Nghiên cứu quy trình sinh thiết phôi, tách ADN của phôi để chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu quy trình sinh thiết phôi, tách ADN của phôi để chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi” với các mục tiêu sau: Xây dựng quy trình sinh thiết phôi; xây dựng quy trình tách ADN của phôi; chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu quy trình sinh thiết phôi, tách ADN của phôi để chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi

N GH IÊN C Ứ U Q U Y T R ÌN H SINH T H IÉ T PHÔI, T Á C H A D N C Ủ A PH ÔI Đ Ẻ C H Ả N Đ O Á N B Ệ N H DI T R U YỀ N T R Ư Ớ C C H U Y Ể N PHÔI s v . Đào Hải Anh*,' CN. Triệu Tiến Sang*; sv . Đào Thị Hải Yến* H ư ớn g dẫn: PGS.TS. Trần Văn Khoa* T ÓM TẲT i Trên thế giới hiện nay có khoáng 300 gen Hên quan đến bệnh di truyền có thể được phát hiện bằng PGD. Trong nhóm chỉ định này, gần 200 bệnh lý di truyền khác nhau như: thalassemia, bệnh thiếu máu ác tính, xơ nang, bệnh ưa chảy máu, loạn dưỡng cơ Duchenne, teo cơ tủy (SMA), điếc bẩm sinh... Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng đụng sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán bệnh di truyền bằng phương pháp tách ADN cùa phôi chưa được quan tâm nhiều ờ Việt Nam. V vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cửu quy trình sình thiểt phôi, tách AD N cửa phôi để chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi” với các mục tiêu sau: Xây dựng quy trình sinh th iầ phôi. - Xây dựng quy trình tách AĐ N cửa phôi. Chẩn đoán bệnh di truyền trước chuyển phôi. Đổi tượng và phương pháp nghiên cún: 30 phôi dư được tiến hành sinh thiết tại Trung tâm Công nghệ phôi Học viện Quân y. Trong 30 phôi, 5 phôi tói và 25 phôi phân cắt. Các phôi này được sinh thiểt và hút lần lượt 2 tế bào: 1 tế bào nhân toàn bộ bộ gen, 1 tế bào thực hiện kỹ thuật F is a Sử dụng phương pháp sinh thiết phôi băng hệ thống kính hiển vị có hộ trợ tia laser. Sử dụng kỹ thuật chẩn đoán: + Kỹ thuật nhân gen PCR để phân tích các đột biến về gen. + Kỹ thuật nhân gen huỳnh quang để chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể. 4 Kỹ thuật nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm huỳnh quang FISH để phân tích bất thường nhiễm sắc thể. + Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel agarose và điện di mao quản. + Kỹ thuật phân tích kết quả bằng phần mềm GenMapper IĐ3.2, Kết quả và kết luận: Thành công trong kỹ thuật sinh thiết phôi ngày 3 và ngày 5. Tách thành công ADN từ một tế bào phôi sau khi sinh thiết và nhân c toàn bộ bộ gen của tế bào phôi phục vụ cho chẩn đoán bệnh di truyền ở các bước tiểp íheo. Đã chẩn đoán được bất thường nhiễm sắc thể ở 30 phôi đư bằng 2 phương pháp nhuộm huỳnh quang nhiễm sắc thể (FISH) và bằng nhân gen định lượng huỳnh quang (QFPCR). Cả hai phương pháp này đều cho kết quả khớp nhau hoàn toàn. Đã tiến hành nhân gen để chẩn đoán được nhóm máu của 9 phôi bào sau khi sinh thiết, ứng dụng cho chẩn đoán bất đồng nhóm máu giữa mẹ và con đối với gia đ nh mà có mẹ mang nhóm máu Rh(). *Từ khóa: Bệnh di truyền; Sinh thiết phôi; Quy tr nh tách AĐN. R s a rc h o f m b ry o b io p s y p ro c d u r , s p r a tin g th DNA o f m b ry o s f o r g n tic diagn ostics o f em bryo before transfer Summ ary In the world today there are about 300 genes involved in