DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................................ iii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................................. iv
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................................. 1
MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………………………………………………………………………………………………...2
1.1. Thực phẩm chức năng cho hệ tiêu hóa: ................................................................................ 2
1.1.1.
Thực phẩm đƣờng ruột ...................................................................................................... 2
1.1.2.
Chuyển hóa thực phẩm đƣờng ruột ................................................................................... 2
1.1.3.
Hệ vi sinh vật đƣờng ruột: ................................................................................................. 3
1.1.4.
Thực phẩm chức năng đƣờng ruột: ................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về prebiotic ........................................................................................................... 4
1.2.1.
Định nghĩa prebiotic .......................................................................................................... 4
1.2.2.
Tính chất prebiotic ............................................................................................................ 5
1.2.2.1.
Tính chất hóa lí ......................................................................................................... 6
1.2.2.2.
Tính chất sinh lí ........................................................................................................ 7
1.2.3.
Tác động có lợi cho sức khỏe ngƣời ................................................................................. 8
1.2.4.
Tác động của prebiotic lên probiotic ............................................................................... 11
1.2.5.
Phân loại prebiotic........................................................................................................... 15
1.2.5.1.
Prebiotic có nguồn gốc tự nhiên ............................................................................. 15
1.2.5.2.
Prebiotic tổng hợp ................................................................................................... 16
1.2.6.
Prebiotic tiêu biểu ........................................................................................................... 17
1.2.6.1.
Fructooligosaccharide (FOS) ................................................................................. 17
1.2.6.1.1. Nguồn gốc ............................................................................................................ 18
1.2.6.1.2. Cấu tạo ................................................................................................................. 19
1.2.6.1.3. Tính chất .............................................................................................................. 19
1.2.6.1.4. Tình hình tổng hợp ............................................................................................... 23
1.2.6.1.5. Enzyme fructotransferase (FTS)- hoạt tính và cố định FTS ................................ 26
1.2.6.1.6. Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ ........................................................... 31
1.2.6.2.
Inulin ....................................................................................................................... 36
1.2.6.3.
Trans-galactooligosaccharide (TOS) ...................................................................... 37
1.2.7. Ứng dụng của prebiotic ................................................................................................... 40
1.2.8.
Hƣớng nghiên cứu và phát triển prebiotic ....................................................................... 41
i
1.2.8.1.
Hướng mở cho ngành thực phẩm ............................................................................ 41
1.2.8.2.
Trong y học, cải thiện sức khỏe người .................................................................... 41
1.3. Tổng quan về synbiotic ......................................................................................................... 41
1.3.1.
Khái niệm ........................................................................................................................ 41
1.3.2. Ứng dụng ......................................................................................................................... 42
1.4.
Sấy thăng hoa ........................................................................................................................ 43
1.4.1.
Định nghĩa ....................................................................................................................... 43
1.4.2. Ƣu, nhƣợc điểm sấy thăng hoa ........................................................................................ 43
1.4.3.
Các giai đoạn trong sấy thăng hoa .................................................................................. 44
CHƢƠNG 2: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KẸO VIÊN SYNBIOTIC…………………………………………. 47
2.1. Công nghệ sản xuất kẹo ........................................................................................................ 47
2.1.1.
Thuyết minh quy trình .................................................................................................... 47
2.1.2.
Vật liệu, phƣơng pháp ..................................................................................................... 49
2.1.3.
Thảo luận: hiệu quả sử dụng prebiotic ............................................................................ 51
2.1.3.1.
Hiệu lực prebiotic ................................................................................................... 51
2.1.3.2.
Đánh giá sản phẩm kẹo trong quá trình lưu trữ lạnh ............................................. 53
2.2. Ảnh hƣởng chế độ vi gói ....................................................................................................... 56
2.2.1.
Cơ sở khoa học vi gói...................................................................................................... 56
2.2.2.
Vật liệu, phƣơng pháp vi gói ........................................................................................... 58
2.2.3.
Thảo luận: tác động của vi gói ........................................................................................ 61
2.2.3.1.
Sự sống của các tế bào probiotic vi gói .................................................................. 61
2.2.3.2.
Nghiên cứu vỏ vi gói ............................................................................................... 61
2.3. Khảo sát tối ƣu môi trƣờng sấy thăng hoa .......................................................................... 63
2.4. Khảo sát, tối ƣu quả trình bảo quản .................................................................................. 64
2.5. Đánh giá cảm quan viên kẹo ................................................................................................ 67
2.6. Bảo quản kẹo synbiotic bằng bacteriocin: .......................................................................... 68
CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………73
Kết luận: ............................................................................................................................................ 73
Hƣớng phát triển ............................................................................................................................... 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………… 75
ii
CHƢƠNG 1…………………………………………………………………………………… 2
Bảng 1.2: Khả năng tiêu hoá của một số prebiotic trên đƣờng ruột ngƣời ........................... 7
Bảng 1.3 Ảnh hƣởng của prebiotic lên lipid máu ................................................................ 9
Bảng 1.4: Hàm lƣợng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) ................................. 18
Bảng 1.5: Đặc tính của FOS so với một số loại đƣờng khác .............................................. 20
Bảng 1.6 : Nguồn thực vật tổng hợp FOS ........................................................................... 24
Bảng1.7 : Vi sinh vật tổng hợp enzym sản xuất FOS ......................................................... 24
Bảng 1.9: Thành phần của trans-galactooligosaccharides: ................................................. 37
Bảng 1.10 : Kết quả kiểm tra vai trò của TOS trên động vật. ............................................ 39
CHƢƠNG 2…………………………………………………………………………………… 47
Bảng 2.1 Tính chất hóa lí của các prebiotic nghiên cứu ..................................................... 50
Bảng 2.2. Khả năng sống của LC-01, LB trong môi trƣờng khảo sát bảo quản ở 4oC ...... 55
Bảng 2.3 Hoạt độ nƣớc của các mẫu thí nghiệm Lactobacillus, Bifidobacterium ............. 62
Bảng 2.4 Tính chất lí hóa và lƣợng tế bào sống của kẹo..................................................... 68
Bảng 2.5 Bacteriocin đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn probiotic ............................................... 70
Bảng 2.6 Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactococcus lactis ......................................... 71
iii
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
CHƢƠNG 1……………………………………………………………………………………...2
Hình 1.1: Đơn phân monosaccharide của các NDOs .................................................... 6
Hình 1.2 Chuyển hóa acid béo ở gan ............................................................................ 10
Hình 1.3 Lượng tế bào sống probiotic qua thời gian bảo quản ...................................... 14
Hình 1.4 Giá trị pH và độ acid của L. acidophilus La-5 theo thời gian bảo quản ........ 14
Hình 1.5 Hàm lượng N phân giải L.casei-01 (a) or L. acidophilus La-5 (b). ................. 15
Hình 1.6: Sơ đồ các quá trình sản xuất của oligosaccharide prebiotic ......................... 17
Hình 1.7: Công thức cấu tạo của FOS ............................................................................ 19
Hình1.8: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu ........................................................... 21
Hình1.9: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu .......................................................... 21
Hình 1.10: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của FTS A.pullulans ..................... 27
Hình 1.11 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ ở quy mô công nghiệp ................ 33
Hình 1.12 Quá trình oxy hóa glucose dưới tác dụng của enzyme GOD ......................... 34
Hình 1.13: cấu trúc hoá học của inulin .......................................................................... 36
Hình 1.14 Biểu đồ chuyển hóa prebiotics ....................................................................... 41
Hình 1.15: Hệ thống sấy thăng hoa………………………………………………………… 46
CHƢƠNG 2………………………………………………………………………………….....47
Hình 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất kẹo viên synbiotic ............................................. 48
Hình 2.2 Hiệu quả sử dụng của prebiotic lên probitic ………………………………… 52
Hình 2.3 Biểu diễn sự thay đổi pH và TA cho bốn mẫu bảo quản ở 40C. ..................... 54
Hình 2.4 Phương pháp vi gói phun phủ ........................................................................ 57
Hình 2.5 Kĩ thuật tạo hạt gel vi gói ................................................................................ 58
Hình 2.6 Phần cắt ngang của gel casein sau vi gói Lactobacillus,Bifidobacterium...... 59
Hình. 2.7 Khả năng sống tế bào Bifidobacterium và Lactobacillus trong các mẫu khi sấy thăng hoa. ................................................................................................................. 61
Hình 2.8 Lượng tế bào Lactobacillus trên môi trường khảo sát trong sấy thăng hoa ... 63
Hình 2.9 Khả năng sống của Bifidobacterium bảo quản ở 4oC và 25 oC, 11%...............65 Hình 2.10 Khả năng sống của Bifidobacterium bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33%..65
Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 11%......66
Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33%.......67
Hình 2.13 Vi khuẩn gây bệnh bị ức chế hoạt động ở pH thấp (<3.5)………………….. 69
Hình 2.14 Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lc.lactis ……… …..72
iv
MỞ ĐẦU
Ngày nay, ta dƣờng nhƣ quá quen thuộc với các sản phẩm chức năng hỗ trợ tăng
cƣờng sức khỏe con ngƣời, giúp phòng ngừa và có thể chữa trị nhiều loại bệnh. Trong
số đó, có tác dụng khá lớn và cũng đƣợc nhắc đến khá nhiều đó là các sản phẩm có bổ
sung probiotic, nhƣ là: sữa chua probi, yakult, kem probiotic, phomat có chứa probiotic.
Thế nhƣng, khái niệm kẹo synbiotic là còn mới lạ, probiotic là những vi sinh vật
có tác động có lợi cho con ngƣời và động vật, nhƣ là lợi ích cho đƣờng tiêu hóa, tăng
cƣờng hệ miễn dịch, giảm dị ứng lactose, giảm ung thƣ…Prebiotic là những thành phần chất không tiêu hóa đƣợc, nhƣng có thể đƣợc lên men bởi hệ vi sinh vật đƣờng ruột
mang lại những lợi ích cho cơ thể chủ. Những lợi ích này sẽ càng có hiệu quả hơn nếu
kết hợp probiotic với prebiotic chức năng. Sự kết hợp đồng thời probiotic và prebiotic
mang lại sản phẩm synbiotic, cho nhiều tác động có lợi hơn nhiều so với khi chỉ sử
dụng đơn lẻ từng chất.
Viên kẹo synbiotic mang hƣơng vị sữa chua là một sản phẩm có sự kết hợp đó,
nhằm mang lại hiệu quả cao hơn cho sức khỏe con ngƣời. Với những điểm thú vị còn
chƣa khai thác hết, đã cuốn hút sinh viên thực hiện đề tài ―nghiên cứu sản xuất kẹo
viên synbiotic‖, mong muốn đƣợc làm sáng tỏ hơn lợi ích về synbiotic cũng nhƣ về sản
phẩm kẹo chức năng.
Nội dung và mục tiêu cần đạt đƣợc trong đề tài:
- Nghiên cứu sản xuất prebiotic, cụ thể là FOS trong quy mô công nghiệp, để
làm thành phần quan trọng bổ sung vào kẹo viên synbiotic.
- Nghiên cứu quy trình sản xuất kẹo synbiotic.
- Khảo sát ảnh hƣởng có lợi của prebiotic lên probiotic trong sản phẩm.
- Khảo sát yếu tố vi gói và tối ƣu môi trƣờng sấy thăng hoa, tác động của
chúng lên sự sống của probiotic.
v
- Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm.
Chƣơng 1: Tổng quan
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Thực phẩm chức năng cho hệ tiêu hóa:
1.1.1. Thực phẩm đƣờng ruột
Vi khuẩn thƣờng trú trong ruột già phụ thuộc vào nguồn cơ chất cung cấp cho
sự hoạt động và tăng sinh của chúng. Cơ chất này chủ yếu đƣợc cung cấp bởi chế độ ăn
uống, cũng có một phần từ nguồn nội sinh nhƣ mucin và chondroitin sulphate. Bất kỳ
thực phẩm nào không tiêu hóa ở phía trên đƣờng tiêu hóa (dạ dày, ruột non) đƣợc xem là một thực phẩm đƣờng ruột cho các vi sinh vật cƣ trú tại ruột già, phụ thuộc vào quá
trình lên men xảy ra, chúng có thể có những tác động tích cực hay tiêu cực cho sức khỏe của vật chủ [17].
Nguồn dinh dƣỡng carbohydrate là tiền chất chính cho quá trình lên men, ATP
đƣợc hình thành thông qua phosphoryl hóa cơ chất, phân hủy saccharose. Nguồn
cacbon chủ yếu là dinh dƣỡng cho vi khuẩn phát triển trong ruột già là tinh bột,
polysaccharide, cùng với các protein, peptide khác nhau và carbohydrate trọng lƣợng
phân tử thấp. Một loạt các endo và exo-glycosidase, protease, các amino- peptidase của
vi khuẩn có thể phân hủy các polyme phức tạp này, hình thành sản phẩm nhỏ hơn: đƣờng, amino axit. Vi khuẩn đƣờng ruột sau đó có khả năng lên men các chất trung
gian này để thành chất chuyển hóa có lợi khác.
1.1.2. Chuyển hóa thực phẩm đƣờng ruột
Các sản phẩm chủ yếu của lên men carbohydrate là các axit béo chuỗi ngắn
(SCFA) và các loại khí. Phần lớn các sản phẩm cuối cùng (95-99%) đƣợc hấp thu vào
máu. SCFA sinh ra là acetate, propionate và butyrate. Ngƣời ta cho rằng acetate đƣợc
làm sạch ở cơ bắp. Propionate phần lớn bị hủy trong gan, trong khi butyrate là nguồn năng lƣợng chính cho đƣờng ruột, các axit hữu cơ chẳng hạn nhƣ succinat và pyruvate thì làm tăng hiệu quả lên men trong ruột già. Các hệ thống trao đổi chất của SCFA trong gan đƣợc cho là đóng góp khoảng 7-8% nhu cầu năng lƣợng hàng ngày cho vật
chủ , tất cả cho thấy vai trò quan trọng của vi sinh vật đƣờng ruột trong quá trình dinh
dƣỡng ngƣời[17].
Sản phẩm cuối chiếm ƣu thế của quá trình lên men protein, gồm hợp chất
phenol, amoniac và một số amine. Những chất chuyển hóa này có liên quan trạng thái
Trang 2
lâm sàng nhƣ tâm thần phân liệt, tạo khối u, chứng đau nửa đầu.
Chƣơng 1: Tổng quan
Từ đây cho thấy, sản phẩm phân giải saccharose trong ruột là lành tính, trong khi
những chất phát sinh từ sự phân giải protein là bất lợi. Nhƣ vậy, có những kết quả tích
cực cũng nhƣ tiêu cực liên quan đến quá trình lên men vi khuẩn đƣờng ruột.
1.1.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột: Đƣờng ruột con ngƣời là một hệ khuẩn khu trú phức tạp trong đó có sự
tồn tại cân bằng hài hòa giữa các vi sinh đƣờng ruột và cơ thể chủ. Vi khuẩn đƣờng ruột đƣợc dùng nhƣ là một kích thích chính cho sự phát triển của hệ thống miễn dịch niêm mạc (Deplancke và Gaskins năm 2002; Macfarlane và Cummings 2002).
Cho tới nay, kiến thức về thành phần hệ vi khuẩn đƣờng ruột đã đƣợc nghiên
cứu, có chứa khoảng 400-500 loài vi sinh vật khác nhau trong đƣờng ruột. Các nhóm
chính có lợi quan trọng là Bacteroide, với đóng góp đáng kể : Bifidobacteria,
Clostridia, Fusobacteria, Eubacteria, Lactobacilli, Coliform, Peptococci,
Peptostreptococci, Streptococci kỵ khí. Số lƣợng các vi khuẩn đƣờng ruột lớn có thể cao tới 1012 trên gam vật liệu phân, và có nhiều đóng góp tích cực cho hệ tiêu hóa, chống táo bón, tiêu chảy... [17].
Hệ vi sinh vật của ruột già cũng có chứa các thành phần gây bệnh nếu phân giải
protein, sinh sản phẩm gây hại. Hơn nữa, cơ quan này là nơi cho các tác nhân gây bệnh
xâm nhiễm, chẳng hạn nhƣ các ký sinh trùng, vi rút và bacteria. Tác nhân vi khuẩn gây
bệnh truyền qua thực phẩm bao gồm Campylobacter, Salmonellae, Listeria và một số
chủng Escherichia coli. Theo thống kê năm 1996, E. coli sản xuất ra chất độc verocytoxin (VTEC) O157, làm 21 ngƣời chết, chúng cũng đƣợc cho là nguyên nhân
gây các bệnh đƣờng ruột nghiêm trọng nhƣ bệnh viêm ruột (loét đại tràng, bệnh Crohn),
ung thƣ ruột kết. Mới đây (tháng 6- 2011) Viện gen Beijing Genomics đã phát hiện và
khẳng định dòng E.coli O104 đang hoành hành ở châu Âu là một dòng vi khuẩn mới có
tính dễ truyền nhiễm và siêu độc, có khả năng kháng các loại kháng sinh chính nhƣ
sulfonamide, cephalothin, penicillin và streptomycin; chủng này đã gây tử vong 22
ngƣời [43].
1.1.4. Thực phẩm chức năng đƣờng ruột:
Nhìn chung, các thành phần khác nhau của các vi sinh vật đƣờng ruột có thể mang lại những giá trị thúc đẩy sức khỏe cũng có thể có những tác động tiêu cực gây ra
bệnh tật.
Trang 3
Từ đây, cần có chế độ dinh dƣỡng hợp lí, hỗ trợ bổ sung hệ vi khuẩn chức năng có lợi, và xem xét nguồn thực phẩm chức năng dùng cho hệ vi sinh này, thông qua đó
Chƣơng 1: Tổng quan
sẽ hạn chế đƣợc vi khuẩn gây hại. Probiotic, prebiotic và synbiotic là tất cả các phƣơng
pháp tiếp cận để cải thiện sức khỏe vật chủ bởi sự củng cố hệ vi khuẩn lợi trong đƣờng ruột. Đồng thời mang lại nhiều hiệu quả tích cực cho sức khỏe nhƣ: giảm ung thƣ, cải
thiện hệ xƣơng, duy trì hệ tiêu hóa khỏe mạnh, tăng cƣờng hệ miễn dịch, ngừa sâu răng,
giảm cholesterol trong máu… Từ những lợi ích lớn của dòng thực phẩm chức năng
đƣờng ruột này mang lại, đã cuốn hút sinh viên tìm hiểu và mong muốn nghiên cứu mảng thực phẩm probiotic, prebiotic, synbiotic này; và đi tìm hiểu cụ thể về ―sản xuất
kẹo viên synbiotic‖.
1.2. Tổng quan về prebiotic
1.2.1. Định nghĩa prebiotic
Prebiotic đƣợc xác định và định tên lần đầu tiên vào năm 1995 do Marcel
Robertfroid và Gibson, cho rằng: ―Prebiotic là những thành phần thực phẩm không tiêu
hóa, mang hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách kích thích chọn lọc sự tăng trƣởng và
hoạt động của một số hữu hạn vi khuẩn trong ruột kết, và do đó cải thiện sức khỏe vật
chủ‖ [15].
Tính chất của prebiotic có tiêu chí cải thiện sức khỏe bởi sự kích thích có chọn
lọc sự sinh trƣởng và hoạt động của một số hữu hạn vi khuẩn ruột, điều này khó mà xác
định đƣợc. Từ đây, các tác giả xem xét lại khái niệm và đề nghị một định nghĩa
mới[16]:
"Một prebiotic là thành phần không tiêu hóa, đƣợc lên men chọn lọc bởi vi sinh vật
đƣờng ruột, cho phép những thay đổi cụ thể, cả về thành phần và hoạt động của hệ vi
khuẩn đƣờng tiêu hóa, đem lại lợi ích và sức khỏe cho cơ thể chủ ".
Định nghĩa mới, cho thấy một sự phối hợp, cân bằng "prebiotic" và
"Bifidogenic", làm gia tăng nồng độ bifidobacteria trong phân ứng với mỗi gam
probiotic đƣợc bổ sung hàng ngày. Hiệu quả của bifidogenic phụ thuộc vào loại, nồng
độ của prebiotic và vào nồng độ bifidobacteria trong ruột của vật chủ.
Theo những nghiên cứu và báo cáo, Gibson và Roberfroid khẳng định : prebiotic
là nhóm các oligosaccharide, nhƣng không phải bất cứ loại carbonhydrate nào cũng có
thể xếp vào nhóm prebiotic mà chúng cần thoả mãn các yêu cầu sau:
- Chống chịu đƣợc môi trƣờng acid của dạ dày, không bị phân giải bởi
Trang 4
enzyme động vật và không bị hấp thu ở ruột non. - Có khả năng lên men bởi các vi khuẩn đƣờng ruột.
Chƣơng 1: Tổng quan
- Kích thích sự phát triển và hoạt tính của các vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ.
Prebiotic không nhất thiết phải là các chất không bị tiêu hoá mà chỉ cần khi đến
ruột kết chúng vẫn còn một lƣợng đủ lớn để làm cơ chất cho quá trình lên men ở đây.
Những carbohydrate nhƣ inulin và oligofructose (OF), (trans-) galacto-
oligosaccharides (TOS hoặc GOS) hoặc lactulose, thỏa mãn đầy đủ các tiêu chí, có thể
đƣợc lên men bằng vi khuẩn đƣờng ruột, (xem bảng 1.1; [33]).
Prebiotic
Cấu trúc
Nguồn trích Tác động
Tổng hợp từ Sac bởi -Fru
B, P
Fructooligosacchride (FOS) -D-Glu[-(12)--D-Fru]n,n=2-4
Oligofructo
Thủy phân inulin
B, P
[-D-Glu]m-D-Fru[-(12)--D-Fru]n
Inulin
chicoree
B, P
-D-Glu[-(12)--D-Fru]n,n=10-60
B, P
Galactooligosaccharide và TOS -D-Glu[-(14)--D-Gal[-(16)--Gal]n Tổng hợp từ lac bởi -Gal
Oligosaccharide đậu nành
B
[-D-Gal-(16)]n-D-Glu[-(12)--D-Fru Từ đậu nành
[-D-Gal-(14) --D-Fru
Lactulose
Lac B,P,PM
[-D-Gal-(14) --D-Glu-(12)--D-Fru Lac+Sac ( tổng hợp bởi -Fru)
Lactosucrose
B
Glucooligosaccharide
Sac+Mal(tổnghợpbởiGlT) B,nnE
Xylooligosaccharide (XO)
Trích từ bắpxylanthủy phân B
-Xyl[-(1-4)- -Xyl]nn=1-8
Thủy phân tinh bột(AmyAmy+Glase
isomalto oligosaccharide(IMO) -D-Glu[-(16) -D-Glu]nn=1-4
Thủy phân tinh bột(-Amy+ iso-Amy)
Maltooligosaccharid
-D-Glu[-(14) -D-Glu]nn=1-6
Viết tắt: Glu= Glucose, Fru= Fructose, Sac= Saccharose, Gal= Galactose, Mal=Maltose, -Fru=-Fructofuranosidase, -
Gal=-Galactosidase, GlT= Glucosyltransferase, //iso Amy=//iso-Amylase, -Glase = -Glucosidase, B=Bifidogen ,
P= pathogenic bacteria, PM= putrefactive metabolites, nnE= neonantal necrotising Enterocolitis
[33]
Bảng 1.1: Các oligosaccharide, prebiotic
1.2.2. Tính chất prebiotic
Các carbohydrate có thể đƣợc phân loại theo kích thƣớc phân tử hoặc mức độ thành các monosaccharit, trùng hợp (số đơn vị monosaccharide kết hợp), oligosaccharide hoặc polysaccharide. Theo danh pháp IUPAC, oligosaccharide đƣợc
định nghĩa là các saccharide có chứa từ 3 đến 10 đƣờng đơn. Cũng có định nghĩa khác,
Trang 5
số đơn phân có thể tăng lên 3-19 đơn vị.
Chƣơng 1: Tổng quan
Đồng thời, dựa trên những đặc tính sinh lý, có thể phân loại thành các
carbohydrate tiêu hóa hoặc không tiêu hóa đƣợc. Prebiotic - oligosaccharide không tiêu hóa (NDOs) có các nguyên tử C anomeric : C1 hay C2 trong các đơn vị
monosaccharide, có một cấu hình liên kết osidic không thể tiêu hóa đƣợc bởi sự thủy
phân của enzyme tiêu hóa (Roberfroid & Slavin, 2000). Các NDOs hiện có sẵn trong tự
nhiên , thành phần trong sản phẩm thực phẩm thƣờng có các monosaccharide đơn vị là
fructose, galactose, glucose và xylose (Hình 1.2) [35].
