intTypePromotion=3

Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn (vibrio cholerae) trên gà mái

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
23
lượt xem
2
download

Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn (vibrio cholerae) trên gà mái

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng quy trình gây miễn dịch trên gà mái với kháng nguyên VKT, tạo cơ sở khoa học để thu thập kháng thể IgY kháng VKT từ trứng do gà mái được gây miễn dịch đẻ ra. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn (vibrio cholerae) trên gà mái

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG THỂ<br /> IgY KHÁNG VI KHUẨN (VIBRIO CHOLERAE) TRÊN GÀ MÁI<br /> Hoàng Trung Kiên*; Lê Thu Hồng*; Lê Thu Hà**; Nguyễn Đặng Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Sản xuất kháng thể kháng vi khuẩn tả (VKT) (Vibrio cholerae) để sử dụng như một biện pháp tạo<br /> miễn dịch thụ động trong dự phòng và điều trị nhiễm VKT là một hướng nghiên cứu đáng quan tâm.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát khả năng gây miễn dịch trên gà mái với chủng VKT được<br /> bất hoạt bằng nhiệt, đồng thời xác định khả năng phân lập kháng thể IgY kháng VKT từ trứng của gà<br /> được gây miễn dịch trước đó. Kết quả: gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là VKT bất hoạt<br /> (nồng độ kháng nguyên tương đương với mật độ VKT 3 x 1010 CFU/ml) có sự hình thành kháng thể<br /> IgY đặc hiệu với kháng nguyên VKT sau 1 tuần gây miễn dịch. Kháng thể IgY phân lập từ trứng của<br /> gà được gây miễn dịch cho phản ứng dương tính với kháng nguyên VKT (trên ELISA) và có khả<br /> năng gây ngưng kết VKT trong môi trường lỏng.<br /> * Từ khóa: Kháng thể IgY; Vi khuẩn tả; Gà mái.<br /> <br /> STUDY ON PRODUCTION OF YOLK IMMUNOGLOBULIN (IgY)<br /> AGAINST VIBRIO CHOLERAE BY EGG-LAYING HENS<br /> IMMUNIZATION<br /> SUMMARY<br /> Production of immunoglobulin against Vibrio cholerae to be used as passive preventive and/or<br /> therapeutic method in V. cholerae infection is a research field that interests many scientists. In this<br /> study, we investigated the effectiveness of the immunization on egg-laying hens with heat-inactivated<br /> V. cholerae. In addition, we determined the possibility of isolating IgY against V. cholerae from egg<br /> yolk laid by the hens previously immunized with V. cholerae antigen.<br /> The results showed that: 1- immunization on egg-laying hens using whole cell heat-inactivated V.<br /> cholerae as antigen (at bacterial concentration of 3.1010CFU/ml) could elicit an IgY production<br /> response one week after first challenge with antigen; 2- IgY isolated from egg yolk laid by the immunized<br /> hens showed positive activity against V. cholerae, in both ELISA and bacterial agglutination assays.<br /> * Key words: Immunoglobulin Y (IgY); Vibrio cholerae.