Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng soybean mosaic virus và bean yellow mosaic virus

Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 118(04): 111 - 115<br /> <br /> LOW MOSAIC VIRUS<br /> 2<br /> Lò Thị Mai Thu1<br /> ,<br /> 3<br /> 2*<br /> Chu Hoàng Hà , Chu Hoàng Mậu<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Tây Bắc,<br /> Trường Đại học Sư phạm- ĐH Thái Nguyên,<br /> 3<br /> Viện Công nghệ Sinh học<br /> <br /> 2<br /> <br /> Bệnh khảm do soybean mosaic virus (SMV) và bean yellow mosaic virus (BYMV) gây thiệt hại<br /> đáng kể về năng suất, chất lƣợng và sản lƣợng hạt đậ<br /> nhiễ<br /> ại virus khác sẽ<br /> . Hiện nay, trong ngành sản xuất đậu<br /> tƣơng mới dừng ở biện pháp phòng mà chƣa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV.<br /> RN<br /> tƣơng<br /> chuyển<br /> thành<br /> ậ<br /> 2008 và thu<br /> đƣợ<br /> ở thế hệ<br /> DT2008 dƣơng tính với phản ứ<br /> 12 l<br /> iếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiệ<br /> ế hệ tiế<br /> .<br /> :<br /> , nách lá mầ<br /> *<br /> <br /> Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây<br /> trồng ngắn ngày, có giá trị cao về dinh dƣỡng,<br /> kinh tế và là nguyên liệu cho công nghiệp, là<br /> cây trồng cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng.<br /> Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng ở<br /> nƣớc ta còn thấp, chất lƣợng hạt chƣa cao là<br /> do mức độ ổn định của giố<br /> ảnh hƣởng<br /> của nấm, côn trùng, vi khuẩ<br /> .<br /> Đậu tƣơng là một trong số các cây trồng dễ bị<br /> nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm<br /> (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm<br /> vàng hại đậu tƣơng (Bean yellow mosaic<br /> virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh<br /> virus khác. Vì vậy, nghiên cứu tạo dòng cây<br /> kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống<br /> đậu tƣơng sạch bệnh là rất cần thiết.<br /> ệnh<br /> khảm ở cây đậu tƣơng đƣợc lan truyền do rệp<br /> làm môi giớ<br /> ệt hại đáng kể về năng<br /> suất, chất lƣợng và sản lƣợng hạt đậu tƣơng<br /> [4]. Hiện nay, trong ngành sản xuất đậu tƣơng<br /> mới dừng ở biện pháp phòng mà chƣa có<br /> thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV.<br /> *<br /> <br /> Tel: 0913 383289, Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn<br /> <br /> Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài<br /> SMV và BYMV là sử dụng các giống đậu<br /> tƣơng kháng bệnh. Tuy nhiên, nguồn giống<br /> đậu tƣơng kháng bệnh tự nhiên đối với SMV<br /> và BYMV là không nhiều, do vậy cách tiếp<br /> cận ứng dụng công nghệ gen để nghiên cứu tạo<br /> giống đậ<br /> ệu quả cao và bền vững. Hai<br /> hƣớng tiếp cận tạo cây đậu tƣơng chuyển gen<br /> kháng virus đƣợc quan tâm nghiên cứu, đó là<br /> (i) phân lập gen từ giống đậu tƣơng có khả<br /> năng kháng virus tốt nhất để chuyển vào giống<br /> đậu tƣơng có tính kháng kém, (ii) chuyển các<br /> gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh<br /> theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference<br /> (RNAi). Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau<br /> phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành<br /> công kỹ thuật RNAi trong chiến lƣợc tạo cây<br /> chuyể<br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 2008 thông qua A. tumefaciens<br /> .<br /> 111<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 118(04): 111 - 115<br /> <br /> kanamycin<br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 1).