genetic diseases can be detected by PGD. In this specific group, nearly 200 different genetic disorders such as thalassemia, pernicious anemia, cystic fibrosis, hemophilia, Duchenne muscular dystrophy, amyotrophic marrow (SMA), congenital deafness etc. However, research in molecular biology applications serving genetic diagnosis by DNA extraction methods of embryo splitting is not much interested in Vietnam. So we made the topic "R s arch mbryo biopsy proc dur , s parating th DNA o f mbryos fo r g n tic diagnosis o f mbryos b for transf r" with the following objectives: * Học viện Quân y 436
Construction mbryo biopsy proc dur . Construction proc ss o f mbryo DNA s paration. - Th diagnosis o f g n tic dis as s b for mbryo transf r: S u b je c ts a n d m e th o d s : Study subjects were 30 embryo biopsies balance in Embryo Technology Center Military Medical University. In 30 embryos and 25 embryos bag 5 embryo cleavage. The biopsied embryos and in turn draw 2 cells: one cell's entire genome, 1 cells perform FISH technique. Use ice embryo biopsy method microscope system supports laser. Use of diagnostic techniques: Human gene PCR technique to analyze the genetic mutation; Technique fluorescent gene to diagnose abnormal number of chromosomes; Cells staining technique using fluorescent dyes to FISH analysis of chromosome abnormalities; Using the techniques of electrophoresis on agarose gel and capillary electrophoresis; Technical analysis software GenMapper results ID3.2. R e s u lts a n d c o n c lu sio n : Success in embryo biopsy techniques day 3 and day 5. Separation of DNA from a cell embryos after biopsy and the entire human genome of embryonic stem cells, which caters to diagnose genetic diseases in the next step. Have been diagnosed chromosomal abnormalities in embryos balance 30 with 2 fluorescent staining of chromosomes (FISH) and human genes and quantitative fluorescence (QFPCR). Both of these methods give results fully match. Conducted human genome to diagnose blood group of 9 after embryo biopsy.Diagnostic applications for alloimmunization between mother and child for families whose mothers carrying Rh. * Key words: Genetic diseases; Embryo biopsy; DNA separation. Chẩn đoán đi truyền trước chuyển phôi (PGD “ Preim plantation G enetic D iagnosis, sau này được gọi là sàng lọc di truyền trướ c chuyển phôi PGS (Preim plantation G enetic Screening). Trường hợp PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào nãm 1990. Đây là m ột chỉ định m ới so với những chỉ định trước đây cù a chẩn đoán tiền sản. Chỉ định này cho phép bố m ẹ có m ang gen tiềm ẩn m ột bệnh lý được biết trước có thể sinh ra m ột trẻ hoàn toàn không m ang gen bệnh. Đ iều này mang đến khả năng ứng đụng rất lớ n củ a PG D khi các nhà khoa học ngày càng p hát hiện nhiều bệnh lý ở người có Hên quan đén di truyền. T rên thế giới hiện nay có khoảng 300 gen liên quan đến bệnh di truyền có thể phát hiện bằng PG D. Trong nhóm ch ỉ định này, gần 200 bệnh lý di truyền khác nhau như: thalassem ia, bệnh thiếu m áu ác tính, xơ nang, bệnh ưa chảy máu, loạn dưỡng cơ D uchenne, teo c ơ tủy (SM A ), điếc bẩm sinh... Từ khoảng 2 thập niên trở lại đây, nhờ sự phát mạnh mẽ của kho a học k ĩ thuật, sinh học phân tử đã trở thành m ột công cụ hỗ trợ đắc lực cho chẩn đoán và điều trị các bệnh đi truyền. Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứn g dụng sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán bệnh di truyền bằng phương pháp tách ADN của phôi chưa được quan tâm nhiều ở V iệt Nam. V vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “N g h iê n c ứu quy trình sinh th iế t ph ôit tách A D N của p h ô i đ ể chẩn đoán bệnh di tru yền trướ c chuyển p h ô i” với các mục tiêu sau: Xây dự ng quy trìn h sin h thiết phôi. Xây dự ng quy trình tách A D N cửa p h ô i Chẩn đoán bệnh d i truyền trước chuyển phôi. 437
II. ĐỖI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Đối tượng nghỉên cứu 30 phôi dư được tiến hành sinh thiết tại Trang tâm Công nghệ phôi Học viện Quân y. Trong 30 phôi có 5 phôi túi và 25 phôi phân cắt. Các phôi này được sinh thiết và hút lần lượt 2 tế bào: 1 tế bào nhân toàn bộ bộ gen, 1 tế bào thực hiện kỳ thuật FISH Thiết b ị máy m c 7 ft" Máy định lượng ADN (Nano Drop- SA) Đèn soi u v (Bỉorad Mỹ) Máy ly tâm cao tốc (H ttỉch-Đức) Hệ thếng sinh thiết phôi (USA) v ạ ' " " , a r : Máy PCR A B I9700 (Appli d Biosyst m) Máy lắc ổn nhiệt (EppendorfĐức) H nh 1. Máy móc thiết bị phục vạ cho nghiên cứu 438
2.2. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp sinh thiết phôi bằng hệ thống kính hiển vị có hỗ trợ tia laser. Sử dụng kỹ thuật chẩn đoán: + Kỹ thuật nhân gen PC R để phân tích đột biến về gen. + Kỹ thuật nhân gen huỳnh quang để chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể. + Kỹ thuật nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm huỳnh quang FISH để phân tích bất thường nhiễm sắc thể. + Sử đụng kỹ thuật điện di trên gel agarose và điện di mao quản. + Kỹ thuật phân tích kết quả bằng phần mềm GenM apper ĨD3.2 III. K Ế T QUẢ 3.1. T h àn h công íro n g kỹ th u ậ t sin h th iết phôi ngày 3 v à n gày 5 Dưới đây là một sổ h nh ảnh phôi sau sinh thiết:
Dưới đây là h nh ảnh nhân toàn bộ bộ gen cua phôi: N s M N: mẫu chứng âm S ' ìĩtẩu nghiên cứu M: thang chuẩrt Hình ảnh điện dỉ kiểm tra nhân toàn bộ bộ gen Đã chẩn đoán được bất thường nhiễm sắc thể ở 30 phôi dư bằng 2 phương pháp nhuộm huỳnh quang nhiễm sắc thể (FISH) và bằng nhân gen định lượng huỳnh quang (QFPCR). Cả hai phương pháp này đều cho két quả khớp nhau hoàn toàn. Dưới đấy là kết quả h nh ảnh chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể: Kết quả chẩn đoán phôi thứ 5 (trỉsomy 21) & n ý *' "i > ' Phôi 8 mang 2 NST 13,18,21, và XY Phôi 5 mang 3 NST 21,2 NST 13,18, và XY 440
Bảng 1. Kết quả chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể bằng nhuộm huỳnh quang FISH Kết quả trên NST Kết quả trên NST Kết quả trên NST Phôi Phôi Phôi 13,18,21 và XY 13,'18,21 và XY 13,18,21 và XY Oỉ 46, XX 11 46, XY 21 46, XY 02 46, XX 12 46, XY 22 46, XY 03 45, XX, 13 13 46, XX 23 46, XY 04 46, XX Ỉ4 47, XY, +21 24 46, XX 05 47, XY, +21 15 47, XY, +21 25 47, XY, +21 06 47, XX, +13 16 46, XX 26 46, XY 07 47, XY, +21 17 46, XX 27 47, XX, +18 08 46, XY 18 45, X X ,18 28 46, XY 09 47,XYíh2 19 47,XXY 29 47, XX, +18 10 47,XY,+21 20 45, XO 30 46, XY Đã nhân gen để chẩn đoán nhóm máu cùa 9 phôi bào sau khi sinh thiết, ứ n g dụng để chẩn đoán bất đồng nhóm máu giữa mẹ và con đối với gia đ nh có mẹ mang nhóm máu Rh(). M âm (lương 1 2 3 4 5 6 7 8 9 40« 3ổ6lip 300 2 100 H nh 2. H nh ảnh điện di kiểm tra bất đồng nhóm máu M; M ark r Ỉ200bp; Ầm: chứng âm nước cất; Dư ng: chứng dư ng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 là các mẫu bệnh nhân nghiên cứu Sản phẩm PC R của gen RhĐ 366 bp. Từ kết quả trên cho thấy: trong 9 tế bào phôi này đều mang nhóm máu Rh(+), chứng tỏ chúng tôi íhực hiện thành công nhân gen RhD cho phôi sinh thiết. Tiến tới áp dụng kỹ thuật này cho các cặp bố mẹ mang nhóm máu Rh() để có khỉ định cần thiết khi mang thai. 3.3. Ý nghĩa và tính sáng tạo Ý nghĩa: Nghiên cứu này đã m ở ra tương lai cho các cặp gia đ nh có nguy cơ sinh ra những đứa trẻ mang dị tật di truyền bẩm sinh. 441
Góp phần quan trọng trong điều trị bệnh cho anh chị của m nh khi đứa trẻ khòe mạnh này ra đời nhờ kỹ thuật PGD. Góp phần loại bỏ dần các gen bệnh trong xã hội, để có được nguồn gen khỏe mạnh, giảm bớt gánh nặng cho gia đ nh và xã hội. Tính sáng tạo: Đây là một kỹ thuật cao, lần đầu tiên 4ược áp dụng tại Học viện Quân y. Lựa chọn được các phương pháp phù hợp cho việc chẩn đoán đối với từng bệnh di truyền. itỴrw v*tt â Ịh 4 ĩ *r> iÂ i LiJtiij i JtiAfvi JVJtiAO * rm ậ T f T ỊfT r%* Ti m r f ỉ. Trần Quang Hanh (2009). "Nhận xét kết quả chuyển phôi giai đoạn Blastocyte tại Trang tâm hỗ trợ sinh sàn bệnh viện phụ sản trang ương từ 2006 đến 2008". Luận văn thạc sỹ y học, Đại học y Hà Nội. 2. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Quách Thị Hoàng Oanh, Phạm Việt Thanh và Trương Đ nh Kiệt (2008). Chẫn đoán di truyền phân từ bệnh beta thalassaemia tại bệnh viện Từ Dũ TPHCM. Tạp chí Y học TPHCM, Tập 12 (phụ bản số I), 341347. 3. Nguyên Khắc Hân Hoan, Phạm ViệÈ Thanh và Trương Đ nh Kiệt, Lâm Thị Mỹ (2008). Chần đoán trước sinh bệnh thlassemia trên 290 trường họp thai. Tạp chí NCYH 74 (3), 17. 4. Alan H.HADNysiđe et ai. (2004). Isothermal whole genome amplification from single AĐN small numbers of cells: a new era for preimplantation genetic diagnosis of inherited disease. Molecular Human Reproduction Vol. 10, No.10 pp. 767772,2004. 5. Ali Hellani et al. Multiple displacement amplification on single ceil ADN possible PGD applications. Molecular Human Reproduction Vol. 10, No.11 pp. 847852,2004. 6. Avi Tsafrir et al. (2010). PGD for fragile X syndrome: ovarian function is the main determinant of success. Human Reproduction, Vol.25, No. 10 pp. 26292636, 2010. ĐÁNH GIÁ SỰ BỘC L ộ DẤU ẤN p53 VÀ BCL-2 TRONG UNG THƯ VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH BS. V ũ Ngọc H à* H ư ớn g dẫn: Th S. C hu Văn Đ ức* TÓM T T Các sản phẩm gen BcI2 và p53 tiếp tục được nghiên cứu rộng rãi để xác định các yếu tố tiên lượng bệnh và để t m ra biện pháp điều trị tối ưu. Mục đích nghiên cứu: (1) Xác định tỷ lệ bộc lộ dấu ấn Bcl2 và p53 cùa ung thư biểu mô íuyén vú. (2) Nhận xét mối liên quan giữa sự bộc lộ Bcl2 và p53 với t nh trạng đi căn hạch, Ihụ ihể nội tiết, độ mô học cũa ung thư biểu mô tuyến vú. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 207 khối nển cứa các bệnh nhân ung thư vú được nhuộm hóa mô miễn dịch (HMMD) với các dấu ấn Bcl2 và p53, ER, PR của hãng Dako. Kết quã: tỷ ỉệ Bcl2(+) cao hớn tỷ lệ p53(+) (60,9% vắ 36,7%). Bcl“2(+) và p53() chiếm tỷ lệ cao nhất (39,5%) và thấp nhất là tỳ ệ Bcl2() và p53(+): 15,5% (p=0,504). Ưng thư vú thụ íhể nội tiết dương u'nh có tỷ lệ p53(+) thấp hơn p53() (p