Hình 1.1: Đơn phân monosaccharide của các NDOs [35]
1.2.2.1. Tính chất hóa lí
NODs đƣợc hòa tan trong nƣớc và cho độ ngọt bằng 0,3-0,6 lần vị ngọt của
sucrose. Trong thực tế, vị ngọt phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, mức độ trùng hợp của
các oligosaccharide. Theo Roberfroid và Slavin (2000) độ ngọt giảm dần khi chiều dài chuỗi oligosaccharide tăng lên. Cƣờng độ ngọt thấp này khá hữu ích chế biến trong các loại thực phẩm, có thể dùng để thay thế sucrose (có nhƣợc điểm độ ngọt hơi cao).
Ngoài ra, khi so sánh với mono-và disaccharide, prebiotic có trọng lƣợng phân
tử lớn hơn, tƣơng ứng cũng sẽ có độ nhớt cao hơn.
Sự ổn định có thể khác nhau ở từng oligosaccharide prebiotic, tùy thuộc vào dƣ
Trang 6
lƣợng đƣờng, dạng vòng C cấu hình anomeric và các loại liên kết. Mối liên kết β- glycosidic thì mạnh hơn mối liên kết α-glycosidic, và đƣờng hexose liên kết bền vững hơn đƣờng pentose. Tuy nhiên, ở pH < 4.0 và nhiệt độ cao hoặc lƣu trữ trong thời gian
Chƣơng 1: Tổng quan
dài tại điều kiện phòng, bất kì oligosaccharide nào trong thực phẩm đều có thể bị thủy
phân, dẫn đến việc mất dinh dƣỡng và giảm tính chất hóa lý (Voragen, 1998).
Các oligosaccharide prebiotic cũng có thể đƣợc sử dụng để làm thay đổi nhiệt độ
đóng băng của thực phẩm đông lạnh, đƣợc dùng để điều khiển cƣờng độ màu của thực
phẩm do phản ứng Maillard; trong quá trình gia nhiệt chế biến, chúng cũng làm tăng
khả năng giữ ẩm.
Giá trị calo của NDOs đƣợc ƣớc tính là 1,5-2,0 kcal/g, chiếm khoảng
40-50% của những carbohydrate tiêu hóa nhƣ sucrose (Sako và cộng sự, 1999.)
1.2.2.2. Tính chất sinh lí
Mặc dù oligosaccharide có tính chất hóa lý quan trọng , nhƣng các lợi ích mang
đến trong thành phần thực phẩm lại chủ yếu do đặc tính sinh lý quyết định.
Prebiotic là những chất khó tiêu:
Prebiotic khó tiêu là do cấu trúc hoá học của nó: cấu tạo từ nhiều đơn phân
( n>= 3), và có những đơn vị tạo liên kết β-glycosidic, không bị thủy phân bởi enzyme
tiêu hóa và acid dịch vị; chính vì vậy có tính bền vững hay một số tính chất đƣợc nêu
trong phần tính chất hóa lý.
Hai công trình nghiên cứu của Bach Knudsen và cộng sự (1995) và Ellegard
(1997) đã chứng minh prebiotic vẫn giữ nguyên một lƣợng lớn (86 – 89%) khi đến ruột
già [19].
Cơ chất
Tác giả công bố, năm
Mô hình thí nghiệm
Lƣợng nạp vào
Lƣợng còn lại
Phần trăm còn lại
(%)
(g)
(g)
7.07
6.1
86
Kỹ thuật mở ruột thông
Inulin
Bach Knudsen và Hessov, 1995
21.2
18.4
87
hồi
17.0
15.0
nt
Inulin
88
Ellegard và cộng sự, 1997
Oligofructose nt
15.5
13.8
89
Oligofructose nt
20.1
6.0
Molis và cộng sự, 1996
89
Trang 7
Bảng 1.2: Khả năng tiêu hoá của một số prebiotic trên đƣờng ruột ngƣời
Chƣơng 1: Tổng quan
Một số kết quả nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra khả năng không bị tiêu hoá của
prebiotic nhƣ: khi dung nạp prebiotic thì lƣợng đƣờng trong máu không tăng (Hidaka, 1986; Rumessen, 1990). Prebiotic khó bị phân giải bởi dịch tiêu hoá từ dạ dày (Nilsson
và cộng sự, 1988).
Những kết quả trên cùng với hàng loạt nghiên cứu khác đã chứng tỏ prebiotic
không bị tiêu hoá trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời.
Prebiotic là nguồn dinh dƣỡng của vi sinh vật có lợi trong đƣờng ruột. Nhƣ vậy prebiotic sau khi đi qua gần hết ống tiêu hoá vẫn còn một lƣợng lớn. Khi đến ruột già prebiotic trở thành nguồn dinh dƣỡng cho hệ vi sinh vật ở đây. Trong số các nhóm vi khuẩn kị khí bắt buộc hiện diện trong đƣờng tiêu hóa, các bifidobacteria
và lactobacilli là những chủng sử dụng chủ yếu oligosaccharide đƣợc coi là các vi
khuẩn có lợi. Lúc này prebiotic đƣợc lên men nhờ khuẩn lợi ở ruột kết.
Sở dĩ các vi sinh vật này có khả năng sử dụng prebiotic là do chúng có thể tiết ra
một số enzyme ngoại bào có khả năng phân giải các liên kết -(2-1)glycosidic. Sản
phẩm của quá trình lên men prebiotic là acid béo mạch ngắn (SCFA) nhƣ acetate, propionate, butyrate và L-lactate, sinh khối vi sinh vật, và các khí CO2, H2, CH4. Tuy nhiên chỉ một chủng vi sinh vật thì chƣa đủ để lên men tuyệt đối prebiotic mà cần sự
phối hợp của nhiều chủng khác nhau. Ví dụ nhƣ các chủng Bacteroide có khả năng sử
dụng carbohydrate có chỉ số polymer hoá (DP) cao, trong khi các chủng Bifidobacteria
chỉ sử dụng đƣợc các loại carbohydrate với chỉ số DP thấp.
Khả năng lên men, tốc độ lên men prebiotic còn phụ thuộc vào cấu trúc, độ trùng
hợp, liên kết glycosidic, mức độ phân nhánh của chúng, sự kết hợp với vi khuẩn trong
quá trình lên men, mối quan hệ giữa cơ chất và các sản phẩm lên men (Voragen, 1998).
Prebiotic mạch thẳng thì dễ lên men hơn prebiotic mạch nhánh. Prebiotic có cấu trúc
càng giống tự nhiên thì càng dễ tiêu thụ bởi các vi sinh vật đƣờng ruột.
1.2.3. Tác động có lợi cho sức khỏe ngƣời 1.2.3.1. Tác động lên chế độ ăn uống
Prebiotic không bị tiêu hóa bởi enzyme trong đƣờng ruột. Vì vậy, chúng làm tăng kích thƣớc khối phân, trọng lƣợng phân, và tần số phân, có tác động tích cực phòng táo bón và tốt cho niêm mạc ruột già [8]. Prebiotic cho tác dụng tích cực khi sử dụng đều hàng ngày, và với lƣợng dùng là 2-10g/ngày.
Trang 8
1.2.3.2. Tác động lên hệ vi khuẩn đường ruột
Chƣơng 1: Tổng quan
Ảnh hƣởng tích cực của prebiotic và synbiotics cho hệ vi khuẩn đƣờng ruột là
thúc đẩy tăng sinh các vi khuẩn có lợi (bifidobacteria và lactobacilli) , ức chế các vi sinh vật có khả năng gây bệnh, cũng nhƣ sự ổn định của môi trƣờng đƣờng ruột bằng
cách giảm pH và sinh ra axit hữu cơ chuỗi ngắn, đã đƣợc nghiên cứu, xác nhận trong
các thí nghiệm và đƣợc kiểm tra khảo sát lại trên cơ thể động vật. Inulin, oligofructose,
TOS, synbiotic làm tăng bifidobacteria và lactobacilli, ức chế chủng vi khuẩn gây bệnh cho con ngƣời và động vật (Clostridium spec., E. coli, Campylobacter jejuni,
Enterobacterium spec., Salmonella enteritidis, hoặc S. typhimurium).
1.2.3.3. Tác động lên sự chuyển hóa lipid
Những nghiên cứu gần đây nhằm đánh giá prebiotic ảnh hƣởng lên
lipid máu (Bảng 1.3). Ba nghiên cứu cho thấy giảm đáng kể cholesterol lipoprotein lƣợng thấp (LDL) và tổng số, không có thay đổi đáng kể triacylglycerol (TAG) [28].
Tác giả
fructan
Liều lƣợng
Ảnh hƣởng lên
glucose
Yashashati cs Canzi cs
FOS inulin
8g ( 2 w) 9g (4 w)
Lipid TC, LDL glucose TC
NS
Luo cs Causey cs
FOS inulin
20g (4 w) 20g (3 w)
NS TAG
NS NS
Bảng 1.3 Ảnh hƣởng của prebiotic lên lipid máu
TC: cholesterol tổng, NS: không đáng kể, w: tuần
[17]
Cơ chế hạ lipid của prebiotic
Prebiotic đƣợc biết nhƣ một cơ chất lý tƣởng cho phát huy hoạt động của vi
khuẩn trong ruột kết, đáng chú ý bifidobacteria và lactobacilli. Trong quá trình lên men các sản phẩm sinh ra bao gồm các loại khí (H2S, CO2, H2, CH4), lactate và SCFAs (acetate, butyrate và propionate). Các SCFAs, acetate và propionate đi vào dòng máu,
và sẽ đƣợc sử dụng bởi gan. Acetate đƣợc chuyển thành acetyl CoA trong gan và có vai trò nhƣ là một cơ chất cho sự tổng hợp lipid ; trong khi propionate đã đƣợc báo cáo ức chế sự tổng hợp lipid. Butyrate, mặt khác, đƣợc phân giải bởi các tế bào ruột già
(colonocytes) và đã đƣợc chứng minh chống lại sự hình thành khối u trong đƣờng ruột.
Trang 9
Các loại SCFAs đƣợc sản xuất trong quá trình lên men phụ thuộc vào các chủng vi khuẩn, các chủng này đƣợc kích hoạt bởi prebiotic. Inulin đã đƣợc chứng minh là tăng
Chƣơng 1: Tổng quan
cả lƣợng acetate và butyrate, galacto-oligosaccharides cũng có tác dụng làm tăng sản
xuất acetate và propionate và xylo-oligosaccharides chỉ tăng acetate [17].
Trong một nghiên cứu đã xác định cơ chế hoạt động của prebiotic lên động vật,
mà hai đại diện quan trọng là inulin và FOS. Các nghiên cứu in vitro thử nghiệm trên
tế bào gan chuột , cho rằng hoạt động OF có liên quan đến sự ức chế tổng hợp
cholesterol nhờ SCFA propionate. Trực tràng có mặt acetate và propionate, kết quả là propionate ngăn cản sự hợp nhất acetate đến TAG đƣợc giải phóng từ gan. Fiordaliso
và cs chứng minh giảm đáng kể TAG trong máu, phospholipid và cholesterol trong chuột, khi chúng đƣợc cho ăn với 10% (w/v) OF. Các thí nghiệm cũng chỉ ra rằng FOS làm giảm lƣợng lipoprotein mức thấp (VLDL), TAG và phospholipid đƣợc tổng
hợp trong gan thông qua este hóa acid béo và glycerol-3-phosphate để tạo thành
VLDL. Việc giảm cholesterol trong những con chuột chỉ cho kết quả sau khi thời gian
dài (16 tuần) cho ăn với OF. Bằng chứng gần đây cho rằng ảnh hƣởng của OF làm
giảm VLDL TAG là do làm giảm hoạt động của các enzym lipogenic (acetyl-CoA ,
cacboxylaza, acid béo synthase, enzym malic, ATP citrate lyase và glucose 6-
phosphate dehydrogenase). Hình 1.2
1.2.3.4. Ảnh hưởng lên đường huyết: glucose và isulin
Cơ chế tác động của prebiotic vào việc giảm mức độ glucose và insulin
đƣợc đề xuất có liên quan với các SCFA, đặc biệt là propionate. Một nghiên cứu trên
động vật gần đây cho thấy một sự suy giảm cả insulin và glucose sau bốn tuần cho ăn
với OF. Các hiệu ứng này đã đƣợc hình thành do hoạt động của OF lên sự tiết hormone
ruột, glucosedependent insulinotropic polypeptide (GIP) ở ruột non và glucagon-like
peptide 1 (GLP- 1) ở cuối hồi tràng và đại tràng [17] .
Trang 10
Hình 1.2 Chuyển hóa acid béo ở gan [17]
Chƣơng 1: Tổng quan
1.2.3.5. Dinh dưỡng cho trẻ sơ sinh
Trong những năm gần đây những nỗ lực đã đƣợc thực hiện để cải thiện chế độ
dinh dƣỡng cho trẻ bú bình nhằm tạo ra một hệ vi sinh vật đƣờng ruột chứa lợi khuẩn
cao tƣơng tự nhƣ của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ trong 2 đến 3 tháng đầu. Điều này đã đƣợc
thực hiện bằng cách cho trẻ bú sữa có bổ sung cả probiotic: bifidobacteria , lactobacilli và Fructo, galacto-oligosaccharide . Yếu tố quyết định sự thành công đó là lựa chọn áp
dụng bổ sung Fructo và galactooligosaccharide [28].
Oligosaccharide sữa mẹ đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và điều hòa miễn dịch của sữa mẹ. Nếu đều đặn bổ sung oligofructose, galacto-oligosaccharide
vào các công thức dành cho trẻ sơ sinh với số lƣợng 0,4-1 g/100 ml trong thời gian
nuôi từ 3 đến 12 tuần tuổi, sẽ cho kết quả gia tăng đáng kể bifidobacteria trong phân từ
20% đến xấp xỉ 60% (em bé bú sữa mẹ ~ 80%).
Ngoài ra, các thí nghiệm ở động vật cũng nhƣ các nghiên cứu ở trẻ sơ sinh và trẻ
em (1 và 14 tuổi ), cho thấy lợi thế khác của việc bổ sung prebiotic, probiotic , hoặc
synbiotic vào thực phẩm cho trẻ đã làm giảm viêm ruột non, giảm rotavirus và do đó
làm giảm tiêu chảy ở trẻ em [24].
Trẻ em ở Thái Lan, Brazil, Mexico, Tây Ban Nha, và Bồ Đào Nha mắc chứng
suy dinh dƣỡng, chế độ cho ăn bổ sung prebiotic đã làm tăng hấp thu canxi giúp tăng
trƣởng và cải thiện sức khỏe cũng nhƣ kích thích miễn dịch, làm giảm các vấn đề dị
ứng [31].
1.2.3.6. Ảnh hưởng bất lợi của prebiotic
Tác dụng phụ của carbohydrate prebiotic, nếu dùng số lƣợng quá nhiều prebiotic
,qua quá trình lên men trong ruột già sinh ra lƣợng lớn khí có thể dẫn đến đầy hơi, hoặc
làm rối loạn tiêu hóa , và tiêu chảy. Trong một thử nghiệm cho 80 ngƣời khỏe mạnh
dùng 31g - 41g oligofructose, tƣơng ứng 0,04- 0,06 g/kg trọng lƣợng cơ thể [53]. Nhận
đƣợc kết quả là một số ngƣời trong số họ bị rối loạn tiêu hóa. Nhìn chung, nên dùng
10-20 g oligofructose hoặc inulin mỗi ngày sẽ không gây tác dụng phụ.
1.2.4. Tác động của prebiotic lên probiotic Nếu prebiotic đƣợc bổ sung chúng sẽ ảnh hƣởng đến đƣờng ruột và có tính nhuận tràng, thông qua việc tác động lên các lợi khuẩn hoặc probiotic. Acid béo mạch
Trang 11
ngắn ( SCFA) là sản phẩm chính của prebiotic lên men, chúng làm kích hoạt sự phát triển của vi khuẩn và quá trình lên men.
Chƣơng 1: Tổng quan
Để có thể phát huy tác dụng, prebiotic cần đi đến manh tràng. Nhƣ đã biết
prebiotic khó bị tiêu hóa bởi enzyme ruột non và tuyến tụy do cấu trúc hóa học, cũng nhƣ tỉ lệ cơ chất của từng loại prebiotic ( có loại prebiotic tinh khiết chứa đến 86-87%
oligosaccharide nhƣ inulin và FOS, có loại chỉ chứa 20- 30% oligosaccharide còn lại là
tinh bột và polysaccharide không phải tinh bột nhƣ XOS chứa 29.4% oligosaccharide,
41% tinh bột, 15% là monosaccharide) [23]
Prebiotic khi đến đƣợc manh tràng sẽ là những cơ chất tiềm năng cho lên men
bởi hệ vi khuẩn. Trong phần này sẽ khảo sát sự ảnh hƣởng, tác động của inulin và FOS lên vài chủng probiotic đại diện: L. casei , L. paracasei, Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis. Các chủng giống đƣợc phân lập và nuôi trên10% (w / v) thạch sữa tách kem (Himedia, Ấn Độ) ủ ở 37oC trong 72h điều kiện hiếu khí cho và chủng Lactobacillus paracasei, điều kiện kỵ khí cho các chủng
khác Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis. Các
chủng qua sấy thăng hoa sẽ đƣợc kích hoạt cấy trên môi trƣờng MRS (Biokar
Diagnostics, Pháp).
Tiến hành thử nghiệm khảo sát trên ba nhóm môi trƣờng, chuẩn bị nhƣ sau: -
Môi trƣờng sữa kiểm chứng: lƣợng 50-ml sữa bò tiệt trùng ở 110-1120 C trong 10 phút.
-
Môi trƣờng sữa đông tụ probiotic: tƣơng tự cho lƣợng 50-ml sữa bò tiệt trùng ở 110-1120 C trong 10 phút, có thêm 2% các chủng L. casei-01, L. acidophilus La-5 hoặc B. lactis B94
-
Môi trƣờng sữa đông tụ synbiotic : giống môi trƣờng sữa probiotic nhƣng đƣợc bổ sung thêm 20 g L -1 một hỗn hợp của FOS: Inulin (50:50) (Beneo- Orafti, Bỉ).
Tiến hành phân tích hóa học để đánh giá:
-
Độ pH của các môi trƣờng sữa đông bằng cách đo trực tiếp với pH kế (Micro pH năm 2002, Crison, Tây Ban Nha), trong khi độ axit đƣợc xác định theo phƣơng pháp AOAC (1990).
-
Đánh giá thành phần acid hữu cơ và đƣờng sử dụng trong các mẫu sữa đông bằng bộ máy HPLC của Merck LaChrom (Fullerton CA, USA).
- Tổng nitơ (TN): N tan trong nƣớc (WSN) và phi protein (NPN) đƣợc xác
Trang 12
định theo phƣơng pháp Kjeldahl.
Chƣơng 1: Tổng quan
Dùng phƣơng pháp phân tích ba chiều của phƣơng sai (ANOVA) để đánh giá ý
nghĩa thống kê của thí nghiệm.
Qua các thí nghiệm ta thu các kết quả nhƣ sau:
Khả năng tồn tại của probiotic
B. lactis B94 và L. casei-01, trong cả hai môi trƣờng sữa đông probiotic và synbiotic, đạt đƣợc số lƣợng tế bào tối đa là 109-1010 cfu g-1 trong 5 đến 30 ngày bảo quản (Hình 1.3 a, b) trong môi trƣờng sữa đông probiotic L. acidophilus La-5 đã không thể hiện một sự tăng trƣởng đáng kể, giá trị cao nhất lƣợng tế bào trong 30 ngày
đầu bảo quản chỉ gần 8.5 log cfu/g; nhƣng nuôi trong môi trƣờng sữa synbiotic thì đạt
Trang 13
lƣợng tế bào cao hơn 9 log cfu/g (hình 1.3 c)[11].
Chƣơng 1: Tổng quan
Hình 1.3 Lượng tế bào sống probiotic qua thời gian bảo quản[11] môi trƣờng sữa probiotic môi trƣờng sữa synbiotic
(a)B. lactis B94, (b)L. casei-01, (c)L. acidophilus La-5
Tuy lƣợng tế bào trong hai môi trƣờng sữa probiotic và synbiotic của B. lactis
B94 , L. casei-01 tƣơng đƣơng nhau trong 30 ngày đầu bảo quản, nhƣng 15 ngày sau
đó lƣợng trong môi trƣờng sữa probiotic là giảm đáng kể, thấp hơn 8 log cfu/g đối với
B. lactis B94 và < 8.5 log cfu/g đối với L. casei-01. Trong khi nếu dùng môi trƣờng sữa
synbiotic lƣợng tế bào vẫn duy trì ở mức từ 8.5 - 9 log cfu/g .
Khả năng phân giải carbonhydrate
Khảo sát sự phân giải các đƣờng tạo acid hữu cơ mạch ngắn (acid lactic, acid
propionic…), đánh giá thông qua độ pH và độ acid đo đƣợc .[13]
Hình 1.4 giá trị pH và độ acid của chủng L. acidophilus La-5 theo thời gian bảo quản[11]
môi trƣờng sữa symbiotic
môi trƣờng sữa probiotic
Trang 14
Chƣơng 1: Tổng quan
Kết quả cho thấy nuôi trong môi trƣờng sữa synbiotic hiệu quả hơn, phân giải
tạo các acid hữu cơ mạch ngắn nhiều hơn, tạo điều kiện cho sự phát triển L. acidophilus trong môi trƣờng acid hơn. Theo Su, Henriksson, và Mitchell (2007), cả
L. casei B. lactis có thể phát triển tốt trên môi trƣờng bổ sung FOS hay Inulin. Các hợp
chất prebiotic có tác dụng làm giảm độ pH, tạo ra acid lactic và acetic cao hơn. Dễ dàng
nhận thấy, chủng L. acidophilus La-5 cho thấy tác dụng rõ rệt của việc bổ sung prebiotic vào môi trƣờng sữa đông, pH của môi trƣờng sữa synbiotic là thấp hơn môi
trƣờng sữa probiotic, đồng thời đạt độ acid cũng cao hơn, nhƣng độ acid này không quá thấp để gây ảnh hƣởng khuẩn lactis.
Khả năng phân giải protein
Sự phân giải protein : lƣợng Nito hòa tan trong nƣớc WSN và Nito phi protein
NPN tăng trong suốt thời gian lƣu trữ đối với môi trƣờng probiotic và synbiotic, còn
môi trƣờng kiểm tra thì không, điều này thể hiện vai trò thực tế của enzyme
probiotic trong nỗ lực phân giải protein (Hình 1.5). ở chủng L. acidophilus La-5, cho
thấy hiệu quả của việc bổ sung prebiotic, lƣợng protein phân giải là cao hơn hẳn trong
môi trƣờng chỉ có sữa đông probiotic.[11]
Hình 1.5 Hàm lượng N phân giải L.casei-01 (a) or L. acidophilus La-5 (b)[11].
Kiểm chứng
probiotic
synbiotic
1.2.5. Phân loại prebiotic
1.2.5.1. Prebiotic có nguồn gốc tự nhiên
Prebiotic có thể đƣợc tìm thấy trong thành phần tự nhiên nhƣ trong sữa, mật ong, trái cây và rau quả: hành tây, rau diếp xoăn, tỏi tây, tỏi, atisô, chuối, lúa mạch đen, và
Trang 15
cây củ hạ. Phần lớn nồng độ dao động từ 0,3% đến 6% trọng lƣợng tƣơi đối với các
Chƣơng 1: Tổng quan
loài, riêng với rau diếp xoăn và cây củ hạ prebiotic chiếm khoảng 5% đến 10% trọng
lƣợng.
Măng tây, củ cải đƣờng, tỏi, rau diếp xoăn, hành tây, lúa mì, mật ong, chuối, lúa
mạch, cà chua là nguồn đặc biệt của fructooligosaccharide (Sangeetha et al, 2005; Yun,
năm 1996;. Ziemer & Gibson, 1998). Isomaltulose có trong mật ong, nƣớc mía, và các
sản phẩm từ mía nhƣ mật đƣờng (Lina và cộng sự, 2002.). Xylooligosaccharide có trong măng, hoa quả, rau, sữa và mật ong (Vázquez và cộng sự, 2000.).
Galactooligosaccharides đƣợc thấy tự nhiên trong sữa ngƣời và có mức nhỏ hơn trong bò sữa (Alander et al, 2001.).[36]
1.2.5.2. Prebiotic tổng hợp
Tổng hợp prebiotic bằng cách thủy phân polysaccharide, và bằng cách tổng hợp
từ nguồn disacarite nhờ sử dụng enzyme. [36]
Galactooligosaccharide đƣợc sản xuất thƣơng mại hóa nhờ β-galactosidases xúc
tác , enzyme này có hoạt động nhƣ transgalactosylation. Trong quá trình sản xuất công
nghiệp galactooligosaccharide, dung dịch lactose nồng độ cao - tinh sạch từ dịch whey
sữa bò, là đƣợc sử dụng nhƣ cơ chất trong phản ứng này. Đƣờng galactose sẽ đƣợc
chuyển đến tổng hợp mạch dài hơn vào lactose. Các sản phẩm chính là các
trisaccharide, cụ thể là 4’- hoặc 6’-galactosyllactose, và các oligosaccharide chuỗi dài
gồm 4 hoặc nhiều hơn 4 đơn vị monosacarit (Sako và cộng sự, 1999.).
Giống nhƣ galactooligosaccharide, lactulose cũng là sản xuất từ lactose, nhƣng
trong trƣờng hợp này, quá trình đồng phân hóa trong môi trƣờng kiềm đƣợc sử dụng để
chuyển đổi các đơn phân glucose của lactose thành fructose. Sản phẩm lactulose tƣơng
đối đắt tiền, không chỉ vì năng suất sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng thấp (20-30%) , mà
còn do chi phí tinh sạch cao: tách galactose, axit isosacharic và các sản phẩm màu
đƣợc tạo ra bởi sự thoái biến một phần lactulose (Villamiel, Corzo, Foda, Montes, &
Olano, 2002).
Các quy trình công nghiệp sản xuất fructooligosaccharide có thể đi từ hai cách:
một là, đƣợc sản xuất từ các đƣờng đôi sử dụng enzym β-fructofuranosidase có hoạt động chức năng transfructosylation. Tƣơng tự nhƣ sản xuất galactooligosaccharide,
nguồn nguyên liệu đầu vào yêu cầu có nồng độ cao (Park & Almeida, 1991). Theo Yun (1996) nồng độ sucrose khác nhau từ 600-850 g/l nên đƣợc sử dụng nhằm tiết kiệm chi phí bốc hơi trong quá trình chế biến cuối cùng. Phƣơng pháp thứ hai đƣợc sử dụng cho sản xuất fructooligosaccharides là thủy phân kiểm soát inulin (inulin oligofructose),
Trang 16
chất này có thể đƣợc chiết xuất từ rễ rau diếp xoăn, (Crittenden & Playne, 1996).
Chƣơng 1: Tổng quan
Isomaltulose, cũng đƣợc nhắc nhƣ là palatinose, là một disacarit tự nhiên sản
xuất từ sucrose , thông qua cơ chế sắp xếp lại các mối liên kết glycosidic từ (1,2)-
fructoside thành (1,6)-fructoside (Lina và cộng sự, 2002.).
Sơ đồ tổng hợp các prebiotic ở hình 1.6
Hình 1.6: Sơ đồ đại diện của các quá trình sản xuất của oligosaccharide prebiotic [36] 1.2.6. Prebiotic tiêu biểu
1.2.6.1. Fructooligosaccharide (FOS)
Trang 17
Đƣờng FOS nổi bật từ những năm 1980 và đƣợc nghiên cứu nhiều hơn cả, không chỉ vì công nghệ sản xuất đơn giản, mà nó còn có nhiều đặc tính sinh học có lợi
Chƣơng 1: Tổng quan
cho sức khỏe con ngƣời, mang đầy đủ các đặc tính của một prebiotic: kích thích tiêu
hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride, chống béo phì, an toàn cho ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng, ngăn ngừa sâu răng … Đặc biệt, FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Ca, Mg, Fe…, ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bằng ion Mg2+, Ca2+ trong cơ thể, chống loãng xƣơng.
Ở Mỹ, inulin và FOS là những sản phẩm dẫn đầu thị trƣờng, tiếp sau đó là GOS. Ở Nhật, Công ty Meiji Seika là công ty đầu tiên sản xuất thành công sảm phẩm FOS
thƣơng mại bằng enzyme chuyển hóa từ Asp. niger và bán trên thị trƣờng với tên thƣơng mại là Neosugar (1984). Gần đây hơn, công ty Cheil Food & Chemicals ở Hàn Quốc đã thành công trong việc cố định tế bào nấm sợi Aureobasidium pullulans để sản
xuất FOS quy mô công nghiệp. FOS đang dần thay thế các loại đƣờng truyền thống
nhƣ đƣờng kính, và ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và thức ăn gia
súc.
1.2.6.1.1. Nguồn gốc
FOS có nhiều trong tự nhiên, tồn tại trong các loại rau quả nhƣ chuối, mận, đào,
quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi… Hàm lƣợng FOS ở một số loại rau quả có thể tham
khảo ở bảng 1.4
Bảng 1.4: Hàm lƣợng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) [7]
Loại cây quả
1-Kestose (GF2) 5.9 1.7
Nystose (GF3) 0.1 0.0
Fructofuranosylnystose (GF4) 0.0 1.11
Tổng FOS (GFn) 6.0 2.8
Chuối Quýt
Đào Lê
3.5 0.8
0.0 0.0
0.0 0.0
3.5 0.8
Mận Dƣa hấu Măng
1.8 2.8 0.3
0.2 0.0 0.0
0.0 0.1 0.0
2.0 3.0 0.3
Rau dền đỏ Rau cần tây
0.1 0.2
0.0 0.0
0.0 0.4
0.1 0.6
Hành ta Dứa Nhật Bản
0.4 0.5
0.3 0.0
0.4 0.0
1.1 0.5
Cà chua Tỏi
0.2 8.7
0.0 1.2
0.4 0.4
0.6 10.3
Cây atiso Hành tây
93.9 15.5
94.3 6.7
98.1 4.2
286.2 26.4
Trang 18
Chƣơng 1: Tổng quan
1.2.6.1.2. Cấu tạo
FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân tử
đƣờng sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết -2,1- glucoside. Công thức tổng quát của đƣờng FOS là GFn, trong đó n là số nhóm n = 2, 3, 4 (G là gốc đƣờng glucose, F là gốc đƣờng fructose), tƣơng ứng là các đƣờng 1- kestose (GF2), nystose (GF3) và fructofuranosylnystose (GF4) với công thức cấu tạo nhƣ hình 2.5.
Trong đó, ketose GF2 gồm ba loại: 1-ketose [ 1F(1--D- fructofuranosyl sucrose)], neoketose [ 6G(1--D- fructofuranosyl sucrose)], 6-ketose [ 6F(1--D- fructofuranosyl sucrose)]. Các fructooligosaccharide có độ polime hóa cao (GF3, GF4…)có công thức [ 1F(1--D- fructofuranosyl)n-1 sucrose], đƣợc tạo ra bằng cách chuyển đơn vị đƣờng fructosyl đến sucrose tạo liên kết tại vị trí -2,1 của sucrose.[26]
Hình 1.7: Công thức cấu tạo của FOS [33]
Trang 19
1.2.6.1.3. Tính chất
Chƣơng 1: Tổng quan
20 là Theo Gross, kestose là loại đƣờng kết tinh màu trắng có góc quay cực []D +28.50 và nhiệt độ nóng chảy là 199 – 2000C. Độ ngọt của kestose, nystose và fructofuranosylnystose so với sucrose lần lƣợt là 31%, 32% và 16%. Độ ngọt tổng của
Tính chất vật lí
ba loại đƣờng này (FOS) chỉ bằng 30% độ ngọt của đƣờng sucrose [26].
Vị ngọt của FOS tƣơng tự sucrose. Đƣờng FOS hút ẩm mạnh, nªn khã b¶o qu¶n ë tr¹ng th¸i tinh thÓ trong thêi gian dài. Ở cïng mét nång ®é, FOS cã ®é nhít cao hơn ®é nhít cña sucrose. §é bÒn nhiÖt cña FOS cũng cao h¬n sucrose. §ƣêng FOS bÒn trong d¶i pH 4.0- 7.0 và nhiÖt ®é cao tíi 1400C [26].
Ở dạng lỏng, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, không màu hoặc màu vàng nhƣ
syrup, có mùi trái cây và vị ngọt. Ở dạng bột, FOS có màu trắng đến vàng nhạt, mùi trái
cây và vị ngọt, FOS hòa tan trong nƣớc [4].
Mét sè t¸c gi¶ khi nghiªn cøu vÒ tÝnh chÊt ho¸ lý cña FOS ®Òu ®ƣa ra mét kÕt luËn chung là cã nhiÒu tÝnh chÊt hãa lý tƣ¬ng tù sucrose nhƣ ®é hòa tan, ®é ®«ng ®Æc, nhiÖt ®é s«i và c¸c th«ng sè vÒ qu¸ tr×nh kÕt tinh. [26].
Bảng 1.5: Đặc tính của FOS so với một số loại đƣờng khác
Đƣờng Độ ngọt Độ ổn định Độ nhớt Tính hút
(Sucrose = 1) ẩm
2 – 10 Thấp Cao 0.7 Sorbitol
2 – 10 Rất thấp Cao 0.9 Xylitol
2 – 10 Thấp Thấp 0.5 Mannitol
2 – 10 Rất thấp Thấp 0.65 Erythritol
2 – 10 Cao Trung bình 0.75 Maltitol
2 – 10 Cao Thấp 0.60 Isomalt
Nhiệt độ pH < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C < 1600C 2 – 10 2 – 10 2 – 10 Rất thấp Cao = sucrose Trung bình Trung bình Trung bình 0.40 0.75 0.30 Lactitol Maltidex FOS
[7]
Tính chất hóa sinh:
Là một đại diện tiêu biểu cho prebiotic, nên FOS cũng mang đầy đủ tính chất
prebiotic:
Trang 20
- FOS kh«ng hoÆc rÊt Ýt bÞ thuû ph©n bëi hÖ enzyme ®ƣêng ruét, nªn khi ¨n lƣîng ®ƣêng trong m¸u kh«ng bÞ biÕn ®éng.ThÝ nghiÖm vÒ sù thay ®æi hàm
Chƣơng 1: Tổng quan
lƣîng ®ƣêng và insulin trong m¸u theo thêi gian sau khi ¨n FOS ®· cho kÕt
qu¶ nhƣ h×nh 1.8; 1.9 và [7]. KÕt qu¶ cho thÊy tr¸i víi sucrose, khi ¨n FOS, trong cùng một kho¶ng thêi gian, lƣîng ®ƣêng trong m¸u kh«ng hÒ thay
®æi
Hình1.8: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu [7]
Hình1.9: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu [7]
- Vẫn còn hiện diện khi đến ruét già, đƣợc lªn men trong ruét già dƣíi t¸c
dông cña vi khuÈn Bifidobacterium. KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh là sinh ra c¸c acid
bÐo m¹ch ngắn (SCFA) nhƣ acid acetic, acid propionic và acid butyric. C¸c chÊt này sau ®ã ®ƣîc thÊm vào thành ruét già hoÆc chuyÓn lªn gan, øc chÕ sù -gia t¨ng cña glucose và chÊt bÐo trong m¸u.
- Các sản phẩm SCFA sinh ra giúp cải thiện lipid, cholesterol trong máu ( nhƣ cơ chế đã đƣợc trình bày trong 1.1.3.3). Sù gia t¨ng hàm lưîng acid sÏ cã
Trang 21
t¸c dông gi¶m pH trong ®ưêng ruét, gi÷ g×n ho¹t ®éng trao ®æi chÊt cña c¸c vi sinh vËt ®ưêng ruét kh¸c æn ®Þnh, ®óng quy luËt, h¹n chÕ hoÆc ng¨n ngõa
Chƣơng 1: Tổng quan
sù ph¸t triÓn cña c¸c vi sinh vËt g©y bÖnh và c¸c vi sinh vËt g©y thèi r÷a. Ở møc ®é cao h¬n nghiªn cøu cßn chØ ra r»ng qu¸ tr×nh gi¶m pH trong ®ưêng ruét cã t¸c dông trùc tiÕp phßng và trÞ bÖnh ung thƣ ruét th«ng qua viÖc ng¨n trõ sù ph¸t triÓn cña bacterium ho¹i sinh và øc chÕ ho¹t lùc cña c¸c enzyme
như nitroreductase, β-glucoronidase và decarboxylase. §©y là nh÷ng enzyme tham gia qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ nit¬ t¹o c¸c s¶n phÈm trung gian cã kh¶ n¨ng g©y ung thư (nh÷ng dÉn xuÊt phenol cña tyrosin và tryprophan). [7].
Nhƣ vËy FOS cã vai trß kh¸ tÝch cùc nhƣ sau: làm giảm làm lƣợng glucose, isulin và chất béo trong máu. Ngoài ra, còn có thể điều chỉnh các enzym tổng
hợp acid béo.
Ảnh hưëng cña FOS ®Õn hÖ vi sinh vËt đường ruột
T¸c ®éng cña FOS ®Õn hÖ vi sinh vËt ®ƣêng ruét ®· ®ƣîc nhiÒu t¸c gi¶ nghiªn cøu. B»ng thÝ nghiÖm ngo¹i thÓ, Gross.D khi nghiªn cøu hÖ vi sinh vËt trùc tràng cho
thÊy c¸c nßi Bifidobacterium spp. và Bacteroides spp cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh trong m«i
trƣêng dinh dƣìng cã chøa FOS, ngƣîc l¹i vi sinh vật gây bệnh Escherichia coli và
Clostridium perfringens l¹i bÞ tiªu diÖt trong m«i trƣêng này. Cßn kÕt qu¶ thÝ nghiÖm trªn c¬ thÓ ngƣêi và ®éng vËt ë c¸c løa tuæi kh¸c nhau sau khi ¨n FOS cho thÊy sè
lƣîng vi sinh vËt Bifidobacterium và Lactobacilli trong ®¹i tràng t¨ng lªn, trong khi ®ã
sè lƣîng vi sinh vËt Clostridium perfringens l¹i gi¶m xuèng. ThÝ nghiÖm cßn chØ râ r»ng do FOS cã cÊu t¹o m¹ch th¼ng ng¾n nªn ®· t¸c ®éng ®Õn kh¶ n¨ng lªn men cña c¸c vi sinh vËt nãi trªn. Cßn c¸c lo¹i fructoligosaccharides m¹ch nh¸nh hoÆc inulin m¹ch th¼ng nhƣng dài th× ¶nh hƣëng trªn rÊt h¹n chÕ.
Ảnh hưëng cña FOS ®Õn bÖnh s©u r¨ng
BÖnh s©u r¨ng chñ yÕu là do vi khuÈn Streptococcus mutans và c¸c liªn cÇu
khuÈn g©y nªn. C¸c vi sinh vËt trªn cã rÊt nhiÒu trong khoang miÖng cña ngƣêi và ®éng vËt. Khi thøc ¨n ®ƣa vào, chóng sÏ lùa chän c¸c thành phÇn dinh dƣìng phï hîp ®Ó lªn
men, ph¸t triÓn và g©y bÖnh. Streptococcus mutans sử dụng nguồn đƣờng tạo thành các
acid và -glucans không tan là nguyên nhân chính gây sâu răng.V× vËy nÕu trong thành
phÇn thøc ¨n cña ta kh«ng chøa hoÆc chøa Ýt chÊt thÝch hîp cho qu¸ tr×nh dinh dƣìng cña lo¹i vi sinh vËt trªn sÏ cã thÓ ng¨n ngõa ®ƣîc bÖnh.
Trang 22
§Ó xÐt ¶nh hƣëng cña FOS ®Õn bÖnh s©u r¨ng ngƣêi ta ®· thÝ nghiÖm trªn c¬ thÓ chuét. KÕt qu¶ cho thÊy nhãm chuét thÝ nghiÖm (¨n FOS) bÞ s©u r¨ng Ýt h¬n nhiÒu so víi nhãm chuét ®èi chøng (¨n sucrose) [7].
Chƣơng 1: Tổng quan
Vai trß thóc ®Èy qu¸ tr×nh hÊp thô calcium cña FOS:
NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy, sö dông FOS cã thÓ t¨ng cƣêng sù hÊp thô calcium cña tÕ bào. Nhê ®Æc tÝnh này, FOS cã thÓ gióp cho con ngƣêi phßng và chèng c¸c bÖnh vÒ chuyÓn ho¸ và bÖnh lo·ng xƣ¬ng. Qu¸ tr×nh thóc ®Èy hÊp thô calcium cña FOS x¶y ra trong ruét già. C¬ chÕ thóc ®Èy trªn chƣa ®ƣîc x¸c ®Þnh mét c¸ch râ ràng nhƣng cã mét kÕt luËn chung là do ba yÕu tè sau:
- §ƣêng FOS trong ruét già bÞ c¸c vi sinh vËt sinh acid lªn men, làm gi¶m pH
cña m«i trƣêng, dÉn ®Õn sù t¸i hoà tan cña c¸c muèi calcium.
- Trong ruét già vi khuÈn Bifidobacterium lªn men m¹nh khi m«i trƣêng cã chøa FOS sinh ra c¸c acid m¹ch ng¾n, c¸c acid này khuyÕch t¸n vào tÕ bào
biÓu b× thành ruét, tõ ®ã thóc ®Èy sù hÊp thô calcium.
- Sù dÞch chuyÓn FOS trong ruét già sÏ kÐo theo sù dÞch chuyÓn cña hîp chÊt calcium-protein, nhê ®ã calcium ®ƣîc tiÕp xóc nhiÒu h¬n víi c¸c tÕ bào thành ruét, t¹o ®iÒu kiÖn tèt cho sù hÊp thô vào m¸u. Ngoài calcium, FOS ®ång thêi cßn thóc ®Èy sù hÊp thô c¶ magiª. §iÒu này thóc ®Èy qu¸ tr×nh ph¸t triÓn xƣ¬ng, t¨ng cƣêng hàm lƣîng calcium trong xƣ¬ng [7].
1.2.6.1.4. Tình hình tổng hợp
V× FOS cã s½n trong tù nhiªn, tån t¹i trong c¸c lo¹i c©y cñ nªn nguån enzim tæng hîp FOS ®Çu tiªn ph¶i lμ tõ c¸c lo¹i thùc vËt trªn. ( bảng 1.6 nêu một số loại thực vật
3
có FOS) hoÆc b»ng c¸c phƣơng ph¸p ho¸ häc, ho¸ lý, ho¸ sinh... Alen vμ Bacon [5] ®· ph¸t hiÖn trªn l¸ c©y cñ c¶i ®êng cã chøa enzim xóc t¸c sacaroza t¹o ra hai trioza thuéc nhãm fructooligosacarit lμ 1-kestoza vμ 6-kestoza. Trong c©y atiso chøa enzim tæng hîp ) vμ c¸c enzim tæng hîp ®êng fructooligosacarit cã ph©n tö ®êng tetrasacarit (GF
n
lîng lín h¬n (GF ). Trong cñ hμnh t©y vμ m¨ng tre cßn chøa phøc hÖ ba enzim cã tªn
gäi lμ:
- 1
G -FT)
- 6
F -sacaraza: sacaraza (SST) G -fructosyltransferaza (6 F -FT)
F -fructosyltransferaza (1
- 1
Cho tới nay phƣơng pháp đực coi là hiệu quả nhất và có khả năng công nghiệp
hóa là phƣơng pháp tổng hợp vi sinh. Bắt đầu bằng sự phát hiện một số chủng nấm men
Trang 23
và nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzymexusc tác quá trình chuyển hóa sucrose thành, với các chủng Aspergillus cho hiệu quả tổng hợp FTS cao đƣợc ứng dụng nhiều
Chƣơng 1: Tổng quan
trong sản xuất FOS, Aspergillus sydowi có thể tổng hợp đƣờng FOS với mức polymer
hóa cao: DP từ 3-13 [33], bảng 1.7 nêu ra các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym chuyển hóa FOS. Đ· cã rÊt nhiÒu nghiªn cøu vÒ lÜnh vùc s¶n xuÊt ®ưêng này theo c«ng nghÖ sinh hãa. C¸c nghiªn cøu chñ yÕu tËp trung vào viÖc ph©n lËp tuyÓn chän gièng ®Ó sinh tæng hîp enzyme, øng dông enzyme trong s¶n xuÊt FOS và nghiªn cøu tinh chÕ FOS.
Bảng 1.6 : Nguồn thực vật tổng hợp FOS
Nguồn
Tác giả
Agave americana (Cây thùa)
Bhatia và cs. (1979);
Agave vera cruze (Cây thùa)
Nandra và Bhatia (1980) Bhatia và cs. (1954, 1955);
Asparagus officinalis (măng tây)
Satyanarayana (1976) Shiomi và cs. (1976, 1979a, 1979b, 1980, 1981, 1982)
Allium cepa (củ hành)
Darbyshire và cs. (1978); Henry và Darbyshire (1980)
Cichorium intybus (rau diếp xoăn)
Shingh và Bhatia (1971); Chandorkar và Collins (1972)
Crinum longifolium Lá củ cải đƣờng
Bhatia và cs. (1959) Allen và Bacon (1956)
Helianthus tuberosus (atisô Jerusalem)
Edelman và Dickerson (1966); Scott và cs. (1966); Praznik và cs. (1990)
Lactuca sativa L. (rau diếp) Lycoris radiata (hạt cây đơn tử diệp)
Chandorkar và Collins (1972) Nagamatsu và cs. (1990)
Taraxacum officinale (cây bồ công anh)
Chandorkar và Collins (1972)
[7]
Bảng1.7 : Vi sinh vật tổng hợp enzym sản xuất FOS
Nguồn
Tác giả
Aureobasidium pullulans
Jung và cs. (1987, 1989); Yun và cs. (1990,
1992, 1993a, b, c, d); Smith và cs. (1980) Hayashi và cs. (1989, 1990, 1991a, b)
Aureobasidium sp.
Fujita và cs. (1990) Duan và cs. (1994)
Arthrobacter sp. Aspergillus japonicus
Aspergillus niger
Hidaka và cs. (1988, 1989); Bealing và Bacon (1953)
Trang 24
Chƣơng 1: Tổng quan
Aspergillus oryzae
Pazur (1952); Kida và cs. (1988); Bealing
Aspergillus phoenicis
và Bacon (1953) Balken và cs. (1991)
Aspergillus sydowi Claviceps purpurea
Muramatsu và cs. (1988); Dickerson (1972); Arcamone và cs. (1970)
Fusarium oxysporum
Penicillium frequentans
Gupta và cs. (1982); Maruyama và cs. (1979); Patel và cs. (1994) Usami và cs. (1991)
Penicillium spinulosum Phytophthora parasitica
Bealing và Bacon (1953) Hankin và Meintype (1977)
Scopulariopsis brevicaulis Saccharomyces cerevisiae
Takeda và cs. (1994) Straathof và cs. (1986)
[7]
Nghiªn cøu sinh tæng hîp FOS từ enzyme FTS
B»ng nghiªn cøu cña m×nh Hidaka ®· t×m ra nhiÒu chñng vi sinh vËt thuéc c¸c loài nhƣ Aspegillus awamori, Saccharomices cerivisiae, Aspegillus niger… cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS. Th«ng qua qu¸ tr×nh ph©n lËp, tuyÓn chän theo ho¹t lùc chuyÓn ho¸ và tû lÖ ho¹t tÝnh chuyÓn ho¸ víi ho¹t tÝnh thuû ph©n (UT/UH), t¸c gi¶ ®· kh¼ng ®Þnh nÊm mèc Asp. niger là nguån vi sinh vËt tèt nhÊt cho lªn men tæng hîp FTS.
Phƣơng pháp lên men FTS: bằng cách lên men chìm hiếu khí với một số chủng
nấm, và các thông số của quá trình lên men nhƣ độ thoáng khí, khuấy đảo, pH và nhiệt độ cần đƣợc xác định cho từng loại vi sinh vật. Điều kiện chung cho tổng hợp FTS
thông qua nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng đã đƣợc nghiên cứu kĩ. Ví dụ nhƣ
sucrose là nguồn carbon tốt nhất cho sự phát triển sinh khối và hoạt động của enzyme. pH cần duy trì lớn hơn 5.5 và nhiệt độ tối ƣu cho tế bào sinh trƣởng là khoảng 300C. Ở Aureobasidium sp., enzyme nội bào sau đó đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng. Hoạt động của enzyme nội bào đƣợc kích thích mạnh khi tăng nồng độ ion Mg2+. Khi hàm lƣợng sucrose trong môi trƣờng bị giới hạn, FOS sẽ đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp carbon. Sau 6h nuôi cấy với 20% sucrose, khoảng 55% (w/w) FOS đƣợc tạo thành. Tế
bào vi sinh vật sau đó đƣợc loại ra khỏi canh trƣờng bằng cách ly tâm và enzyme đƣợc chiết tách nhờ lysozyme hoặc có thể cố định số tế bào vi sinh vật chứa enzyme đó và đƣa vào sản xuất FOS [26].
Trang 25
Mét ®Æc ®iÓm chung cho tÊt c¶ c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn cho thÊy, hÇu hÕt FTS trong c¸c vi sinh vËt t×m ®ƣîc chñ yÕu là enzyme néi bào và lu«n chøa ®ång thêi
Chƣơng 1: Tổng quan
c¶ hai ho¹t tÝnh là thuû ph©n và chuyÓn ho¸. Tû lÖ ho¹t lùc cña hai ho¹t tÝnh trªn thay
®æi phô thuéc vào chñng lo¹i gièng và ®iÒu kiÖn lªn men, ®iÒu kiÖn ph¶n øng… [7].
1.2.6.1.5. Enzyme fructotransferase (FTS)- hoạt tính và cố định FTS
FTS là tên gọi chung cho các enzyme có hoạt tính xúc tác quá trình chuyển dịch
gốc fructose. Quá trình trên có thể xảy ra theo hai cách là cắt không gắn và cắt rồi gắn. Khả năng xúc tác cắt không gắn của enzyme là hoạt tính thủy phân (viết tắt là UH), còn khả năng cắt rồi gắn là hoạt tính chuyển hóa (viết tắt là UT).
Nhiều nhà nghiên cứu vẫn gọi tên loại enzyme dùng sản xuất FOS là -D-
fructofuranosidase, một loại enzyme thuộc nhóm thủy phân kí hiệu EC.3.2.1.26.
Nguyên nhân có thể là do hoạt tính chuyển gốc fructose ban đầu đƣợc phát hiện ở
enzyme invertase khi tiến hành thí nghiệm với mẫu có nồng độ sucrose cao. Trong khi đó số khác lại gọi enzyme này là fructosyltransferase, kí hiệu EC.2.4.1.9, nhằm phân
biệt với các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân khác [26].
Phụ thuộc vào vị trí gắn các gốc fructose lên chất nhận, enzyme này đƣợc phân ra nhiều loại với các tên gọi khác nhau nhƣ: 6G-fructosyltransferase (6G-FT), 6F- fructosyltransferase (6F-FT) và 1F-fructosyltransferase (1F-FT). Các enzyme trên xúc tác lên phân tử sucrose tạo các FOS có phân tử lƣợng nhƣ nhau nhƣng không giống nhau về cấu trúc phân tử. Ba enzyme 6G-FT , 6F-FT và 1F-FT xúc tác gắn vào phân tử đƣờng ở các vị trí khác nhau tạo ra các đƣờng tƣơng ứng.
Các FTS có nguồn gốc từ thực vật chỉ có hoạt tính UT, nhƣng mang tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối (gắn gốc fructose vào phân tử đƣờng sucrose khác ở nhiều vị trí khác
nhau). Khác với enzyme tổng hợp từ vi sinh vật, FTS trong thực vật có phân tử nhỏ hơn
và trong phân tử không chứa nhóm glucoside. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chúng là 300C – 450C [7].
Trong khi đó FTS có nguồn gốc từ vi sinh vật lại có cả hai loại hoạt tính UT và UH nhƣng hoạt tính gắn lại có tính đặc hiệu cơ chất gần nhƣ tuyệt đối. Enzyme FTS có nguồn gốc khác nhau cũng khác nhau về cấu tạo hóa học. FTS tổng hợp từ vi sinh vật là những enzyme đa cấu tử, có phân tử lƣợng cao (>10.000 Da), trong phân tử có chứa các nhóm glucoside. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme này là 500C – 600C, rộng hơn so với enzyme từ thực vật, pH thích hợp là 5 - 6.5 và nồng độ sucrose từ 700-850g/l [26].
Trang 26
Một số chất ức chế và xúc tác hoạt động chuyển hóa của FTS cũng đƣợc nghiên cứu. Ở loài cây Agave americana, FTS đƣợc xúc tác bởi các ion Ca2+, Mg2+, Co và Li+
Chƣơng 1: Tổng quan
và bị ức chế bởi Ag+, Pb, Hg, Al3+ và Sn. Trong khi đó, enzyme sản xuất bởi loài nấm sợi Aureobasidium sp. bị ức chế bởi Hg, Cu và Pb [26].
FTS là loại enzyme đặc hiệu, nó chỉ có thể tác dụng xúc tác phân cắt và gắn kết
gốc fructose trong phân tử sucrose hoặc các dẫn xuất của sucrose để tạo thành FOS.
Còn ở trong dung dịch chỉ có fructose và glucose thì enzyme này không có khả năng
xúc tác tạo FOS.
Cơ chế chung cho phản ứng chuyển hóa gốc fructose nhƣ sau:
GF + fructosyltransferase F – fructosyltransferase + G
F-fructosyltransferase + GF GF2 + fructosyltransferase
Hình 1.10 cho thấy cơ chế xúc tác phản ứng tạo các FOS từ sucrose của
fructosyltransferase thu từ A.pullulans.
Hình 1.10: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của FTS
A.pullulans [26] G, GF, GF2, GF3, GF4 lần lƣợt là glucose, sucrose, 1-kestose, nystose, 1F-
fructofuranosylnystose.
Quá trình tổng hợp này, cần hai loại enzyme tổng hợp riêng biệt: để tổng hợp trisaccharide (GF2) nhờ đến hoạt động của sucrose: sucrose 1F- Fructosyltransferase (SST); sau đó oligosaccharide (GFn) tổng hợp đƣợc cần đến enzyme fructan: fructan 1F- Fructosyltransferase (FFT).
Hoạt tính enzyme FTS
Trang 27
Hidaka và c¸c céng sù là nh÷ng ngƣêi ®Çu tiªn nghiªn cøu kh¶ n¨ng c«ng nghiÖp ho¸ s¶n xuÊt FOS tõ ®ƣêng kÝnh nhờ enzym fructosyltransferase . ¤ng còng là ngƣêi ®·
Chƣơng 1: Tổng quan
®ƣa ra phƣ¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t lùc fructosyltransferase (FTS) và ®¹i lƣîng biÓu thÞ
mèi liªn quan gi÷a ho¹t lùc FTS và hiÖu suÊt chuyÓn ho¸ sucrose thành FOS (tû lÖ ho¹t
T
tÝnh chuyÓn ho¸ víi ho¹t tÝnh thuû ph©n U ) mà cho tíi nay vÉn ®ƣîc coi nhƣ là /U H
phƣ¬ng ph¸p c¬ së cho hÇu hÕt c¸c nghiªn cøu liªn quan tíi FOS.
Hoạt tính thủy phân và tổng hợp của enzyme FTS ngoại bào sản xuất từ chủng
nấm sợi đƣợc xác định bằng cách đo lƣợng glucose và fructose sinh ra, bằng cách dùng
phƣơng pháp xác định đƣờng khử theo Miler [18].
Một đơn vị hoạt tính tổng hợp (UT) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần xúc
tác cho sinh ra 1M glucose trong một phút tại những điều kiện phản ứng xác định.
Một đơn vị hoạt tính thủy phân (UH) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần xúc
tác cho sinh ra 1M fructose tại những điều kiện phản ứng xác định.
Tỉ lệ T/H cũng là hiệu suất chuyển hóa sucrose thành FOS sẽ biểu thị đƣợc khả
năng sinh tổng hợp của enzyme có trong môi trƣờng phản ứng.
Tiến hành xác đinh hoạt tính enzyme và hiệu suất chuyển hóa nhƣ sau:
- Trộn 90 L cơ chất sucrose và 100L dịch trích enzyme thu đƣợc từ Aspergillus BT18 đem ủ hỗn hợp phản ứng xảy ra ở 45oC trong 15 phút, sau đó đun nóng lên 100 oC khoảng 5 phút thì dừng phản ứng.
- Tạo một hỗn hợp: trộn 1mL dung dịch glucose với 22mg ATP, trộn hỗn hợp tiếp với 13mL nƣớc, kèm bốn đơn vị hexokinase và hai đơn vị glucose-6-
phosphate dehydrogenase.
- Lấy 950L hỗn hợp trên thêm 50L dịch phản ứng dừng ở bƣớc 1. ủ ở 37 oC trong 20 phút đặt trong tôi, đem đi đo quang phổ ở bƣớc song OD595, lƣợng glucose sinh ra (G1) đƣợc xác định.
- Thêm vào 0.1 U enzyme phosphoglucose isomerase sau đó ủ ở 37 oC trong 20 phút đặt trong tối, đo OD595 lần nữa và xác định nồng độ glucose (G2) - Nồng độ fructose trong mẫu đƣợc xác định bằng hiệu số G2-G1, hiệu suất
chuyển hóa của enzyme FTS đƣợc xác định bởi công thức G1/ (G2-G1).
FTS nội bào và ngoại bào:
Trang 28
Enzyme là loại protein đƣợc tạo thành bên trong tế bào, các enzyme này thƣờng không có khả năng di chuyển qua màng sinh học nên phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Những enzyme nội bào này muốn thu nhận phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phƣơng pháp[4].
Chƣơng 1: Tổng quan
- Phƣơng pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền. - Phƣơng pháp vật lí: dùng song siêu âm. - Phƣơng pháp hóa hoc: dùng dung môi butyric, aceton, ethanol…
Một số enzyme đƣợc tách khỏi tế bào, để thực hiên nhiệm vụ chuyển hóa cơ chất,
thực hiện các phả ứng ngoài tế bào. Những enzyme này có khả năng hòa tan trong môi
trƣờng nƣớc, đƣợc gọi là những enzyme ngoại bào[20].
Xu hƣớng gần đây gia tăng sử dụng prebiotic đặc biệt là FOS trong ngành công
nghệ thực phẩm đã thúc đẩy các nghiên cứu về các enzyme và chủng vi sinh vật tổng hợp FOS. Enzyme FTS ngoại bào đƣợc nghiên cứu gần đây có nguồn gốc từ nấm men
và một số chủng vi khuẩn.
Theo Maugeri và Hernalsteens và cs (2007), nấm men có trong hoa và quả thuộc
rừng nhiệt đới Brazil, có khả năng tạo enzyme ngoại bào có hoạt tính tổng hợp fructose
cao. Một trong số những chủng tiềm năng này là Rhodoturula spp. (LEB- V10). Enzyme này không có hoạt tính thuy phân, nhƣng thay vào đó có thể hoạt động đƣợc trong nền cơ chất sucrose nồng độ 50%(w/w).
Inulinase từ Kluyveromyces marxianus đƣợc nghiên cứu bởi Santos và
Maugeri, 2007. Enzyme ngoại này có khả năng sản xuất chuyên biệt 1-F
fructooligosacchride
Một chủng khác là Schnniomyces occidentalis đƣợc mô tả dùng tổng hợp 6-
ketose ( nghiên cứu bởi Alvaro- Benito và cs, 2007), chủng này tạo enzyme có hoạt
động chính là thủy phân sucrose.
Chủng vi khuẩn Bacillus macerans có thể sản xuất FTS, dịch trích enzyme thô có thể tổng hợp chọn lọc GF5, GF6, trong khi đó enzyme này nếu đem tinh sạch chỉ tổng hợp chủ yếu 1-ketose và nytose nhƣ những enzyme FTS khác ( Park và cs, 2001).
Thu nhận enzyme
Hidaka ®· kÕt luËn r»ng sucrose là nguån carbon lý tƣëng cho lªn men sinh tæng hîp FTS và hiÖu suÊt tæng hîp FTS cña chñng vi sinh vËt trªn t¨ng tû lÖ thuËn víi nång ®é sucrose trong m«i trƣêng lªn men. Sau khi lên men chủng giống chọn lọc cho sản xuất FTS, để nâng cao hiệu suất phản ứng tổng hợp FOS , bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng sucrose. Việc thu nhận dịch enzyme FTS nội, ngoại bào tiến hành nhƣ sau:
-
Trang 29
Xö lý sinh khèi: Sinh khèi thu ®îc sau lªn men ®îc röa s¹ch b»ng níc cÊt vμ dung dÞch ®Öm Mcllvaine (muèi photphat natri - axit citric) 0,1 M pH5.
Chƣơng 1: Tổng quan
0
- Ph¸ vì tÕ bμo : Sö dông 3 ph¬ng ph¸p lμ nghiÒn bi, ®ång ho¸ siªu tèc vμ siªu ©m. C¶ 3 ph¬ng ph¸p trªn ®Òu dïng dung dÞch ®Öm Mcllvaine (muèi phèt ph¸t natri- axit citric) 0,1M pH= 5. [6]
-
Sau khi ph¸ vì tÕ bμo, dung dÞch ®îc ng©m 3 giê ë nhiÖt ®é 4 C. Cuèi cïng enzim th« ®îc t¸ch ra tõ dung dÞch b»ng c¸ch läc ch©n kh«ng, hoÆc li t©m l¹nh. Enzyme th« sau ®ã ®îc ®em ph©n tÝch ho¹t lùc. Qu¸ tr×nh tuyÓn chän gièng sÏ c¨n cø vμo ho¹t lùc cña enzim.
Cố định tế bào – phƣơng pháp hiệu quả để sản xuất FOS
Nghiên cứu enzyme nội bào từ nấm mốc Aspergillus, thấy hầu hết chúng có
một đặc điểm chung là nguồn enzyme nội bào có hoạt lực chuyển hóa và tỉ lệ hoạt tính
chuyển hóa với hoạt tính thủy phân cao hơn nhiều so với enzyme FTS ngoại bào [7]. Từ đây, để phát huy đƣợc hiệu quả sử dụng nguồn enzyme nội bào này nên tiến hành
cố định tế bào Aspergillus lên chất mang.
Nghiên cứu của K-J Duan nhằm cố định Aspergillus japonicus bằng cách bẫy
vào mạng gluten và ứng dụng vào sản xuất FOS từ sucrose nhờ enzyme -
fructofuranosidase nội bào. Gluten đƣợc nhận thấy là vật liệu thích hợp để cố định sợi
nấm cùng với enzyme sản xuất FOS. Gluten là một dạng polymer tự nhiên, và là phụ
phẩm của công nghiệp sản xuất bột mì. Sử dụng gluten có các ƣu điểm nhƣ nó là chất
có thể phân giải đƣợc, rẻ tiền, không độc và là nguồn nguyên liệu có sẵn[9].
Quá trình cố định tế bào đƣợc thực hiện: Bột gluten (10g, Sigma) đƣợc hòa tan
trong 200ml dung dịch NaOH 0.05N. Sau khi ly tâm loại những phần không tan, phần
dd gluten còn lại đƣợc điều chỉnh với HCl 0.1N. Khi pH giảm còn 11, tiếp tục thêm
5ml dung dịch tinh bột đã bị oxy hóa vào (22%, w/v), và sau đó pH đƣợc giảm tiếp
xuống 6. Sau khi đã làm lắng gluten dạng keo và loại bỏ những phần nổi lên trên bề
mặt, phần keo lắng đƣợc trộn đều với sợi nấm đã nghiền nhỏ của A.japonicus. Phần gel
này sau đó đƣợc làm khô ở dạng những sợi tế bào đƣợc cố định với đƣờng kính 0.25cm. Sau cùng cắt gel khô thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 0.25cm x 0.4 cm và trữ ở 40C trƣớc khi đem sử dụng.
Sử dụng tế bào cố định này cho sản xuất fructooligosacchride theo mẻ: bổ sung
1g (hoặc 1 lƣợng cụ thể nào đó) mảnh tế bào cố định vào 100 ml dung dịch đƣờng sucrose (40%, w/v) để sản xuất FOS ở 370C dƣới chế độ lắc 125v/p đặt trong bể nƣớc. Quá trình sản xuất FOSs đƣợc kiểm soát bằng cách đo hàm lƣợng FOS tạo thành trong
Trang 30
dung dịch.
Chƣơng 1: Tổng quan
Kết quả thu đƣợc: với hiệu quả cố định tế bào A.japonicus, sucrose nhanh chóng biến đổi thành glucose và 1-kestose (GF2) theo tiến trình phản ứng. Sau 4 giờ hàm lƣợng 1-kestose tạo ra đạt giá trị cao nhất. 1-kestose sau đó đƣợc chuyển hóa thành nystose (GF3). Tổng lƣợng FOS, mà chủ yếu là 1-kestose và nystose, đạt đến giá trị cực đại là khoảng 61% lƣợng đƣờng trong hỗn hợp sau 5h phản ứng.
1.2.6.1.6. Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ
Một quy trình sản xuất FOS với quy mô công nghiệp gồm những bƣớc sau: - Cung cấp nguyên liệu thô chứa sucrose. Nguồn sucrose từ mía đƣờng đƣợc cung cấp bởi Candico® (Belgium) đƣợc xem là sucrose hữu cơ, thƣờng đƣợc
cung cấp dƣới dạng tinh thể rắn.
- Phối trộn với enzyme để tạo thành một hỗn hợp. Enzyme sử dụng có hoạt tính endo-inulinase (EC 3.2.1.7) và hoạt tính fructosyltransferase (FTS) (EC
3.2.1.26) hoặc chỉ cần có hoạt tính của FTS và sử dụng ở thể tự do. Chế phẩm
enzyme có hoạt tính endo-inulinase là endo-inulinase Novoenzyme 960 và có hoạt tính FTS là Pectinex Ultra SP-L cả hai chế phẩm này đều đƣợc cung cấp
bởi Novozymes.
- Việc phối trộn sẽ dừng lại khi hàm lƣợng FOS đạt ít nhất 45 wt.% của tổng lƣợng carbohydrate trong hỗn hợp. Nhiệt độ cho quá trình này là từ 400C cho đến 750C. Lƣợng sucrose đƣợc xử lý nằm trong khoảng từ 500 đến 500.000 kg trong một ngày. Trong giai đoạn này nƣớc sẽ đƣợc cộng vào để giúp cho
hỗn hợp chịu đựng đƣợc với chế độ xử lý nhiệt UHT. Sử dụng UHT để bảo
đảm không có vi sinh vật gây bệnh tồn tại trong hỗn hợp, đặc biệt là
Staphilicoccus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfrigens, Clostridium
botulinum, Salmonella và Listeria. Vi sinh vật gây hại này đƣợc thử phản ứng
màu bằng cách nuôi trên môi trƣờng VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) sau 24h ở 370C. Thời gian phối trộn tốt nhất nằm trong khoảng từ 12 đến 36 giờ. Thời gian phản ứng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm đôi lúc cần bổ sung thêm lƣợng enzyme.
- Có thể bất hoạt enzyme hoặc không. - Kiểm tra thành phần FOS thu đƣợc nhờ kỹ thuật HPLC (sắc ký lỏng cao áp). Qua ba bƣớc: tiệt trùng (UHT), Lọc màng để đảm bảo điều kiện tiệt trùng và gia nhiệt giữa từ 850C tới điểm sôi của hỗn hợp FOS.
Trang 31
Sản xuất FOS cao độ từ sucrose bằng cố định tế bào[38]
Chƣơng 1: Tổng quan
Những phát triển gần đây trong ngành công nghệ enzyme đã có thể sản xuất ra
FOS ở quy mô lớn. Trên thực tế, có thể sản xuất FOS nhờ enzyme tổng hợp theo hai hƣớng: thứ nhất dùng hệ thống enzyme tự do, và thứ hai là dùng enzyme hay tế bào
VSV cố định.
Nhƣng trong phạm vi nghiên cứu, sẽ trình bày quy trình công nghệ tổng hợp
FOS nhờ cố định tế bào (sử dụng FTS và bổ sung thêm GOD). Enzyme FTS tốt nhất là sản phẩm từ các chủng nấm sợi A.niger, A.japonicus, Aureobasidium pullulan.
Quy trình công nghệ tổng hợp FOS đƣợc trình bày chi tiết bên dƣới hình
1.11[38].
Thuyết minh quy trình: Sản xuất enzyme: Các chủng nấm sản xuất FTS đƣợc nuôi trong môi trƣờng hiếu khí, các điều kiện
lên men nhƣ nhiệt độ, pH, sự khuấy đảo… còn tùy thuộc ào từng chủng nấm. Thành
phần dinh dƣỡng chứa sucrose là nguồn cacbon tốt nhất cho cả sự phát triển của tế bào và hoạt động sản xuất enzyme. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển thƣờng khoảng 30oC và pH trên 5.
Sử dụng môi trƣờng lỏng tối ƣu cho nuôi cấy A.oryzae bổ sung sucrose và dịch
trích nấm men (đã đƣợc mô tả bởi Rao và cộng sự, 2005); giúp sản xuất enzyme dễ hơn
và có chi phí thấp.
Cố định tế bào: đƣợc tiến hành theo những nguyên tắc nêu trong phần cố
định tế bào mục 1.1.6.1.5
3
Bổ sung enzim glucooxydaza (GOD) sản xuất FOS cao độ: §Æc tÝnh cña enzim GOD C¸c nghiªn cøu vÒ cÊu t¹o vμ ®Æc tÝnh cña enzim GOD ®· ®îc A. Crueger vμ W.Crueger thùc hiÖn n¨m 1990. C¸c t¸c gi¶ ®· kÕt luËn enzim GOD lμ hîp chÊt
Trang 32
DA. GOD chøa 2 ph©n tö FAD vμ glucoprotein, cã ph©n tö lîng kho¶ng 155 X 10 16% khèi lîng ph©n tö lμ hydratcacbon ( mannoza, galactoza vμ glucosamine díi d¹ng N-acetyl). M¹ch hydratcacbon trong ph©n tö GOD kh«ng tham gia xóc t¸c vμ cÊu t¹o cña nã cho tíi nay còng cha ®îc nghiªn cøu râ rμng.
Chƣơng 1: Tổng quan
VSV
Sản xuất enzyme
Cố định tế bào
Tổng hợp theo mẻ
Enzyme GOD
Cơ chất:
Tổng hợp FOS
FOS 90%
Tinh sạch
Cô dặc
Tiệt trùng
FOS≥95%
Sucrose syrup
Trang 33
Hình 1.11 Quy trình công nghệ sản xuất FOS cao độ ở quy mô công nghiệp[38]
Chƣơng 1: Tổng quan
Enzim GOD sinh tæng hîp tõ A. niger cã cÊu t¹o bëi 583 axit amin. §iÓm
®¼ng ®iÖn cña enzim nμy lμ pH 4.2 [19]. Enzim GOD cã tÝnh ®Æc hiÖu rÊt cao, chØ cÇn mét thay ®æi nhá trong cÊu tróc th× ho¹t lùc oxy hãa cña enzim ®· kh¸c h¼n nhau, vÝ dô gèc glucoza trong ph©n tö enzim ë d¹ng β - D glucoza cã ho¹t tÝnh oxy hãa m¹nh h¬n α - D glucoza 157 lÇn [27]. Enzim GOD cßn cã mét ®Æc tÝnh quan träng lμ rÊt an toμn vÒ mÆt thùc phÈm .
C¬ chÕ xóc t¸c cña enzim GOD
Hình 1.12 Quá trình oxy hóa glucose dưới tác dụng của enzyme GOD[7]
Theo ph¬ng tr×nh ph¶n øng ta thÊy, ®Çu tiªn glucoza díi t¸c dông cña enzim GOD bÞ oxy ho¸ t¹o thμnh β-D-glucolacton, sau ®ã tù ph©n thμnh axit gluconic. Sù t¹o thμnh axit gluconic sÏ lμm gi¶m pH cña m«i trêng, nªn trong qu¸ tr×nh ph¶n øng ph¶i ®ång thêi bæ sung kiÒm ®Ó ®iÒu chØnh pH (ph¬ng ph¸p potentionmetric).
Cơ chất Sucrose là nguồn cơ chất tự nhiên cho FTS. Ảnh hƣởng của nồng độ sucrose đƣợc nghiên cứu để hạn chế tối thiểu phản ứng thủy phân. Năng suất tối đa sản xuất FOS đạt đƣợc khi nồng độ nguồn sucrose ban đầu là 55 Brix.
Trang 34
Ngoài ra, cũng có nghiên cứu cho thấy nồng độ cao của syro sucrose thực phẩm thƣơng mại (60-70 Brix) nên đƣợc sử dụng cho cả quy trình sản xuất FOS liên tục hay
Chƣơng 1: Tổng quan
theo mẻ. Nồng độ syro sucrose cao có lợi, làm hoạt động của nƣớc thấp, tránh phản ứng
thủy phân; nhƣ vậy sẽ tốt cho tổng hợp FOS.
FOS thực phẩm đƣợc sản xuất từ đƣờng sucrose thực phẩm tinh khiết. Trong sản
xuất theo mẻ sử dụng enzyme tự do đã đƣợc Shin và cộng sự mô tả: sản xuất đƣợc
166g/l FOS từ 360 g/l đƣờng.
Tổng hợp FOS Vì tổng hợp FOS từ hệ enzyme tự do nên quy mô sản xuất là theo mẻ. Nếu có sử
dụng enzyme hoặc tế bào cố định việc sản xuất FOS có thể thực hiện lên men liên tục.
Lên men theo mẻ:
Enzyme FTS đƣợc tạo dịch treo trong syro sucrose cao độ (55- 70 Brix) và ủ ở 55 - 60oC trong 20- 25h có khuấy động nhẹ. Tuy nhiên, sản xuất theo mẻ dùng enzyme vẫn có những nhƣợc điểm: enzyme dễ bị phá hủy hoặc bị hao hụt theo dòng sản phẩm,
sản phẩm có lẫn enzyme làm quá trình tinh sạch tốn kém hơn. Kết quả là phải mất một
chi phí cao cho sản xuất một đơn vị sản lƣợng FOS. Với sự tiến bộ của kĩ thuật, dùng
phƣơng pháp sản xuất liên tục có nhiều ƣu điểm hơn và kinh tế hơn.
Trong quy trình sản xuất FOS bởi FTS có vấn đề chính là ngoài sản phẩm FOS
sinh ra còn có glucose và lƣợng sucrose dƣ. Tại bƣớc sản xuất cuối cùng, thu đƣợc
lƣợng tối đa là 55 – 60% FOS trong tổng số chất khô. Vài tác giả đã tập trung nghiên
cứu phƣơng pháp tạo FOS nồng độ cao. Vì vậy việc bổ sung GOD đƣợc thực hiện,
GOD sẽ chuyển glucose thành acid gluconic, nồng độ glucose sẽ giảm đi trong quá
trình tổng hợp FOS; nhờ vậy nồng độ FOS tăng lên đến 90% ( Jung và cs.,1993).
Tinh sạch sản phẩm FOS: FOS 90% muốn đạt nồng độ cao hơn nữa ta dùng phƣơng pháp phân tách sắc kí.
Gần đây, Vankova và cs., 2008, đã nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình phân tách tinh sạch FOS. Một chất trao đổi cation phân tách saccharide (AmberliteTM 1320 Ca, Rhom Has company, France) dựa trên khung poly (styrene- divinylbenzene) với nhóm chức năng – (SO3) 2Ca2+ đã đƣợc sử dụng. nhờ phƣơng pháp tinh sạch này mà dịch FOS sau sắc kí chỉ chứa ít hơn 5% lƣợng monosaccharide và disaccharide. Làm tăng năng suất FOS lên hơn 90%.
Cô đặc: Làm bay hơi sản phẩm phản ứng đƣợc thực hiện bởi quy trình truyền thống cô đặc sucrose, tạo syrup khô tinh khiết. Hệ thống lọc cũng đƣợc sử dụng để làm cô đặc sản phẩm.
Tiệt trùng
Có thể dùng tia cực tím hoặc lọc tiệt trùng. Để tránh tạo màu ảnh hƣởng sản
Trang 35
phẩm, việc lọc nhiệt độ cao không đƣợc đề xuất. Hiện nay kỹ thuật tiệt trùng UHT vẫn
Chƣơng 1: Tổng quan
đảm bảo chất lƣợng cảm quan và tiệt trùng hiệu quả. UHT tuy tiệt trùng ở nhiệt độ cao
nhƣng chỉ trong thời gian ngắn.
1.2.6.2. Inulin
1.2.6.2.1. Nguồn gốc
Inulin đƣợc chiết tách từ thực vật trong tự nhiên thuộc họ Composithae ví dụ nhƣ rau diếp xoăn, ở dạng không phân nhánh thƣờng đƣợc tách chiết từ rễ. Loại inulin
này có đơn phân là glucose, fructose, sucrose. Mức độ polymer hoá (DP) của inulin từ rau diếp xoăn từ 2 đến 60 với giá trị polymer hoá trung bình (DPav) là 12. Sở dĩ có chỉ số polymer hoá trung bình vì inulin có nguồn gốc thực vật thƣờng là một hỗn hợp có
mức độ polymer hoá khác nhau, ví dụ có 10% inulin từ rau diếp xoăn có chỉ số DP từ 2(F2) đến 5(GF4). [29]
1.2.6.2.2. Cấu tạo
Inulin có công thức cấu tạo: C6nH10n+2O5n+1
Hình 1.13: Cấu trúc hoá học của inulin[29]
Inulin là một polymer mạch thẳng đƣợc cấu tạo từ các đơn phân là fructose, các
monomer này liên kết với nhau bằng liên kết -(2-1) glycosidic, và mạch polymer
thƣờng tận cùng bằng gốc glucose. [29]
Inulin tận cùng bằng gốc glucose đƣợc gọi là alpha-D-glucopyranosyl-[beta-D-
Trang 36
fructofuranosyl](n-1)-D-fructofuranosides (GpyFn).
Chƣơng 1: Tổng quan
Inulin tận cùng không có gốc glucose đƣợc gọi là beta-D-fructopyranosyl-[D-
fructofuranosyl](n-1)-D-fructofuranosides (FpyFn).
Do đƣợc tạo thành bởi các liên kết -glucosidic nên inulin không bị thuỷ phân
bởi các enzyme có trong đƣờng tiêu hoá mà chỉ bị thuỷ phân một phần bởi enzyme
endoinulinase (EC 3.2.1.7) thành oligofructose.
1.2.6.2.3. Tác dụng của inulin
Cho đến ngày nay tác dụng của inulin đã đƣợc nghiên cứu khá nhiều và khá
hoàn thiện. Vai trò lớn nhất của inulin là cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột (ở ruột
già) trong đó chúng sẽ kích thích các vi sinh vật có lợi cho sức khoẻ nhƣ lactobacilli,
bifidobacteria, fusobacteria và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật có hại nhƣ Escherichia coli, Clostridia, Veillonellae, Candida. Cơ chế ảnh hƣởng của inulin lên sự
phát triển của các vi khuẩn có lợi vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Tuy nhiên ngƣời ta đã đƣa ra phỏng đoán, các vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào inulinase có khả
năng phân giải inulin, sử dụng inulin nhƣ là một nguồn dinh dƣỡng của chúng.
Bảng 1.8: Tóm lƣợc những kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu ảnh hƣởng của
(log CFU/g)
( g/ngày)
Liều lƣợng inulin dùng Số khảo sát (Ngƣời)
Lƣợng Bifidobacteria sau dùng
trƣớc dùng
10
5
8.8
9.5
9
8.7
9.8
6
23
8.8
9.7
8
6
9
9.5
8
20
7.9
9.1
12.5
10
8.3
9.3
4
38
7.7
9.0
8
8
8.1
9.0
5
8
8.0
9.5
10
8
8.8
9.5
15
8
8.2
9.5
20
[29]
inulin lên sự phát trỉên của Bifidobacteria, khảo sát trên phân ngƣời.
Trang 37
1.2.6.3. Trans-galactooligosaccharide (TOS)
Chƣơng 1: Tổng quan
1.2.6.3.1. Thành phần TOS
Trans-galactooligosaccharides (TOS) là một prebiotic thƣờng đƣợc sử dụng trong các sản phẩm sữa, TOS cũng tồn tại một lƣợng rất thấp trong sữa ngƣời. Trong
công nghiệp, TOS đƣợc tổng hợp từ lactose thông qua phản ứng transgalactosyl bằng
enzyme -galactosidase từ Aspergillus oryzae. Nguồn nguyên liệu sản xuất TOS là
lactose trong dịch whey.
TOS là một polymer có đơn phân là lactose liên kết với nhau bằng liên kết -(1-
4), -(1-3), -(1-6) glycosid và mạch polymer bắt đầu bằng phân tử glucose ở đầu
khử.[23]. TOS là một hỗn hợp các oligosaccharide với chỉ số DP từ 2 – 6 phụ thuộc vào
nguồn enzyme sử dụng để tổng hợp.
Loại oligosaccharide
Hàm lƣợng Cấu trúc
Gal (1-6) Gal (1-4) Glu
Gal (1-3) Gal (1-4) Glu
Trisaccharides
50 %
Gal (1-4) Gal (1-4) Glu
Gal (1-4) Gal (1-6) Glu
Gal (1-6) Gal (1-6) Gal (1-4) Glu
Tetrasaccharides
35 %
Gal (1-3) Gal (1-6) Gal (1-4) Glu
Gal (1-6) Gal (1-3) Gal (1-4) Glu
Gal (1-6) Gal (1-6) Gal (1-6) Gal (1-4) Glu
Penta- và hexa
15 %
saccharides
Gal(1-6)Gal(1-6)Gal(1-6)Gal(1-6)Gal(1-4)Glu
Gal: galactose, Glu: glucose
Bảng 1.9: Thành phần của trans-galactooligosaccharides:
[17]
1.2.6.3.2. Tính chất
Trang 38
TOS có khả năng hút ẩm tốt và độ tan cao. Độ ngọt của TOS bằng 1/3 của đƣờng sucrose
Chƣơng 1: Tổng quan
1.2.6.3.3. Tác dụng TOS
Tƣơng tự nhƣ inulin, TOS cũng có tác dụng làm cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột.Tanaka và cộng sự đã chứng minh vi sinh vật đƣờng ruột có thể sử dụng TOS nhƣ
một nguồn dinh dƣỡng. Ông tiến hành thí nghiệm với 8 chủng Bifidobacteria, 5 chủng
Bacteroide, 3 chủng Fusobacteria, 6 chủng Eubacteria, 8 chủng Clostridia, chủng
Propionibacterium acnes, 8 chủng Lactobacilli, 8 chủng Streptococci, 4 chủng Enterobacteriaceae và chủng Staphylococcus aureus; so sánh khả năng sử dụng TOS
của các chủng này. Kết quả cho thấy các chủng Bifidobacteria, 2 chủng Bacteroide fragilis, 4 chủng Lactobacilli, 4 chủng Enterobacteria phát triển tốt trên môi trƣờng có TOS. Điều này đã chứng tỏ chủng Bifidobacteria đƣợc TOS kích ứng.
Tiến hành thử nghiệm TOS trên chuột có hệ vi sinh vật đƣờng ruột tƣơng tự nhƣ
ở ngƣời cũng cho kết quả khả quan. Rowland và Tanaka (1993) tiến hành thử nghiệm
trên chuột, cho sử dụng khẩu phần ăn chứa 5% TOS sau 4 tuần kiểm tra thấy có sự tăng
rõ rệt lƣợng vi khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli.
Đối tƣợng
Liều lƣợng
Thời gian
Kết quả
Tác gỉa và năm công bố
Morishita và
Có sự tăng rõ rệt các vi khuẩn bifidobacteria và
Chuột
5% (w/v)
7 tuần
Konishi,
staphylococci,
giảm streptococci
1994
Andrieux và
Chuột
10% (w/v)
Không rõ
Szylit, 1992
Hàm lƣợng Acid béo mạch ngắn, H2, lactate, succinate tăng; hàm lƣợng butyrate, valerate và isoacids giảm.
Có sự tăng rõ rệt các vi
Rowland và
Chuột
5% (w/v)
4 tuần
khuẩn bifidobacteria và khuẩn lactobacilli;
vi
Tanaka, 1993
enterobacteria giảm.
Bảng 1.10 : Kết quả kiểm tra vai trò của TOS trên động vật.
[25]
Trang 39
Nếu nhƣ kết quả thử nghiệm trên động vật khá đồng nhất thì kết quả thử nghiệm TOS trên ngƣời có nhiều trái ngƣợc. Ito và cộng sự (1990) đã tiến hành thử nghiệm TOS trên ngƣời với các liều 0, 2.5, 5 và 10g/ngày trong 8 tuần thấy có sự gia tăng vi
Chƣơng 1: Tổng quan
khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli. Tuy nhiên trong nghiên cứu của Alles (1998) khi
cho 40 ngƣời khoẻ mạnh sử dụng TOS với liều lƣợng 15g/ngày thấy hầu nhƣ số lƣợng Bifidobacteria không đổi. Điều này có thể giải thích do số lƣợng vi khuẩn Bifidobacteria trong đối tƣợng thử nghiệm đã khá cao (>109CFU/g) nên TOS hầu nhƣ không có tác dụng đáng kể. Nhƣ vậy khả năng kích ứng Bifidobacteria của TOS không
phụ thuộc vào liều lƣợng sử dụng mà phụ thuộc vào tình trạng sức khoẻ của ngƣời sức khoẻ hay đúng hơn là phụ thuộc vào trạng thái của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. TOS chỉ
có tác dụng rõ rệt khi hệ này mất cân bằng.
1.2.7. Ứng dụng của prebiotic
Một số prebiotic đã đƣợc biết đến nhƣ là nguyên liệu thực phẩm chức năng
trong vài thập kỷ qua, và đƣợc ứng dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp.
những ứng dụng chính trong ngành đồ uống (nƣớc trái cây, cafe, ca cao, trà, soda, và
thức uống có cồn), các sản phẩm sữa (Lên men sữa, sữa bột và kem), sữa chua
probiotic (dựa trên vi sinh vật sống mang lại hiệu quả có lợi cho vật chủ thông qua nâng
cao sự cân bằng vi sinh vật đƣờng ruột) và sản phẩm synbiotic (có chứa một hỗn hợp
của probiotic và prebiotic mang lợi ích cho vật chủ bằng cách cải thiện sự sống cũng
nhƣ bổ sung thêm vi sinh vật sống trong chế độ ăn (Gibson & Roberfroid, 1995).[21]
Các ứng dụng hiện tại của prebiotic trong ngành công nghiệp thực phẩm bao
gồm các món tráng miệng nhƣ bánh pudding; kẹo, bánh quy, sô cô la, bánh mì và bánh
ngọt; các sản phẩm từ thịt và đậu phụ (Voragen, 1998). Tuy nhiên, những đặc tính hóa
lý và sinh lý của các sản phẩm prebiotic khác nhau tùy thuộc vào loại hỗn hợp chuẩn
bị, oligosaccharide prebiotic chế biến trong từng thực phẩm cụ thể cũng khác nhau
(Crittenden & Playne, 1996). Ví dụ, để chế biến bánh mì loại prebiotic thích hợp dùng
là galactooligosacharide, khi đƣa vào quá trình lên men với nấm men và nƣớng của
bánh mì GOS không bị chia nhỏ, và làm cho bánh mì có hƣơng vị và cấu trúc đặc
trƣng.
Prebiotic cũng đƣợc ứng dụng trong ngành dƣợc phẩm: sản phẩm cho ngƣời tiểu đƣờng, mỹ phẩm và dung dịch súc miệng (Crittenden & Playne, 1996). Cũng có thể
đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi. Ví dụ: Lactulose, hiện đang đƣợc sử dụng chủ yếu nhƣ sản phẩm dƣợc phẩm kiểm soát táo bón (Villamiel và cộng sự , 2002)..
Cyclodextrin đƣợc sử dụng trong thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi
trƣờng, và ngành công nghiệp dệt may. Trong lĩnh vực môi trƣờng nó giúp hòa tan các chất ô nhiễm hữu cơ, loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ và kim loại nặng trong nƣớc, đất,
Trang 40
không khí. Trong các chế phẩm mỹ phẩm (kem đánh răng, chất làm mềm vải, khăn
Chƣơng 1: Tổng quan
giấy) Cyclodextrin kiểm soát hƣơng thơm trong các sản phẩm này (Del Valle, 2004;
Singh và cộng sự, 2002)..
1.2.8. Hƣớng nghiên cứu và phát triển prebiotic 1.2.8.1. Hướng mở cho ngành thực phẩm
Cần có thêm nhiều nghiên cứu về cấu trúc, chức năng của các prebiotic để khai thác đƣợc tiềm năng của chúng đồng thời cần đổi mới trong công nghệ sản xuất để sản
xuất ra nhiều hơn oligosaccharide, làm giảm giá thành để có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu trong lĩnh vực này hiện đang có nhiều tiến triển. Các chuyên gia công nghệ thực phẩm phải đối mặt với thách thức về hiệu quả
sử dụng prebiotic và sự chấp nhận của ngƣời tiêu dùng, từ đó có thể tạo ra nhiều sáng
tạo trong việc thiết kế các sản phẩm mới các dòng sản phẩm ngũ cốc, bánh quy, thức ăn
cho trẻ sơ sinh , thực phẩm cai sữa. [36]
1.2.8.2. Trong y học, cải thiện sức khỏe người
Hầu hết các prebiotic đƣợc chuyển hóa ở gần (bên phải) ruột già. Ngƣợc lại, phía
(bên trái) phân giải protein nhiều hơn, với mức độ tƣơng đối cao chất tiền gây ung thƣ
và độc tố. Một tính chất mong muốn trong prebiotic là khả năng tạo ra một sự chuyển
hóa saccharose suốt chiều dài của ruột kết (từ phải sang trái) . Điều này có thể đạt đƣợc
bằng cách sản xuất prebiotic với một trọng lƣợng phân tử thích hợp theo đó : các phân
tử có trọng lƣợng thấp đƣợc chuyển hóa bên trái và phân tử có trọng lƣợng phân tử
cao đƣợc chuyển hóa chậm hơn bên phải (đƣợc thể hiện sơ lƣợc hình. 2.11)
Hình 1.14 Biểu đồ chuyển hóa prebiotics[28].
1.3. Tổng quan về synbiotic
Trang 41
1.3.1. Khái niệm
Chƣơng 1: Tổng quan
Synbiotic là một thuật ngữ để chỉ sự kết hợp probiotic với prebiotic có tác dụng
kích thích sự tăng trƣởng và hoạt động của các vi khuẩn có lợi [12].
Sự kết hợp probiotic với prebiotic cải thiện sự sống sót của chủng khuẩn lợi khi
qua hệ dạ dày và ruột non, vì vậy gia tăng hiệu quả của chủng probiotic trong ruột già.
Ngoài ra, prebiotic còn giúp chủng probiotic sống lâu hơn trong hệ tiêu hóa để hiệu quả
có lợi đƣợc tối ƣu hơn.
Prebiotic đóng vai trò là nguồn dinh dƣỡng giúp cho probiotic hoạt động hiệu
quả tối ƣu hơn trong ruột. Những vi khuẩn có lợi ƣa thích sử dụng nguồn chất xơ
prebiotic, bằng cách bổ sung dinh dƣỡng cho vi khuẩn có lợi sẽ giúp lợi khuẩn phát triển ƣu thế, và ức chế vi sinh vật gây hại. Nhƣ vậy sự kết hợp giữa prebiotic và
probiotic sẽ mang lại nhiều tác động hơn với khi chỉ dùng từng chất riêng lẻ.
1.3.2. Ứng dụng
1.3.2.1. Trong y học
Để tăng hiệu quả tối ƣu của probiotic, hiện tại các bác sĩ có khuynh hƣớng sử
dụng liệu pháp synbiotic trong những thử nghiệm lâm sàng. Liệu pháp synbiotic là an
toàn hơn liệu pháp dùng kháng sinh để điều trị, giảm nhiều tác dụng phụ, giảm thời
gian điều trị ở bệnh viện… Chẳng hạn nhƣ ứng dụng synbiotic trong việc chữa trị
những bệnh nhân bị viêm ruột nghiêm trọng do Hội chứng ruột ngắn, ứng dụng trong
ngăn ngừa sự nhiễm sau phẫu thuật làm giảm tình trạng tái phát bệnh ung thƣ bàng
quang.[2]
Vào năm 2004, Kanamori và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm liệu pháp sinh
tổng hợp cải thiện những triệu chứng bệnh viêm ruột kết nghiêm trọng ở hội chứng ruột
ngắn. Bảy trẻ thiếu dinh dƣỡng bị viêm ruột non do hội chứng ruột ngắn đƣợc điều trị
với liệu pháp sinh tổng hợp trong thời gian hơn một năm( dao động từ 15- 55 tháng).
Liệu pháp sinh tổng hợp trong thời gian dài này làm bình thƣờng hóa hệ vi sinh vật
đƣờng ruột, ức chế sự phát triển các vi sinh vật gây hại trong ruột, và làm tăng đáng kể
hàm lƣợng các acid béo chuỗi ngắn trong phân. Sự thay đổi môi trƣờng vi sinh vật trong đƣờng ruột này ức chế sự phát triển tình trạng viêm ruột non, kết quả là làm tăng cân nhanh chóng 6 trong 7 trẻ. Tình trạng thiếu dinh dƣỡng cũng đƣợc cải thiện ở năm
trong số 6 bệnh nhân tăng cân .
Trang 42
Sugawara và cộng sự (2006) đã tiến hành thử nghiệm liệu pháp synbiotic ( bao gồm hai chủng probiotic L.casei Shirota , Bifidobacterium breve Yakult và prebiotic TOS) trên các bệnh nhân đang trong tiến trình phẫu thuật ung thƣ mật. Họ tiến hành thử nghiệm liệu pháp synbiotic trên hai nhóm: nhóm dùng synbiotic sau khi phẫu thuật ,nhóm dùng synbiotic trong thời gian phẫu thuật(perioperative ), và các thử nghiệm
Chƣơng 1: Tổng quan
lâm sàng khác của 2 nhóm. Đối với nhóm perioperative, kết quả cho thấy có sự gia tăng
đáng kể số lƣợng tế bào bạch huyết (lymphocyte) và có hiệu quả ức chế đáng kể hiệu ứng viêm toàn phát sau khi phẫu thuật. Khi so sánh với nhóm dùng synbiotic sau khi
phẫu thuật thì nhóm dùng synbiotic trong thời gian phẫu thuật cho thấy mức độ cải
thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột tốt hơn và làm giảm đáng kể tình trạng nhiễm sau phẫu
thuật cho thấy mức độ cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột tốt hơn và làm giảm đáng kể thời gian điều trị tại bệnh viện sau khi phẫu thuật và rút ngắn thời gian điều trị kháng
sinh ở nhóm dùng synbiotic trong thời gian phẫu thuật.
1.3.2.2. Trong ngành thực phẩm
Việc sử dụng của synbiotics nhƣ thành phần thực phẩm chức năng là một lĩnh
vực mới. Những nghiên cứu thực hiện cho đến nay với synbiotics đã xem xét ảnh
hƣởng của chúng các vi sinh đƣờng ruột. Trong một nghiên cứu ở các đối tƣợng khỏe
mạnh, một sản phẩm sữa lên men có chứa Bifidobacterium spp. có 18 g inulin đã đƣợc
bổ sung vào, dùng trong 12 ngày. Kết quả lên men sản phẩm sữa (probiotic) tăng đáng
kể tỷ lệ bifidobacteria trong ruột [2].
1.3.2.3. Trong chế biến thức chăn nuôi
Bổ sung synbiotic vào thức ăn gia cầm, ví dụ sản phẩm Biomin là sản phẩ kết hợp
chủng probiotic Enterococcus faecium và prebiotic fructooligosaccharide (FOS) dùng
bổ sung vafoo thức ăn cho gà, giúp duy trì và ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột. FOS
kích thích chọn lọc sự phát triển của các nhóm khuẩn có lợi Bifidobacteria trong ruột
già và vì vậy đánh bại vi sinh vật gây bệnh Samonella sp. và E. coli .[2]
1.4. Sấy thăng hoa
1.4.1. Định nghĩa Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng sự thăng hoa của nƣớc,
chuyển trực tiếp nƣớc ở dạng thể rắn sang thể hơi. Ở điều kiện bình thƣờng ẩm trong thực phẩm ở dạng lỏng nên để thăng hoa chúng cần đƣợc chuyển sang thể rắn bằng phƣơng pháp lạnh đông. Vì vậy nên còn gọi là phƣơng pháp sấy lạnh đông (Free drying
hay Lyophillisation)
Phƣơng pháp sấy thăng hoa do kĩ sƣ G.I. Lappa Stajenhexki phát minh năm
1921, đƣợc ứng dụng lần đầu tiên ở Nga.
Trang 43
1.4.2. Ƣu, nhƣợc điểm sấy thăng hoa
Chƣơng 1: Tổng quan
Trong kĩ thuật sấy ,nhiệt là nguyên nhân gây tổn thất về hƣơng thơm và chất
dinh dƣỡng. tuy nhiên, sấy thăng hoa làm giảm hoạt độ của nƣớc mà không dùng nhiệt tác động lên thực phẩm, kết quả là vẫn giữ đƣợc hƣơng thơm và chất lƣợng sản phẩm
tốt.[42]
Ƣu điểm: sấy thăng hoa tạo đƣợc sản phẩm có chất lƣợng cao, giữ nguyên cấu
trúc, màu sắc, hƣơng vị, giữ gìn hoạt tính sinh học, không làm mất các vitamin. Tiêu hao năng lƣợng để bay hơi hàm ẩm thấp.
Nhƣợc điểm: giá thành thiết bị cao, vận hành cần có trình độ kĩ thuật cao.
1.4.3. Các giai đoạn trong sấy thăng hoa
1.4.3.1. Giai đoạn làm lạnh (giai đoạn lạnh đông)
Trong giai đoạn này vật liệu sấy đƣợc làm lạnh từ nhiệt độ môi trƣờng khoảng
200C xuống nhiệt độ (-10 ; -150C). Ở giai đoạn này không gian của bình thăng hoa đƣợc hút chân không và áp xuất trong bình giảm. Do áp suất giảm nên phân áp suất hơi nƣớc trong không gian bình thăng hoa cũng giảm so với phân áp suất trong lòng vật
liệu sấy điều này dẫn tới hiện tƣợng thoát ẩm từ vật liệu sấy cho nên nhiệt độ vật liệu
sấy nhỏ hơn điểm 3 thể. Có 2 cách làm lạnh đông vật liệu sấy: Cách thứ nhất sử dụng
thiết bị làm lạnh đông thông thƣờnghoặc nitơ lỏng để làm lạnh đông sản phẩm bên
ngoài buồng sấy thăng hoa. Cách thứ hai là vật sấy tự lạnh đông ngay trong buồng sấy
thăng hoa khi buồng sấy đƣợc hút chân không.Trong giai đoạn này có khoảng 10 -
15% trên toàn bộ ẩm thoát ra khỏi vật liệu sấy, sản phẩm cần đƣợc làm lạnh đông
rất nhanh để hình thành các tinh thể băng nhỏ ít gây hƣ hại đến cấu trúc tế bào của sản
phẩm. Đối với sản phẩm dạng lỏng, phƣơng pháp làm lạnh đông chậm đƣợc sử dụng để
băng tạo thành từng lớp, các lớp này tạo nên các kênh giúp cho hơi nƣớc dịch
chuyển dễ dàng.
1.4.3.2. Giai đoạn thăng hoa
Giai đoạn này là giai đoạn tách ẩm chính của phƣơng pháp sấy thăng hoa. Ở đây áp suất hơi nƣớc đƣợc giữ dƣới 4,58 mmHg (610,5 Pa) và nƣớc ở dạng băng, khi sản phẩmđƣợc cung cấp nhiệt, thì băng rắn sẽ thăng hoa trực tiếp thành hơi mà không bị tan chảy. Hơi nƣớc tiếp tục đƣợc tách ra khỏi sản phẩm bằng cách giữ cho
áp suất trong buồng sấy thănghoa thấp hơn áp suất hơi nƣớc trên bề mặt của băng, đồng thời tách hơi nƣớc bằng máy bơm chân không và ngƣng tụ nó bằng các ống xoắn ruột gà lạnh, các bản dẹt lạnh hoặc bằng hoáchất. Khi quá trình sấy tiếp diễn, bề mặt thăng
Trang 44
hoa di chuyển vào bên trong sản phẩm đông lạnh, làm sản phẩm đƣợc sấy khô. Nhiệt lƣợng cần thiết để dịch chuyển bề mặt thăng hoa (ẩn nhiệt thăng hoa) đƣợc truyền đến
Chƣơng 1: Tổng quan
sản phẩm do sự dẫn nhiệt hoặc do vi sóng cung cấp. Hơinƣớc di chuyển ra khỏi sản
phẩm qua các kênh và đến bình ngƣng, sau đó thành băng bámtrên bề mặt ống. Trong giai đoạn này nhiệt độ vật không đổi. Nhƣ vậy, nếu không tính quá trình mất ẩm
trong phƣơng pháp để vật ẩm tự lạnh đông trong buồng sấy khi hút chân không thì
sản phẩm đƣợc sấy trong hai giai đoạn :Trƣớc tiên do quá trình thăng hoa xuống
khoảng 15% độ ẩm và sau đó do bay hơi củaphần nƣớc không đóng băng đến 2% độ ẩm bằng quá trình nhả ẩm đẳng nhiệt. Quá trình nhả ẩm đẳng nhiệt (desorption) đạt
đƣợc bằng cách nâng nhiệt độ máy sấy lên gần nhiệt độ môitrƣờng xung quanh trong khi vẫn giữ áp suất thấp giống nhƣ quá trình sấy ở các thiết bị sấy chân không thông thƣờng.
1.4.3.3. Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại :
Là giai đoạn làm bay hơi ẩm liên kết, nhiệt độ của vật liệu sấy tăng nhanh.
Trong một số sản phẩm (ví dụ nƣớc ép trái cây, dịch chiết cà phê cô đặc), sự hình
thành nên trạng thái thuỷ tinh trong quá trình đóng băng gây ra nhiều khó khăn cho việc
di chuyển hơi nƣớc. Vì vậy, chất lỏng cần đƣợc đóng băng ở dạng bọt (phƣơng
pháp sấy thăng hoa bọt : vacuumpuff freeze drying). Cả hai phƣơngpháp đều tạo
nên các kênh nhờ đó hơi nƣớc có thể thoát đi đƣợc. Ở phƣơng pháp thứ ba,nƣớc trái cây
sau khi đóng băng đƣợc nghiền thành cục, nhờ đó sấy nhanh hơn và cho phépkiểm soát
kích cỡ của hạt bột tốt hơn. Tốc độ sấy phụ thuộc phần lớn vào tính cản trở nhiệtcủa sản
phẩm và ở mức độ thấp hơn vào độ cản trở dòng hơi (dịch chuyển khối) ra khỏi bề mặt
thăng hoa. Sau giai đoạn thăng hoa do trạng thái của nƣớc trong vật liệu nằm trên điểm
3 thể nên ẩm trên vật liệu trở về dạng lỏng. Vì khi đó áp suất trong bình thăng hoa vẫn
đƣợc duy trì bé hơn áp suất khí trời nhờ bơm chân không và vật liệu sấy vẫn tiếp tục
đƣợc gia nhiệt nên ẩmvẫn không ngừng biến từ dạng lỏng sang dạng hơi và đi vào
không gian bình thăng hoa. Nhƣ vậy giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy
chân không bình thƣờng. Quá trình dịch chuyển ẩm trong sấy thăng hoa khác với quá trình dịch chuyển ẩmtrong hệ thống sấy khác làm việc ở áp suất khí quyển. Khi thăng
hoa các phân tử nƣớc không va chạm nhau nhờ đó mà sấy thăng hoa có một ƣu điểm
Trang 45
lớn là bảo toàn đƣợc chất lƣợng sinh học của sản phẩm sấy
Chƣơng 1: Tổng quan
Trang 46
Hình 1.15: Hệ thống sấy thăng hoa [43 ]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
CHƢƠNG 2:NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KẸO VIÊN SYNBIOTIC
2.1. Công nghệ sản xuất kẹo
2.1.1. Thuyết minh quy trình KÑo lμ mét trong nh÷ng s¶n phÈm chÝnh, chiÕm khèi lîng bËc nhÊt trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn ®êng. Phô thuéc vμo ®Æc tÝnh nh tr¹ng th¸i, thμnh phÇn vμ h¬ng vÞ, kÑo ®îc chia ra lμm nhiÒu chñng lo¹i nh kÑo cøng, kÑo mÒm, kÑo dai ... Do đặc tính dễ bảo quản, tiện ích trong việc sử dụng, cũng nhƣ đa dạng phong phú cho nhiều chủng loại kẹo khác nhau, nªn kÑo ®· ®îc s¶n xuÊt vμ tiªu dïng réng r·i tõ bao ®êi nay trªn
kh¾p thÕ giíi, cho mäi ®èi tîng. §Ó t¨ng cêng gi¸ trÞ cña kÑo, cũng nhƣ đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng, mong muốn đƣợc đem lại những sản phẩm
không chỉ đảm bảo dinh dƣỡng, ngon miệng mà còn mang kèm những chức năng có lợi
cho sức khỏe. Vì vậy, việc nghiên cứu để tạo ra viên kẹo synbiotic mang hƣơng vị sữa chua có bổ sung nhiều chủng khuẩn probiotic và sử dụng đƣờng chức năng FOS hoặc
inulin nhằm mang lại nhiều tác động tích cực để cải thiện sức khỏe và tăng cƣờng khả
năng phòng chống bệnh tật; đồng thời mong muốn hơn nữa là tạo đƣợc sản phẩm nhƣ
món tráng miệng sữa chua nhƣng lại khá tiện lợi có thể sử dụng bất kì lúc nào, bất kì ở đâu.
Quy trình sản xuất kẹo đƣợc trình bày nhƣ ở hình 2.1
Thuyết minh quy trình [22]
Sữa tƣơi thu hoạch về từ các trang trại ( đƣợc hiệu chỉnh hàm lƣợng béo đạt
3.5%, hàm lƣợng chất khô gồm: protein 3.3%, và lactose 4,5%), đƣợc đun nóng đến 80oC trong 30 phút, sau đó làm mát về đến nhiệt độ ủ.
Các chủng probiotic đƣợc chọn lọc và qua vi gói, sau đó đem ủ ở 200C trong 20h
một lƣợng 5% (w/v) probiotic này với sữa tƣơi đã qua xử lí nhiệt.
Tiếp theo, trộn phần sữa lên men này với prebiotic inulin ( rau diếp xoăn, hoặc
atiso), FOS, có kèm bột sữa gầy (SMP. Chang Fu).
Tất cả hỗn hợp đƣợc đƣa qua sấy thăng hoa kèm phối trộn với tá dƣợc (44.5% sorbital và 4.5% xylitol). Sấy thăng hoa là một phƣơng pháp đƣợc lựa chọn cho bảo
quản đảm bảo hoạt tính sinh học sản phẩm. Phƣơng pháp sấy này ít co ngót và kết quả
Trang 47
sản phẩm có thể dễ dàng hòa tan trong nƣớc trở lại.
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Cuối cùng, dùng máy nén Manesty F3 Tablet (Liverpool,Vƣơng quốc Anh) để
nén hỗn hợp thành dạng kẹo viên. Sấy probiotic phối trộn với prebiotic và nén lại thành dạng viên có thể xem nhƣ là một sản phẩm kẹo mới, dùng nhƣ món tráng
Sữa tƣơi
probiotic
Xử lí nhiệt
Vi gói
Trộn lần 1
Ủ (200C trong 20h)
Trộn lần 2
Prebiotic, bột sữa gầy
Tá dƣợc
Sấy thăng hoa
Ép viên
Viên kẹo synbiotic
miệng.
Trang 48
Hình 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất kẹo viên synbiotic
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Điểm đáng chú ý của đề tài là tạo viên kẹo với sự kết hợp hữu ích của probiotic
và prebiotic. Vậy nên các mục tiêu của nghiên cứu này phải khảo sát và giải quyết
các vấn đề sau:
(1) Kiểm tra sự phát triển của chủng probiotic khi có prebiotic trong môi trƣờng
và chọn chủng probiotic phát triển tốt dƣới tác dụng của inulin và OF.
(2) Xác định những tác động của việc thêm bột inulin, OF lên các hoạt động acid
hóa và khả năng sống của các probiotic (LC-01) trong 28 ngày bảo quản tại 40C.
2.1.2. Vật liệu, phƣơng pháp
2.1.2.1. Phân lập giống probiotic
Việc phân lập và tuyển chọn chủng giống sao cho phát huy đƣợc tối đa hoạt tính
probitic, chẳng hạn nhƣ việc chọn chủng thƣơng mại Lactobacillus acidophilus LA-5,
L.casei LC-01, Bifidobacterium bifidum BB-12, lấy từ Chr. Hansen Pty. Ltd (Australia ). Sau đó chúng đƣợc giữ ở -22oC cho đến khi bổ sung vào sữa tƣơi tiến hành quy trình làm kẹo [38].
Đồng thời chủng phải có sức chịu đựng tốt với điều kiện sấy bất lợi, theo nghiên
cứu của Marıa Claudia Otero chọn chủng Lactobacillus gasseri CRL1421,
Lactobacillus delbrueckii sp.bugaricus CRL1461 (LB) đã đƣợc chọn. [27]
Chủng probiotic đặc biệt là Bifidobacteria phát triển chậm trong môi trƣờng sữa
do chúng thiếu hoạt động thủy giải protein, vì vậy đòi hỏi kết hợp với các nhân tố tăng
trƣởng cần thiết nhƣ là amino acid, peptid để tăng sự phát triển của chúng (Klaver và
cs, 1993). Việc đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn phân giải tốt protein Lactobacillus
delbrueckii sp.bugaricus CRL1461 (LB) cũng nhằm cải thiện sự tăng trƣởng và khả
năng sống của probiotic và giúp giảm thời gian lên men ( Dave và Shah, 1998).
Các chủng LAB đƣợc phân lập và tuyển chọn từ hạt kefir tại Hsinchu ở phía
Bắc Đài Loan (Lin và cs. 1999) gồm Lactobacillus kefiri, Lactobacillus
kefiranofaciens , Lactococcus lactis (Chen et al 2008.)
2.1.2.2. Chuẩn bị prebiotic:
Bột inulin rau diếp xoăn thƣơng mại (Raftiline GR với chiều dài chuỗi trung bình là 10) và chuỗi ngắn inulin hoặc oligofructose (OF) (Raftilose P95 với chiều dài
chuỗi trung bình là 4) đã đƣợc cung cấp bởi Mandurah Australia Pty. Ltd (Dandenong, Vic., Australia).[38]
Trang 49
Inulin Atisô Jerusalem (JAI): Các JAI đƣợc chiết xuất từ củ JA theo Paseephol và cs (2007) có nồng độ lớn hơn 12o B.
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Các đặc điểm lý-hóa của JAI đƣợc so sánh với hai loại bột inulin rau diếp xoăn
thƣơng mại thể hiện trong Bảng 2.1
Raftilose P95a
RaftilineGRa
JAI
Tính chất
Cấu trúc
GFn + Fn
GFn + Fn
GFn
Chiều dài mạch
4
12
9
Độ ẩm (%)
95
95
95
Inulin/FOS
95
92
75
Đƣờng
5
8
15
pH
5-7
5-7
5-7
[38]
Bảng 2.1 Tính chất hóa lí của các prebiotic nghiên cứu
2.1.2.3. Xác định hoạt lực của các loại prebiotic :
Khả năng thúc đẩy sự tăng trƣởng của các prebiotic đƣợc đánh giá trên chủng
probiotic lựa chọn (LA-5, LC-01, BB-12); so sánh hiệu quả của inulin , FOS thƣơng
mại và inulin từ atiso với nhau , tất cả đƣợc thêm vào probiotic ở mức 4%. Mẫu kiểm
tra không chứa prebiotic. Sử dụng môi trƣờng MRS cho LC-01, BB-12 và LA-5 theo Paseepholvà cs. (2008). Để duy trì điều kiện phát triển ổn định trong tất cả các thí nghiệm, thực hiện khử trùng môi trƣờng.
Bốn gam mỗi loại bột inulin đƣợc hòa tan trong 20 ml nƣớc cất và thêm 80 ml
môi trƣờng tăng trƣởng để đạt đƣợc nồng độ inulin cuối cùng 4% (w / v). Môi trƣờng
không bổ sung prebiotic (100 ml môi trƣờng tăng sinh) đƣợc sử dụng để kiểm tra đối chứng. Một ml probiotic đã đƣợc chuyển vô trùng vào mỗi môi trƣờng ủ ở 370C trong 16 h trong điều kiện hiếu khí cho LA-5, kỵ khí cho BB-12 và LC-01.
Độ đục của môi trƣờng phát triển đã đƣợc kiểm tra tại cuối thời kỳ ủ bằng cách đo mật độ quang học (OD). Các chai đƣợc vortex trong 20 s, và môi trƣờng đồng nhất
đƣợc chuyển vào cuvette cho đọc độ hấp thu ở 600 nm (Kneifel.,2000).
2.1.2.4. Quá trình bảo quản lạnh
Hiệu quả của prebiotic nâng cao khả năng sống của probiotic trong thời gian bảo quản lạnh hơn 28 ngày ở (40C). Ba mẫu thí nghiệm gọi tên là JAY, INY và OFY đƣợc chuẩn bị bằng cách bổ sung 12% SM (skim milk) cùng 4% của mỗi loại inulin
Trang 50
atiso, inulin rau diếp xoăn (Raftiline GR) và oligofructose (Raftilose P95), tƣơng
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
ứng. Mẫu đối chứng NFCY (control non fat yoghurt) cũng đƣợc chuẩn bị: 16% tổng chất khô đều là SM.
2.1.2.5. Phân tích sản phẩm:
Xác định độ axit titratable (TA)
Titratable axit (nhƣ % axit lactic) đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ
AOAC 947.05 sử dụng NaOH 0.1 M (AOAC, 2000).
Xác định độ pH
Độ pH của sữa chua đã đƣợc đo bằng pH kế (mô hình 520A, Orion Research
Inc, Boston, MA, USA). Tất cả các phân tích đƣợc thực hiện tại 200C.
Định lƣợng probiotic
Số các đơn vị hình thành (CFU) trên đĩa có chứa 25-250 khuẩn lạc đƣợc tính
toán cho mỗi gram mẫu và khả năng sống của probiotic trong các mẫu khác nhau đƣợc tính nhƣ sau (Bruno và cộng sự, 2002.):
% Khả năng sống = (CFU/g sau 28 ngày bảo quản) / (CFU/g ban đầu) x 100
Khảo sát tính chất vật lý:
Độ cứng của kẹo đã đƣợc đo trên máy kiểm tra độ cứng Pharma Test PTB311
(Hamburg, Đức). Tính dễ vỡ vụn đo bằng máy đo Roche (Hoffman La Roche, Basel,
Thụy Sĩ). Sau khi tạo viên cân khối lƣợng, 20 viên kẹo đã đƣợc quay trong 20 phút và
sau đó tiến hành cân lại để kiểm tra phần trăm trọng lƣợng bị mất do vỡ và mài mòn.
Kiểm tra độ hòa tan, đo lƣờng tốc độ hòa tan của kẹo, đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp mô tả bởi Rawlins (1977), tốc độ quay là 60 vòng / phút và nhiệt độ là 37 oC.[22]
2.1.3. Thảo luận: hiệu quả sử dụng prebiotic
Hai thí nghiệm riêng biệt đƣợc thực hiện để đánh giá chức năng của prebiotic và
để xác định ứng dụng có thể của nó trong các sản phẩm sữa.[38]
Trang 51
2.1.3.1. Hiệu lực prebiotic
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Hình 2.2 Hiệu quả sử dụng của prebiotic lên probitic [38]
Phân tích Hình. 2.2 cho thấy khả năng sử dụng các loại bột inulin khác nhau bởi ba chủng probiotic, đo giá trị các mẫu ở OD 600 nm. Nhìn chung, chủng LC-01 có thể sử dụng prebiotic tốt nhất, tiếp theo là BB-12. Đối với sự tăng trƣởng của LA-5 là thấp với tất cả các loại prebiotic, điều này thể hiện qua giá trị OD đo đƣợc của mẫu bổ sung P95 nuôi với LA-5 ở 600 nm là 0.8 là thấp hơn rất nhiều so với 2.2 của LC-01 và
1.6 của BB-12. Sự tăng trƣởng của LC-01 là cao nhất trong môi trƣờng có chứa
oligofructose (Raftilose P95), và JAI kích thích sự tăng trƣởng của LC-01 tƣơng tự nhƣ
Trang 52
inulin (Raftiline GR).
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Theo Voragen (1998), sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của prebiotic (phân
nhánh hoặc không ), mức độ trùng hợp (DP), thành phần của các monomer và mức độ hòa tan vào nƣớc ảnh hƣởng đến việc sử dụng chúng bởi vi sinh vật. Trong nghiên cứu,
Raftilose P95 là prebiotic sử dụng tốt nhất cho cả ba chủng probiotic vì độ dài chuỗi
ngắn, độ hòa tan trong nƣớc cao. Trong khi sự tăng trƣởng các chủng probiotic trong
inulin là thấp hơn. Những phát hiện này phù hợp với nghiên cứu của Roberfroid và cs. (1998) : chuỗi ngắn inulin (DP <10) là chất lên men tốt nhất, đƣợc lên men nhanh
hơn so với chuỗi inulin dài.
Kết quả so sánh mẫu probiotic nuôi trên môi trƣờng kiểm chứng không bổ sung
prebiotic, cho thấy nếu không bổ sung prebiotic, hiệu quả tăng trƣởng các chủng
probiotic là kém hơn hẳn, mật độ tế bào đo đƣợc trong mẫu CTRL là kém hơn nửa mật
độ mẫu P95 cho chủng BB-12 và chỉ bằng một phần năm mật độ mẫu P95 cho chủng
LC-01 Hình 2.2
Từ các kết quả tổng hợp đƣợc: prebiotic đƣợc sử dụng hiệu quả nhất trên chủng
LC-01, và prebiotic đƣợc chọn là OF P95.
2.1.3.2. Đánh giá sản phẩm kẹo trong quá trình lưu trữ lạnh
Trong nghiên cứu này, nghiên cứu những ảnh hƣởng của việc bổ sung bột inulin (JAI
và inulin rau diếp xoăn ), FOS về sự sống và hoạt động acid hóa của probiotic trong quá trình lên men và bảo quản lạnh ở 40C.
Thay đổi độ pH và TA [38]
Hình. 2.3 cho thấy biến đổi độ pH và độ axit của các mẫu thử nghiệm và
mẫu kiểm chứng trong quá trình lƣu trữ lạnh đến ngày 28. Không có sự khác biệt (P >
0,05) đáng kể trong các giá trị pH và TA trong việc bổ sung và không bổ sung
prebiotic ( môi trƣờng NFCY) trong suốt thời gian lƣu trữ. Một kết quả tƣơng tự cũng
đƣợc báo cáo của bởi Guven và cộng sự. (2005) và Zhu (2004).
Vào ngày 1, việc sản xuất acid trong mẫu bổ sung JAI (JAY, pH 4.2, TA 1,02%) thì cao hơn, nhƣng không đáng kể so với mẫu bổ sung oligofructose (OFY, pH 4.4, TA 0,86%) , với mẫu inulin rau diếp xoăn (INY, pH 4.5, TA 0,79%), và giá trị acid
JAI là tƣơng đồng với mẫu kiểm chứng. Tất cả mẫu có chứa chất prebiotic có độ pH và độ chua ổn định theo thời gian, thực nghiệm đƣợc hiển thị trên hình 2.3 cho thấy độ giảm chỉ tối đa là 0,2 đơn vị pH và tăng 0,28% giá trị TA ở ngày cuối lƣu trữ. Vào
Trang 53
ngày 28, độ pH trung bình từ 4,3 (đối với INY) đến 4.1 (cho OFY và JAY), tính axit của tất cả các mẫu thay đổi từ 1,05% (đối với INY) đến 1,20% (đối với NFCY).
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Hình 2.3 Biểu diễn sự thay đổi pH (đường gạch đứt), và TA (đường liền) cho bốn mẫu trong suốt quá trình lên men và bảo quản ở 40C.[38] ( Tam giác): INF, ( dấu chéo): OFY, (hình thoi): JAY, (hình vuông): NFCY
Các giá trị pH và độ acid thể hiện trên hình cho thấy có một sự tƣơng đƣơng tính
chất môi trƣờng cho mẫu có và không bổ sung prebiotic, nhƣ vậy việc bổ sung prebiotic
là không tạo ảnh hƣởng tiêu cực ( môi trƣờng quá acid ) ức chế probiotic. Hình 2.3 [38]
Thay đổi số lƣợng probiotic
Sự thay đổi số lƣợng LC-01 và LB trong mẫu có và không có bổ sung prebiotic
trong quá trình lên men và trong thời gian lƣu trữ 28 ngày đƣợc trình bày trong Bảng 2.2
Nhìn chung, khả năng sống của LB và LC-01 là gần tƣơng tự nhau, nhƣng LC- 01 cho tỉ lệ sống tốt hơn. So sánh, kiểm tra, việc bổ sung của inulin không ảnh hƣởng
đến sự sống của LB, nhƣng cải thiện đáng kể khả năng tồn tại của LC-01. Thứ tự tính hiệu quả của prebiotic tác dụng hỗ trợ probiotic: xét ở giai đoạn cuối vào ngày 28,
chủng LC-01 đƣợc cải thiện khả năng sống tốt nhất trong inulin rau diếp xoăn (Raftiline GR, gần 7.4 log CFU/g) tiếp theo là oligofructose (Raftilose P95, 7.3 log
Trang 54
CFU / g) và đến JAI (7.1 log CFU /g).
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Trong khoảng thời gian 28 ngày lƣu trữ, các prebiotic cho thấy hỗ trợ tốt nhất
hoạt động tăng trƣởng của LC-01 vào giai đoạn 7 ngày đầu, nhƣng sau đó tốc độ động tăng trƣởng giảm dần. Đến ngày 21 thì lƣợng tế bào giảm xuống con số hơn 7 log
CFU/g, việc suy giảm này có thể đƣợc giải thích vì các sản phẩm trao đổi chất, acid hữu
cơ sinh ra, ức chế sự phát triển của probiotic. Tuy nhiên, so với trong môi trƣờng
NFCA lƣợng tế bào ở ngày 28 chỉ khoảng hơn 6 log CFU/g thì rõ ràng bổ sung prebiotic cải thiện tích cực lƣợng probiotic trong bảo quản. Nhƣ vậy, việc bổ sung bột
inulin là hữu ích trong việc cải thiện sự tăng trƣởng của LC-01 trong thời gian lên men
và sự sống của chúng trong thời gian lƣu trữ (P 0,05). Các kết quả này phù hợp với
những báo cáo của Aryana và McGrew (2007): có sự gia tăng số lƣợng L. casei với
việc bổ sung bột inulin.
Bên cạnh những kết quả có đƣợc từ thí nghiệm, cũng đã có những kết luận tƣơng
tự về việc sử dụng bột inulin bởi các probiotic đã đƣợc báo cáo trƣớc đó của al Akalin
và cộng sự. (2004), Bruno và cộng sự. (2002), Shin cs. (2000) và Varga cs . (2003) tìm
thấy rằng : có một cải tiến đáng kể trong việc lƣu giữ khả năng tồn tại của
bifidobacteria trong sữa chua có chứa prebiotic (inulin / OF) trong thời gian lƣu
trữ. Tƣơng tự nhƣ vậy, Aryana cs (2007), Capela cs. (2006), Desai cs. (2004) và
Donkor cs. (2007)., quan sát rằng inulin rau diếp xoăn là nguồn carbon ƣa thích cho
các chủng Lactobacillus, do đó giúp tăng trƣởng và duy trì khả năng tồn tại trong thời
gian lƣu trữ. Cơ chế mà inulin cải thiện khả năng tồn tại của các sinh vật probiotic trong
kho lạnh vẫn còn chƣa rõ ràng. Hai cơ chế có thể đề xuất cho đến nay là : inulin cung
cấp chất dinh dƣỡng bổ sung để thúc đẩy môi trƣờng tăng trƣởng (Makras et al, 2005.)
và chúng bảo vệ các tế bào probiotic khỏi bị tổn thƣơng bởi acid (Desai et al, 2004.).
Khả năng sống của probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ : loại
Trang 55
chủng probiotic đƣợc sử dụng, môi trƣờng, nhiệt độ thời gian trong bảo quản, ảnh hƣởng của các sản phẩm phụ sinh ra SCFA, hydro, peroxide…( (Medina và Jordano, 1994 ; Shah, 2000). Trong bài sẽ khảo sát sự ảnh hƣởng của việc vi gói và chế độ sấy thăng hoa lên khả năng sống của probiotic.
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
thời gian
NFCY
JAY
OFY
INY
Môi trƣờng
LC- 01
5.26
5.31
0
5.28
5.44
8.01
8.26
1
8.34
8.21
7.98
8.2
2
8.34
8.28
7.86
8.21
7
8.2
8.20
7.52
8.1
14
8.15
8.14
7.11
7.42
21
7.54
7.89
6.06
7.1
28
7.3
7.37
5.29
5.36
0
5.27
5.44
LB
8.18
8.13
1
8.15
8.16
8.16
8.13
2
8.13
8.16
7.67
7.71
7
7.72
7.84
7.00
7.03
14
7.02
7.02
6.33
6.49
21
6.36
6.64
6.2
6.2
28
6.23
6.39
[38]
Bảng 2.2. Khả năng sống của LC-01, LB (log CFU/g) trong môi trƣờng có và không có bổ sung prebiotic trong bảo quản ở 4oC
2.2. Ảnh hƣởng chế độ vi gói
2.2.1. Cơ sở khoa học vi gói Phƣơng pháp phun phủ cho vi gói probiotic gồm ba công nghệ chủ yếu khác nhau về kiểu tầng sôi không khí đƣợc sử dụng và vị trí trong thiết bị - nơi vật liệu bao phủ cùng không khí nén đƣợc phun vào (hình2.4). Các vi khuẩn probiotic vi gói có
mặt trong các hạt bột mịn, đƣợc giữ trong chuyển động bên trong thiết bị và đƣợc chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo (lên men, cô đặc, sấy thăng hoa). Trong thực phẩm ứng dụng lớp phủ chủ yếu là lipid (ví dụ nhƣ sáp, axit béo và các loại dầu đặc biệt),
Trang 56
nhƣng các protein (ví dụ nhƣ gluten và casein) hoặc carbohydrate (dẫn xuất của cellulose, carrageenan và alginate) cũng có thể đƣợc sử dụng. Hình biểu diễn minh họa 2.4 [10]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Hình 2.4 Phương pháp vi gói phun phủ [10]
Kĩ thuật tạo hạt gel cho vi gói (ME) probiotic, có ba kỹ thuật đƣợc sử dụng cho
ME của probiotic trong gel alginate (nhƣ ở hình 2.5). Trong quá trình phun đẩy tạo hạt
vi gói ( hình 2.5 bên trái), kích thƣớc của các hạt có thể đƣợc điều chỉnh bằng cách sử
dụng vòi rung hoặc hiệu ứng piezzo. Với quá trình nhũ tƣơng ( hình 2.5 ở giữa và bên
phải), tốc độ rung chuyển tùy vào máy trộn cho phép điều chỉnh kích thƣớc hạt. Các
quá trình nhũ tƣơng đƣợc thực hiện bằng cách cho dịch tế bào alginate hoặc
Trang 57
carrageenan vào pha dầu. việc tạo hạt gel sau đó xảy ra thông qua việc bổ sung dung dịch CaCl2 hoặc một dung dịch acid. Đồng vi gói , có thể đƣợc thực hiện bằng cách thêm các thành phần hoạt tính sinh học thứ hai (các dung dịch polymer hóa hoặc các dung dịch bao phủ) vào dung dịch alginate. [10]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Hình 2.5 Kĩ thuật tạo hạt gel vi gói[10]
Các kỹ thuật phổ biến nhất đƣợc sử dụng trong vi gói probiotic là nhũ tƣơng,
dùng lực đẩy và sấy phun. Kích thƣớc của các hạt vi gói thu đƣợc là rất quan trọng bởi
vì nó ảnh hƣởng đến tính chất cảm quan của thực phẩm. Hạt alginate đƣợc tạo bởi kỹ
thuật nhũ tƣơng có kích thƣớc từ 20 m đến 2 mm, và bằng kỹ thuật phun đẩy từ 2-4
mm. Với công nghệ phun đẩy mới , có thể tạo đƣợc kích thƣớc hạt 150 m. Kĩ thuật
phun đẩy cho hình dạng hạt đồng nhất hơn kỹ thuật nhũ tƣơng. Sấy phun sản xuất
đƣợc hạt vi gói kích thƣớc từ 5 - 80 m. Đối với việc vi gói, vi khuẩn probiotic đƣợc
tăng trƣởng trong điều kiện môi trƣờng tối ƣu, sau đó đƣợc ly tâm và đƣợc sử dụng dƣới hình thức dịch hoặc bột sấy thăng hoa . Việc sử dụng bột đông khô, có thể là một giải pháp thiết thực hơn trong ngành công nghiệp thực phẩm vì sự ổn định của sản
phẩm sấy đông khô trong quá trình vận chuyển cũng nhƣ lƣu trữ. [36]
2.2.2. Vật liệu, phƣơng pháp vi gói
Trong bài nghiên cứu theo phƣơng pháp vi gói của Thomas Heidebach [37]
Trang 58
2.2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Transglutaminase từ vi sinh vật (TGase) thu đƣợc từ Công ty Ajinomoto, Inc
(Hamburg, Đức), với hoạt tính 1000 U/g.
Protease N ―Amano" lấy từ Công ty Enzym Amano (Nagoya, Nhật Bản) với
hoạt tính lớn hơn 150000 U/g.
Tinh bột (RS) đƣợc mua từ Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Dầu hoa tinh khiết đƣợc lấy từ một cửa hàng địa phƣơng.
2.2.2.2. Chuẩn bị hỗn hợp tế bào - protein
Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng đƣợc tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Dịch chiết protein đã đƣợc chuẩn bị bằng cách phân tán trong caseinate natri
nồng độ 15% (w / w). Sau 2 h khuấy đảo, độ pH của dịch casein đƣợc điều chỉnh đến 7.0 với NaOH 5N, hòa tan, khuấy đảo qua đêm ở 4oC trƣớc khi sử dụng tiếp. Hai gam Lactobacillus, Bifidobacterium đƣợc làm tan đá và trộn với 28g casein, để tạo ra một hỗn hợp protein- tế bào với khoảng 1010 - 2 x 1010 (CFU g-1) probiotic. Thêm 1% (w / w) RS vào hỗn hợp protein - tế bào trƣớc khi tiến hành quá trình đóng gói.
2.2.2.3. Quá trình vi gói :
Quá trình vi gói đƣợc thực hiện theo một phƣơng pháp mô tả trƣớc đây dựa trên
các kỹ thuật nhũ tƣơng nƣớc trong dầu (Heidebach và cộng sự, 2009a.). TGase đƣợc thêm vào hỗn hợp protein-tế bào ở 400C, tiếp tục bổ sung 150 g dầu hoa (40oC) trong một bình Erlen 200 ml và khuấy tốc độ không đổi 900 vòng / phút bằng máy khuấy từ
trong 120 phút. Trong quá trình nhũ tƣơng hóa sự phân tán giọt hỗn hợp protein - tế bào
đƣợc chuyển đổi thành các hạt gel nhờ enzym.
Trang 59
Hình 2.6 Phần mặt cắt ngang của gel casein cảm ứng bởi Tgase sau quá trình vi gói Lactobacillus và Bifidobacterium[37]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Trong hình là đại diện hình ảnh mặt cắt ngang của gel casein sau quá trình vi
gói ở độ phóng đại 10000. Các tế bào Lactobacillus (đánh dấu bằng mũi tên) có thể đƣợc tìm thấy phân bố ngẫu nhiên trong mạng gel protein.
Sau đó, các tế bào vi gói qua keo hóa sẽ đƣợc tách khỏi dầu nhờ ly tâm nhẹ
(500v, 1 phút). Phần dịch đƣợc tách bỏ và phần tủa sau ly tâm đƣợc tái pha loãng hai lần, lắc trong 5 phút và sau đó tách ra một lần nữa. Nƣớc và dầu còn sót lại, đƣợc tách bỏ. Các tế bào vi gói đƣợc bảo quản ở 40C, sau đó quá trình sấy thăng hoa đƣợc thực hiện trong vòng 1 ngày.
Quá trình sấy thăng hoa đã đƣợc thực hiện theo mô tả của Higl và
cs. (2007). Một gam dịch tế bào vi gói hoặc không vi gói (hỗn hợp tế bào-protein,
xem phần 2.2.2.2) đã đƣợc chuyển vào lọ thủy tinh có đƣờng kính trong 25 mm và sấy
bằng máy sấy thăng hoa (Alpha LSC 1-4, Đức). Các mẫu ban đầu đƣợc đông lạnh tại - 200C trong máy sấy thăng hoa ở áp suất khí quyển. Sau 1 h quá trình sấy đã đƣợc bắt đầu bằng cách giảm áp suất buồng đến 0,370 mbar và tăng nhiệt độ đến +100C, sau đó quá trình sấy đƣợc thực hiện theo các điều kiện này trong 3 h. Các mẫu sấy khô có chứa khoảng 1.5x1010 - 4,5x 1010 CFU g-1. Nƣớc còn sót lại trong tất cả các mẫu sau khi sấy là từ 3% và 4%.
2.2.2.4. Lưu trữ các mẫu sấy
Sau khi sấy thăng hoa mẫu đƣợc lƣu trữ trong môi trƣờng muối hòa tan của LiCl hoặc MgCl2 tại độ ẩm tƣơng đối (RH) là 11% và 33% (Castro và cộng sự, 1995.), bảo quản ở 4 và 250C.
2.2.2.5. Xác định khả năng sống sau khi sấy thăng hoa
Để phân tích số lƣợng tế bào sống: đã vi gói hoặc dạng tự do sau khi sấy, mỗi
lọai đƣợc hydrat hóa trở lại với nƣớc cất hai lần ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút trƣớc khi phân tích. Khả năng sống (tỉ lệ sống) sau khi sấy thăng hoa đƣợc xác định là mối quan hệ giữa CFU g-1 trƣớc khi sấy (NBF) và các CFUg-1 của mẫu hydrat hóa lại sau khi sấy (NAF) xem công thức : khả năng sống (%) = NAF/ NBF x100% (1)
Sự sống của các tế bào vi gói probiotic hoặc hỗn hợp protein-tế bào không vi gói
sau thời gian bảo quản khác nhau đƣợc tính toán bởi công thức : khả năng sống (%) = Nt/ NAF x 100% (2)
Trong đó: Nt là CFU g-1 probiotic vi gói (hoặc không) đƣợc hòa tan trở lại vào
nƣớc tại các thời điểm t lƣu trữ khác nhau.
Trang 60
2.2.2.6. Phân tích thống kê
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Các thí nghiệm cho dữ liệu có ý nghĩa với ít nhất hai thí nghiệm độc lập có độ
lệch chuẩn (SD). Mức ý nghĩa thống kê đƣợc thiết lập tại p <0,05. Trong các thí nghiệm lƣu trữ với ít nhất hai thí nghiệm độc lập của từng điều kiện lƣu trữ, phân tích
hồi quy đƣợc thực hiện để kiểm tra sự tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn và thời gian lƣu trữ. Với hệ số xác định R2 0.8 trong mọi trƣờng hợp, thống kê có ý nghĩa cho sự tƣơng quan tại p <0,01.
2.2.3. Thảo luận: tác động của vi gói
2.2.3.1. Sự sống của các tế bào probiotic vi gói
Ảnh hƣởng của việc vi gói lên sự sống của Bifidobacterium và Lactobacillus sau
sấy thăng hoa đƣợc thể hiện trong hình. 2.7
Hình. 2.7 Khả năng sống tế bào Bifidobacterium và Lactobacillus vi gói (cột màu
xám đen tối), vi gói với RS (cột màu xám nhạt) và tế bào tự do (cột trắng) khi sấy thăng hoa[37].
Đối với Bifidobacterium không có sự khác biệt trong tỷ lệ sống giữa các mẫu không vi gói, mẫu vi gói có và không có RS. Với Lactobacillus, tỷ lệ sống của
các tế bào vi gói không bổ sung RS cao hơn đáng kể so tế bào tự do. Loài vi khuẩn khác nhau thể hiện khả năng sống khác nhau trong cùng điều kiện sấy nhƣ nhau, đó là do các yếu tố nội tại khác nhau trong tế bào. Biểu đồ cũng cho thấy, khả năng sống của
Lactobacillus so với Bifidobacterium là kém hơn.
Trang 61
2.2.3.2. Nghiên cứu vỏ vi gói
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Trong một nghiên cứu của al Kearney và cộng sự. (1990), cũng có kết
luận Lactobacillus plantarum vi gói với alginate cải thiện khả năng sống cao hơn so với các tế bào tự do trong điều kiện sấy thăng hoa tƣơng tự. Tốc độ hydrat hóa trở lại
và thể tích chất lỏng sau khi sấy thƣờng ảnh hƣởng đến sự hồi phục tế bào probiotic
lactobacilli (Meng và cộng sự, 2008.). Trong nghiên cứu của Kearney và cộng
sự. (1990), một gel caseinate liên kết ngang đƣợc sử dụng làm chất vi gói , giúp bảo vệ các tế bào chống lại tác dụng thẩm thấu, nhờ đó có thể giải thích sự sống cao hơn cho
Lactobacillus vi gói trong nghiên cứu này.
Việc sử dụng vỏ protein để vi gói probiotic là một khái niệm khá mới. Reid và các cộng sự. (2005) đã sản xuất vỏ bọc protein sữa bằng cách cho hỗn hợp whey protein trộn với Lactobacillus rhamnosus , nhỏ giọt vào dung dịch Ca2+. Theo nghiên cƣú Higl cs, 2008;. Santivarangkna và cộng sự, 2008;. Zayed và Roos, 2004 cho biết
hoạt động của nƣớc thấp làm lƣợng nƣớc còn lại trong mẫu sau khi sấy là thấp dẫn đến
tỷ lệ sống của probiotic sau sấy cũng thấp theo. Trong trƣờng hợp vi gói vỏ protein, khả
năng sống tế bào vi gói sau sấy không có sự khác biệt quan trọng so với các tế bào tự
do, nhƣng lƣợng nƣớc còn sót lại trong tế bào sau sấy cao hơn đáng kể so với các tế
bào tự do, nhƣ vậy sẽ cải thiện đáng kể khả năng sống của Lactobacillus rhamnosus.
Mẫu
hoạt độ nƣớc
Vi gói Lactobacillus không bổ sung RS
0.109
Vi gói Lactobacillus với RS
0.118
Tế bào Lactobacillus tự do
0.096
Vi gói Bifidobacterium không bổ sung RS 0.097
Vi gói Bifidobacterium có RS
0.115
Tế bào Bifidobacterium tự do
0.092
[37]
Bảng 2.3 Hoạt độ nƣớc của các mẫu thí nghiệm Lactobacillus, Bifidobacterium
Trang 62
Trong phần nghiên cứu này, đã dùng tinh bột bắp để bổ sung vào nguyên liệu vi gói, sau đó khảo sát hoạt độ nƣớc giữa các mẫu chỉ vi gói, vi gói với bột bắp và
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
không vi gói với nhau, ta có kết quả nhƣ bảng 2.3 . Từ bảng thấy rằng dùng vật liệu vi
gói có bổ sung RS cho hoạt độ nƣớc của Bifidobacterium và Lactobacillus đều cao hơn các mẫu còn lại, và từ những kết luận của Higl cs, 2008;. Santivarangkna và cộng sự,
2008, có thể nói vi gói có bổ sung RS cho tỉ lệ sống của probiotic cao hơn.
2.3. Khảo sát tối ƣu môi trƣờng sấy thăng hoa
Các chủng Lactobacillus đƣợc tiến hành sấy thăng hoa trong ba môi trƣờng
khác nhau và trong nƣớc (môi trƣờng kiểm chứng), gồm : (i)% 6 (w / v) sữa tách béo
, (ii) 6% (w / v) sữa tách béo với 6% (w / v) lactose và (iii)% 6 (w / v) sữa tách béo với
6% (w / v) sucrose.[35]
Trang 63
Hình 2.8 Lượng tế bào sống Lactobacillus trên các môi trường khảo sát trong sấy thăng hoa[27].
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
( Cột trắng): trƣớc sấy, (cột sọc): sau sấy.
Việc cải thiện khả năng sống trong mỗi môi trƣờng đối với mỗi chủng là khác nhau tùy vào chủng giống . Khảo sát thấy rằng khả năng tồn tại của L. gasseri
CRL1421 trong quá trình sấy thăng hoa có bổ sung sữa và đƣờng so với L. delbrueckii
subsp. delbrueckii CRL1461 là hiệu quả hơn rất nhiều (p <0,001) nhƣ thể hiện trong
Hình 2.8, nhƣng sức chịu đựng với điều kiện môi trƣờng còn tùy thuộc nội tại bản thân chủng giống, điều này cũng góp phần dẫn đến sự sống L. delbrueckii sp.
delbrueckii CRL1461 kém hơn L. gasseri CRL1421 sau khi sấy.
Hơn nữa, việc sử dụng sữa tách béo, sữa tách béo kết hợp với đƣờng lactose
hoặc sucrose tăng đáng kể khả năng sống của cả hai chủng sau quá trình sấy thăng hoa
hơn rất nhiều so với sấy trong nƣớc (Hình 2.8 ). Điều này thể hiện rất rõ khi quan sát
chủng L. delbrueckii sp. delbrueckii CRL1461: lƣợng tế bào trong mẫu sau sấy với sữa
tách béo- sucrose là hơn 8 log CFU/ml, còn trong môi trƣờng sấy với nƣớc lƣợng tế
bào sống sụt giảm đáng kể còn lại khá thấp chỉ 2 log CFU/ml. Nhƣ vậy, việc bổ sung
sữa và đƣờng đã cải thiện đáng kể khả năng sống của Lactobacillus.
Môi trƣờng tối ƣu đối với mỗi chủng cũng có khác nhau; với L. gasseri
CRL1421: môi trƣờng sữa tách béo- lactose là hiệu quả hơn hai môi trƣờng còn lại;
với L. delbrueckii sp. delbrueckii CRL1461 môi trƣờng tối ƣu đƣợc sử dụng là sữa
tách béo – sucrose.
2.4. Khảo sát, tối ƣu quả trình bảo quản
Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản và độ ẩm tƣơng đối lên sự sống của
tƣơng đối 11% và 33%
probiotic. Từ hình 2.9 - 2.12 cho thấy sự sụt giảm các tế bào probiotic trong mẫu bảo quản khác nhau ở 40C và 250C ở hai độ ẩm cho Bifidobacterium và Lactobacillus. [37]
Với mong muốn là các vi sinh vật có thể đƣợc lƣu trữ tại nhiệt độ cao hơn để tiết
kiệm đƣợc chi phí cho việc làm mát trƣớc khi sử dụng. Tuy nhiên, qua thí nghiệm thấy bảo quản probiotic ở 250C là không hiệu quả bằng ở 40C. Vì nhiệt độ cao hơn làm thúc đẩy các phản ứng hóa học có hại, chẳng hạn nhƣ quá trình oxy hóa acid béo (Castro và
cộng sự, 1995.). Do đó, để đạt đƣợc tỷ lệ sống cao, bảo quản lạnh vẫn là tốt hơn cho
việc kéo dài thời gian lƣu trữ, giữ hoạt tính probiotic.
Ngoài nhiệt độ bảo quản, độ ẩm bảo quản cũng đóng vai trò quan trọng đảm bảo
Trang 64
khả năng sống của vi khuẩn probiotic. Lƣợng nƣớc dƣ trong mẫu tƣơng quan với các giá trị aw của mẫu. Hơn nữa, giá trị aw của mẫu cân bằng với độ ẩm tƣơng đối môi
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
trƣờng xung quanh trong thời gian lƣu trữ. Do đó, lƣu trữ tại RH quá cao dẫn đến tăng
lƣợng nƣớc trong mẫu và gây bất lợi. Theo Castro et al., 1995 độ ẩm trong phạm vi 7- 11% là tối ƣu . Ở độ ẩm cao hơn, mức độ oxy hóa tăng lên nhanh (Castro và cộng sự, 1995; Higl và cs, 2007;.. Teixeira và cs, 1995).
Hình 2.9 Khả năng sống của Bifidobacterium có và không có vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 11%[37]
Trang 65
Hình 2.10 Khả năng sống của Bifidobacterium tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33% [37]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Từ các kết quả khảo sát ( đƣợc thể hiện trên hình ) cho thấy, nếu dùng chế độ vi gói sẽ cải thiện đáng kể khả năng sống của Bifidobacterium, so với tế bào không vi
gói thì khả năng sống của Bifidobacterium cao hơn khỏang 10 lần sau hơn 90 ngày bảo quản ở 4oC và độ ẩm 11%. Kết quả cũng tƣơng tự cho bảo quản ở 25 oC nhƣng do ảnh hƣởng của nhiệt độ cao làm gia tăng các phản ứng hóa học có hại nên thời gian bảo
quản Bifidobacterium chỉ trong thời gian ngắn khoảng 60 ngày.
Trong chế độ bảo quản ở 33% hàm ẩm, khả năng sống của Bifidobacterium có suy giảm chút ít (ở cả 4oC và 25 oC) , và thời gian bảo quản bị rút ngắn đi chỉ còn khoảng 30 ngày nếu bảo quản ở 25 oC (giảm đi một nửa so với bảo quản ở 25 oC, 11% ẩm).
Từ các kết quả cho thấy, việc bảo quản hiệu quả nhất ở 4oC, độ ẩm 11% và có vi gói Bifidobacterium: cho kết quả khả năng sống của Bifidobacterium khoảng 10%
và lƣu trữ đƣợc trong hơn 90 ngày.
Trang 66
Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 11% [37]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Hình 2.12 Khả năng sống của Lactobacillus tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33% [37]
Quan sát tƣơng tự ta cũng nhận thấy Lactobacillus thích hợp bảo quản ở chế độ 4oC và độ ẩm 11% nâng cao đƣợc khả năng sống hơn 1% và kéo dài thời gian bảo quản hơn 90 ngày. Chế độ vi gói là không có ảnh hƣởng lên Lactobacillus.
Ngoài ra, so sánh giữa Lactobacillus và Bifidobacterium khả năng tồn tại của
Lactobacillus là kém. Điều này do bản thân sức chịu đựng của giống, cũng đã đƣợc
thảo luận nhiều trong những phần trên.
2.5. Đánh giá cảm quan viên kẹo
Thành phần hóa học, tính chất vật lí, lƣợng tế bào sống và giá trị cảm
quan của viên kẹo synbiotic[22].
Thành phần hóa học và tính chất của kẹo viên synbiotic đƣợc đƣa ra trong Bảng 2.4. Giá trị protein trong các sản phẩm bánh kẹo trên thị trƣờng là từ 0% (nhiều nhất bao gồm kẹo đậu, kẹo bơ cứng,…) đến 5% (kẹo sữa có phủ chocolate). So với giá trị dinh dƣỡng protein cho các sản phẩm bánh kẹo thƣơng mại, kẹo kefir chứa 12,38%
protein sữa, cao hơn hầu hết các các loại bánh kẹo. Một chỉ tiêu khá quan trọng cần
Trang 67
xem xét là đảm bảo đủ số lƣợng tế bào sống để mang đến những tác động có lợi cho ngƣời tiêu dùng, theo quy định của Hiệp hội sữa Thế giới: sản phẩm sữa lên men phải đảm bảo chứa > 107 (CFU/g) để mang lại lợi ích cho sức khỏe . Lƣợng tế bào sống trong sản phẩm đạt 7.37 log CFU/g sau 28 ngày lƣu trữ trong môi trƣờng có bổ sung
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
inulin ( rau diếp xoăn) và bột sữa gầy (bảng 2.2) , điều này cho thấy tính hữu ích của
sản phẩm.
Tính chất vật lý của kẹo cũng đƣợc liệt kê trong Bảng 2.4. Trọng lƣợng trung
bình của sản phẩm là 0,7 g với độ dày 5,7 mm. Độ cứng và mức độ vỡ vụn của kẹo lần
lƣợt là 51,60 N và 0,96%,. Bertocchia và cộng sự (2005) chỉ ra rằng các lực nén ép
trong quá trình ép tạo viên ảnh hƣởng lớn tới độ cứng, thời gian tan rã và kích thƣớc trung bình của viên kẹo. Tốc độ hòa tan kẹo chủ yếu liên quan đến các tính chất bề mặt
của viên kẹo. Ngoài ra, khả năng vỡ vụn cao hơn làm tăng việc giải phóng, hòa tan kẹo.
Viên kẹo đƣợc tạo ra cần 14,46 phút để hòa tan hoàn toàn trong nƣớc và theo Wolff
và cộng sự . 2003 ., độ cứng tiêu chuẩn cho kẹo yêu cầu cần trung bình 12 phút để hòa
tan hoàn toàn trong nƣớc.
1,45 12,38 <0,10
0,70 5,70 0,96 51,60
Thành phần hóa học Độ ẩm (%) Protein (%) chất béo (%) Tính chất vật lý Trọng lƣợng (g) Độ dày (mm) khả năng vỡ vụn(%) Độ cứng (N) độ hòa tan(min) 14,46 khả năng sống vi khuẩn lactic (log cfu / g)
7.37
[22]
Bảng 2.4 Tính chất lí hóa và lƣợng tế bào sống của kẹo
[]
2.6. Bảo quản kẹo synbiotic bằng bacteriocin:
Nhƣ ở đầu đề tài có đề cập đến chủng vi khuẩn đƣờng ruột gây hại nhƣ H. pylori , Salmonellae, Listeria, E.coli , có thể dẫn đến tử vong ở ngƣời. Cũng nhƣ có
Trang 68
nhiều nhóm vi sinh vật gây hƣ hỏng, xâm nhiễm quá trình lên men. Một điều có thể
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
thấy là probiotic hoàn toàn có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gây hại xâm nhập đƣờng
ruột. Sở dĩ các vi khuẩn này có khả năng kháng khuẩn tốt là do trong quá trình trao đổi chất đã tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn nhƣ axit hữu cơ (axit lactic và axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin... Các sản phẩm trao đổi chất này chính là "vũ khí" kháng khuẩn của
probiotic.
Có hai cơ chế giúp probiotic phát huy khả năng kháng khuẩn:
Khả năng kháng khuẩn của các axit hữu cơ
Các axit hữu cơ đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn lactic chủ yếu là axit lactic và axit
acetic, các axit này góp phần giảm pH tiêu diệt các vi khuẩn có hại ví dụ nhƣ vi khuẩn E.coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus... Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trƣờng axit bên ngoài, H+ từ môi trƣờng sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lƣợng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đƣờng phân (glycolysis), tế bào vi khuẩn cạn kiệt
năng lƣợng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các anion của axit còn gây rối loạn sự thẩm
thấu của màng tế bào. Những nguyên nhân này làm cho vi khuẩn bị chết.
Hình 2.13 Vi khuẩn gây bệnh bị ức chế hoạt động ở pH thấp (<3.5) [41]
Khả năng kháng khuẩn của Bacteriocin
Trang 69
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất protein là những phân tử peptide đƣợc riboxom tổng hợp từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng. Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
thối rữa và các mầm bệnh trong thực phẩm phổ biến là vi khuẩn Listeria
monocytogenes và Staphylococcus aureus.
Bacteriocin đƣợc chia thành 4 nhóm: Nhóm I là nhóm lantibiotic, là polypeptit
có trọng lƣợng phân tử < 5KDa. Nhóm II gồm các bacteriocin không phải là
lantibiotic, có khối lƣợng <10KDa. Nhóm III là bacteriocin có trọng lƣợng phân tử > 30KDa, nhóm IV là các bacteriocin phức tạp, ngoài thành phần chính là protein chúng
còn chứa lipid và cacbonhydrat.
Cơ chế tác động bacteriocin rất đa dạng: tạo thành các kênh làm thay đổi tính
thấm của màng tế bào, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất. Nhiều loại
bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục đƣợc làm suy yếu thành tế bào.
Theo những nghiên cứu: hai chủng khuẩn lactic chính chiếm ƣu thế trong hệ vi
khuẩn đƣờng ruột, bao gồm 56 loài Lactobacillus và nhiều loài Bifidobacterium. Hầu
hết các loài này đƣợc dùng để sản xuất bacteriocin trong ống nghiệm (Avonts và De
Vuyst năm 2001; Carr cs. 2002; Cross 2002). Gần đây, một số chủng cũng đã đƣợc
chứng minh sản xuất bacteriocin trong cơ thể (Bảng 2.5). Một nghiên cứu đã chứng
minh hoạt động trong cơ thể của chủng Lactobacillus salivarius UCC118 có thể sản
xuất bacteriocin phổ kháng sinh rộng mạnh (Abp118) hoạt động chống lại tác nhân
gây bệnh truyền qua thực phẩm Listeria monocytogenes (Claesson cs. 2006) [32].
Bacteriocin
Chủng sản xuất
Chủng bị ức chế
Nghiên cứu
ABP-118
Lactobacillus salivarius UCC118
Listeria monocytogenes
Corr et al. (2007)
Bovamine™ Lacticin B
Lactobacillus acidophilus L. acidophilus
E. coli O157:H7 V. anguillarum
Brashears et al. (2003a) Taoka et al. (2006)
L. casei L26 L. johnsonii La1 L. acidophilus LB Enterococcus faecium J96
E. coli O111, L. monocytogenes H. pylori H. pylori, H. felis Salmonella pullorum
Cruchet et al. (2003) Coconnier et al. (1998) Audisio et al. (2000)
UNa UN UN Enterocin
[ 32]
Trang 70
Bảng 2.5 Bacteriocin đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn probiotic
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Một chủng Lactobacillus casei L26 LAFTI biểu hiển khả năng ức chế đáng kể
chủng enterohemorrhagic của E. coli và chủng L. monocytogenes ở chuột (Su cs.2007), nhờ chúng có thể sản xuất bacteriocin UNa (Pidcock cs. 2002). Chủng
lactobacilli sinh ra bacteriocin ức chế Helicobacter pylori - tác nhân gây bệnh dạ dày
nghiêm trọng (Kandulski và cộng sự năm 2008). Hoạt động kháng H.pylori đã đƣợc
xác định trong chủng probiotic Lactobacillus johnsonii LA1 (Gotteland và cộng sự năm 2008;. Michetti và cs.1999) và Lactobacillus acidophilus (Coconnier cs. 1998).
Trong cả hai trƣờng hợp, hoạt động ức chế đƣợc diễn ra khi H. pylori liên kết với các tế bào biểu mô ruột. L. acidophilus LB còn đƣợc chứng minh bảo vệ chuột không bị nhiễm Helicobacter felis (Coconnier và cs., 1998; Nedrud và Blanchard 2001), điều
này ức chế sự xâm nhiễm dạ dày và và do đó giảm chứng viêm dạ dày (Coconnier et
al. 1998).
Bacteriocin đƣợc sản sinh bởi vi khuẩn lactic là tác nhân sinh học an toàn trong bảo quản thực phẩm thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học, có hoạt tính kìm hãm
đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trƣởng và phát triển của một số vi khuẩn gây hại
trong thực phẩm [1].
Trong phạm vi nghiên cứu của bài có phân lập chọn giống Lactococcus lactis
vào sản xuất kẹo, với mục đích biết đƣợc khả năng kháng khuẩn cũng nhƣ vai trò bảo
quản của Lactococcus lactic, tiến hành khảo sát phổ kháng khuẩn trong dịch
bacteriocin của chủng Lc.lactis đối với một số chủng vi khuẩn chỉ thị. Từ bảng 2.6 cho
thấy dịch bacteriocin từ chủng Lc.lactis có phổ kháng khuẩn khá rộng, có hoạt tính ức
chế vi khuẩn Gram dƣơng và ức chế một số vi khuẩn Gram âm gây bệnh nhƣ Sal.
typhimurium và E.coli [1].
Bảng 2.6 Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactococcus lactis
Chủng vi khuẩn chỉ thị Chủng vi khuẩn chỉ thị
Đƣờng kính vòng kháng khuẩn 11 10 12 0 14 15
Trang 71
Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus licheniformis 1 Bacillus licheniformis 2 Bacillus Staphylococcus aureus Đƣờng kính vòng kháng khuẩn 16 12 15 12 13 11 Salmonella typhimurium Escherichia coli Streptococcus sp Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus plantarum [1]
Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic
Salmonella typhimurium Lactobacillus plantarum
Hình 2.14 Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng
Trang 72
Lc.lactis đối với một số chủng chỉ thị [1]
Chƣơng 3: Kết luận và kiến nghị
CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN
Kết luận:
Muốn có đƣợc những lợi ích cho sức khỏe mà probiotic mang lại trƣớc tiên phải duy trì đƣợc sự tồn tại của chúng trong cơ thể, hơn nữa là phải tăng sự phát
triển lợi thế và tăng số lƣợng của chúng hơn những chủng vi sinh vật có hại.
Nhƣ vậy, tối ƣu lƣợng probiotic trong thực phẩm, cũng nhƣ duy trì đƣợc khả năng sống và hoạt tính của chúng khi đƣa vào cơ thể là một việc quan trọng. Từ những
nghiên cứu trong bài để duy trì đƣợc lƣợng probiotic tối đa trong sản phẩm, cần
những vấn đề sau: - Quan trọng đầu tiên, bổ sung prebiotic nhằm bảo vệ probiotic đảm bảo sự tồn tại và cung cấp dinh dƣỡng thúc đẩy sự tăng trƣởng. FOS P95 là prebiotic hiệu quả
hơn hẳn trong việc tăng trƣởng của probiotic đặc biệt là chủng L.casei LC-01, và
inulin thƣơng mại( rau diếp xoăn): INY (GR) tạo đƣợc môi trƣờng acid không
tăng cao, thuận lợi cho sự phát triển cho Lactobacillus và Bifidobacterium . - Probiotic cần đƣợc vi gói để đƣợc bảo vệ qua điều kiện sấy, quá trình bảo quản cũng nhƣ trong điều kiện acid thấp của hệ tiêu hóa ngƣời. Vi gói có bổ sung RS
sẽ cải thiện khả năng sống cho Lactobacillus đáng kể hơn nhiều so với tế bào tự
do, việc vi gói là cải thiện không cao cho Bifidobacterium.
- Bổ sung thêm SM và đƣờng (sucrose hoặc lactose) vào quá trình sấy thăng hoa, sẽ cải thiện đƣợc khả năng sống cho L. gasseri CRL1421, L. delbrueckii subsp.
delbrueckii CRL1461
- Thực hiện bảo quản sản phẩm kẹo ở chế độ lạnh 4oC và giữ ẩm 11%, nhờ vậy cải thiện thời gian sống của Bifidobacterium và Lactobacilus lên hơn 90 ngày.
Sản phẩm kẹo viên là đáp ứng đƣợc chỉ tiêu yêu cầu probiotic của Hiệp Hội sữa
Thế giới: đạt lƣợng tế bào 7.37 log CFU/g sản phẩm sau 28 ngày lƣu trữ.
Hiện nay, với sự phát triển của khoa học, công nghệ, y học…cũng làm phát sinh ra những dòng khuẩn biến thể khá nguy hại, nhƣ gần đây nhất (2011) xuất hiện
khuẩn E. coli O104 miễn nhiễm đƣợc hầu hết với các loại kháng sinh chính ( nhƣ đã đề cập đầu bài) gây nguy hiểm cho con ngƣời. Trong khi y học vẫn chƣa khống chế đƣợc những tình huống mới, bất ngờ nhƣ trên, thì rõ ràng việc nâng cao sức đề kháng con ngƣời nhờ vào ngay chính những nguồn thực phẩm hằng ngày là một việc hoàn toàn cần thiết, đặc biệt là tăng cƣờng miễn dịch hệ tiêu hóa bằng bổ sung
Trang 73
probiotic.
Chƣơng 3: Kết luận và kiến nghị
Hƣớng phát triển
Trong quá trình thực hiện Đồ án, sinh viên thấy còn nhiều vấn đề còn chƣa khai
thác hết, và đây sẽ là hƣớng nghiên cứu phát triển tiếp theo, với mong muốn hoàn
thiện hơn những kiến thức về các chủng khuẩn probiotic để có thể phát huy tối đa
lợi ích từ chúng, cũng nhƣ tối ƣu sử dụng prebiotic:
- Reuterin là một chất chuyển hóa trung gian trong quá trình lên men yếm khí glycerol của lactobacilli. Là một chất kháng khuẩn rộng, chống lại nhiều vi khuẩn hại. Đây là hƣớng sinh viên cần làm rõ hơn, cũng nhƣ vấn đề khảo sát
chủng lactis sinh bacteriocin cao bổ sung vào sản phẩm probiotic. Với hƣớng
này có thể phát huy hơn nữa lợi ích của probiotic, cũng nhƣ sẽ hoàn thiện tính
chức năng của sản phẩm và sẽ mang lại đƣợc hiệu quả cao hơn cho ngƣời sử
dụng.
- Trong bài sinh viên chỉ mới phối hợp probiotic với prebiotic, cần khảo sát thêm
Trang 74
việc vi gói probiotic bằng prebiotic và sấy có dùng prebiotic.
Tài liệu tham khảo
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
quản thịt tƣơi sơ chế tối thiểu. Science & Technology Development, Vol 11, No.09 – 2008.
2 Dƣơng Thanh Liêm (2009), Thực phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, NXB ĐH
Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.
3 Nguyễn Đức Lƣợng . Công nghệ enzyme. Nxb Đại học Quốc gia Tp. HCM 4 Nguyễn Đình Thị Nhƣ Nguyện (2009), Nghiên cứu quá trình
tinh sạch
Fructooligosaccharide bằng phƣơng pháp lọc nano, Luận văn cao học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh
5 Hồ Nhân. Reuterin-giải pháp mới thay thế kháng sinh an toàn và hiệu quả 6 Lƣơng Đình Quát (2007), Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý sinh khối vi khuẩn lam S.platensis để sản xuất một số loại nƣớc uống giàu dinh dƣỡng, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
7 Trịnh Thị Kim Vân và cộng sự
(2004), Nghiên cứu sản xuất đƣờng
fructooligosaccharide bằng công nghệ đa enzyme và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng, Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật, Bộ Khoa học và
công nghệ - Viện công nghiệp thực phẩm.
Tài liệu Tiếng Việt 1 Nguyễn Thúy Hƣơng, Trần Thị Tƣởng An. Thu nhận bacteriocin bằng phƣơng pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactis cố định trên chất mang BC và ứng dụng trong bảo
Tài liệu Tiếng Anh
8 Cherbur C . Inulin and oligofructose in the dietary fiber concept. Brit J Nutr 87:159–
162
9 Chien, C.S., Lee, W.C, Lin, T.J. Immobilization of Aspergillus japonicus by entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides, Enzyme and Microbial Technology 29, 252 – 257.
10 Claude P Champagne and Patrick Fustier. Microencapsulation for the improved delivery of bioactive compounds into foods. Current Opinion in Biotechnology 2007,
18:184–190
11 Dina Rodrigues a, Teresa A.P. Rocha-Santos. The potential effect of FOS and inulin upon probiotic bacterium performance in curdled milk matrices. Food Science and Technology
12 FAO technical meeting on prebiotic, 2007. Food quality and Standard service 13 Gross D. "Non- reducing oligosaccharides", Methods in Carbohydrate chemistry.
Whistler R.L and Wolman M.L. Academic press, New York, Vol. 1.
Trang 79
Tài liệu tham khảo
14 Gibson G.R., Willis C.L. and Loo J.V. "Non-digestible oligosaccharides and
Bifidobacteria- implications for health", Int. Sugar J., 96 pp. 381-387.
15 Gibson GR, Roberfroid MB (1995) Dietary Modulation of the Colonic Microbiota:
Introducing the Concept of Prebiotics. J Nutr 125:1401–1412
16 Gibson GR, Probert HM, Van Loo JAE, Roberfroid MB (2004) Dietary Modulation of the human colonic microbiota: Updating the concept of prebiotics. Nutr Res Rev
17:257–259
17 Glenn R Gibson, Christine M William, Functional foods 18 G.R.Gibson, R.A. Rastall . Prebiotic Development and Application 19 G.T. Macfarlane, H. Steed and S. Macfarlane. Bacterial metabolism and health-related Journal of Applied
effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. Microbiology 2008; 104: 305–344
20 Gerald W.T. probiotic and prebiotic: where are we going 21 Kieran M. Tuohy, Hollie M. Probert, Chris W. Smejkal and Glann R. Gibson. Using
probiotics and prebiotics to improve gut health. DDT Vol. 8
22 K.N. CHEN1, C.Y. KUO2, J.S. SHIU3 and M.J. CHEN. Process optimization for a novel kefir candy with high probiotic viability. Journal of Food Process Engineering (2010)
23 John H Cummings, George T Macfarlane, and Hans N Englyst. Prebiotic digestion and
fermentation. Am J Clin Nutr 2001; 73: 415 – 420.(d)
24 Juffrie M (2002) Fructooligosaccharides and diarrhea. Biosci Microflora 21:31–34 25 Jurgen Schrezenmeir and Michael de Vrese. Probiotics, prebiotics, and synbiotics—
approaching a definition. Am J Clin Nutr 2001;73:361–364.
26 Jong won Yun. Fructooligosaccharides- occurrrence preparation and application.
Enzyme and microbial Technology 19: 107- 117
27 Marıa Claudia Otero, Maria Carolina Espeche. Optimization of the freeze-drying media and survival throughout storage of freeze-dried Lactobacillus gasseri and Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii for veterinarian probiotic applications. Process
Biochemistry 42 (2007) 1406–1411
28 Michael de Vrese,. J. Schrezenmeir. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Adv
Biochem Engin/Biotechnol (2008) 111: 1–66
29 Marcel Roberfroid. Prebiotics: The Concept Revisited. The Journal of Nutrition 2007;
137: 830 – 837.
30 Nyman M (2002) Fermentation and bulking capacity of indigestible carbohydrates: the
case of Inulin and oligofructose. Brit J Nutr 87:163–168
31 Nopchinda S, Varavithya W, Phuapradit P, Sangchai R, Suthutvoravut U,. Effect of bifidobacterium Bb12 with or without Streptococcus thermophilus supplemented formula on nutritional status. J Med Assoc Thai 85:1225–1231
Trang 80
Tài liệu tham khảo
32 O. Gillor & A. Etzion & M. A. Riley. The dual role of bacteriocins as anti- and
probiotics. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:591–606
33 43 [f] Playne MJ, Crittenden R (1996) Commercially available oligosaccharides. IDF
Bulletin 313:10–22
34 Robert A. Rastall . Prebiotic and Probiotic science and technology, tập 1 35 Solange I. Mussatto ,Ismael M. Mancilha. Non-digestible oligosaccharides: A review.
Carbohydrate Polymers 68 (2007) 587–597
36 Susanna Rokka, Pirjo. R. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation:
challenges for industrial application. Eur food Res Tech (2010)
37 Thomas Heidebach, Petra Forst, Ulrich Kulozik.
Influence of casein-based
microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells . Journal of Food Engineering 98 (2010) 309–316
38 Tatdao Paseephol, Frank Sherkat. Probiotic stability of yoghurts containing Jerusalem artichoke inulins during refrigerated storage. Journal of functional ( 2 0 0 9 ) 311 –318
Trang web tham khảo:
39 http://www.scribd.com/doc/23129934/20/ứng-dụng-trong-sấy-thăng-hoa 40 http://www.yakult.vn/pressarticle/detail/id/59/Co-che-khang-khuan-cua-probiotic 41 ebook.edu.net.vn/resources/iportal/ebook/.../Chuong%2013.pdf 42 http://tuoitre.vn/Chinh-tri-xa-hoi/Song-khoe/441304/Gia-do-thu-pham-cua-dich-
Ecoli.html
43 http://enbac.net/index.php?frame=detail&id=86026
Trang 81