<br /> 12 do Trung tâm<br /> Nghiên cứu và Phát triển cây đậu đỗ, Viện<br /> cây lƣơng thực và cây thực phẩm - Viện Khoa<br /> học Nông nghiệp Việt Nam cung cấ<br /> . Vect<br /> <br /> -<br /> <br /> Nách lá mầm<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> E<br /> <br /> Kỹ thuật tái sinh đa chồ<br /> A. tumefaciens qua nách lá mầm hạ<br /> cây đậu tƣơng đƣợc tiến hành dựa trên<br /> phƣơng pháp của Olhoft và cộng sự (2006) có<br /> cải tiế<br /> (2011) [2].<br /> <br /> (%). DNA tổng số từ các mẫu lá non đƣợc<br /> tách chiết theo phƣơng pháp của Saghai<br /> Maroof và cộng sự (1984) [10] có cải tiến.<br /> Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ<br /> thuậ<br /> :<br /> SMV-CPi-Fi: 5‟- CACCGCAGCAGAAGCTTACA -3‟;<br /> BYMV-CPi-Ri: 5‟- ATGTTCCGAACCCCAAGCAA -3‟.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> 2008<br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> A. tumefaciens<br /> [2<br /> <br /> -<br /> <br /> A. tumefaciens<br /> -<br /> <br /> G<br /> <br /> H<br /> <br /> 1.<br /> <br /> A –<br /> ; B - Gây tổn thương<br /> nách lá mầm trong dịch khuẩ<br /> ễm 30 –<br /> 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện<br /> tố<br /> ; D - Cảm ứng tạo đa chồi trên<br /> SIM lầ<br /> (bổ sung BAP 2 mg/l +<br /> kanamycin 50 mg/l); E - Cắt bỏ lá mầm, chuyển<br /> sang môi trường kéo dài chồ<br /> (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l +<br /> kanamycin50 mg/l); G - Ra rễ<br /> (bổ<br /> ; H - Ra cây<br /> (giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)<br /> <br /> kim châm. Theo Olhoft và đtg (2006)<br /> [7], Xue và đtg (2006) [12], Zhang và đtg<br /> (1999) [13] việc gây tổn thƣơng nách lá mầ<br /> ủ mô đích cho sự xâm<br /> nhiễ<br /> ẩn. Yamada và đtg (2012)<br /> [14]<br /> , sử dụng bàn chải làm<br /> từ thép không gỉ để tạo các vết thƣơng ở nách<br /> lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt kỹ<br /> thuật và sự<br /> , mức độ hình<br /> thành chồi ở nách lá mầ<br /> ụ<br /> thuộc vào kỹ thuật gây tổn thƣơng mà còn phụ<br /> thuộc vào đặc điểm của kiểu gen cây đậu<br /> tƣơng [8].<br /> -<br /> <br /> 1.<br /> 112<br /> <br /> D<br /> <br /> [11].<br /> <br /> -<br /> <br /> C<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả biến nạp cấ<br /> <br /> G<br /> <br /> ĐT12<br /> <br /> DT2008<br /> <br /> Lô thí Số mẫu<br /> nghiệm biến nạp<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> Tổng<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> 100<br /> 150<br /> 120<br /> 370<br /> 250<br /> 180<br /> 220<br /> 200<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 850<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> Số mẫu<br /> Số chồi Số chồi<br /> tạo<br /> kéo dài ra rễ<br /> chồi<br /> 27<br /> 10<br /> 5<br /> 48<br /> 17<br /> 16<br /> 37<br /> 13<br /> 10<br /> 112<br /> 40<br /> 31<br /> 130<br /> 50<br /> 30<br /> 75<br /> 28<br /> 19<br /> 103<br /> 45<br /> 29<br /> 95<br /> 41<br /> 27<br /> 403<br /> <br /> 164<br /> <br /> 118(04): 111 - 115<br /> <br /> 105<br /> <br /> Số<br /> <br /> Số cây<br /> số<br /> gen (%)<br /> <br /> 4<br /> 12<br /> 8<br /> 24<br /> 26<br /> 16<br /> 25<br /> 23<br /> <br /> 3<br /> 10<br /> 3<br /> 16<br /> 7<br /> 6<br /> 9<br /> 10<br /> <br /> 90<br /> <br /> 32<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,35<br /> <br /> 19<br /> <br /> 2,24<br /> <br /> thƣớ<br /> 1,35% (5/370).<br /> 40 chồi kéo dài trên môi trƣờng chọn<br /> lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó<br /> 31 chồi ra rễ<br /> ận đƣợ<br /> ển<br /> trên giá thể<br /> ờng chọn<br /> lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó<br /> 105 chồi ra rễ<br /> ận đƣợ<br /> phát triển trên giá thể<br /> <br /> 2008, k<br /> <br /> 2,24%<br /> (19/850).