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tiêu chảy cấp do tả là bệnh truyền nhiễm<br /> cấp tính do nhiễm vi khuẩn tả đường tiêu<br /> hóa. ệnh có thể gây ra các vụ dịch lớn và<br /> <br /> được coi là một bệnh truyền nhiễm nguy<br /> hiểm, do khả năng lan truyền nhanh trong<br /> cộng đồng thông qua thức ăn và/hoặc nguồn<br /> nước sinh hoạt ô nhiễm bởi VKT. Sau khi<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn<br /> PGS. TS. Lê Văn Đông<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> nhiễm VKT theo đường tiêu hoá, độc tố do<br /> vi khuẩn tiết ra sẽ bám và thâm nhập vào tế<br /> bào niêm mạc ruột, gây rối loạn quá trình<br /> vận chuyển tích cực các chất điện giải qua<br /> màng tế bào niêm mạc ruột, dẫn đến tăng<br /> tiết dịch vào lòng ống tiêu hoá và gây tiêu<br /> chảy mất nước. Điều trị bệnh tả chủ yếu là<br /> bù nước, điện giải cho bệnh nhân. Đã có<br /> nhiều báo cáo về việc sử dụng kháng sinh<br /> trong điều trị nhiễm VKT giúp rút ngắn thời<br /> gian điều trị cũng như thời gian vi khuẩn<br /> được bài tiết ra môi trường [3, 4]. Tuy<br /> nhiên, cũng có báo cáo về một số chủng<br /> VKT kháng kháng sinh [5, 9]. Sử dụng<br /> kháng thể tạo miễn dịch thụ động là một<br /> trong những hướng nghiên cứu tìm kiếm<br /> các biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị<br /> nhiễm VKT được nhiều nhóm nghiên cứu<br /> quan tâm trong nhiều năm qua [7, 8]. Kháng<br /> thể IgY (immunoglobulin từ lòng đỏ trứng yolk immunoglobulin) là một trong những<br /> nguồn kháng thể có nhiều tiềm năng ứng<br /> dụng, do có nhiều ưu điểm so với kháng thể<br /> IgG của động vật có vú (quy trình gây miễn<br /> dịch và thu thập kháng thể đơn giản, lượng<br /> kháng thể thu được cao...). Ở một số loài<br /> gia cầm, IgY trong lòng đỏ trứng có cấu trúc<br /> phân tử tương tự IgG ở động vật có vú; IgY<br /> có nguồn gốc từ kháng thể trong máu gia<br /> cầm mẹ, được vận chuyển tích cực sang<br /> lòng đỏ trứng, sau đó sang gia cầm nở từ<br /> trứng, tạo ra tình trạng miễn dịch thụ động<br /> ở gia cầm mới nở.<br /> Đề tài này được tiến hành nhằm: Xây<br /> dựng quy trình gây miễn dịch trên gà mái<br /> với kháng nguyên VKT, tạo cơ sở khoa học<br /> để thu thập kháng thể IgY kháng VKT từ<br /> trứng do gà mái được gây miễn dịch đẻ ra.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.<br /> - Chủng VKT do Khoa Vi sinh vật, Bệnh<br /> viện 103 cung cấp, được phân lập từ mẫu<br /> bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh tả tại<br /> Việt Nam.<br /> - Gà mái giống Tam Hoàng ở độ tuổi đẻ<br /> trứng, số lượng 15 con (với các cá thể cùng<br /> lứa), trọng lượng khoảng 1,5 - 2 kg, được<br /> nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và<br /> nước uống, chiếu sáng với ánh sáng tự<br /> nhiên 10 - 12 giờ/ngày.<br /> - Hoá chất, sinh phẩm chủ yếu: tá chất<br /> Freund hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh<br /> (Sigma, Hoa Kỳ); cộng hợp peroxidase kháng thể IgG cừu kháng IgY gà và các hoá<br /> chất cần thiết khác cho phản ứng ELISA<br /> (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp).<br /> - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: thạch<br /> kiềm, canh thang BHI.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn<br /> dịch cho gà mái (thực hiện tại Trung tâm<br /> Nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học<br /> viện Quân y):<br /> - Hoạt hóa và tnuôi cấy tăng sinh chủng<br /> vi khuẩn V. cholarea phòng thí nghiệm (lưu<br /> giữ đông khô ở -800C): cấy vi khuẩn trong<br /> bình nuôi cấy với canh thang BHI, nhiệt độ<br /> 370C trong 24 giờ. Ly tâm rửa 3 lần với<br /> NaCl 0,9%, thu cặn tế bào để tạo huyền<br /> dịch vi khuẩn 1011 CFU/ml.