Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis để sử dụng ngoại kiểm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐẶC HIỆU<br /> TOXOCARA CANIS ĐỂ SỬ DỤNG NGOẠI KIỂM<br /> Vũ Quang Huy*,**, Nguyễn Nhật Giang***<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và<br /> đông lạnh. Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết thanh sản xuất theo phương pháp đông khô và<br /> đông lạnh.<br /> Phương pháp: Sàng lọc mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật ELISA; khẳng<br /> định độ đặc hiệu của kháng thể kháng Toxocara canis bằng kỹ thuật Western blot. Sản xuất mẫu thử nghiệm<br /> bằng phương pháp đông khô và đông lạnh. Đánh giá đồng nhất bằng phép phân tích phương sai một yếu tố và độ<br /> ổn định bằng phép kiểm định t – test.<br /> Kết quả: 11 mẫu huyết thanh có kháng thể kháng Toxocara canis nồng độ cao: từ 31,517 NTU đến 56,581<br /> NTU được sàng lọc bằng ELISA. Khẳng định độ đặc hiệu kháng thể kháng Toxocara canis bằng Western blot: 01<br /> mẫu âm tính và 10 mẫu dương tính. Mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis đưa vào sản xuất 2 lô mẫu: lô<br /> mẫu đông khô nồng độ 31,012 NTU; lô mẫu đông lạnh nồng độ 27,184 NTU. Sản xuất bằng phương pháp đông<br /> khô và đông lạnh đều đạt độ đồng nhất có ý nghĩa thống kê Fisher. Mẫu huyết thanh sản xuất bằng phương pháp<br /> đông khô đạt độ ổn định trong 1 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ ­80°C với p > 0,05. Mẫu huyết thanh sản xuất<br /> bằng phương pháp đông lạnh đạt độ ổn định trong 3 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ­80°C với p > 0,05. Mẫu huyết<br /> thanh sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh đạt độ ổn định ở nhiệt độ 30°C trong thời gian 7 ngày với p<br /> > 0,05.<br /> Kết luận: Sản xuất được mẫu huyết thanh đặc hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô và đông<br /> lạnh để sử dụng ngoại kiểm. Mẫu sản xuất theo phương pháp đông khô và đông lạnh đạt tính đồng nhất và độ ổn<br /> định: mẫu đông khô ổn định trong 1 tháng, mẫu đông lạnh ổn định trong 3 tháng ở nhiệt độ bảo quản ­80°C;<br /> mẫu ổn định trong 7 ngày ở nhiệt độ 30°C.<br /> Từ khoá: Toxocara canis, ngoại kiểm, ELISA, Western blot.<br /> ABSTRACT<br /> RESEARCH PROCESS OF PILOT PRODUCTION SERUM HAS TOXOCARA CANIS SPECIFIC<br /> ANTIBODIES USING FOR EXTERNALQUALITY ASSESSMENT<br /> Vu Quang Huy, Nguyen Nhat Giang<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 22 - No 5- 2018: 213 – 218<br /> Objectives: To produce pilot batches of anti­Toxocara canis specific antibodies serum by freeze­drying and<br /> freezing methods. To evaluate homogeneity and stability of serum samples produced by freeze­drying and freezing<br /> methods.<br /> Methods: Serum samples were screened for anti­Toxocara canis antibodies by ELISA, then the presence of<br /> anti­Toxocara canis specific antibodies was confirmed by Western blot. Samples were produced in pilot<br /> production by using freeze­drying and freezing methods. Homogeneity and stability of final samples were<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 213<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> evaluated by F test and t­test, respectively.<br /> Results: 11 serum samples containing high concentrations of anti­Toxocara canis antibodies ranging from<br /> 31.517 NTU to 56.581 NTU were screened; and the specificity of anti­Toxocara canis antibodies was confirmed<br /> by Western blot: 01 negative sample, 10 positive samples. Two anti­Toxocara canis specific antibodies serum<br /> sample plots were produced: by freeze­drying method with the concentration of 31.012 NTU; and by freezing<br /> method with concentration of 27.184 NTU. Serum samples produced by freeze­drying and freezing were<br /> homogeneity with F test. Serum samples produced by freeze­drying were stable for 1 month when stored at ­80°C<br /> with p > 0.05. Serum samples produced by freezing were stable for 3 months when stored at ­80°C with p > 0.05.<br /> Samples produced by either method were stable for 7 days at 30°C with p > 0.05.<br /> Conclusions: Production of anti­Toxocara canis specific antibodies serum samples by freeze­drying and<br /> freezing method using for external quality assessment is feasible. Samples produced by freeze­drying and freezing<br /> were homogeneous and stable: freeze­dried samples were stable for 1 month, frozen samples were stable for 3<br /> months at ­80°C; Samples were stable for 7 days at 30°C.<br /> Keywords: EQA, Toxocara canis, ELISA, Western blot.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ và đông lạnh.<br /> Phòng xét nghiệm là một hệ thống phức tạp Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của<br /> liên quan đến nhiều người và bao gồm nhiều mẫu huyết thanh sản xuất theo phương pháp<br /> hoạt động để cho ra sản phẩm là kết quả xét đông khô và đông lạnh.<br /> nghiệm. Nếu kết quả xét nghiệm không chính PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> xác có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng. Thiết kế nghiên cứu<br /> Theo khuyến cáo của CLSI, CDC, WHO(9): để<br /> Nghiên cứu thực nghiệm.<br /> đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm cần tiến<br /> hành nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng. Đối tượng nghiên cứu<br /> Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm đang Mẫu huyết thanh có kháng thể kháng<br /> được triển khai rộng rãi trong các lĩnh vực xét Toxocara canis.<br /> nghiệm: hoá sinh, huyết học, vi sinh… Tuy Tiêu chuẩn chọn mẫu<br /> nhiên, ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ký Mẫu huyết thanh được lấy bằng phương<br /> sinh trùng, đặc biệt là huyết thanh chẩn đoán ký pháp đảm bảo vô khuẩn, mẫu dương tính với<br /> trùng trong đó có huyết thanh chẩn đoán Toxocaracanis, sàng lọc kháng nguyên HBsAg,<br /> Toxocara canis (ELISA) còn nhiều hạn chế: cho anti-HCV và anti-HIV 1/2. Mẫu huyết thanh<br /> đến nay, chưa có bất kỳ một công trình nào được không có chất chống đông, không bị tán huyết<br /> công bố về mẫu ngoại kiểm ký sinh trùng trong và không đục màu. Mẫu huyết thanh được lấy<br /> nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề không quá 48 giờ và được bảo quản ở tủ lạnh 2 –<br /> tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết 8°C kể từ khi lấy mẫu cho đến khi thu thập mẫu.<br /> thanh đặc hiệuToxocara canis để sử dụng ngoại Phương pháp tiến hành<br /> kiểm” nhằm sản xuất được mẫu huyết thanh đạt<br /> Thu thập mẫu, lưu trữ -80°C.<br /> tiêu chuẩn theo ISO/IEC 17043:2011(3,8): độ đặc<br /> Loại trừ các tác nhân nhiễm trùng.