<br /> 500bp<br /> <br /> 500bp<br /> <br /> 500bp<br /> <br /> giống DT2008.<br /> các dòng cây đậu tƣơng chuyể<br /> 0<br /> S<br /> ặt của gen chuyển trong các dòng đậu<br /> tƣơng chuyển gen<br /> ỹ<br /> thuậ<br /> gen. DNA tổng số từ 16 mẫu lá đậu tƣơng<br /> ĐT12 và 32 mẫu lá đậu tƣơng DT2008 đƣợ<br /> agarose<br /> 1%<br /> PCR. K<br /> -<br /> <br /> ạ<br /> <br /> 2.<br /> điện di kiểm tra sự có mặt của<br /> cấu trúc CPi (S đậu tương chuyể<br /> 2008<br /> (M: Marker 50 bp; 1-16: 16 dòng đậu tương ĐT12<br /> chuyển gen; (-): Đối chứng âm; 1-32: 32 dòng đậu<br /> tương DT2008 chuyển gen).<br /> <br /> ẳng định<br /> cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) đã đƣợc<br /> chuyển thành công vào hai giống đậu tƣơng<br /> ĐT12 và DT2008.<br /> gen<br /> <br /> ĐT12<br /> oạn DNA thu đƣợc có kích<br /> <br /> 1.<br /> 113<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> A.<br /> tumefaciens, N<br /> P5CSm<br /> <br /> HA1<br /> <br /> 5N<br /> <br /> –<br /> -<br /> <br /> .<br /> polypeptid, nhƣ gen CP, gen<br /> <br /> -<br /> <br /> .<br /> KẾT LUẬN<br /> Đã chuyể<br /> ậ<br /> 2008 và thu đƣợc 5 dòng cây đậ<br /> ở thế hệ T0 mang cấ<br /> 2008 dƣơng tính với phản ứ<br /> <br /> -<br /> <br /> iếp tục chọn lọc,<br /> phân tích biểu hiệ<br /> ế hệ tiế<br /> .<br /> Lời cảm ơn: Công trình đượ<br /> <br /> –<br /> ỗ trợ kinh phí và thuộc nội<br /> 114<br /> <br /> 118(04): 111 - 115<br /> <br /> dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp Bộ<br /> Giáo dục & Đào tạo, mã số: B2013-TN04-05<br /> do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes<br /> EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance<br /> to Bean golden mosaic virus in genetically<br /> engineered common bean (Phaseolus vulgaris).<br /> Mol Plant Microbe Interact 20:717–726.<br /> 2. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu<br /> Hoàng Hà, Lê văn Sơn (2011), “Nghiên cứu khả<br /> năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của<br /> hai giống đậu tƣơng (Glycine max L.) ĐT12 và<br /> DT84 bằng Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ<br /> Sinh học, 8 (38): tr. 1305-1310.<br /> 3. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2011). Luận án<br /> tiến sĩ sinh học. Đại học Thái Nguyên.<br /> 4. Hartman G.L., Sinclair J.B, and Rupe J.C.<br /> (1999) Compendium of Soybean Diseases. Fourth<br /> Edition. The American Phytopathological Society.<br /> Press, Minnesota, USA.<br /> 5. Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích<br /> Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình<br /> (2011) Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh<br /> đốm vòng ứng dụng cơ chế RNAi. Hội thảo quốc<br /> gia bệnh hại thực vật Việt nam: 316 – 326.<br /> 6. Kasai, M. and A.Kanazawa (2012) RNA<br /> silencing as a tool to uncover gene function and<br /> engineer novel traits in soybean. Breed. Sci. 61:<br /> 468–479<br /> 7. Olhoft P.M., Donovan C.M., Somers D.A.<br /> (2006), “Soybean (Glycine max) transformation<br /> using mature cotyledonary node explants”.<br /> Methods in molecular biology: Agrobacterium<br /> protocols, 2nd ed. Humana Press Inc, Totowa, NJ:<br /> pp. 385-396.<br /> 8. Paz M.M., Shou H., Guo Z., Zhang Z.,<br /> Banerjee A.K. and Wang K. (2004) Assessment of<br /> conditions affecting Agrobacterium- mediated<br /> soybean transformation using the cotyledonary<br /> node explant. Euphytica 136: pp.167–179.<br /> 9. Paz, M.M., J.C. Martinez, A.B.Kalvig, T.M.<br /> Fonger and K. Wang (2006) Improved<br /> cotyledonary n ode method using an alternative<br /> explant derived from mature seed for efficient<br /> Agrobacterium-mediated soybean transformation.<br /> Plant Cell Rep. 25: 206–213.<br /> 10. Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen<br /> RA, Allard RW (1984). Ribosomal DNA spacerlength polymorphisms in barley: Mendelian<br /> inheritance, chromosomal location and population<br /> dymnamics. Proc Natl Acad Sci USA 81:80148018.<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 11. Lo Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn<br /> Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậ<br /> ,<br /> 35<br /> (3), tr. 129-135<br /> 12. Xue R.G., Xie H.F. and Zhang B. (2006) A<br /> multi-needle-assisted transformation of soybean<br /> cotyledonary node cells. Biotechnol. Lett. 28:pp.<br /> 1551–1557.<br /> <br /> 118(04): 111 - 115<br /> <br /> 13. Zhang, Z., A.Xing, P.Staswick and T.E.<br /> Clemente (1999) The use of glufosinate as a<br /> selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean. Plant Cell Tissue Organ<br /> Cult. 56: 37–46.<br /> 14. Yamada T., Takagi K., Ishimoto M., (2012)<br /> Recent advances in soybean transformation and<br /> their application to molecular breeding and<br /> genomic analysis. Breeding Science 61: 480–494<br /> <br /> SUMMARY<br /> STUDY ON CREATION TRANSGENIC SOYBEAN PLANTS HAVE<br /> RESISTANCE TO SOYBEAN MOSAIC VIRUS AND BEAN YELLOW<br /> MOSAIC VIRUS<br /> Lo Thi Mai Thu1, Le Hong Trang2,<br /> Chu Hoang Ha3, Chu Hoang Mau2*<br /> 2<br /> <br /> 1<br /> Tay Bac University,<br /> College of Education - TNU<br /> 3<br /> Institute of Biotechnology<br /> <br /> Mosaic diseases in soybean caused by soybean mosaic mosaic virus (SMV) and bean yellow<br /> mosaic virus (BYMV) cause significant damage in terms of productivity, quality and yield of<br /> soybean seeds. If the soybean cultivars infected with simultaneously both SMV and BYMV and<br /> other viruses will cause huge damage. Currently, in soybean production only measures to prevent<br /> and stopped, but without any of medication to treat SMV and BYMV. Application of transgenic<br /> technique on RNAi mechanism is modern technology solutions to create transgenic soybean lines<br /> with tolerance resistance to SMV and BYMV. In this study we have successfully transformed<br /> structure pK7GW-CPi (SMV- BYMV) into two soybean cultivars DT12 and DT2008 and 5<br /> transgenic plants lines from cultivar DT12 and 19 transgenic plants lines from cultivar DT2008 in<br /> the T0 positive with PCR have been collected. Gene transfer efficiency was 1.35% for cultivar<br /> DT12 and was 2.24% for cultivar DT2008. Necessary to continue studying to selective and<br /> expression analysis of resistance simultaneously both types of SMV and BYMV of transgenic<br /> soybean lines in generation of T1 and the next generations, for the purpose create virus-resistant<br /> transgenic soybean varieties with hight level.<br /> Key words: Agrobacterium-mediated transformation, cotyledonary node, transgenic soybean,<br /> SMV and BYMV.<br /> <br /> Ngày nhận bài:13/3/2014; Ngày phản biện:18/3/2014; Ngày duyệt đăng: 25/3/2014<br /> Phản biện khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm – Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyê<br /> *<br /> <br /> Tel: 0913 383289, Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn<br /> <br /> 115<br /> <br />