<br /> - Tạo kháng nguyên vi khuẩn: trộn huyền<br /> dịch vi khuẩn đã bất hoạt bằng nhiệt<br /> (800C/20 phút) với tá chất Freund hoàn<br /> chỉnh hoặc không hoàn chỉnh (tỷ lệ 1:1 về<br /> thể tích). Huyền dịch vi khuẩn sau khi trộn<br /> <br /> 2<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> tá chất được sử dụng ngay để gây miễn<br /> dịch trên gà mái.<br /> - Gây miễn dịch cho gà mái: 15 gà mái<br /> được chia ngẫu nhiên thành 5 lô để gây<br /> miễn dịch với các liều kháng nguyên khác<br /> nhau nhằm xác định liều kháng nguyên<br /> tối ưu.<br /> Bảng 1: Nồng độ kháng nguyên VKT dùng<br /> để gây miễn dịch cho gà mái.<br /> LÔ GÀ<br /> Số lượng<br /> (con)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,5 x<br /> 1010<br /> <br /> 3x<br /> 1010<br /> <br /> Liều kháng Không 0,375 x 0,75 x<br /> nguyên (mật gây<br /> 1010<br /> 1010<br /> độ vi khuẩn, miễn<br /> CFU/ml)<br /> dịch<br /> <br /> (CFU: colony forming unit: số đơn vị<br /> khuẩn lạc)<br /> Lấy máu tĩnh mạch gà trước khi gây miễn<br /> dịch, tách huyết thanh, bảo quản ở -200C.<br /> Gây miễn dịch trên gà theo phương pháp<br /> của Hoàng Trung Kiên và CS (2010) [1]:<br /> tiêm dưới da 1 ml huyền dịch kháng nguyên<br /> trộn với tá chất Freund hoàn chỉnh; sau mỗi<br /> 3 tuần, tiêm nhắc lại cùng liều kháng nguyên<br /> với tá chất Freund không hoàn chỉnh, trong<br /> 12 tuần liên tiếp.<br /> 7 ngày sau mỗi lần tiêm kháng nguyên,<br /> lấy máu tĩnh mạch gà, tách huyết thanh,<br /> bảo quản ở -200C để kiểm tra hiệu giá<br /> kháng thể IgY kháng VKT bằng kỹ thuật<br /> ELISA. Đồng thời, phân lập kháng thể IgY<br /> từ lòng đỏ trứng gà, thực hiện phản ứng<br /> ELISA để xác định sự có mặt của kháng thể<br /> IgY kháng VKT trong lòng đỏ trứng gà.<br /> * Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể<br /> IgY kháng VKT (thực hiện tại La bô Miễn<br /> dịch, Trung tâm Nghiên cứu Y - Dược học<br /> quân sự, Học viện Quân y):<br /> <br /> - Chuẩn bị khay phản ứng: VKT được xử<br /> lý bằng phương pháp siêu nghiền với máy<br /> siêu âm. 100 µl huyền dịch kháng nguyên<br /> siêu nghiền (nồng độ 5 µg/ml, trong dung<br /> dịch NaHCO3 0,1 M; pH 9,6), ủ qua đêm ở<br /> 40C trong các giếng của khay phản ứng<br /> ELISA 96 giếng để gắn kháng nguyên lên<br /> giếng. Rửa các giếng 5 lần bằng dung dịch<br /> PBS-T (0,15 M NaCl; 0,02 M NaH2PO4;<br /> 0,01% Tween 20; pH 7,4). Ủ giếng phản<br /> ứng với 150 µl dung dịch BSA 1% ở 370C<br /> trong 2 giờ. Rửa các giếng 5 lần với PBS-T.<br /> - Thực hiện phản ứng ELISA: bổ sung<br /> 100 µl huyết thanh gà (hoặc dung dịch<br /> chứa IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà) vào<br /> các giếng phản ứng; ủ khay phản ứng ở<br /> 370C trong 30 phút; rửa khay phản ứng<br /> bằng PBS-T. Phát hiện kháng thể IgY đặc<br /> hiệu với kháng nguyên VKT bằng cách bổ<br /> sung vào các giếng 100 µl dung dịch cộng<br /> hợp peroxidase - kháng thể IgG cừu kháng<br /> IgY gà; ủ khay phản ứng ở 370C trong 30<br /> phút; rửa khay phản ứng bằng PBS-T, tiếp<br /> đó bổ sung vào các giếng 100 µl dung dịch<br /> OPD, giữ khay phản ứng trong buồng tối, ở<br /> nhiệt độ phòng trong 10 phút; ngừng phản<br /> ứng bằng cách bổ sung vào mỗi giếng 50 µl<br /> H2SO4 2 M. Đo mật độ quang học của dung<br /> dịch phản ứng trong từng giếng tại bước<br /> sóng 450 nm, sử dụng máy đo quang phổ<br /> DTX 880 (Beckman Coulter, Hoa Kỳ). Mật<br /> độ quang học của dung dịch phản ứng gián<br /> tiếp phản ánh hiệu giá kháng thể kháng<br /> VKT trong mẫu huyết thanh hoặc dung dịch<br /> tương ứng.<br /> * Thử nghiệm ngưng kết VKT trong môi<br /> trường lỏng (thực hiện tại Khoa Vi sinh vật,<br /> Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội):<br /> Trộn huyền dịch vi khuẩn (sau nuôi cấy<br /> tăng sinh; mật độ 1010 CFU/ml) với kháng<br /> thể IgY (ở các độ pha loãng tăng dần trong<br /> dung dịch P S), trong các giếng có đáy<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Thống kê và so sánh mật độ quang học<br /> của các giếng tương ứng với các mẫu<br /> huyết thanh bằng các thuật toán của phần<br /> mềm Microsft excel 2003.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Tính đặc hiệu với kháng nguyên<br /> VKT của kháng thể IgY.<br /> <br /> OD 450 (nm)<br /> <br /> Trên các mẫu huyết thanh gà được gây<br /> miễn dịch và gà trong nhóm đối chứng<br /> (không gây miễn dịch), chúng tôi sử dụng<br /> phản ứng ELISA xác định sự có mặt của<br /> kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên VKT.<br /> <br /> Hình 1: Phản ứng ELISA phát hiện IgY<br /> kháng VKT trong huyết thanh gà.<br /> Kết quả phản ứng ELISA: sau 1 tuần<br /> gây miễn dịch bằng VKT lần đầu, trong tất<br /> cả các mẫu huyết thanh gà đều có mặt<br /> kháng thể kháng VKT, trong khi các mẫu<br /> huyết thanh gà thu thập trước khi gây miễn<br /> dịch và các mẫu huyết thanh gà nhóm đối<br /> <br /> chứng (lô 1 - không gây miễn dịch với VKT)<br /> cho kết quả phản ứng ELISA âm tính. Điều<br /> này cho thấy sử dụng kháng nguyên VKT<br /> bất hoạt để gây miễn dịch có khả năng kích<br /> thích đáp ứng tạo kháng thể kháng VKT<br /> trên gà mái.<br /> Mật độ quang học của các giếng phản<br /> ứng tương ứng với mẫu huyết thanh được<br /> khảo sát gián tiếp cho thấy nồng độ kháng<br /> thể kháng VKT trên gà được gây miễn dịch<br /> có xu hướng tăng dần sau từng lần gây<br /> miễn dịch. Kết quả này phù hợp với quy<br /> luật chung về đáp ứng tạo kháng thể trên<br /> động vật. Trong số các lô gà được gây<br /> miễn dịch, mẫu huyết thanh gà thuộc lô số<br /> 5 (gây miễn dịch với nồng độ kháng nguyên<br /> cao nhất, tương ứng với mật độ vi khuẩn 3<br /> x 1010 CFU/ml) cho kết quả mật độ quang<br /> học của các giếng phản ứng cao hơn rõ rệt<br /> so với những lô gà được gây miễn dịch còn<br /> lại (p < 0,05). Như vậy có thể thấy, quy trình<br /> gây miễn dịch sử dụng trong nghiên cứu<br /> này đã có tác dụng kích thích gà mái tạo ra<br /> được kháng thể IgY kháng VKT. ên cạnh<br /> đó, trong phạm vi dải nồng độ kháng<br /> nguyên VKT sử dụng để gây miễn dịch (thể<br /> hiện bằng mật độ vi khuẩn từ 0,375 x 1010 3 x 1010 CFU/ml), cường độ đáp ứng tạo<br /> kháng thể có xu hướng tỷ lệ thuận với nồng<br /> độ kháng nguyên sử dụng gây miễn dịch.<br /> <br /> OD 450 (nm)<br /> <br /> hình chữ U của khay nhựa 96 giếng. Khay<br /> phản ứng được giữ ở nhiệt độ phòng trong<br /> 1 giờ, sau đó để lắng tự nhiên ở 40C qua<br /> đêm. Hiện tượng ngưng kết vi khuẩn được<br /> đánh giá là dương tính khi quan sát thấy<br /> hình ảnh đám ngưng kết, âm tính khi vi<br /> khuẩn (không bị ngưng kết) lắng tự nhiên<br /> xuống trung tâm của đáy giếng.<br /> <br /> Độ pha loãng kháng thể (x 1.000)<br /> Hình 2: Phản ứng ELISA phát hiện IgY<br /> kháng VKT (từ lòng đỏ trứng gà).<br /> <br /> 4<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng<br /> gà được pha loãng thành những nồng độ<br /> khác nhau, sau đó thực hiện phản ứng<br /> ELISA để xác định sự có mặt của kháng thể<br /> IgY kháng VKT trong lòng đỏ trứng. Phản<br /> ứng ELISA cho kết quả dương tính với mẫu<br /> kháng thể IgY phân lập từ trứng của gà<br /> được gây miễn dịch với kháng nguyên VKT<br /> (ngay cả ở mức pha loãng 1/4.000), trong<br /> khi mẫu đối chứng âm (kháng thể phân lập<br /> từ trứng của gà không gây miễn dịch)<br /> không có phản ứng với kháng nguyên VKT.<br /> Trong số các kháng thể có trong máu<br /> gà, một lớp kháng thể có cấu trúc phân tử<br /> tương tự như kháng thể IgG ở động vật có<br /> vú, được vận chuyển tích cực từ gà mái<br /> sang lòng đỏ trứng do gà mái đẻ ra, lớp<br /> kháng thể này được gọi là IgY (yolk<br /> immunoglobulin), đó chính là nguồn gốc<br /> của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng.<br /> Bằng phương pháp gây miễn dịch trên gà<br /> mái và thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ<br /> trứng do gà được gây miễn dịch đẻ ra, Tim<br /> Sunnary và CS (2011) thu được kháng thể<br /> IgY kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng<br /> ức chế trực khuẩn mủ xanh trên mô hình<br /> vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm<br /> trực khuẩn mủ xanh [2]. Tương tự, nhóm<br /> nghiên cứu của Hoàng Trung Kiên và CS<br /> (2010) đã thu được IgY từ lòng đỏ trứng gà<br /> kháng vi khuẩn E. ictaluri (gây bệnh mủ gan<br /> cá tra) [1]. Theo Kazuyuki H và CS (2010),<br /> IgY đặc hiệu với VKT có nguồn gốc từ lòng<br /> đỏ trứng gà được chứng minh có tác dụng<br /> bảo vệ trên mô hình chuột nhắt trắng sơ<br /> sinh nhiễm VKT [6]. Trong nghiên cứu này,<br /> sự có mặt của kháng thể IgY đặc hiệu trong<br /> huyết thanh gà sau khi gây miễn dịch với<br /> kháng nguyên VKT, cũng như trong lòng đỏ<br /> trứng của gà được gây miễn dịch là cơ sở<br /> khoa học quan trọng để chúng tôi tiến hành<br /> <br /> phân lập kháng thể IgY kháng VKT trong<br /> lòng đỏ trứng gà, trên cơ sở đó có thể khảo<br /> sát hoạt tính sinh học, tác dụng bảo vệ của<br /> kháng thể này trên mô hình động vật gây<br /> nhiễm VKT.<br /> 2. Hoạt tính ngƣng kết VKT của kháng<br /> thể IgY.<br /> <br /> Hình 3: Phản ứng ngưng kết VKT bởi<br /> kháng thể IgY trong môi trường lỏng.<br /> (A: khay 96 giếng thực hiện phản ứng<br /> ngưng kết với các độ pha loãng kháng thể<br /> khác nhau; B (IgY phân lập từ lòng đỏ trứng<br /> của gà được gây miễn dịch): phản ứng<br /> ngưng kết dương tính: hình ảnh đám vi<br /> khuẩn ngưng kết tại đáy giếng phản ứng; C:<br /> phản ứng ngưng kết âm tính: vi khuẩn lắng<br /> tự nhiên xuống đáy giếng phản ứng)<br /> Phản ứng ngưng kết vi khuẩn thực hiện<br /> trong phiến nhựa 96 giếng có đáy hình chữ<br /> U. Kết quả: IgY phân lập từ lòng đỏ trứng<br /> của gà được gây miễn dịch với kháng<br /> nguyên VKT có khả năng gây ngưng kết<br /> VKT trong môi trường lỏng. Hiệu giá kháng<br /> thể ngưng kết được xác định là 1/512 với<br /> dung dịch chứa kháng thể IgY phân lập từ<br /> lòng đỏ trứng (của gà được gây miễn dịch)<br /> bằng phương pháp tủa lipid với nước cất<br /> lạnh; nồng độ protein trong dung dịch sau<br /> tủa lipid là 0,8 mg/ml (số liệu không trình<br /> bày trong bài báo này).<br /> <br /> 5<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản