Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống thông caribê (Pinus caribaea Morelet ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ------------------

NGUYỄN VĂN PHONG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea

Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

HÀ NỘI - 2009

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ------------------- NGUYỄN VĂN PHONG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea

Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60. 62. 60

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. CHU HOÀNG HÀ

HÀ NỘI - 2009

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc nâng cao chất lượng rừng, sử dụng các loài cây có giá trị về kinh tế

và môi trường, sinh trưởng nhanh, thích ứng được nhiều điều kiện sinh thái,

lập địa không tốt là chiến lược phát triển của ngành Lâm nghiệp từ năm 2010

đến 2020. Bên cạnh việc lựa chọn các loài cây bản địa cho trồng mới, khoanh

nuôi làm giàu rừng, công tác nghiên cứu, khảo nghiệm trồng thử các loài cây

ngoại lai đóng vai trò rất quan trọng (Quyết định số 18/2007/QĐ-TTg ngày 5

tháng 2 năm 2007 của thủ tướng chính phủ) [1]. Hiện nay, Thông caribê

(Pinus caribaea Morelet), là một trong những loài cây lâm nghiệp đang được

quan tâm phát triển [11], [19].

Thông caribê thuộc họ thông (Pinaceae) với 3 biến chủng là: Pinus

caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis và Pinus caribaea var

bahamensis có phân bố tự nhiên ở vùng Trung Mỹ. Thông caribê đã được du

nhập vào nhiều nước khác nhau, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới và

á nhiệt đới. Ở Việt Nam, Thông caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm từ

năm 1963 tại vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 2003). Đây là loài cây lá kim sinh

trưởng nhanh, thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông Ba lá, Thông Mã vĩ và

Thông nhựa, gỗ có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường được sử dụng

làm ván ép (Bredenkamp và Van Vuuen, 1987). Ngoài ra Thông caribê còn

được sử dụng làm gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột sợi giấy dai,

gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng nội thất, lấy nhựa… Thông

caribê còn có một lợi thế khác là có khả năng thích ứng với nhiều vùng sinh

thái khác nhau của nước ta [3], [9], [11], [19].

Khả năng gây trồng Thông cairibê ở nước ta đã được công bố trong tiêu

chuẩn ngành (04TCN 68 - 2004). Theo quyết định số 62/2006 QĐ-BNN, ngày

16/8/2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT về chiến lược phát triển

giống cây lâm nghiệp giai đoạn 2006 - 2020, nhu cầu lượng cây giống Thông

caribê cần hàng năm trong giai đoạn 2006 – 2015 là 14.000.000 cây/năm. Đây

là số lượng cây giống cần rất lớn, hiện nay Thông caribê hiện được trồng bằng

hạt sinh trưởng khá nhanh. Tuy vậy, việc nhân giống sinh dưỡng, đặc biệt là

nhân giống bằng hom và nuôi cấy mô là cơ sở để tạo nguồn giống có chất

lượng di truyền đồng đều, giữ được đặc điểm di truyền của cây lấy mẫu, làm

cơ sở cho công tác khảo nghiệm dòng vô tính của những cây trội được chọn

lọc. Nhân cây vô tính dễ dàng chủ động được nguồn giống, không bị ảnh

hưởng bởi mùa vụ và thời tiết.

Nhân giống sinh dưỡng Thông caribê đã và đang được nhiều nhà khoa học

trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu và bước đầu thu được một số kết

quả khả quan như: nhân giống bằng hom đã tạo được lượng lớn cây giống với

tỉ lệ hom ra rễ 93,3%…. Ở Việt Nam, nghiên cứu thăm dò nhân giống in vitro

Thông caribê đã được một số nơi nghiên cứu [7], [23] nhưng đạt hệ số nhân

chồi thấp 1,7 lần (Phạm Thị Kim Thanh, 2007) và chưa xây dựng được quy

trình để có thể ứng dụng trong sản xuất.

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro”.

Với mục tiêu nghiên cứu như sau:

+ Tạo được nguồn mẫu sạch đủ lớn từ 2 loại nguyên liệu (hạt chín, chồi

cành từ thực địa).

+ Phát triển quy trình nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả, hệ số nhân

chồi cao.

Nội dung nghiên cứu chính

+ Tạo mẫu sạch từ hạt và chồi cành của cây Thông caribê.

+ Tạo đa chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

+ Thử nghiệm khả năng tạo rễ in vitro cây Thông caribê.

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1. Giới thiệu cây Thông caribê

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố

Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) là loài cây nhiệt đới, họ thông

(Pinaceae) và nằm trong bộ thông (Coniferales) ngành hạt trần (Gynospermae) [3].

Thông caribê là loài thông bản địa ở vùng Trung Mỹ. Dựa vào sự phân

bố tự nhiên của loài ở các vùng địa lý khác nhau, Thông caribê được chia

thành 3 biến chủng (Luckhof, 1964; Lamb, 1973) như sau:

- Pinus caribaea var hondurensis (PCH) phân bố dọc bờ biển Đại Tây Dương vùng Trung Mỹ, từ Belize tới bắc Nicaragua, từ 120 đến 180 vĩ độ Bắc, từ 83030’ tới 89025’ kinh độ Tây. PCH mọc tự nhiên ở Belize, Guatemala,

Honduras và Nicaragua ở độ cao dưới 1000m so với mặt nước biển. Cây trưởng thành có thể cao tới 35 - 40m, sinh khối đạt khoảng 10 - 40m3/ha/năm.

- Pinus caribaea var bahamensis (PCB) phân bố ở quần đảo Bahamas và Caicos (240 - 270 vĩ độ Bắc, 71040’ - 790 kinh độ Tây). Cây mọc ở độ cao

gần 12m so với mặt nước biển, cây trưởng thành cao khoảng 15 - 20m.

- Pinus caribaea var caribaea (PCC) phân bố ở phía tây Cuba và trên đảo thông (220 - 230 vĩ độ Bắc, 82020’ - 84015’ kinh độ Tây). Cây mọc tự

nhiên ở độ cao dưới 280m so với mặt nước biển.

Vùng phân bố tự nhiên của PCH từ bờ biển vào sâu trong lục địa nên

sự biến động của các yếu tố khí hậu là khá lớn. Ví dụ nhiệt độ mùa đông ở nội địa của Belize có thể xuống tới 50C, trong khi mùa hè có thể nóng tới 370C.

Tuy nhiên, nhiệt độ không bao giờ xuống tới mức đóng băng. Lượng mưa

phân bố không đều giữa các vùng, biến động từ 1.500mm/năm ở núi thông

(Belize) tới 3.900 mm/năm ở Bluefields (Nicaragua). Những lâm phần thông

ở sâu trong lục địa có lượng mưa thấp hơn so với ven biển. Lượng mưa hàng

năm ở thung lũng sông Choluteca ở Hunduras có thể xuống tới 660mm với 6

tháng lượng mưa không vượt quá 40mm/tháng. Vì phân bố ở vùng Trung Mỹ,

PCH thích hợp với nhiều loại đất, từ đất cát xốp, thoát nước tốt, đất phù sa

dọc bờ biển Đại Tây Dương tới các loại đất trong lục địa được hình thành từ

các loại đá mẹ phiến thạch, granite, schist và đá cát với độ PH từ 4 đến 5, tầng

đất từ dày tới mỏng. Đất sét chặt bí, thoát nước không tốt không thích hợp với

Thông caribê [6].

Quần đảo Bahamas và Caicos, nơi PCB mọc tự nhiên có khí hậu ấm áp,

mùa đông khô và không có sương muối. Biến động về nhiệt độ không quá lớn giữa các mùa trong năm. Nhiệt độ trung bình dao động từ khoảng 220C ở tháng lạnh nhất tới 280C ở tháng nóng nhất. Lượng mưa trung bình năm là

1.185mm và tập trung chủ yếu ở các tháng 9 và 10. Lượng mưa biến động từ

khoảng 177mm ở tháng có lượng mưa nhiều nhất tới 32mm ở tháng khô nhất.

Mùa khô từ tháng 11 tới tháng 4 năm sau. PCB nơi nguyên sản mọc tốt trên

đất phong hoá từ đá vôi san hô, thoát nước tốt. Loại đất này khá nông, nghèo

dinh dưỡng và chứa đựng nhiều ôxít sắt bị rửa trôi từ tầng đá vôi. Vì được

hình thành từ đá vôi nên có tính kiềm cao, độ PH = 8,4 hoặc có thể cao hơn.

Tuy nhiên, nấm cộng sinh ở rễ của PCB phát triển tốt ở đất có tính kiềm cao

và có thể sẽ là nguyên nhân chủng này không được gây trồng nhiều ở ngoài

nơi phân bố tự nhiên của chúng.

PCC sinh trưởng ở điều kiện biến động lớn về nhiệt độ thì phát triển kém. Nhiệt độ thấp nhất và cao nhất ở Cuba có thể là từ 120C tới 340C. Lượng

mưa biến động từ 1.060mm/năm ở bờ biển phía Nam tới 1.794mm/năm ở đảo

thông. Vùng phân bố của PCC cũng có một mùa đông khô và lượng mưa tập

trung vào một số tháng mùa hè. PCC nơi nguyên sản thích hợp với đất phát

triển trên đá mẹ phiến thạch hoặc đá cát, thoát nước tốt, độ PH < 5. PCC không

sinh trưởng trên đất đá vôi mặc dù dạng đất này có rất nhiều ở Cuba [10].

1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Thông caribê cao 15 - 40m, đường kính có thể trên 100cm. Thân thẳng

tán hình tháp. Cành nghiêng sau xoè rộng. Vỏ màu nâu nhạt, nứt dọc sau bong

từng mảng dài. Chồi hình trụ tròn màu nâu thẫm. Lá hình kim mọc cụm trên

đầu cành ngắn, mỗi cụm 3 lá ít khi 4 hoặc 5 lá. Lá dài 15 - 25cm đường kính

1,5mm màu xanh vàng, hai mặt trên có dải phấn trắng, mép có răng cưa nhỏ.

Bẹ bao quanh gốc cụm lá dài 10 - 20mm màu nâu nhạt gồm nhiều lá hình vẩy

trong suốt, sống lâu.

Nón đực hình trụ, dài 1,3 - 3,2cm. Nón cái trên đầu cành non hình viên

chuỳ dài 5 - 10cm, đường kính 2,5 - 3,8cm. Nón cái chín trong 2 năm, lúc đầu

màu tím hồng sau màu xanh, khi chín hoá gỗ màu nâu. Nón có cuống ngắn

thuờng vẹo và quặp về phía cành. Vẩy nón hình thoi, mặt vẩy mỏng hơi lồi,

giữa có một gai nhọn gần 1mm. Hạt hình trứng dài 6mm, đường kính 3mm.

Vỏ hạt nâu có nhiều chấm tròn. Hạt có cánh mỏng dài 2 - 2,5cm.

Hệ rễ hỗn hợp, nơi tầng đất dày rễ cọc ăn sâu, nơi tầng đất mỏng hệ rễ

bên rất phát triển.

Là cây ưa sáng, nhạy cảm với sương giá và lửa, là một trong những loài

cây lá kim mọc nhanh trên thế giới, ở lập địa thích hợp cây 15 tuổi tăng

trưởng bình quân năm có thể đạt 1,5m chiều cao và 2,5cm đường kính. Ra

nón tháng 3 - 4. Nón chín tháng 7 - 8 năm sau.

1.1.3. Giá trị sử dụng

Gỗ màu vàng nhạt, lõi màu đỏ, có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải,

thường được dùng làm ván ép. Thân thẳng, dễ cưa xẻ nhưng phụ thuộc nhiều

vào độ tuổi tương đối cứng tỉ trọng 0,5 - 0,7. Có thể dùng trong xây dựng, làm

trụ mỏ, tiện khắc và bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ,

gỗ đóng đồ nội thất…và cho nhiều nhựa chất lượng cao [3].

Với tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng thích ứng rộng với các vùng

sinh thái khác nhau trên thế giới, đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế. Vì thế

Thông caribê là loài cây rừng đặc biệt để trồng rừng công nghiệp, được rất

nhiều nước nhập giống gây trồng, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới

và á nhiệt đới. Việt Nam là một nước nhiệt đới có các điều kiện địa lý khá

tương đồng với sự phân bố tự nhiên của Thông caribê. Do vậy mà loài Thông

caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm ở nước ta từ năm 1963 và đã có

những thành công nhất định [10], [19].

1.1.4. Tình hình sản xuất, gây trồng trong và ngoài nước

* Ở ngoài nước: Thông caribê đã được dẫn nhập và gây trồng ở trên 65

nước trên thế giới. Giới hạn vĩ độ vùng trồng được mở rộng đáng kể so với nơi nguyên sản, từ vĩ độ 550 nam ở Argentina tới 330 vĩ độ bắc ở Ấn độ. Giới hạn kinh độ cũng được mở rộng từ 1800 kinh độ Đông ở fiji tới 1580 kinh độ

Tây ở Hawaii. Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200m ở

Zaire, 1220m ở Nigeria, trên 1820m ở Uganda và 2400m ở Kenya [11].

Như vậy, Thông caribê đã được gây trồng trên tất cả các dạng khí hậu

của các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố rừng trồng của loài đã

được mở rộng cả về độ vĩ và độ kinh, cả từ vùng có khí hậu miền núi tới khí

hậu cận miền núi và vùng ven biển.

Ở Malaysia, Thông caribê được trồng trên diện tích lớn và cho sinh khối bình quân khoảng 17m3/ha/năm. Ở Đặc khu miền Bắc Australia, các xuất

xứ tốt nhất của PCH sau 10 năm sinh trưởng rất nhanh, cho sinh khối bình quân 22m3/ha/năm. Ở bang Queensland (cũng thuộc Australia), ở 9,5 tuổi, PCH đạt 16 - 18m3/ha/năm trong khi biến chủng PCB đạt khoảng 14,8m3/ha/năm [38].

* Ở trong nước: Thông caribê được dẫn nhập đầu tiên vào nước ta năm

1963 để trồng thử nghiệm tại Lang Hanh và Lang Linh thuộc tỉnh Lâm Đồng

(Lê Đình Khả, 1990; Phí Quang Điện, 2001). Loài thông này đã được trồng

thử ở Vĩnh Yên, Phú Thọ, Ninh Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Quảng Ninh,

Bắc Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, gần đây trồng ở Đông Nam bộ và Tây

Nguyên. Kết quả bước đầu cho thấy có thể gây trồng và cho hiệu quả kinh tế

ở một số địa phương. Sau đó Trung tâm nghiên cứu Giống cây rừng (Viện

Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam), Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

Phù Ninh phối hợp với nhiều cơ quan bố trí khảo nghiệm Thông caribê ở

nhiều vùng sinh thái khác nhau trong cả nước, như: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Ba

Vì (Hà Nội), Yên Thế (Bắc Giang), Yên lập (Quảng Ninh), Đại Huệ (Nghệ

An), Đông Hà (Quảng Trị), Tiền Giang (Thừa Thiên Huế), Sông Mây (Đồng

Nai), Hàm Thuận Nam (Bình Thuận)…

Các kết quả bước đầu cho thấy đây là loài cây sinh trưởng nhanh, thích

nghi sinh thái rộng, có nhiều triển vọng để gây trồng trên nhiều dạng lập địa

của nước ta, đặc biệt là biến chủng PCH (Stahl, 1984; Phí Quang Điện, 1989,

2001). Ví dụ, trên lập địa nghèo kiệt ở Yên Lập (Quảng Ninh) Thông caribê cho năng suất khoảng 8 - 10m3/ha/năm. Ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), chủng PCH

trồng trên đất feralít tầng trung bình, phát triển trên đá mẹ phiến thạch sét, thoát nước tốt, ở tuổi 15 đạt 16 - 18m3/ha/năm. Thông caribê biến chủng PCH

trồng năm 1984 tại Đông Hà (Quảng Trị) cho sinh trưởng bình quân là

2m/năm về chiều cao và 2,7cm/năm về đường kính.

Có nhiều nơi, Thông caribê không những sinh trưởng tốt mà còn ra hoa

kết hạt chắc từ tuổi 14 - 15 trở đi, có thể thu hái, gieo ươm tạo cây con như ở

Đại Lải (Vĩnh Phúc), Tiền Phong (Thừa Thiên Huế), Đông Hà (Quảng Trị)…

Ví dụ, hạt giống PCH tại Đại Lải đạt tỉ lệ nảy mầm tới 90%, cây con tạo từ

nguồn hạt này sinh trưởng tốt, ít sâu bệnh. Cây con 1 tuổi ở rừng trồng đạt

chiều cao trung bình là 1,17m, đường kính gốc đạt 1,8cm. Từ 3 đến 8 tuổi,

cây sinh trưởng nhanh hơn đạt chiều cao trung bình khoảng 1,8 - 2m/năm,

đường kính D1,3 = 1,6 - 1,8cm/năm. Từ đây chúng ta thấy ở 1 - 2 tuổi cây

sinh trưởng khá tốt trên cả 6 vùng địa lý - lập địa khác nhau, từ tuổi 3 PCH

sinh trưởng vượt PCC, sâu đục ngọn cây bắt đầu xuất hiện (tỉ lệ từ 2,5 - 3%),

ở PCH nhiều hơn PCC. Là một trong những loài cây chủ lực trồng rừng tổ

trên đất nghèo xấu phổ biến ở Việt Nam (Đại Lải và Đông Hà là những khu

vực điển hình), những kinh nghiệm có được cùng với những kết quả nghiên

cứu đã và đang được tiến hành, nghiên cứu của luận văn mong góp phần giúp

các cơ sở trồng rừng sản xuất Thông caribê đạt được kết quả tốt nhất, thiết

thực đóng góp chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng của đất nước và kế

hoạch phát triển nghề rừng đến năm 2020 [6].

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

Sự biệt hoá và phản biệt hoá cùng với tính toàn năng của tế bào thực

vật là cơ sở lý luận vững chắc để nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

Nuôi cấy in vitro là một phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của

phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào về cơ bản không có sự tổ hợp lại của

thể nhiễm sắc trong quá trình phân chia, vì thế đây là phương thức nhân giống

truyền đạt các biến dị di truyền của cây mẹ cho cây in vitro. Cây in vitro

không những giữ được các hình thái giải phẫu của cây mẹ, giữ được các biến

di truyền mong muốn mà còn giữ được các biến dị di truyền về sinh trưởng

nhanh và cho năng suất cao của chúng. Nhân giống in vitro là phương thức

giữ được ưu thế lai đời F1 và khắc phục được hiện tượng phân ly đời F2, nhân

giống in vitro làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, rút ngắn thời gian thực hiện

chương trình cải thiện giống cây rừng và là phương thức nhân nhanh các loài

cây quí hiếm đang bị khai thác cạn kiệt. Đây là phương thức góp phần bảo tồn

nguồn gen cây rừng và nhân giống bổ sung cho các loài cây khó thu hái và

bảo quản hạt [12], [8], đặc biệt là nhân nhanh số lượng lớn nguồn giống tốt

phục vụ chương trình trồng rừng.

Vì thế, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là một trong

những công cụ có hiệu quả nhất cho chọn giống cây rừng, là phương thức

đang được áp dụng phổ biến để nhân giống các dòng vô tính có năng suất cao.

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần

quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong cải

thiện cuộc sống của con người. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực

vật ở nước ta từ nay tới năm 2020 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng

phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân

nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro [28].

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển phát triển

sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự

phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật. Để điều khiển được sự phát

sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm

chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ hàm

lượng của 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy

khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc

mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy, tỉ lệ nồng độ

auxin/cytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỉ lệ này

cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo mô sẹo [29], [5].

1.2.1. Phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân

giống vô tính cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom, tách dòng… Nhân

giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực

ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (bao gồm: làm sạch virus, nhân

nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự

nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây rừng) và đã mang lại hiệu

quả kinh tế lớn nhất [2]. Có 3 phương thức để tạo cây in vitro:

a. Hoạt hoá chồi nách

Hoạt hoá chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi

cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì

sự hoạt hoá của chồi nách diễn ra theo hai cách:

- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi

nuôi cấy loài cây hai lá mầm như: khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá…)

- Cách 2: Tạo cụm chồi từ đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm

như: Cây lúa, cây mía…)

b. Phương pháp tạo chồi bất định

Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác

của cây, không phải là phôi. Ví dụ như: chồi hình thành từ mô sẹo (callus).

Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá,

giẻ hành. Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hoá và tái

sinh tế bào để bắt tế bào sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông

qua giai đoạn phát triển mô sẹo.

c. Phương pháp tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào

sôma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn

chỉnh hoặc có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân

tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện

quá trình phản phân hoá và tái sinh tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành

phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Sự hình

thành phôi trải qua 2 bước chính sau:

- Bước 1: Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá

trình này cần môi trường giàu auxin vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo

các tế bào phôi, đồng thời auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số

lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng

phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không

bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protêin, ARN thông tin.

- Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của

giai đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao thì kích

thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế cho quá trình phân hoá và phát triển tiếp

theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là

rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp, nếu nồng độ thấp có thể gây sốc

cho phản ứng và nồng độ cao có thể gây ức chế hoặc gây độc [22].

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy in vitro

- Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại là môi trường hoá học và môi

trường vật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in

vitro. Ngoài chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có

nhiệm vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn

tại, phân hoá và phát triển. Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải

lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở

từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể.

- Môi trường hoá học: cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết

cho sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro.

Thành phần của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục

đích nuôi cấy, nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2], [30].

+ Nhóm các nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là những nguyên

tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm các nguyên tố

sau: N, P, K, S, Mg và Ca...Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá

trình trao đổi chất của tế bào và có chức năng xây dựng nên thành tế bào. Môi

trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường nhiều kali

sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.

+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là những nguyên

tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co,

Mn, Bo…Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng

chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô.

Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy

phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp. Hàm lượng của

các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi

trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.

+ Nguồn carbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng

rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn carbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng

hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn carbon

bổ sung là đường sucrose và glucose với liều lượng 20-30 g/lít. Trong trường

hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: maltose, lactose

hay fructose.

+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả

năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu

cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung thêm các

loại vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-

enzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào. Các vitamin thường được

sử dụng như: B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5 (Axit

nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo - inositol

cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành

tế bào thực vật.

+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường

nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như:

nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước

dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol và các chất có

hoạt tính auxin, cytokinin. Ngoài ra, Khoai tây và Chuối cũng hay được sử

dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích

tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy.

+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai

trò hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công

của toàn bộ quá trình nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và

sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ.

Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn

nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến

hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỉ lệ các chất điều hoà

sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3

nhóm chất chính là auxin, cytokinin và gibberellin.

Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, sự

hình thành rễ bất định và mô sẹo. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng

bốn loại auxin là: IAA (Indol acetic acid), IBA (Indol butyric acid), NAA

(Naphthyl acetic acid) và 2.4-D (2,4-Dicloro phenoxy axetic axit). Các loại

auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-5,0mg/lít tuỳ từng loài cây, từng

loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy.

Các chất thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế

bào và hình thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là:

Kinetin và BAP (Benzyl amino purin). Tỉ lệ giữa auxin và cytokinin quy định

sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành mô

sẹo. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ

auxin/cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt

hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỉ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt

hoá theo hướng tạo mô sẹo.

Các chất thuộc nhóm gibberellin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào,

kéo dài lóng, đốt thân, cành cây. Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ

nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Chất thường được sử

dụng nhất trong nhóm này là GA3.

Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh

trưởng và phát triển khác như ethylen. Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ

đến sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro.

+ Độ pH của môi trường: là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp

tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế

đã chứng minh khi pH thấp (pH< 4,5) hoặc cao (pH >7) đều gây ra ức chế

sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Cụ thể, nếu pH của môi

trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng

hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy. Thông thường độ pH dao động trong

khoảng từ 5,5 - 6,5 trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật.

- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh

hưởng cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.

+ Nhiệt độ: là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân

chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh

hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25 ± 20C.

+ Ánh sáng: các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự

phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời

gian chiếu sáng, cường độ và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu

sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy.

Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12 - 16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn

huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux, tương đương với khoảng cách 30

cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường

độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy mô sẹo có thể không cần

ánh sáng. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi

cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng.

Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh

trưởng của mô sẹo.

1.2.3 Các bước chính trong nhân giống in vitro

Theo George (1993) [22], quá trình nhân giống in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt

là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong

điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước

khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh

trưởng của mẫu cấy in vitro.

Mục tiêu của các chương trình cải thiện giống là thu nhận được một lượng

đáng kể tăng thu di truyền càng nhanh càng tốt, đồng thời duy trì được một vốn

di truyền phong phú để đảm bảo tăng thu trong tương lai. Để nhận được những

tăng thu như vậy phải dựa trên các phương pháp chọn lọc nhằm chọn ra những

cá thể đáp ứng tốt nhất những yêu cầu của nhà chọn giống để dùng như những

cây bố mẹ trong các chương trình chọn giống và sản xuất hạt.

Sau khi đã chọn được loài và xuất xứ đáp ứng mục tiêu kinh tế và phù

hợp với mỗi vùng thì chọn lọc cây trội là phần then chốt của bất kỳ một

chương trình nào về cải thiện giống cây rừng. Có cây trội được chọn lọc cẩn

thận, được khảo nghiệm hậu thế để đánh giá từ đó xây dựng các vườn giống

để cung cấp giống thì năng suất rừng mới từng bước được nâng cao, đáp ứng

yêu cầu ngày càng tăng của sản xuất xã hội. Cây trội là nền tảng của một

chương trình chọn giống [8].

Chọn cây trội là phương pháp lợi dụng biến dị cá thể tự nhiên trong quần

thể để nâng cao sản lượng đời sau so với giống đại trà. Tăng thu di truyền khi

chọn lọc cá thể có thể đạt 25 - 50%, mức độ biến động giữa các cá thể trong

quần thể càng lớn thì tăng thu di truyền đạt được càng cao.

Các cây trội đã chọn có thể được dùng để lấy giống phát triển trực tiếp vào

sản xuất. Còn nếu biết phối hợp với các phương pháp chọn giống khác như lai

giống, gây đột biến… sẽ mang hiệu quả cao hơn.

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng mẫu cấy in vitro. Trong giai đoạn này cần đảm

bảo các yêu cầu như tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng

tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.

Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là hoa và cuối

cùng là đoạn thân, mảnh lá chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh

một số cây như măng tây, dứa khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh

số lượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định, tạo

phôi vô tính.

Vấn đề đặt ra là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh

thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 270C và

12 - 16h chiếu sáng/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên

đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau.

Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh

sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng

nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường

không chứa chất kích thích sinh trưởng. Sau đó cây được ra ngoài vườn ươm

phát triển tốt thì cây phải đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây đảm bảo về các yêu cầu chiều cao, rễ, lá…

+ Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt

+ Phải điều chỉnh độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế

độ dinh dưỡng thích hợp [22].

1.3. Thành tựu về nuôi cấy in vitro

1.3.1. Thành tựu chung về nuôi cấy mô, tế bào thực vật trong và ngoài nước

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật

đã và đang có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và trong nghiên cứu

phát triển khoa học công nghệ trên thế giới và Việt Nam.

* Ngoài nước

Hiện nay nuôi cấy in vitro đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong sản

xuất thương mại cây lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới, hàng trăm loài cây lá

rộng và hàng chục loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô thành công. Cho tới năm

1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55 loài trong tổng số 67

loài tre - trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài

Dendrocalamus asper với số lượng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng được

nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng.

Số lượng các loài Bạch đàn đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro ngày càng tăng: đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác

nhau được nuôi cấy thành công.

Trung Quốc là nước thành công trong trong việc tạo cây in vitro cho các

loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như:

Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng…

Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã được thử nghiệm nhân giống thành

công bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,

Carpinus… Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng

nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng

dòng vô tính…Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim được nghiên cứu

nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong đó phải kể đến

các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh

[10]...Một số loài Thông đã được nuôi cấy thành công đó là Pinus nigra, P.

pinaster của các tác giả như: Shakya và cộng sự (1989) [42], Thorpe và Harry

(1991) [47], Okamura và Kondo (1995) [39].

Shakya và cộng sự (1989) đã thành công trong nghiên cứu nhân giống

P. wallichiana bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi có định hướng. Phôi tách ra được

nuôi cấy trên môi trường Aiken - Christie (LP - 1984) bổ sung BAP ở các

nồng độ từ 0 - 88µM trong 10; 14; 21 ngày. Kết quả đạt ít nhất 40 chồi/phôi

trong một chu kỳ cấy chuyển 4 tháng [42]

Thorpe và Harry (1991) đã nghiên cứu nuôi cấy thông Pinus

canariensis với nguồn vật liệu sử dụng chủ yếu từ lá mầm của cây con mới

nảy mầm vô trùng, tác giả đã sử dụng hai loại môi trường nuôi cấy chính là

môi trường SH (1972) và môi trường MCM (1983) có bổ sung 5 - 10 µM

BAP. Kết quả nghiên cứu đã xác định được môi trường MCM với nồng độ

BAP tối ưu trong giai đoạn tái sinh chồi là 10 µM, xác định được tổ hợp

phytohormon là BAP/2iP (tỉ lệ 1:1) là 5/5 µM cho kết quả tái sinh chồi tốt

hơn môi trường chỉ có BAP, xác định được giá thể ra rễ là hỗn hợp vô trùng

than bùn/vermiculate (tỉ lệ 1:1) chứa ¼ khoáng MCM, xử lý chồi ra rễ bằng

IBA 1µM trong 4 giờ. Kết quả đã đưa cây invitro vào giá thể trong bầu PVC

ở điều kiện nhà kính [47].

Năm 1995, Okamura và Kondo công bố “Hướng dẫn nuôi cấy mô cây

thông” giới thiệu tạo cây con thông Pinus thunbergi trong ống nghiệm từ nuôi

cấy phôi và lá mầm. Trong hướng dẫn này dùng môi trường GD (1972) và

môi trường AE để nuôi cấy giai đoạn nhân chồi. Giai đoạn nuôi cấy ban đầu

bổ sung 5 - 10 µM BAP và 3% đường. Giai đoạn ra rễ dùng môi trường

Risser and White có bổ sung 10 µM IBA và đã tạo thành công cây con trong

ống nghiệm [39].

Theo Aronen và cộng sự (2008), trong nghiên cứu tạo mô sẹo từ phôi

hạt của loài Pinus silvestris L cho thấy kết quả tái sinh từ mô sẹo rất cao (trên

90% ) [48].

Trong công trình nghiên cứu của mình Yiqun Lin và Michael R. Wagner

đã đưa ra kết luận: trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l

2,4-D là môi trường tạo mô sẹo tốt nhất cho loài Pinus pondorosa [50].

Các thành tựu trên đã cho thấy kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế

bào đã và đang đóng góp quan trọng trong việc nhân nhanh, chọn tạo và cải

thiện giống cây trồng nông - lâm nghiệp. Nhiều giống cây trồng có giá trị

đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cao

cho người dân, các công ty ở nhiều quốc gia. Trong tương lai gần, nhiều

giống cây trồng chất lượng cao được sản xuất bằng phương pháp nuôi cây

mô, tế bào sẽ thay thế dần các cây giống sản xuất từ phôi hạt, đặc biệt là các

cây lâm nghiệp.

* Trong nước

Ở nước ta, các nghiên cứu nuôi cấy mô, tế bào phát triển mạnh từ năm

1995 trở lại đây, nhưng đã gặt hái được nhiều thành tựu trong nhân giống và

chọn giống cây trồng. Kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô, tế

bào thực vật đã trở thành một phương thức nhân giống phổ biến ở hầu hết các

tỉnh thành trong cả nước. Đã có rất nhiều loài cây trồng được nhân nhanh

bằng phương pháp này và đã được ứng dụng trong thực tiễn sản xuất.

Hiện nay, nước ta đã có rất nhiều cơ sở nhân giống bằng nuôi cấy mô ở

qui mô lớn, trong đó có những cơ sở nhân giống cây rừng như: Trung tâm

nghiên cứu giống cây rừng, Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh,

Công ty giống lâm nghiệp Trung Ương, Xí nghiệp giống thành phố Hồ Chí

Minh, Trường Đại học Lâm nghiệp…

Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống

một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn và Keo lai có

năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên

cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho

Keo lai, Bạch đàn và một số giống cây rừng khác [11], [12], [14].

Thời gian gần đây có khá nhiều nghên cứu nhân giống in vitro cây rừng như:

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho

giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu nhiễm ít nhất và có tỉ lệ

bật chồi cao nhất là từ tháng 5 đến tháng 8. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l

BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Môi trường

ra rễ thích hợp là môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỉ lệ ra rễ tới 83,8%

[14].

Dương Thị Thảo Trang và cộng sự (2006) đã đưa ra môi trường thích

hợp nhất tạo nguồn cây Bời lời con in vitro sạch bệnh ban đầu là MS có bổ

sung 5,0 mg/l BAP, ở nồng độ 1,5 mg/l thích hợp nhất với quá trình tái sinh

chồi, ở nồng độ 1,2 mg/l cho kết quả tạo rễ tốt nhất.

Tạ Minh Hoà và cộng sự (2006) đã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi in

vitro ở cây Dó trầm và đưa ra kết luận: có thể tạo ra một bộ sưu tập Dó trầm in

vitro thông qua việc nuôi cấy chồi nách của cây nhiều năm tuổi. Đoạn thân chồi

nách là phần có khả năng tái sinh mạnh nhất so với các chồi khác trong nuôi

cấy in vitro. Cụm chồi xuất hiện sự tăng trưởng chồi nách hiện sẵn rong chồi

ngọn in vitro, chồi nách tạo mới trong quá trình kéo dài ngọn chồi in vitro trên

môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/lBA, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l adenin.

Hồ Văn Giảng và cộng sự (2006) đã bước đầu xây dựng quy trình nhân

giống cây Dó trầm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Môi trường thích hợp nhất

cho nhân chồi là MS cải tiến bổ sung 0,3 mg/l BAP, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar

cho hệ số nhân chồi đạt 4,2 chồi/cụm. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là WMP +

0,3 mg /l NAA + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar tỉ lệ ra rễ đạt 88,7% và cây mô sống

đạt 98% khi đưa ra vườn ươm.

Bùi Văn Vinh và cộng sự (2006) chỉ ra môi trường nuôi cấy có bổ sung

BAP 0,2 ppm và Kinetin 0,2 ppm là thích hợp nhất cho sự mọc chồi của cây Khôi.

Môi trường nhân nhanh chồi là MS có bổ sung BAP 1 ppm + Kinetin 0,05 ppm

đạt hiệu quả cao hơn các thí nghiệm khác. Môi trường MS có bổ sung NAA 0,1

ppm cho kết quả ra rễ đạt 100% .

Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2008). Nghiên cứu nhân giống cây Dầu

mè bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro phục vụ trồng rừng nguyên liệu sản xuất dầu

diesel sinh học. Môi trường cảm ứng tạo đa chồi tốt nhất (MI = MS + BA

0,1mg/l + IBA 0,01mg/l) với hệ số nhân chồi là 4 lần [20].

Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2009) đã nghiên cứu nhân giống Vù

hương bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và giâm hom. Tạo được quy trình

hoàn chỉnh cho nhân giống loài cây này [21].

Đỗ Tiến Phát (2009), nghiên cứu tái sinh thành công cây Thông nhựa từ

hai loại nguyên liệu phôi hạt chín và thân mầm, đã chọn được môi trường

M16 trong 4 môi trường thử nghiệm [18].

Ngoài ra nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô, tế bào còn được ứng

dụng để tạo ra giống cây sạch bệnh virus như: Khoai tây, Cà chua, Bưởi, Cam

Quýt; ứng dụng trong tạo cây trồng biến đổi gen như: Bông, Lúa, Ngô, Cà

chua, Đu đủ [2], [5], [17], [24], [29].

1.3.2. Các nghiên cứu về Thông caribê

1.3.2.1. Ở nước ngoài

Nhân giống hom Thông caribê đã được tiến hành rất sớm từ những

năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ 20 tại Queensland ở Australia. Hiện nay, tại cơ

sở nhân giống hom ở Gympie hàng năm đã đến 3 triệu cây hom để gây trồng

rừng Thông caribê [10].

Theo Henrique và cộng sự (2006) trong công trình nghiên cứu công bố

của mình, sử dụng hom với độ dài 4 - 6cm ở nồng độ 4000mg/l IBA với

100mg/l paclobutrazon, sau 60 ngày giâm cho tỉ lệ ra rễ của hom cao nhất

(95,31%) [31], các loài thông khác cũng đã được nhiều nhà khoa học quan

tâm nhân giống bằng hom từ sớm như: Stromquist và Hansen (1980) [44],

Silva (1985) [43], Oliveira (1989) [40]…đã công bố kết quả giâm hom trên

loài cây thông mình nghiên cứu với hiệu quả cao. Bên cạnh nhân giống bằng

hom, việc nhân giống Thông caribê bằng phương pháp nuôi cấy in vitro cũng

đã và đang được nhiều nhà khoa học ở một số phòng thí nghiệm lớn trên thế

giới quan tâm nghiên cứu và bước đầu thu được một số kết quả khả quan, tạo

tiền đề quan trọng cho nhân giống Thông caribê với số lượng lớn, chất lượng

cao phục vụ trồng rừng sản xuất đang có nhu cầu rất lớn.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là nền tảng của công nghệ sinh học thực

vật, nhân nhanh, tạo mô sẹo, lai đã đóng góp nhiều trong cải thiện giống cây

rừng. Nuôi cấy invitro đã được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu

như: Skidmore và cộng sự (1988), Akaneme và cộng sự (1997, 2008), Sturnia

và Nancy (1993), Ozkurt và cộng sự (2008).

Theo Skidmore và cộng sự (1988) đã tiến hành nuôi cấy chồi in vitro

Thông caribê trong môi trường lỏng cho kết quả phát triển nhanh hơn môi

trường rắn sau 4 tuần nuôi cấy [33].

Akaneme và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2 loại auxin

và 2 loại cytokinin tới tạo mô sẹo, cho thấy tỉ lệ 1mg/l NAA và 2mg/l BAP

mô sẹo Thông caribê phát triển tốt nhất trên môi trường AE (Arnold ADN

Eriksson, 1997) [48].

Sturnia và Nancy (1993) công tác tại Viện nghiên cứu KHTN, thuộc

đại học Philipin, tạo thành công mô sẹo Thông caribê trên môi trường MSM

bổ sung 8,9µM BA [45].

Ozkurt và cộng sự (2008) nghiên cứu nhân giống invitro loài thông

nigra J F. Anrold subsp đã chỉ ra môi trường Douglas-fir cotyledon revised

(DCR) có bổ sung 13,6 µM 2,4-D và 2,2µM BAP cho kết quả mẫu phôi hạt

tái sinh mô sẹo tốt nhất [52].

Qua các kết quả nghiên cứu về loài thông nói chung và Thông caribê

nói riêng được đưa ra ở trên, trong các môi trường nuôi cấy thường bổ sung

thêm cytokinin (BAP), đôi khi kết hợp với một auxin ở nồng độ nhất định.

Chồi thông sau đó được ra rễ trên môi trường chứa IBA cho tỉ lệ ra rễ tốt nhất,

loài Thông caribê đã được quan tâm nghiên cứu từ sớm ở nhiều nước, không

giống như những đối tượng cây rừng khác, việc tái sinh invitro bằng cách tạo

đa chồi hay tái sinh cây thông qua mô sẹo và phôi soma trên cây thông gặp rất

nhiều khó khăn, các nghiên cứu ở đây chủ yếu đều tạo nguồn vật liệu từ phôi

hạt. Nguyên nhân chủ yếu do tính chất ngủ nghỉ sâu của hạt cũng như khả

năng sinh trưởng rất chậm của loại cây này trong điều kiện in vitro. Nhưng

đến nay, đã có những nghiên cứu thành công nhất định ở rất nhiều nước trên

thế giới, hiện nay các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu đưa công

nghệ tạo giống, nhân nhanh giống áp dụng cho Thông caribê.

1.3.2.2.Ở trong nước

Ở Việt Nam, Thông caribê đã được chọn là loài cây trồng chủ yếu trong

nghề rừng [4], tuy vậy những nghiên cứu mới chỉ đi sâu về khảo nghiệm và

nhân giống bằng hom, cây trồng phải nhập hạt từ nước ngoài như: Australia

và các nước Đông Nam Á là chủ yếu. Những nghiên cứu về nhân giống bằng

công nghệ hiện đại còn rất ít và đạt những kết quả khiêm tốn chưa được ứng

dụng rộng rãi.

Qua một số tài liệu nghiên cứu trong nước về Thông caribê: Kết quả

khảo nghiệm cho thấy biến chủng hondurensis có sinh trưởng nhanh nhất ở

Việt Nam trên tất cả các vùng sinh thái đã trồng, trong đó Sông Mây - Đồng

Nai Thông caribê có sinh trưởng nhanh nhất, lượng tăng trưởng gấp từ 1,2 đến 3,5 lần so với ở các nơi được khảo nghiệp khác (30,6 dm3/cây/năm, ck4

năm) nhưng lại không có hạt hữu thụ [11].

Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Lâm Đồng cho biết, đã xây dựng

vườn vật liệu, nhà giâm hom và ứng dụng công nghệ giâm hom tiến tiến của

Ôxtrâylia để sản xuất cây giống của loài Thông caribê. Đây là một nhánh

nghiên cứu của Dự án Card 32/05 VIE, do Ôxtrâylia tài trợ triển khai trong 2

năm qua tại Việt Nam. Hom giống Thông caribê đã được trồng khảo nghiệm

trên diện tích 9 ha ở Đồng Nai cùng một số tỉnh Tây Nguyên cho kết quả tốt

(cây phát triển nhanh, ít sâu bệnh…).

Thông caribê được Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng - Viện

KHLNVN, nghiên cứu giâm hom từ năm 1995, đến năm 1999 đã đạt được tỉ

lệ ra rễ 93,3% (Lê Đình Khả và cộng sự, 2003) [10].

Theo tác giả Nguyễn Đình Hải và cộng sự (2007) báo cáo về khảo

nghiệm, đánh giá và áp dụng công nghệ tiên tiến cho phát triển rừng trồng

Thông caribê thì mô hình rừng trồng Thông caribê 15 năm tuổi đã đạt sản lượng 17 - 30m3/ha/năm [6].

Bên cạnh đó, Thông caribê cũng đã được một số tác giả tiến hành

nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô-tế bào nhằm tạo ra lượng

lớn cây giống chất lượng cao cung cấp cho nhu cầu trồng rừng sản xuất, như:

Tác giả Trần Trung Hiếu và cộng sự đã tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu

nhân nhanh giống Thông caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy

in vitro”, đã đưa ra một số kết luận có ý nghĩa: Thông caribê tái sinh tốt nhất

trên môi trường cơ bản SH (Schenk & Hildebrandt, năm 1973) có bổ sung

3mg/l BA và 0,5mg/l IBA [7].

Theo Phạm Thị Kim Thanh và Huỳnh Đức Nhân (2007) đã nghiên cứu

về nhân giống Thông caribê bằng kỹ thuật nuôi cấy In vitro, tỉ lệ mẫu sạch có

khả năng tái sinh rất thấp, chỉ đạt 8,5%, chồi Thông caribê nuôi cấy trong môi

trường MCM có bổ sung 0,5mg/l BAP có hệ số nhân thấp chỉ đạt 1,7 lần [23].

Như vậy, các kết quả nghiên cứu về nhân giống Thông caribê còn rất hạn chế,

không giống các đối tượng cây rừng khác như Bạch đàn, Keo, Tếch,

Hông...những nghiên cứu trên cây thông nói chung và cây Thông caribê nói

riêng mới chỉ là bước đầu và mang tính chất thăm dò. Một số kết quả công bố

ở trên chỉ dừng lại ở việc khảo sát nhân nhanh trong điều kiện in vitro và chưa

có được một quy trình tái sinh hoàn chỉnh, tuy nhiên những kết quả này là cơ

sở ban đầu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về nhân giống loài cây

này bằng công nghệ nuôi cấy in vitro.

Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội

dung cơ bản về nuôi cấy in vitro và sử dụng cây mô trong sản xuất. Các tác

giả đã chỉ ra một số môi trường nuôi cấy, tạo rễ…Những kết quả nghiên cứu

này làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo và được ứng dụng cho từng

loài. Đó cũng là những dẫn liệu và định hướng quan trọng cho đề tài này. Kết

quả nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nuôi cấy phôi vô tính và tạo chồi trực

tiếp từ các cơ quan của cây mầm. Mặc dù các công trình nghiên cứu ở các

nước trên thế giới đã giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới việc nuôi cấy in

vitro thông, nhưng ít có tác giả nào đề cập tới vấn đề tái sinh chồi Thông

caribê trực tiếp từ chồi non một cách đầy đủ và xây dựng quy trình cho loài

cây này. Do vậy, nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea

Morelet) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là bước đi cần thiết và rất

quan trọng để nhân nhanh giống tốt của Thông caribê.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Thông qua các công trình đã công bố, đối với Thông caribê thì vật liệu nhân

giống có hiệu quả nhất là chồi cành, ngoài ra phôi hạt chín cũng là nguồn vật liệu

thường được sử dụng. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn chồi cành

và hạt chín lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi, có mã số 12, thu thập từ Đại Lải

do trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc bộ cung cấp để làm vật

liệu nghiên cứu.

B

A

C

D

Hình 2.1: Vật liệu nghiên cứu được lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi

A: Cây Thông caribê trội 15 tuổi để thu vật liệu nghiên cứu

B: Chồi cành và quả lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi, có mã số 12

C: Hạt lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi, có mã số 12

D: Chồi cành được lấy từ cây hom 3 tuổi giâm cành từ cây trội 12 tuổi,

có mã số 12.

2.2. Thiết bị và hoá chất

- Thiết bị: thí nghiệm sử dụng các thiết bị, máy móc của Phòng Công

nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện KHCN Việt Nam và

PTN Giống và Công nghệ sinh học - Trường Đại học Lâm nghiệp, gồm: các

loại box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân phân tích, cân kỹ thuật,

tủ sấy, nồi khử trùng, máy nước cất một lần, hai lần, máy đo pH, máy khuấy

từ, dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng:

Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,…

- Hoá chất: Môi trường sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây Thông

caribê là môi trường M16 (Pullman và cộng sự, 2003), các hoá chất trong môi

trường M16 được thể hiện ở phần phụ lục; các loại vitamin (B1, B6, B12);

các chất điều hoà sinh trưởng: benzyl amino purine (BAP), kinetin (Kin),

indol- 3- butiric acid (IBA), naphthyl acetic acid (NAA) và gibberellic acid

(GA3)… được cung cấp bởi các hãng uy tín và chất lượng trên thế giới như

Sigma, Research oganic (Mỹ), Mark (Đức), Wako (Nhật).

2.3. Địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học - Viện khoa học

và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội và Trung tâm Giống

& Công nghệ sinh học - Viện Sinh thái rừng & Môi trường - Trường Đại học

Lâm nghiệp Việt Nam.

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo với các chế độ:

Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày.

Cường độ chiếu sáng: 2000-3000 lux. Nhiệt độ phòng nuôi: 250C ± 20C.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.4.1.1 Tạo mẫu Thông caribê sạch in vitro từ phôi hạt

Để nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ảnh hưởng thời gian của hoá chất khử trùng đến tỉ lệ mẫu sạch.

Với mục đích: đạt được tỉ lệ mẫu sạch cao nhất.

+ Thu mẫu và xử lý mẫu:

Hạt của quả chín thu hoạch được lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi,

trồng tại Đại Lải - Vĩnh Phúc. Sau khi thu về, quả được tách lấy hạt và cho

vào bình thuỷ tinh rửa sạch bằng cách lắc mạnh với nước xà phòng loãng

trong 20 phút, tiếp theo rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Mỗi công thức lặp 3

lần, dùng 150 hạt/1công thức

+ Hạt Thông caribê được khử trùng theo 3 công thức:

Công thức khử trùng 1: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút + Javen (60%)

thời gian 10 phút

Công thức khử trùng 2: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút + Javen (60%)

thời gian 15 phút

Công thức khử trùng 3: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút + Javen (60%)

thời gian 20 phút

Hạt Thông caribê được khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 3 phút,

loại bỏ cồn, rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó khử trùng tiếp

bằng Javen 60% bổ sung Tween 20 trong thời gian như các công thức trên rồi

loại bỏ Javen bằng nước cất vô trùng 5 lần, thấm khô hạt bằng giấy thấm vô

trùng sau đó đem tách bỏ lớp vỏ gỗ rồi mang khử trùng lần nữa và dùng panh,

dao, kéo vô trùng tách phôi hạt khỏi nội nhũ cho vào môi trường nuôi cấy M16.

Phôi sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng M16 có

bổ sung thêm 0,5mg/lNAA và 0,1mg/l GA3, 30g/l đường và 8g/l agar, để kích

thích hạt nảy mầm.

2.4.1.2. Tạo mẫu sạch Thông caribê in vitro từ chồi thực địa

- Thu mẫu và xử lý mẫu:

Chồi cành thông có chiều dài 4 - 5 cm được lấy ngoài thực địa mang về.

Sau khi thu về, sử dụng chổi rửa chuyên dụng, dùng nước xà phòng loãng để loại

bỏ sơ bộ nguồn nấm bệnh bám vào mẫu vật và cho vào bình thuỷ tinh rửa sạch

bằng cách lắc mạnh với nước xà phòng loãng trong 20 phút, tiếp theo rửa lại

bằng nước máy nhiều lần. Mỗi công thức lặp 3 lần, dùng 105 mẫu/1 công thức

- Chồi Thông caribê được khử trùng theo 3 công thức.

+ Công thức khử trùng 1: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút +

HgCl2(0,05%) thời gian 8 phút.

+ Công thức khử trùng 2: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút +

HgCl2(0,1%) thời gian 8 phút.

+ Công thức khử trùng 3: C2H5OH(70%) thời gian 3 phút +

HgCl2(0,2%) thời gian 8 phút.

Chồi cành Thông caribê được đưa vào tủ cấy vô trùng, rửa sạch bằng

nước cất vô trùng 3 lần, ngâm mẫu trong dung dịch cồn 70% trong thời gian 3

phút, loại bỏ cồn, rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó khử trùng

tiếp bằng HgCl2 ở các nồng độ như trên trong thời gian 8 phút, rồi loại bỏ

HgCl2, rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần, sau đó đem cắt bớt 2/3 chiều dài của

lá, cắt mẫu cấy có chiều dài 2 cm và cho vào môi trường nuôi cấy ½ M16.

Chồi cành sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng M16 có bổ

sung thêm 30g/l đường và 8g/l agar, pH = 5,8.

- Kích thích nảy chồi. Các mẫu sạch tạo được sau 4 tuần mang cấy

chuyển sang môi trường mới để kích thích mẫu nảy chồi. Thành phần môi

trường nuôi cấy: M16 + vitamin (B5) + 30g/l sucrose + 8g/l agar bổ sung

thêm 0,1mg/l GA3 [18], [21].

2.4.1.3. Tạo đa chồi Thông caribê từ đỉnh chồi cây mầm

Đỉnh chồi cây mầm được cắt ngắn có kích thước khoảng 0,5 cm, đặt lên

môi trường nuôi cấy (P1-4) với thành phần môi trường là M16 + vitamin (B5)

+ 30g/l sucrose + 8g/l agar + BAP, pH = 5,8. Mỗi công thức lặp 3 lần với

tổng số mẫu bố trí 90 mẫu/1 công thức. Trong đó nồng độ BAP thay đổi theo

bảng 2.1 sau:

Bảng 2.1. Công thức bố trí thí nghiệm tạo đa chồi từ đỉnh chồi cây mầm

Công thức thí nghiệm Công thức môi trường

M16 + 0 mg/l BAP ĐC

M16 + 7 mg/l BAP P1

M16 + 8 mg/l BAP P2

M16 + 9 mg/l BAP P3

M16 + 10 mg/l BAP P4

2.4.1.4. Tạo đa chồi Thông caribê từ đoạn thân cây mầm

Đoạn thân cây mầm được cắt ngắn có kích thước khoảng 0,5 cm, đặt lên

môi trường nuôi cấy (P4-8) với thành phần môi trường là M16 + vitamin (B5) +

30g/l sucrose + 8g/l agar + BAP, pH=5,8. Trong đó nồng độ BAP thay đổi theo

bảng 2.2. Mỗi công thức được lặp 3 lần với tổng số 90 mẫu/1 công thức.

Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm tạo đa chồi từ đoạn thân cây mầm

Công thức thí nghiệm Công thức môi trường

M16 + 0 mg/l BAP Đ/C

M16 + 2 mg/l BAP P5

M16 + 4 mg/l BAP P6

M16 + 6 mg/l BAP P7

M16 + 7,5 mg/l BAP P8

Sau 6 tuần nuôi cấy, xác định tỉ lệ mẫu tạo đa chồi, số chồi/mẫu, đánh

giá chất lượng chồi trên các công thức thí nghiệm.

2.4.1.5. Nhân nhanh Thông caribê từ đoạn thân cây mầm

Thân cây mầm Thông caribê được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài

từ 0,3 - 1cm. Cấy các đoạn thân mầm lên môi trường tạo đa chồi tốt nhất

nghiên cứu ở mục trên, kích thước các đoạn thân được thay đổi theo bảng 2.3.

Bảng 2.3. Công thức bố trí thí nghiệm thay đổi

theo kích thước trên môi trường P6

Công thức thí nghiệm Kích thước các đoạn thân

0,3 cm P6

0,5 cm P6

0,7 cm P6

1,0 cm P6

2.4.1.6. Thử nghiệm tạo rễ in vitro cây Thông caribê

Sau khi các chồi Thông caribê sinh trưởng tốt trên môi trường thí

nghiệm, đủ tiêu chuẩn, chiều cao và độ mập của chồi... cây in vitro có kích

thước từ 1,5 cm trở lên được cắt và cấy lên môi trường tạo rễ SR: ½ M16 +

30g/l sucrose + 9g/l agar; bổ sung các nồng độ khác nhau của IBA như bảng

2.4.

Bảng 2.4. Công thức thí nghiệm tạo đa chồi từ đoạn thân cây mầm

Công thức thí nghiệm Công thức môi trường

M16 + 0 mg/l IBA Đ/C

M16 + 0,5 mg/l IBA PR1

M16 + 1,0 mg/l IBA PR2

M16 + 1,5 mg/l IBA PR3

M16 + 2,0 mg/l IBA PR4

2.4.2. Phương pháp thu thập, xử lý đánh giá kết quả

Các chỉ tiêu theo dõi:

Tổng số mẫu bị nhiễm

X 100 (%

Tỉ lệ mẫu nhiễm =

Tổng số mẫu nuôi cấy

Tỉ lệ mẫu nhiễm

Tổng số mẫu sạch tạo được

X 100 (%)

Tổng số mẫu nuôi cấy

Tỉ lệ mẫu sạch

Tỉ lệ mẫu sạch = Tỉ lệ mẫu nảy mầm

Tổng số mẫu nảy mầm

X 100 (%)

Tỉ lệ mẫu nảy mầm =

Tổng số mẫu nuôi cấy

Tổng số chồi

X 100 (%)

Số chồi TB/mẫu =

Tổng số mẫu nuôi cấy

Số chồi trung bình/mẫu

Tổng số mẫu tạo chồi Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi = X 100 (%) Tổng số mẫu nuôi cấy

X n

 Trung bình mẫu



Q x (  n



(



x i

Sai tiêu chuẩn mẫu S

Trong đó:



1 

xi là giá trị quan sát thứ i

Khoảng sai dị đảm bảo (tối thiểu) (Least Significant Diference)

LSD = Sed.t05(k)

Trong đó Sed là sai tiêu chuẩn của các trung bình mẫu

t05 (k) giá trị tra bảng ở mức xác suất có ý nghĩa 5% với bậc tự do k

Trong bảng phân tích phương sai Sig: là xác xuất của tiêu chuẩn F để

kiểm tra giả thuyết H0

Nếu Sig > 0,05: không có sự sai khác giữa các mẫu so sánh

Nếu Sig < 0,05: giữa các mẫu so sánh có sự sai khác.

Sau đó kết quả được thể hiện bằng các biểu phù hợp và sử dụng phần

mềm Excel và SPSS 15.0 để xử lý số liệu. Các bước tiến hành nghiên cứu

trong luận văn được mô phỏng theo sơ đồ 01.

Cây trội Thông caribê

Chồi cành Hạt

Khử trùng Javen

Khử trùng HgCl2

Tạo cây con

Nhân nhanh chồi

Kéo dài chồi Tạo rễ

Sơ đồ 01. Sơ đồ thí nghiệm nhân giống in vitro cây Thông caribê

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro cây Thông caribê

3.1.1. Tạo nguồn mẫu sạch từ phôi hạt

Đây là giai đoạn đầu tiên, có vai trò quan trọng nhằm cung cấp nguyên liệu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống in vitro. Yêu cầu của giai đoạn này là tỉ lệ phôi hạt nẩy mầm cao và tỉ lệ mẫu sạch cao. Để đáp ứng được yêu cầu trên thì các mẫu phôi hạt lấy từ ngoài môi trường tự nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi trường nuôi cấy.

Tạo được mẫu sạch là yếu tố đầu tiên quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống. Là công việc rất khó: cần thực hiện thao tác nhanh, khéo léo, cẩn thận, tỉ mỉ, chính xác… nhằm huỷ diệt tuyệt đối các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn…) bằng các hoá chất, nhưng vẫn phải giữ được sức sống cho mẫu cấy.

Trong nuôi cấy in vitro, người ta thường sử dụng các loại hoá chất như: HgCl2, Ca(OCl2)2 và NaOCl để khử trùng mẫu cấy tuỳ từng loài cây nuôi cấy mà sử dụng các loại hoá chất với nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau nhằm đem lại hiệu quả cao nhất. Hạt Thông caribê khi lấy về được tách bỏ lớp vỏ gỗ bên ngoài và mang khử trùng bằng Javen (60%), chúng tôi dùng Javen ở nồng độ 60% so với lượng Javen trong chai của công ty hoá chất Lâm Thao sản xuất. Kết quả này được kế thừa từ tài liệu đã công bố của Nguyễn Văn Phong và cộng sự, năm 2009, dùng Javen trong khử trùng hạt cây Cọc dào [20] và trong phương pháp khử trùng hạt Thông nhựa của Đỗ Tiến Phát [18], Javen ở nồng độ này phù hợp cho khử trùng hạt, ít làm phôi hạt bị chết nhưng vẫn đảm bảo được khả năng diệt nguồn nấm bệnh của hạt mang từ bên ngoài vào với thời gian khử trùng như trình bày ở phần phương pháp (mục 2.4.1) rồi tách phôi cấy trên môi trường nuôi cấy M16 có các phần dinh dưỡng như trong phần phụ lục và bổ sung các hoá chất như mục 2.4.1.

Để tìm hiểu ảnh hưởng của Javen ở các thời gian khử trùng khác nhau đến mẫu cấy phôi hạt Thông caribê, tìm ra công thức khử trùng tốt nhất, thí nghiệm được tiến hành như mục 2.4.1.1 và thu được kết quả như bảng 3.1.

Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy chất khử trùng Javen (60%) với thời gian khử trùng khác nhau đã đem lại hiệu quả khác nhau về các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu nhiễm; tỉ lệ mẫu sạch; tỉ lệ mẫu nẩy mầm.

Bảng 3.1. Tác dụng của Javen (60%) ở các thời gian khác nhau đến kết quả tạo mẫu sạch từ hạt

Số mẫu khử trùng (mẫu) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ mẫu phôi nảy mầm (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Thời gian khử trùng (phút)

10 150 81,3 78,0 18,7

15 150 96,0 82,7 4,0

20 150 96,7 73,3 3,3

ỉ l ệ (

)

Thời gian (phút)

Qua bảng trên ta thấy: Sử dụng Javen 60% cho thấy khi thời gian khử trùng tăng lên mẫu nhiễm giảm nhưng mẫu chết tăng. Cụ thể tương ứng với các thời gian khử trùng 10 phút, 15 phút, 20 phút có các tỉ lệ mẫu nhiễm là 18,7%, 4%, 3,3% còn tỉ lệ mẫu chết là 3,3%, 13,3% và 23,4%. Đồng thời khả năng nẩy mầm của phôi cũng chịu ảnh hưởng của thời gian khử trùng. Khi thời gian khử trùng tăng lên khả năng nảy mầm của phôi giảm. Dung dịch Javen 60% không những diệt nấm, vi khuẩn mà còn ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng nảy mầm của phôi.

Biểu đồ 3.1. Tác dụng của Javen (60%) tới tỉ lệ tạo mẫu sạch và nảy mầm của phôi hạt

Biểu đồ 3.1 cho thấy khử trùng bằng dung dịch Javen 60% với thời

gian 15 phút và 20 phút có tỉ lệ mẫu sạch khác nhau không đáng kể, nhưng

khử trùng trong 15 phút tỉ lệ mẫu nảy mầm cao hơn so với thời gian khử trùng

20 phút, với tỉ lệ tương ứng là: mẫu sạch 96% và 96,7%; mẫu nảy mầm

82,7% và 73,3%. Còn đối với thời gian khử trùng 10 phút thì tỉ lệ mẫu sạch

thu được tương đối cao (81,3%), nhưng có tỉ lệ mẫu nhiễm cao (18,7%). Vì

vậy, trong ba công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt Thông

caribê, công thức khử trùng dùng Javen 60% với thời gian 15 phút là tốt nhất,

chất lượng thân mầm tốt đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho các bước nghiên cứu tiếp

B: Phôi hạt Thông caribê

A: Hạt Thông caribê đã được bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài

C: Phôi hạt chín nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy

D: Cây in vitro sinh trưởng tốt sau 6 tuần nuôi cấy

theo (hình 3.1 - D), với tỉ lệ mẫu sạch 96% và tỉ lệ nảy mầm 82,7%.

Hình 3.1. Nguồn mẫu sạch tạo được từ phôi hạt

A

B

3.1.2. Tạo nguồn mẫu sạch từ chồi cành

Tạo nguồn mẫu sạch in vitro từ chồi cành là công đoạn khá phức tạp,

khó khăn hơn so với tạo mẫu sạch từ phôi hạt nhưng nếu tạo được nguồn mẫu

sạch từ chồi cành của những cây trội sẽ có ý nghĩa hơn so với tạo nguồn mẫu

sạch từ phôi hạt trong quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro. Vì các cây con

được tạo ra từ chồi cành lấy từ cây trội nên sẽ có phẩm chất di truyền tốt như

cây mẹ, cây sinh trưởng, phát triển đồng đều trong cùng một điều kiện sinh

thái gây trồng. Còn nhân giống in vitro từ nguồn mẫu ban đầu là phôi hạt sẽ

không mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên, đối với những loài cây nguồn hạt

giống không dồi dào, tỉ lệ hạt nảy mầm thấp, việc tạo mẫu sạch từ chồi gặp

nhiều khó khăn thì phương thức tạo mẫu sạch từ phôi hạt cũng có ý nghĩa. Để

xây dựng thành công một quy trình nhân giống in vitro cho một loài cây nào

đó, cần thiết phải tạo được một lượng mẫu sạch đáng kể để tiến hành thiết kế

các thí nghiệm. Vì vậy, để nhanh chóng đạt được thành công, người ta thường

tạo nguồn mẫu sạch tạm thời từ phôi hạt để nhằm tối ưu hoá quy trình.

Để tạo mẫu sạch từ chồi cành Thông caribê, khi mang chồi cành từ cây

hom Thông caribê 3 tuổi, được nhân giống từ cây trội có mã số 12 tại Đại Lải

- Vĩnh Phúc, đựng vào hộp giữ ẩm sau đó được thao tác và khử trùng như

trình bày ở mục 2.4.1.2. Sau 5 tháng theo dõi, thống kê và xử lý số liệu, kết

quả thu được trình bày như ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Tác dụng HgCl2 ở các nồng độ khác nhau đến kết quả tạo mẫu

sạch từ chồi thực địa

Số mẫu khử trùng (mẫu) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)

Nồng độ khử trùng (%)

105 48,6 5,3 51,4 0,05

105 68,6 11,3 31,4 0,1

105 71,4 14,7 28,6 0,2

Qua bảng 3.2 cho thấy: ở thời gian 8 phút khử trùng, sử dụng HgCl2 ở

các nồng độ khử trùng tăng, tỉ lệ mẫu nhiễm giảm và tỉ lệ mẫu chết tăng rõ rệt.

Tương ứng ở các nồng độ 0,05%, 0,1% và 0,2%, tỉ lệ mẫu nhiễm lần lượt là

51,4%, 31,4% và 28,6%. Đồng thời, thời gian khử trùng cũng ảnh hưởng trực

ỉ l ệ (

)

Nồng độ HgCl2 (%)

tiếp tới khả năng nảy mầm của chồi, được thể hiện trực quan qua biểu đồ 3.2.

Biểu đồ 3.2. Tác dụng HgCl2 tới tỉ lệ tạo mẫu sạch từ chồi cành

Biểu đồ 3.2 cho thấy với nồng độ khử trùng 0,2% tỉ lệ mẫu sạch tạo ra

trong thời gian khử trùng 8 phút là 71,4% nhưng tỉ lệ chết cao là 14,7%.

Nguyên nhân do HgCl2 là một chất cực độc đối với mọi tế bào sống, ở nồng

độ cao, muối HgCl2 có thể ngấm nhanh vào trong tế bào, gây độc làm cho tế

bào mẫu chồi bị chết hoặc mất khả năng nảy chồi. Mặc dù vậy, nhưng tỉ lệ

mẫu chết này thấp hơn rất nhiều so với công thức khử trùng tốt nhất H2O2 5%

trong 20 phút là 10,1% (Phạm Thi Kim Thanh, 2007) [23], đây là thành công

mới của luận văn.

Từ hiệu quả khử trùng chồi bằng HgCl2 ở các nồng độ khác nhau, nhận

thấy sử dụng HgCl2 nồng độ 0,1% có hiệu quả cao hơn so với sử dụng ở các

nồng độ 0,05% và 0,2%. Với nồng độ khử trùng 0,1% cho tỉ lệ mẫu sạch

(68,6%) có khả năng nẩy mầm tốt (hình 3.2-B), mẫu có triển vọng nảy chồi

mới cao hơn các nồng độ khác. Đây là nguồn vật liệu rất tốt, đầy ý nghĩa

trong nuôi cấy in vitro để sau này ứng dụng công thức tối ưu của bước nghiên

cứu sau, nhằm nhân nhanh nguồn vật liệu này lên.

B

A

Hình 3.2. Tạo mẫu sạch từ chồi cành

A: Chồi ngọn từ thực địa

B: Mẫu sạch tạo được từ chồi ngọn

3.2. Nghiên cứu tạo đa chồi trong điều kiện in vitro

Kết quả tạo mẫu sạch từ chồi cành sau 6 tháng mới bắt đầu xuất hiện nảy

chồi, các chồi này phát triển tốt nhưng sinh trưởng chậm. Trong giới hạn thời

gian của luận văn không cho phép nên chúng tôi chưa sử dụng nguồn chồi mới

này cho các nghiên cứu tiếp, nhưng kết quả nghiên cứu vẫn đang được theo

dõi, ở đây chúng tôi dùng nguồn cây mầm nảy từ phôi hạt để nghiên cứu tìm

công thức môi trường phù hợp nhất cho tạo đa chồi, sau đó tiếp tục kiểm

nghiệm lại nguồn chồi tái sinh từ chồi càch trên công thức môi trường tốt nhất

đó.

3.2.1. Tác dụng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo đa chồi từ đỉnh

chồi cây mầm in vitro

Trong nhân giống in vitro, môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các

chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trong cả quá trình. Do các mẫu vật khi bị

tách rời khỏi cây mẹ không còn khả năng tự dưỡng, nếu không tiếp tục cung

cấp chất dinh dưỡng thì chúng sẽ bị chết. Để tồn tại, phân hoá và tiếp tục phát

triển trong điều kiện in vitro, chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh

dưỡng cần thiết và phù hợp cho sự sống của mô. Khả năng tái sinh và phát

triển của chồi trong quá trình nuôi cấy in vitro là nhân tố quan trọng quyết

định sự thành bại và tốc độ của việc ứng dụng quy trình nhân giống in vitro

cho một đối tượng cụ thể, tuy nhiên khả năng này không những phụ thuộc vào

từng loài, từng dòng và giai đoạn tuổi của từng đối tượng cụ thể mà còn phụ

thuộc vào môi trường nuôi cấy thích hợp.

Hệ số nhân chồi của cây Thông caribê trong quá trình nuôi cấy in vitro

phụ thuộc nhiều vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng khoáng, các chất điều

hoà sinh trưởng… Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi

trường thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi. Đây là giai đoạn quyết định

hiệu quả của kỹ thuật nhân giống. Giai đoạn này, các thử nghiệm được tiến

hành để xác định được ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng, tác

dụng của chất điều hoà sinh trưởng lên quá trình nhân chồi thông in vitro.

Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng gây ảnh hưởng

chọn lọc đến các gen, kích thích sự phát sinh hình thái và phân hoá theo

những hướng khác nhau của các tế bào trong nuôi cấy in vitro [47]. BAP là

chất điều hoà sinh trưởng có ảnh hưởng đến cảm ứng tạo mô sẹo, phôi soma

của cây Thông caribê.

BAP là chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp nhân tạo thuộc nhóm

cytokinin, có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài

thời gian hoạt động của mô phân sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào.

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BAP có vai trò rất quan trọng trong việc

kích thích mạnh mẽ sự hình thành các chồi non, quyết định hệ số nhân và chất

lượng chồi. Theo báo cáo của Joarder và cộng sự (1993), BAP thuộc nhóm

cytokinin rất tốt cho việc phát sinh chồi cây neem (Azadirachta indica Juss.

Meliaceae). BAP tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh

chồi ở cây gỗ [46], [51].

Phôi hạt sau khi nuôi cấy 8 tuần trên môi trường M16 phát triển thành cây

mầm (hình 3.1 - D) . Các đỉnh chồi cây mầm được cắt với kích thước 0,5 cm cấy

trên các công thức môi trường cảm ứng tạo đa chồi từ P1, P2, P3 và P4 với các chất

hoá học trong môi trường như trình bày ở mục 2.4.1.3. Sau đó chúng tôi tiến hành

quan sát, đánh giá, thu thập và xử lý số liệu. Kết quả thu được trình bày như ở

bảng 3.3.

Bảng 3.3: Tác dụng của BAP đến khả năng tạo đa chồi

từ đỉnh chồi cây mầm

Công thức Số mẫu cấy (mẫu) Tỉ lệ tạo đa chồi (%) Nồng độ (mg/l) Số chồi TB/mẫu (chồi)

ĐC 0 90 0,0 1,2 ± 0,40

7 90 77,8 3,8 ± 0,40

8 6,5 ± 0,33 86,7 90

5,7 ± 0,51 83,3 90 9

4,3 ± 0,40 78,9 90 10

P1 P2 P3 P4 Kết quả từ bảng trên cho thấy: việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy

chất điều hoà sinh trưởng BAP đã thể hiện rõ hiệu quả cảm ứng tạo đa chồi. Ở

công thức môi trường đối chứng không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, có

hệ số nhân chồi thấp nhất là 1,2 lần, còn trên các công thức môi trường có bổ

sung chất điều hoà sinh trưởng đã cho kết quả cảm ứng tạo đa chồi với các tỉ

lệ và tính chất chồi khác nhau. Ở các công thức thí nghiệm với cùng một loại

chất điều hoà sinh trưởng nhưng có nồng độ và tỉ lệ các chất khác nhau cũng

ỉ l ệ (

)

Nồng độ BAP (mg/l)

cho kết quả tạo đa chồi khác nhau.

Biểu đồ 3.3. Tác dụng của BAP tới tỉ lệ tạo đa chồi và số chồi TB/mẫu

Từ bảng 3.3 và biểu đồ 3.3, ta thấy trên các môi trường bổ sung BAP ở

nồng độ 9 mg/l và 10 mg/l tương ứng với các công thức P3, P4 có tỉ lệ mẫu

hình thành đa chồi khá cao, tương ứng là 83,3% và 78,9%. Song nhìn chung

chất lượng chồi không đồng đều, hiện tượng mô sẹo hoá xảy ra mạnh nên hệ

số chồi tái sinh được có xu hướng giảm dần (5,7 ± 0,51; 4,3 ± 0,40). Sự phát

triển của chồi ở công thức môi trường P4 bổ sung 10 mg/l BAP có tỉ lệ mẫu

tạo chồi khá cao song lại có xu hướng tái sinh chồi nách và chồi phụ mạnh,

tạo nhiều chồi nhỏ bao quanh thân chồi đỉnh, khiến cho sự phát triển của chồi

theo hướng kéo dài chồi bị hạn chế và có hệ số nhân chồi là 4.3 ± 0,4 lần

Mặt khác, ở công thức này hiện tượng thuỷ tinh hoá diễn ra khá mạnh,

hình thành khá nhiều mô sẹo xốp, gây ảnh hưởng lớn đến sự hình thành chồi

và chất lượng chồi (chồi phát sinh yếu ớt, không đồng đều và không có ý

nghĩa) và có xuất hiện mẫu thí nghiệm bị chết, có thể nồng độ BAP cao không

phù hợp với sự phát triển của đỉnh chồi. Khi đó ở công thức đối chứng (ĐC)

nhanh thích ứng với môi trường mới, chồi xanh nhưng hầu như không có

phân hoá tạo chồi mới, được thể hiện qua hình 3.3-A. Ở công thức P2 có bổ

sung 8 mg/l BAP có tỉ lệ mẫu tạo đa chồi cao nhất (86,7%) và hệ số nhân chồi

cao nhất 6,5 lần (hình 3.3-B ), mẫu không bị chết.

Kết quả kiểm tra phân tích phương sai trong SPSS, cho thấy xác suất

Ftính < 0,05 (phụ lục) nghĩa là nồng độ BAP ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả thí

nghiệm. Từ đây, lần nữa khẳng định được công thức P2 cho kết quả tạo đa

chồi tốt nhất, với hệ số nhân là: 6,5 ± 0,33 lần.

B A

Hình 3.3. Tạo đa chồi từ đỉnh chồi cây mầm

A: Cụm chồi tạo được trên môi trường P1

B: Cụm chồi tạo được trên môi trường P2

3.2.2. Tác dụng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn

thân cây in vitro

Để nghiên cứu khả năng cảm ứng đa chồi từ đoạn thân mầm, chúng tôi

tiến hành bố trí các công thức thí nghiệm như đối với cảm ứng đa chồi từ đỉnh

chồi, với chất điều hoà sinh trưởng BAP ở các nồng độ khác nhau.

Các đoạn thân mầm được cắt thành các đoạn nhỏ với kích thước 0,5 cm

và đặt lên môi trường cảm ứng tái sinh chồi với chất điều hoà sinh trưởng

BAP ở các nồng độ khác nhau. Sau 6 tuần nuôi cấy, quan sát, thu thập và xử

lý số liệu, kết quả thu được ghi ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Tác dụng của BAP đến khả năng tạo đa chồi

từ đoạn thân cây mầm

Công thức Nồng độ Số mẫu cấy Tỉ lệ tạo đa Số chồi

thí nghiệm (mg/l) (mẫu) chồi (%) TB/mẫu

(chồi)

ĐC 0 90 1,2 ± 0,02 0,0

P5 2 90 3,9 ± 0,04 77,8

P6 4 90 5,2 ± 0,05 88,9

P7 6 90 4,6 ± 0,04 78,9

P8 7,5 90 3,4 ± 0,06 76,7

Khác với đỉnh chồi, đoạn thân mầm Thông caribê cảm ứng với BAP

chậm hơn. Sau 2 tuần đầu nuôi cấy, đa số các đoạn thân mầm cảm ứng mô

sẹo hoá rất mạnh, sau đó hình thành chồi, số lượng chồi tạo ra cao. Sau 6 tuần

nuôi cấy, quan sát thấy hầu hết các mô sẹo hình thành chồi trên các công thức

môi trường thí nghiệm từ P5 đến P8 với tỉ lệ mẫu tạo đa chồi từ 76,7 – 88,9%,

còn ngược lại ở công thức đối chứng (không bổ sung chất điều hoà sinh

trưởng), tỉ lệ mẫu tạo đa chồi 0%. Ở các công thức môi trường P7 và P8 có

một số mẫu cấy bị chết nhiều các mô mới hình thành, nguyên nhân là khi

đoạn thân mầm non, cảm ứng với nồng độ BAP cao nên đã bị chết. Màu xanh

chồi nhạt hơn, do bị kích thích chồi quá mạnh, và số chồi hình thành mới có

xu hướng giảm dần.

Kết quả ở bảng 3.4 cũng cho thấy rằng, đối với đoạn thân mầm khi nuôi

cấy trên môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng ít có khả năng tái sinh

chồi, với tỉ lệ rất thấp 1,2 lần. Khi sử dụng đơn lẻ BAP từ nồng độ 2 mg/l đến

8 mg/l cho tạo đa chồi từ thân mầm kết quả cho thấy ở nồng độ 4 mg/l có tỉ lệ

tái sinh chồi đạt 5,2 ± 0,05 lần cao hơn so với các nồng độ khác. Đối với

nghiên cứu gần đây nhất về Thông caribê đã công bố thì tỉ lệ nhân chồi là 1,7

lần trên môi trường ¼ MCM bổ sung 0,5 mg/l BAP (Phạm Thị Kim Thanh,

2007), cho thấy tỉ lệ tái sinh chồi của luận văn này cao hơn 3,5 lần. Điều này

chứng tỏ rằng BAP ở nồng độ 4m/l phù hợp với tạo đa chồi đoạn thân cây

mầm Thông caribê. Kết quả này dùng toán thống kê để kiểm tra như trong

phụ biểu, với xác suất của Ftính < 0,05 cho thấy các công thức nghiên cứu có

ỉ l ệ (

)

Nồng độ BAP (mg/l)

sự sai khác rõ rệt với 3 lần lặp, kết quả thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95%.

Biểu đồ 3.4. Tác dụng của BAP tới tỉ lệ tạo đa chồi và số chồi

TB/mẫu từ đoạn thân mầm

So sánh kết quả cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn thân mầm và chồi đỉnh cây mầm cho thấy: Ở các công thức môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng của đỉnh chồi và đoạn thân mầm đều không có khả năng tạo đa chồi,

(tỉ lệ mẫu tạo được đa chồi 0,0%). Nhưng ngược lại, trong các công thức môi trường có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng BAP, tỉ lệ tái sinh chồi từ các đoạn thân mầm thấp hơn so với tạo đa chồi từ đỉnh chồi cây mầm.

Thực tế khi nghiên cứu cho thấy, sau khoảng 4 tuần nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo đa chồi, các đỉnh chồi cây mầm hầu hết đã tạo đa chồi, còn các đoạn thân mầm ở công thức có nồng độ BAP cao 7,5 mg/l các mô sẹo chưa tạo chồi, chỉ có lác đác một số ít có chồi đơn. Mặt khác, đa số các đoạn thân mầm đều tạo mô sẹo có màu nâu vàng, hoặc tạo mô sẹo xốp có màu trắng không có khả năng hình thành chồi (hình 3.4-A).

Như vậy, trong môi trường có các chất điều hoà sinh trưởng, Môi trường P6 có khả năng cảm ứng tạo đa chồi và có tỉ lệ tạo chồi cao hơn so với khả năng tạo đa chồi từ các công thức nghiên cứu. Công thức môi trường P6: M16 + vitamin (B5) + 4mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, là môi trường thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo đa chồi cây mầm Thông caribê in vitro (hình 3.4-B).

P6

P5

P7

P8

B ĐC A

Hình 3.4. Tác dụng của BAP tới tạo đa chồi từ đoạn thân cây mầm

A: Đoạn thân cây mầm (0,5 cm) cấy trên các công thức môi trường sau 4 tuần

B: Đoạn thân cây mầm (0,5 cm) cấy trên môi trường P6 sau 6 tuần nuôi cấy

3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước đoạn thân cây in

vitro Thông caribê tới việc tạo đa chồi

Nhân nhanh chồi là bước quyết định hiệu quả của cả quá trình nhân

giống. Do đây là bước tạo ra số lượng lớn nguồn vật liệu in vitro để tạo cây

con hoàn chỉnh. Sau khi nghiên cứu tìm ra được công thức môi trường tạo đa

chồi tốt nhất phần trên (P6), để tối ưu hoá quy trình tạo đa chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên ảnh hưởng của kích thước đoạn thân ở các kích thước: 0,3; 0,5;

0,7 và 1,0 (cm). Sau 6 tuần nuôi cấy dưới dàn đèn, chúng tôi tiến hành thu

thập và phân tích số liệu kết quả thu được trình bày như ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kích thước đoạn thân đến hệ số nhân chồi

Kích thước đoạn thân mầm (cm) Số mẫu cấy (mẫu) Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi (%) Số chồi TB/mẫu (lần)

0,3 0,5 0,7 90 90 90 75,6 88,9 88,9 3,0 ± 0,04 5,5 ± 0,06 6,1 ± 05

1,0 90 90,0 7,2 ± 0,06

Đây là bước nghiên cứu tối ưu hoá kỹ thuật nuôi cấy in vitro Thông

caribê, qua các công trình trong và ngoài nước đã công bố, chúng tôi chưa

thấy tác giả nào đề cập đến công đoạn này, ở nước ta các công trình nghiên

cứu của Trần Trung Hiếu và cộng sự [7], Phạm Thị Kim Thanh và Huỳnh

Đức Nhân [23] đều không đưa ra cụ thể kích thước đoạn chồi và thân cây

Thông in vitro trong các thí nghiệm của mình. Kích thước đoạn thân cây in

vitro ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thí nghiệm như: hệ số nhân chồi, tỉ lệ tạo

đa chồi… khi nghiên cứu kích thước đoạn thân sẽ giúp người sản xuất cây

giống in vitro tạo được số lượng nhiều cây mô hơn trong cùng một thời gian

cấy chuyển, từ đây mang lại năng suất lao động của những người sản xuất cây

mô cao hơn.

Từ kết quả số liệu ở bảng trên cho chúng ta thấy: ở tất cả các công thức

đều cho hệ số nhân và tỉ lệ mẫu tạo đa chồi tăng dần, tỉ lệ thuận với kích

thước đoạn thân mầm tăng lên, kích thước mẫu cấy từ 0,3; 0,5; 0,7 và 1,0

(cm) có hệ số nhân tương ứng là 3,3 lần; 5,5 lần; 6,1 lần; 7,2 lần với tỉ lệ mẫu

tạo đa chồi cao tương ứng là 75,6; 88,9; 88,9; 90%. Độ dài đoạn thân 0,5 cm

có hệ số nhân gấp 1,5 lần đoạn thân 0,3 cm, khi đó độ dài đoạn thân lớn hơn

1,7 lần. Vì vậy, hiệu quả sử dụng kích thước đoạn 0,5 cm có hệ số nhân chồi

cao hơn kích thước đoạn thân mầm 0,3 cm. Đối với các đoạn có kích thước

0,7 cm và 1,0 cm có độ dài lớn hơn 0,5 cm tương ứng là 1,4 lần; 2 lần nhưng

lại có hệ số nhân chồi lớn hơn là 1,1 lần và 1,3 lần. Điều này chứng minh cho

ta thấy là sử dụng đoạn 0,5 cm (hình 3.5-B) dùng để nhân nhanh là tốt nhất,

hơn thế nữa khi sử dụng đoạn 0,5 cm dễ làm, thao tác nhanh…làm rút ngắn

được thời gian cắt mẫu mà hiệu quả nhân chồi lại cao nhất, bên cạnh đó tỉ lệ

tạo đa chồi biến động không lớn. Nhằm tăng độ tin cậy của kết quả nghiên

cứu, chúng tôi tiến hành phân tích phương sai như trong phụ biểu, với xác

suất của Ftính < 0,05 cho thấy các công thức nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt với 3 lần lặp, kết quả thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95%. Điều này được thể

H ệ s ố n h â n c h ồ i

Kích thước đoạn thân mầm (cm)

hiện trực quan hơn qua biểu đồ dưới đây.

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng kích thước đoạn thân mầm tới số chồi TB/mẫu

B

A

Hình 3.5. Tạo đa chồi từ kích thước thân cây mầm trên môi trường P6

A: Kích thước 0, 3 cm B: Kích thước 0,5 cm

3.3. Kết quả tạo rễ in vitro cây Thông caribê

Giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (cây có đầy đủ thân, lá và rễ) là một

giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro, cây con có bộ rễ

khoẻ mạnh sẽ có khả năng sống và sinh trưởng tốt khi đưa từ điều kiện phòng

thí nghiệm ra trồng ở nhà lưới. Nhiều quy trình nhân giống các loài cây lâm

nghiệp đã không thành công do chồi nuôi cấy in vitro không có khả năng ra rễ

hoặc tỉ lệ ra rễ rất thấp (cây Dó trầm, cây Bách xanh, Pơmu, Trẩu...). Do vậy,

chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm môi trường tạo rễ in vitro cây con Thông

caribê hoàn chỉnh.

Trong quá trình nuôi cấy, các chồi hình thành có thể phát sinh rễ tự

nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải được cấy chuyển sang một

môi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số loài, các chồi có thể sẽ tạo rễ

khi được chuyển trực tiếp ra đất. Môi trường kích thích tạo rễ thường bổ sung

các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin.

Auxin là nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dung thường

xuyên trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các

thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của

mô sẹo, huyền phù tế bào, điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là phát

sinh rễ.

IBA là chất kích thích sinh trưởng thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô với mục đích kích thích tạo rễ, đã được nhiều tác giả sử dụng trong tạo rễ

in vitro cây thông [48], [52]. Để nghiên cứu vai trò của IBA trong việc cảm

ứng tạo rễ của chồi Thông caribê, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các công

thức môi trường có bổ sung IBA với nồng độ khác nhau.

Chồi Thông caribê khi đạt chiều dài từ 1,5 cm trở lên (hình 3.6-A) sẽ

được cấy chuyển sang môi trường tiền cảm ứng ra rễ M16 có bổ sung thêm

IBA ở các nồng độ từ 1,0 mg/l – 2 mg/l. Thời gian tiền cảm ứng tạo rễ từ 3 - 4

ngày, sau đó chồi sẽ được cấy chuyển sang môi trường dinh dưỡng ½ M16 +

vitamin (B5) không có chất điều hoà sinh trưởng, nuôi tiếp trong thời gian 6

tuần, thu thập và phân tích số liệu kết quả thu được thể hiện như ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IBA tới tỉ lệ ra rễ Thông caribê

Công thức IBA (mg/l) Chất lượng rễ

0 0,5 1,0 1,5 2,0 Tỉ lệ tạo rễ (%) 0,0 31,1 65,6 55,6 43,3 Số rễ trung bình (rễ) - 1,0 ± 0,12 1,0 ± 0,07 1,7 ± 0,05 2,0 ± 0,05 - +++ +++ + + ĐC PR1 PR2 PR3 PR4

Ghi chú: (+) Rễ phình to, đen; (+++) Rễ phát triển nhanh, dài, màu trắng, phân nhiều rễ cấp 1. Quan sát tỉ lệ hình thành rễ của chồi sau thời gian 6 tuần nuôi cấy,

chúng tôi thấy rằng trong công thức (ĐC) không bổ sung IBA, không thấy

hình thành rễ, còn ở các công thức thí nghiệm bổ sung thêm IBA có tỉ lệ chồi

Thông caribê ra rễ đạt từ 31,1 đến 65,6%, cao nhất là công thức PR2 (1mg/l)

và thấp nhất là công thức môi trường PR1 (0,5 mg/l), tỉ lệ cây ra rễ giảm

xuống do xuất hiện của các dạng mô sẹo nhỏ, rễ phình to, đen và chậm kéo

dài. Khi tăng dần nồng độ IBA bổ sung vào môi trường tiền cảm ứng ra rễ thì

số rễ hình thành từ chồi in vitro cũng tăng dần lên và cho số lượng rễ cao nhất

ở công thức PR4 (2mg/l), cùng với điều kiện như vậy thì tỉ lệ dị hình cũng

tăng theo, hầu hết rễ cây phát sinh từ khối mô sẹo hình thành ở phần gốc cây

in vitro nên dễ bị đứt gãy khi ra cây. Mặc dù số rễ tạo được nhiều nhưng dị

dạng (phình to, xốp và không có khả năng kéo dài), phần rễ còn lại không bị

dị hình nhưng phát triển chậm, đen, dễ gãy và không phân nhánh, không xuất

hiện rễ cấp 1. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Konstantin và cộng sự

(2003) [52], Trần Trung Hiếu và cộng sự (2003) [7], Đỗ Tiến Phát (2009)

[18]. Khi nghiên cứu ra rễ cho chồi thông, sử dụng IBA ở nồng độ thấp

0,2mg/l tỉ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 17% và công thức ra rễ tốt nhất qua kết quả của

Phạm Thị Kim Thanh [23] là 34,38% ở nồng độ 2mg/l IBA Như vậy, qua kết

quả thí nghiệm, căn cứ vào tỉ lệ ra rễ và chất lượng của rễ cây in vitro ở các

công thức trên, chúng tôi thấy nồng độ 1mg/l IBA là phù hợp cho việc tạo rễ

của chồi Thông caribê in vitro, tuy số rễ tạo được ít nhưng chất lượng rễ tốt

(rễ dài, phát triển nhanh, màu trắng và phân nhiều rễ cấp 1; hình 3.6-D).

Chúng tôi tiến hành phân tích phương sai như trong phụ biểu, với xác suất của

Ftính < 0,05 cho thấy các công thức nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt với 3 lần

lặp, kết quả thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95%. Kết quả qua quá trình nghiên

cứu tạo rễ này được thể hiện qua hình 3.6. Qua quá trình nghiên cứu thực hiện

các thí nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành được mục tiêu đặt ra của luận văn.

Nhằm mô phỏng tổng hợp những kết quả đó, chúng tôi mô phỏng qua sơ đồ

số 02.

A

C

A C

D C

B C

Hình 3.6. Tạo cây con hoàn chỉnh

A: Cây Thông caribê in vitro đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ;

B: Cây Thông caribê in vitro được chuyển sang môi trường tạo rễ;

C: Cây Thông caribê in vitro được chuyển sang môi trường tạo rễ sau 3 tuần;

D: Rễ Thông caribê in vitro tạo được sau 6 tuần.

Cây trội Thông caribê

Chồi cành Hạt

Khử trùng HgCl2 (0,1%) 15 phút Khử trùng Javen 60% 08 phút

Tạo đa chồi: từ chồi đỉnh dài 0,5cm (P2), từ đoạn thân dài 0,5cm (P6) (5 tuần nuôi cấy)

8 tuần

Tạo cây Thông caribê hoàn chỉnh

Sơ đồ 02. Tóm tắt kết quả nhân giống in vitro cây Thông caribê

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1.Kết luận

* Đối với tạo mẫu sạch: Đã tạo được mẫu sạch đủ lớn và tìm được

công thức tốt nhất.

+ Sử dụng Javen 60% với thời gian khử trùng 15 phút đối với mẫu phôi

hạt, đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất với tỉ lệ mẫu sạch tạo được 96%, tỉ lệ nảy

mầm đạt 82,7%.

+ Sử dụng HgCl2 0,1% với thời gian 8 phút khử trùng chồi cành thu từ

thực địa, cho kết quả tạo mẫu sạch tốt nhất 68,6%.

* Tạo đa chồi:

+ Tạo đa chồi từ đỉnh sinh trưởng có tỉ lệ chồi cao nhất là môi trường

P2, có hệ số nhân chồi là 6,5 ± 0,33 lần, tỉ lệ tạo đa chồi là 86,7%.

+ Số chồi thu được của đoạn thân mầm trên môi trường P6: Môi trường

M16 có bổ sung 4mg/l BAP cho hệ số nhân cao nhất (5,2 ± 0,05 lần) và có

chất lượng cây mầm tốt sau 8 tuần nuôi cấy.

* Nhân nhanh chồi: Xây dựng được kỹ thuật tạo đa chồi in vitro cây

Thông caribê đạt hiệu suất cao: Với đỉnh chồi cây mầm tỉ lệ tạo đa chồi đạt

86,7% và trung bình 6,5 ± 0,33 chồi/cụm nuôi trên công thức môi trường P2.

Với đoạn thân mầm kích thước 0,5 cm có hiệu quả kinh tế cao nhất, tỉ lệ tạo

đa chồi là 88,9% và trung bình 5,5 chồi/cụm nuôi trên công thức môi trường

M16 có bổ sung 4mg/l BAP(P6).

* Kết quả tạo rễ cây Thông caribê in vitro: Tỉ lệ chồi ra rễ đạt 65,6%

khi nuôi trên công thức môi trường PR4 tiền cảm ứng trong 3 ngày, sau đó cấy

chuyển sang môi trường mới ½ M16 bổ sung vitamin(B5). Tổng thời gian

tính từ khi vào mẫu đến ra cây trồng trong nhà lưới là 06 tháng.

2. Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu các giai đoạn tiếp theo như: tiếp tục lấy chồi tái

sinh từ mẫu chồi cành để thử nghiệm trên môi trường tốt đã được xác định

cho nuôi cấy cây mầm từ phôi hạt, huấn luyện cây và đưa cây ra môi trường

tự nhiên.

- Hoàn thiện kỹ thuật vi nhân giống Thông caribê, nhân nhanh cây từ

chồi cành và để ứng dụng vào sản xuất cây giống chất lượng tốt phục vụ trồng

rừng sản xuất.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn.........................................................................................................i

Danh mục bảng:................................................................................................ii

Danh mục hình:................................................................................................iii

Danh mục biểu đồ:...........................................................................................iv

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................... 3

1.1. Giới thiệu cây Thông caribê ................................................................. 3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố .................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học ................................................ 5

1.1.3. Giá trị sử dụng .................................................................................. 5

1.1.4. Tình hình sản xuất, gây trồng trong và ngoài nước ...................... 6

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ........................... 8

1.2.1. Phương pháp nhân giống in vitro ................................................... 9

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy in vitro ..................... 11

1.2.3 Các bước chính trong nhân giống in vitro ..................................... 15

1.3. Thành tựu về nuôi cấy in vitro ........................................................... 17

1.3.1. Thành tựu chung về nuôi cấy mô, tế bào thực vật trong và ngoài nước

......................................................................................................... 17

1.3.2. Các nghiên cứu về Thông caribê ................................................... 22

1.3.2.1. Ở nước ngoài ............................................................................ 22

1.3.2.2.Ở trong nước .............................................................................. 23

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 27

2.1. Vật liệu ................................................................................................. 27

2.2. Thiết bị và hoá chất ............................................................................. 28

2.3. Địa điểm thí nghiệm ............................................................................ 28

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 29

2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................... 29

2.4.1.1 Tạo mẫu Thông caribê sạch in vitro từ phôi hạt ....................... 29

2.4.1.2. Tạo mẫu sạch Thông caribê in vitro từ chồi thực địa .............. 30

2.4.1.3. Tạo đa chồi Thông caribê từ đỉnh chồi cây mầm ..................... 31

2.4.1.4. Tạo đa chồi Thông caribê từ đoạn thân cây mầm .................... 31

2.4.1.5. Nhân nhanh Thông caribê từ đoạn thân cây mầm ................... 32

2.4.1.6. Thử nghiệm tạo rễ in vitro cây Thông caribê ............................32

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 35

3.1. Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro cây Thông caribê ........................ 35

3.1.1. Tạo nguồn mẫu sạch từ phôi hạt .................................................. 35

3.1.2. Tạo nguồn mẫu sạch từ chồi cành ................................................ 38

3.2. Nghiên cứu tạo đa chồi trong điều kiện in vitro ............................... 40

3.2.1. Tác dụng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo đa chồi từ đỉnh

chồi cây mầm in vitro ..................................................................... 41

3.2.2. Tác dụng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn

thân cây in vitro .............................................................................. 45

3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước đoạn thân cây in

vitro Thông caribê tới việc tạo đa chồi .......................................... 47

3.3. Kết quả tạo rễ in vitro cây Thông caribê .......................................... 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 55

1.Kết luận .................................................................................................... 55

2. Kiến nghị ................................................................................................. 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÓM TẮT LUẬN VĂN

PHỤ LỤC

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống thông caribê (Pinus caribaea Morelet ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea

B

A

C

D

Hình 2.1: Vật liệu nghiên cứu được lấy từ cây Thông caribê trội 15 tuổi

Tỉ lệ mẫu sạch = Tỉ lệ mẫu nảy mầm



Cây trội Thông caribê

Hình 3.1. Nguồn mẫu sạch tạo được từ phôi hạt

A

B

B

A

Hình 3.2. Tạo mẫu sạch từ chồi cành

P6

P5

P7

P8

Hình 3.4. Tác dụng của BAP tới tạo đa chồi từ đoạn thân cây mầm

B

A

Hình 3.5. Tạo đa chồi từ kích thước thân cây mầm trên môi trường P6

A

C

A C

D C

B C

8 tuần

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của Marketing mix đến ý định học cao học của sinh viên khối ngành kinh tế thuộc Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng