACGCTCTACAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG

TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG

GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG CCCTACAGCCGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC

TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC CGTAAAACCCCCCAATTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTA

 C29-17B4ZAB015 - (563 nts)

TTTGGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGA

TCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTG CTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGG

TCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGG GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGG

CCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCC TCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGC

CGTAAAACCCCCCAATTTCCAAAGGTGACCTCGGATCAGGTAGAT

 C30-17B4ZAB016 - (556 nts)

TTGGAAGTAAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGA TCATTACTGAGTTACCGCTCATCAACCCTTTGTGAACATACCTTAACTGTTG

CTTCGGCGGGTAGGCGTCCCCTAAAAAGGACGTCTCCCGGCCCTCTCCCGTC CGCGGGTGGGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTT

TCTTCTGAGTGACACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG

CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCAT TCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGG

TGTTGGGGCTCTACGGTTGACGTAGGCCCTTAAAGGTAGTGGCGGACCCTCT CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACATTTCGTCTCGCATTGGGATTCGGAGGGA

176

CTCTAGCCGTAAAACCCCCAATTTTACTAAGGTGACCTC

 C33-17B4ZAB017 - (551 nts)

TTTGGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGA TCATTACTGAGTTTACGCTCTACAACCCTTTGTGGACATACCTATAACTGTT

GCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGCCTCCCGCCCCCGGGCGG GTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTG

AGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT

CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCG GGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGG

GCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGC CTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTG

2. Giải trình tự vùng gen ApMat

CCGTAAAACCCCCAATTTCCAAAGGTGACCTCGG

 C1-19D5ZAA000/19D5ZAA001 - (915 nts)

ACAAGAGCGCCTCTTGATGATGTATCCCGACTACCGTTACACCCCTCGCAAG

CCGTCTGAGAAGCGCCATCGAAAGCCTAGTGGCCAAAGCAAGAAGACCAG CTTAGCAGCGTCGATGAGGTAGAGGCCGCCTCCTACCCGAGAGCGACAAAA

CCATCAGCGCGCCCACTTGTCGGCTCCAGACGGAGGAGTATGAGTTATACC TACCGACTGCGACAAGTCGCTGTAGTATCAGTCATGGAACGGAATAGATAT

CGGCGCTGCCAAACGACTTTAGGTCGTCCTTGTGTTCTAGACTGGCAGCATC AGCGACCAGAGGAGCCTCAGAACATGGCGCCTTTGGAGGCTGTCTTCGATC

TCTATCCAGTCAGCGTGACCCAGGAGGCGACCACGCATCTGTTCGTCGATTC ACTTCCCGCATGCTGTGGCAAGAGTTACCTGCGCGAGAAACCAACAGACCT

TTGTGCGGCGATACTTAGACGTACGAACGCTAGGAGATCACCGGATCTGAG GAACCAAGAATCATCCTGGACCATCTGCTTCGATGGCAACGCGAAGCAGAG

ATCTTCGATTTGATGAACATATTGGTGCAAAAATGTACTCACAACCCATGTA TTCGCATGTCAAGCGAATACGAATCTTTTTCTGTAATTATAATCTGCAAGCC

AGTAAATATCATCTTCATGGACCATCTATTCCAGCCCGATACCTAGAGTGTC TTTTGGCCCCCGCCGTGAGGACCATTGATTCGCCCACATGTTGCTCTTCGCC

ACTGCAGACTGCCAACACCATCCATGATGCCCAGCCACTGTCTCGACTGCGC ATCACGGGAATAACTAGGTCTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTCCAGATGAA

177

CGTCCCGCACCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGGCTCCC

 C4-19D5ZAA002/19D5ZAA003 – (919 nts)

GCACAAGGAGCGCCTCTTGATGATGTATCCCGACTACCGTTACACCCCACGC

AAGCCGTCTGAGAAGCGCCATCGAAAGCCTAGTGGCCAAAGCAAGAAGGC CAGCTTAGCAGCGTCAATGAGGTAGAGGCCGCCTTCTACCCAAGAGCGACA

ACACCATCAGCGCGCCGACTTGTCGGCTCCAGACGGAGGAGTATGAGTTAT ACCTACCGACTGCGATGAGTCGCTGTAGCATCTGCCACGAAATGGAACTGA

TATCGGCGCTGCCAGACGACCTAAGGTTGTCTTTGTGTCCTAGAATGGCAGC ATTAGCGACCAGAGGAGCCTAAGAATGTGGCGCCTTTGGCGGCTGTCTTCG

ATCTCCATCCAGTCAGCGTGACCCAGGAGGCGACCACACATCTGGCCATCG ATTCCCTTCCCGCATGCTGCAGCAAGAGTTACCCTGCGCCAGAAACCAACA

GACCTTTGTGCGGCGATACTTAGGCGTACGAATGCAAGGAGATCGCCGGAT CTGAGGAACCAAGAATCATCCTGGCCCATCTGCTTCGCTGGCAACGCGAAC

CAGAGATCTTCGATTTAATGAACATATTGGTGGTAAAATGTACTCACAACCC ATGTATTCGCATATTCAGAGCGAACCCGAGTCTTTTTCTGTAATTATAATCT

GCAAGCCAGTAAATATTATCTTCATAGACCATCTATTCCAGCCCGATACCTA AAGTGTCTTTTTCCCCCACCATGGGGACTATTCATTCGCCCATATCATGCTCT

TCGCCACTGCGGACTGCCAACACCATCCACGATACACAGCCGCTGTCACGA CTGCGCATCACGGGAGTAACTAGGTCTGATCTTTCTTCCAGTCGCTGCTCCA

GATGAACGTCCCGCATCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGACCCC

 C6-19D5ZAA004/19D5ZAA005 – (910 nts)

178

AGCGCCTCTTGATGATGTATCCCGACTACCGTTACACCCCTCGCAAGCCGTC TGAGAAGCGCCATCGAAAGCCTAGTGGCCAAAGCAAGAAGACCAGCTTAG CAGCGTCGATGAGGTAGAGGCCGCCTCCTACCCGAGAGCGACAAAACCATC AGCGCGCCCACTTGTCGGCTCCAGACGGAGGAGTATGAGTTATACCTACCG ACTGCGACAAGTCGCTGTAGTATCAGTCATGGAACGGAATAGATATCGGCG CTGCCAAACGACTTTAGGTCGTCCTTGTGTTCTCGACTGGCAGCATCAGCGA CCAGAGGAGCCTCAGAACATGGCGCCTTTGGAGGCTGTCTTCGATCTCTATC CAGTCAGCGTGACCCAGGAGGCGACCACGCATCTGTTCGTCGATTCACTTCC CGCATGCTGTGGCAAGAGTTACCTGCGCGAGAAACCAACAGACCTTTGTGC GGCGATACTTAGACGTACGAACGCTAGGAGATCACCGGATCTGAGGAACCA AGAATCATCCTGGACCATCTGCTTCGATGGCAACGCGAAGCAGAGATCTTC GATTTGATGAACATATTGGTGCAAAAATGTACTCACAACCCATGTATTCGCA TGTCAAGCGAATACGAATCTTTTTCTGTAATTATAATCTGCAAGCCAGTAAA TATCATCTTCATGGACCATCTATTCCAGCCCGATACCTAGAGTGTCTTTTGG CCCCCGCCGTGAGGACCATTGATTCGCCCACATGTTGCTCTTCGCCACTGCA GACTGCCAACACCATCCATGATGCCCAGCCACTGTCTCGACTGCGCATCACG GGAATAACTAGGTCTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTCCAGATGAACGTCCC GCACCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGGCTCCC

 C9-19D5ZAA006/19D5ZAA007 - (894 nts)

CACAAGGAGCGCCTCCTGATGATGTACCCCGACTACCGTTACACCCCACGC

AAGCCGTCTGAGAAGCGTCATCGAAAGCCCAGTGGCCAAAGCAAGAAGGC CAGCTTAGCAGCGTCGATGAGGTAGAGGTCGTCTCCTACCCGAGAGCGACG

ACACCATCAGCGCGCCGACTTGTCAGCTCAAGACGGAGGAGTATGAGTTAC ACCTACCGACTGCGACAAGTCGCTGTAGCATCAGCAACGAATTGGAACCGA

TATCGGCGCTGCCAGACCACCTTAGGTTGTCTTTGTGCCCTTGACTGGCAGC ATCAGCGACCAGGGAAGCCTAAGAATATGGCGCCTTTGTGCAGCTGTCTTC

GATCTCTATCCAGTCAGCGTGGCCAAGCAGGCACCCATGCATCTGGTCATA GATTCCCTTCTTATATGCTGCGGCAAGAGTTACCCTGCGCCGGAAACCAACA

GACCTTTGTGCGGCGATACTTAGACGTACGAACGCTAGGAGATCACCGGAT CTGACGAACCAAGAATCATCCTGGCCCATCTGCTTCGATGGCTACGCGAAC

CAGAGATCTTCGATTCGATGAACTTATTGGTAGAAAAATGTACTACTACTGT ACTCACAACCCATATATTCGCATGTTCAAAGCGAACACGTACCTTTTTCTGT

AATTATAATCTGCAAGCCAGTAAATATCATCTTCATAGACCATCTATTCCAG ACCGATACCTAGAGTGTCATTTCTTTTCCTAGCATAAGAATAATGATCCGCC

CATGTGATGCTCTTCGCCACTGTCACGACCGCGCATCACGGGAATACTAGGT CTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTCCAGATGAAGGTCCCGCATCTCCACTCC

GTCCCCGATTCTTTGACCCC

 C14-19D5ZAA008/19D5ZAA009 - (915 nts)

179

ACAAGAGCGCCTCTTGATGATGTATCCCGACTACCGTTACACCCCTCGCAAG CCGTCTGAGAAGCGCCATCGAAAGCCTAGTGGCCAAAGCAAGAAGACCAG CTTAGCAGCGTCGATGAGGTAGAGGCCGCCTCCTACCCGAGAGCGACAAAA CCATCAGCGCGCCCACTTGTCGGCTCCAGACGGAGGAGTATGAGTTATACC TACCGACTGCGACAAGTCGCTGTAGTATCAGTCATGGAACGGAATAGATAT CGGCGCTGCCAAACGACTTTAGGTCGTCCTTGTGTTCTAGACTGGCAGCATC AGCGACCAGAGGAGCCTCAGAACATGGCGCCTTTGGAGGCTGTCTTCGATC TCTATCCAGTCAGCGTGACCCAGGAGGCGACCACGCATCTGTTCGTCGATTC ACTTCCCGCATGCTGTGGCAAGAGTTACCTGCGCGAGAAACCAACAGACCT TTGTGCGGCGATACTTAGACGTACGAACGCTAGGAGATCACCGGATCTGAG GAACCAAGAATCATCCTGGACCATCTGCTTCGATGGCAACGCGAAGCAGAG ATCTTCGATTTGATGAACATATTGGTGCAAAAATGTACTCACAACCCATGTA TTCGCATGTCAAGCGAATACGAATCTTTTTCTGTAATTATAATCTGCAAGCC AGTAAATATCATCTTCATGGACCATCTATTCCAGCCCGATACCTAGAGTGTC TTTTGGCCCCCGCCGTGAGGACCATTGATTCGCCCACATGTTGCTCTTCGCC ACTGCAGACTGCCAACACCATCCATGATGCCCAGCCACTGTCTCGACTGCGC ATCACGGGAATAACTAGGTCTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTCCAGATGAA CGTCCCGCACCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGGCTCCC

 C26-19D5ZAA010/19D5ZAA011 - (879 nts)

CTGATGATGTACCCCGACTACCGTTACACCCCACGCAAGCCGTCTGAGAAG

CGTCATCGAAAGCCCAGTGGCCAAAGCAAGAAGGCCAGCTTAGCAGCGTCG ATGAGGTAGAGGTCGTCTCCTACCCGAGAGCGACGACACCATCAGCGCGCC

GACTTGTCAGCTCAAGACGGAGGAGTATGAGTTACACCTACCGACTGCGAC AAGTCGCTGTAGCATCAGCAACGAATTGGAACCGATATCGGCGCTGCCAGA

CCACCTTAGGTTGTCTTTGTGCCCTTGACTGGCAGCATCAGCGACCAGGGAA GCCTAAGAATATGGCGCCTTTGTGCAGCTGTCTTCGATCTCTATCCAGTCAG

CGTGGCCAAGCAGGCACCCATGCATCTGGTCATAGATTCCCTTCTTATATGC TGCGGCAAGAGTTACCCTGCGCCGGAAACCAACAGACCTTTGTGCGGCGATA

CTTAGACGTACGAACGCTAGGAGATCACCGGATCTGACGAACCAAGAATCAT CCTGGCCCATCTGCTTCGATGGCTACGCGAACCAGAGATCTTCGATTCGATG

AACTTATTGGTAGAAAAATGTACTACTACTGTACTCACAACCCATATATTCGC ATGTTCAAAGCGAACACGTACCTTTTTCTGTAATTATAATCTGCAAGCCAGTA

AATATCATCTTCATAGACCATCTATTCCAGACCGATACCTAGAGTGTCATTTC TTTTCCTAGCATAAGAATAATGATCCGCCCATGTGATGCTCTTCGCCACTGTC

ACGACCGCGCATCACGGGAATACTAGGTCTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTC CAGATGAAGGTCCCGCATCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGACCCC

 C29-19D5ZAA012/19D5ZAA013 (930 nts)

TGCAAGATGCACAAGGAGCGCCTCTTGATGATGTATCCCGACTACCGTTAC ACCCCACGCAAGCCGTCTGAGAAGCGCCATCGAAAGCCTAGTGGCCAAAGC

AAGAAGGCCAGCTTAGCAGCGTCAATGAGGTAGAGGCTGCCTCCTACCCGA GAGCGACAACACCCTCAGCGCGCCGACTTGTCGGGTCCAGACGGAGGAGTA

TGAGTACCTACCGACTGCGCCGAGTCGCTGTAGCAACAGCCACGAAACGGA ACCGATATCGGCGCTGCCAGACGACCTCAGGTTGTCTTTGTGTCCTAGACTG

GCAGCATCAGCGATCAGATGAGCCTAAGAATGTGGCGCCTTTTGCGGCTGTC TTCGATCTCTACCCAGTCAGCGTGACCCAGGAGGCGACCACACATCTGGTCA

TCGATTCTTTGCCGCATGCTGTAGCAAGAGTTGCCCTGCACCAGAAACCAAC AGACCTTTGTGCGGCGAAACTTAGGCGTGCGAACGCAAGGAGATCGCCGGA

TCTGAGGAACCAAGAATCATCCTGGCCCATCTGCTTCGATGGCAACGCGAAC CAGGGATCTTCAATTTGATGAACATGTTGGTGGAAAAATGTACTCACAACCC

ATGTATTCGCATGTCAAAGCGAACACGAATCTTTTTCTGTAATTATAATCTGC AAGCCAGTAAATATTATCTTCATGGACCATCTATTCCAGCCCGATACCTAGA

GTGTCTTTTGCCCCCCGCCATGAGGACCATTGATTCGCCCACATGTTGCTCTT CGCCACTGCAGACTGCCAACACCATCCATGATGCCCAGCCACTGTCTCGACT

180

GCGCATCACGGGAATAACTAGGTCTGATCTTTTTTCCAGTCGCTGCTCCAGAT GAACGTCCCGCATCTCCACTCCGTCCCCGATTCTTTGACCCCGACTCCC

 C33-19D5ZAA014/19D5ZAA015 (919 nts)