<br /> hiệu, tính đồng nhất, độ ổn định để sử dụng<br /> trong chương trình ngoại kiểm huyết thanh học Sàng lọc mẫu có kháng thể kháng Toxocara<br /> chẩn đoán ký sinh trùng Toxocara canis. canis bằng kỹ thuật ELISA (Toxocara IgG ELISA<br /> – NOVATEC Immundiagnostica GMBH – REF:<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> TOCG0450; LOT: TOCG-061).<br /> Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc<br /> Khẳng định độ đặc hiệu của kháng thể<br /> hiệu Toxocara canis theo phương pháp đông khô<br /> kháng Toxocaracanis có trong nguyên liệu sản<br /> 214 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> xuất bằng kỹ thuật Western blot(1) (Toxocara IgG tương ứng với mẫu chứng dương,đặc hiệu<br /> Western blot – LDBIO Diagnostics, FRACE – SN: Toxocara canis.<br /> KTX12-00239; LOT: P01003-12T-016). Bảng 1. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kháng thể<br /> Phân phối mẫu vào eppendorf, mỗi mẫu kháng Toxocara canis<br /> 100µl. ELISA<br /> WESTERN<br /> Stt Mã số mẫu Cut<br /> Tiến hành đông khô/ đông lạnh mẫu: đông off<br /> OD NTU Kết luận BLOT<br /> khô ở điều kiện nhiệt độ -40°C, áp suất hơi 0,129 Chứng<br /> 1 Dương tính<br /> mBar trong 18 giờ; đông lạnh ở nhiệt độ -80°C dương<br /> trong 24 giờ. Dương<br /> 2 TXA01 0,547 2,178 39,817 Âm tính<br /> tính<br /> Đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định: số liệu Dương<br /> 3 TXA02 0,547 3,038 55,539 Dương tính<br /> từ kết quả Toxocara IgG ELISA. tính<br /> Dương<br /> + Độ ổn định dài hạn: bảo quản ở tủ lạnh 2 – 4 TXA03 0,547 2,609 47,697<br /> tính<br /> Dương tính<br /> 8°C và ở tủ đông -80°Cđể đánh giá độ ổn định Dương<br /> 5 TXA04 0,547 2,864 52,358 Dương tính<br /> sau 1 tháng, 3 tháng. tính<br /> Dương<br /> + Độ ổn định ngắn hạn: để đánh giá tác động 6 TXA05 0,547 3,095 56,581<br /> tính<br /> Dương tính<br /> của yếu tố nhiệt độ và thời gian trong khi vận Dương<br /> 7 TXA06 0,547 3,039 55,558 Dương tính<br /> chuyển mẫu đến các đơn vị, giả định nhiệt độ tính<br /> trong quá trình vận chuyển là 30°C, đánh giá Dương<br /> 8 TXA07 0,547 2,988 54,625 Dương tính<br /> tính<br /> mẫu sau 5 ngày, 7 ngày. Dương<br /> 9 TXA08 0,547 1,724 31,517 Dương tính<br /> Thu thập và xử lý số liệu tính<br /> Dương<br /> Số liệu được xử lý bằng phần mềm 10 TXA09 0,547 2,341 42,797<br /> tính<br /> Dương tính<br /> Microsoft Excel 2010 và SPSS 20.0. Sử dụng Dương<br /> 11 TXA10 0,547 1,909 34,899 Dương tính<br /> phân tích one way ANOVA để đánh giá tính tính<br /> đồng nhất và t-test để đánh giá độ ổn định của Dương<br /> 12 TXA11 0,547 2,559 46,782 Dương tính<br /> tính<br /> mẫu huyết thanh sản xuất.<br /> KẾT QUẢ<br /> Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu<br /> Toxocara canis theo phương pháp đông khô và<br /> đông lạnh.<br /> 11 mẫu huyết thanh có kháng thể<br /> khángToxocara canisxác định bằng kỹ thuật<br /> ELISA có nồng độ cao được sàng lọc: thấp<br /> nhất là mẫu TXA08 với 31,517 đơn vị NTU; cao<br /> nhất là mẫu TXA05 với 56,581 đơn vị NTU. Hình 1. Kết quả xét nghiệm Western blot Toxocara sp<br /> Khẳng định kháng thể đặc hiệu kháng Mẫu huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu<br /> Toxocara canis bằng kỹ thuật Western blot(1): kháng Toxocara canis được phân phối vào<br /> mẫuTXA01 (bảng 1, hình 1) xuất hiện 2 băng eppendorf và xử lý đông khô/ đông lạnh. Kết<br /> trong nhóm 100 – 200 kDa, 2 băng trong nhóm quả, chúng tôi sản xuất được 2 lô mẫu huyết<br /> 70 – 90 kDa, không đặc hiệu Toxocara thanh đặc hiệu Toxocara canis:<br /> canis;mẫu TXA02, TXA03, TXA04, TXA05, Mẫu đông khô: 100 mẫu, mỗi mẫu có thể tích<br /> TXA06, TXA07, TXA08, TXA09, TXA10, TXA11 trước đông khô là 100µl huyết thanh, nồng độ<br /> (bảng 1, hình 1) xuất hiện 5 băng trong nhóm ban đầu 31,012 NTU.<br /> băng có trọng lượng phân tử thấp 24 – 35 kDa, Mẫu đông lạnh: 100 mẫu, mỗi mẫu có thể<br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 215<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> tích 100µl huyết thanh, nồng độ ban đầu 0,359 > 0,05. Nồng độ trung bình kháng thể trong<br /> 27,184 NTU. mẫu sản xuất giảm: nhiệt độ -80°C, mẫu đông<br /> Kết quả đánh giá độ đồng nhất khô sau 1 tháng là 31,865 NTU, sau 3 tháng là<br /> Bảng 2. Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất 28,479 NTU, mẫu đông lạnh sau 1 tháng là<br /> bằng phương pháp đông khô và đông lạnh 27,301 NTU, sau 3 tháng là 26,795 NTU; nhiệt độ<br /> Chỉ số Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh 2 - 8°C, mẫu đông khô sau 1 tháng là 28,853<br /> Trung bình NTU, sau 3 tháng là 25,430 NTU, mẫu đông lạnh<br /> 31,012 27,184<br /> (NTU) sau 1 tháng là 26,087 NTU, sau 3 tháng là 24,556<br /> SD 1,140 0,994 NTU.<br /> CV (%) 3,68 3,66<br /> F thực nghiệm 2,517 0,591<br /> Bảng 4. Độ ổn định của mẫu đông khô và đông lạnh<br /> F lý thuyết Với k1 = 9, k2 = 10, α = 0,05 ta có F = 3,02 ở nhiệt độ 30°C<br /> Thời điểm Chỉ số Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh<br /> Lô mẫu sản xuất bằng phương pháp đông<br /> 5 ngày Trung bình 25,466 26,256<br /> khô có giá trịF thực nghiệm = 2,517 < F lý thuyết = 3,02; lô (NTU)<br /> mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh có SD 0,651 1,036<br /> giá trị F thực nghiệm = 0,591 < F lý thuyết = 3,02. Mẫu sản CV (%) 2,56 3,95<br /> xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh P 0,929 > 0,05 0,251 > 0,05<br /> 7 ngày Trung bình 25,501 26,312<br /> đạt tính đồng nhất. (NTU)<br /> Mẫu sản xuất theo phương pháp đông lạnh SD 0,660 1,045<br /> có độ lệch chuẩn = 0,994 và hệ số biến thiên = CV (%) 2,59 3,97<br /> 3,66% thấp hơn so với mẫu sản xuất bằng P 0,860 > 0,05 0,305 > 0,05<br /> phương pháp đông khô có độ lệch chuẩn = 1,140 Ở điều kiện vận chuyển giả định có nhiệt độ<br /> và hệ số biến thiên = 3,68%. 30°C, các mẫu sản xuất theo phương pháp đông<br /> Kết quả đánh giá độ ổn định khô và đông lạnh đạt độ ổn định trong 7 ngày.<br /> Bảng 3. Độ ổn định của mẫu đông khô và đông lạnh BÀN LUẬN<br /> theo thời gian và nhiệt độ Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh đặc hiệu<br /> Thời Chỉ Mẫu đông khô Mẫu đông lạnh Toxocara canis theo phương pháp đông khô và<br /> điểm số -80°C 2 - 8°C -80°C 2 - 8°C<br /> đông lạnh<br /> Trung<br /> bình 31,865 28,853 27,301 26,078 Quy trình sản xuất mẫu huyết thanh có<br /> (NTU) kháng thể kháng Toxocara canis bắt đầu từ khi<br /> 1 SD 1,411 1,173 0,320 0,900<br /> tháng thu thập nguyên liệu sản xuất. Đề tài nghiên<br /> CV<br /> (%)<br /> 4,43 4,07 1,17 3,50 cứu ảnh hưởng của các điều kiện sản xuất và<br /> P 0,140>0,050,0000,05 0,023