Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (ipt) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

NGHIÊN C U TẠO CÁC NG NG MANG G N

ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT NG PH NG PHÁP I N

NẠP NH VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

H vi n : Tr n uy H ng

Hà Nội – 2015

L i cảm n

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

guy n ăn Đ ng tận t nh, d u dắt, h ớng dẫn, truy n t nh ng inh nghi

qu b u c ng nh ng vi n và t o mọi i u ki n giúp ỡ tôi trong qu tr nh học

tập và nghi n cứu.

Tôi xin g i l i cả ơn ến phòng ào t o t o i u i n và tận t nh h ớng dẫn

ọi th t c ể tôi c thể hoàn thành luận văn này

ôi xin g i l i cả ơn tới tập thể c n b hòng thí nghi m Trọng iể Công ngh

tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p giúp ỡ nhi t t nh trong suốt th i

gian tôi thực hi n h a luận.

Cuối c ng nh ng hông ph n quan trọng, tôi xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng

b n bè, nh ng ng i luôn quan tâ , ng h và là chỗ dựa cho tôi trong suốt th i

gian là h a luận này, c ng nh trong cu c sống.

ôi luôn ghi nhớ và hông bao gi qu n sự giúp ỡ vô c ng to lớn ôi xin g i

ến tất cả qu th y cô, gia nh, b n bè lòng biết ơn vô tận

Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015

Học viên

n y H ng

M c c

L i cảm n ......................................................................................................................................... i

M c c .............................................................................................................................................. ii

nh m c h nh v ........................................................................................................................... iv

nh m c ảng................................................................................................................................. v

nh m c c c ch vi t t t .............................................................................................................. vi

M Đ U ........................................................................................................................................... 1

Ch ng –T NG QUAN ............................................................................................................... 3

1.1 Nguồn gốc cây ngô ............................................................................................................ 3

1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới .......................................................................... 5

1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: .......................................................................... 9

C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p

1.4 Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................ 13

Ti-Plasmid ............................................................................................................... 14

1.4.1 Chức năng c T-DNA .......................................................................................... 16

1.4.2 C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens ............................................................... 16

1.4.3 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin ........ 18

1.4.4

1.5 C ch ch u hạn hiện t ng già h và gen IPT ......................................................... 19

C ch ch u hạn c thực vật ................................................................................ 19

1.5.1 Hiện t ng già h và c c y u tố ảnh h ởng ....................................................... 20

1.5.2 Đi u hò sự già h và v i trò c Cyto inin ...................................................... 20

1.5.3 Gen ipt và promoter pSARK12 ............................................................................. 21

1.5.4

1.6 C c ph ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp ....................... 21

Ph ng ph p Southern ot .................................................................................. 21

1.6.1 Ki m tr hả năng ch u hạn ở t i cây con ...................................................... 22

1.6.2 Ch ng – VẬT LIỆU VÀ PH NG PHÁP ............................................................................ 24

2.1 Vật liệu ............................................................................................................................ 24

Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 24

2.1.1 Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen ............................................. 24

2.1.2 H chất và thi t b sử d ng .................................................................................. 24

2.1.3

2.2 Ph ng ph p nghiên cứu ............................................................................................... 25

Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium 2.2.1 tumefaciens .............................................................................................................................. 25

Phân tích cây chuy n gen bằng ph ng ph p sinh học phân tử. ....................... 27

2.2.2 Đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 30

2.2.3 Đ nh gi sự h già c trong đi u iện c t h i cành .............................. 31

2.2.4

2.3 Đ đi m, th i gi n và ph ng ph p xử ý số liệu ....................................................... 31

Ch ng - K T QUẢ .................................................................................................................... 32

3.1 K t quả c qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c giống ngô................. 32

3.2 Ki m tr ằng ph ng ph p sinh học phân tử............................................................ 35

K t quả t ch chi t NA t ng số ............................................................................ 35

3.2.1 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen hpt ................ 36

3.2.2 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen ipt ................. 37

3.2.3 K t quả phân tích Southern ot c c dòng ngô chuy n gen th hệ T .............. 38

3.2.4 3.3 K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 40

3.4 K t quả đ nh gi qu tr nh h già c hi c t ............................................ 45

Ch ng – THẢO LUẬN ............................................................................................................. 46

4.1 Chuy n gen thông qu vi huẩn ................................................................................... 46

4.2 Phân tích ằng ph ng ph p sinh học phân tử ........................................................... 47

4.3 Đ nh gi s ộ i u hiện ch u hạn c cây con ở đi u iện phòng thí nghiệm......... 49

Ch ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH .................................................................................. 52

5.1 K t uận ........................................................................................................................... 52

5.2 Ki n ngh ......................................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 53

PH L C ........................................................................................................................................ 59

iii

nh m c h nh v

H nh 1: ấu trú Ti-plasmid ............................................................................................................ 14 H nh 2 : Hệ thống ve tor li n hợp .................................................................................................... 15 H nh 3 : Hệ thống vector nhị thể (kép) ............................................................................................ 15 H nh 4: ấu trú T-DNA ................................................................................................................. 16 H nh 5 : S ấu trú ve tor pSI hyg-2 ....................................................................................... 24 H nh 6 : S quy tr nh huyển gen ............................................................................................... 27 H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh giống ng ................................................. 32 H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh ................................................................................................. 33 H nh 9: M t số h nh nh gi i o n huyển gen ......................................................................... 33 H nh 10: K t qu iện i N t ng số ............................................................................................ 36 H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 ......................................................................... 37 H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 .......................................................................... 37 H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 .......................................................................... 38 H nh 14: K t qu Southern lot ng huyển gen ở th hệ T1 .................................................. 39 H nh 15: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 1 r y x l h n .................................................................................................................................................... 40 H nh 16: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 1............................................................................................... 41 H nh 17: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh lưới số 1. ........................................................................................................................................... 41 H nh 18: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 1 ............................................................................................................................................ 41 H nh 19: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 2 r y x l h n .................................................................................................................................................... 43 H nh 20: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 2.............................................................................................. 43 H nh 21: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh lưới số 2 ............................................................................................................................................ 44 H nh 22: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 2 ............................................................................................................................................ 44 H nh 23: nh gi qu tr nh h gi l H9 ............................................................................. 45 H nh 24: nh gi qu tr nh h gi l M8............................................................................. 45

nh m c ảng

ng 1: Ph n lo i thực v t ................................................................................................................. 3 ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới những n m g n y ................................................... 5 ng 3: T nh h nh s n xuất ng ở Việt Nam những n m g n y .................................................. 10 ng 4: Th nh ph n inh ư ng trong 100g h t ............................................................................. 11 ng 5: Tr nh tự m i ........................................................................................................................ 29 ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n ............................................................ 32 ng 7: Số opy gen huyển ............................................................................................................ 39

nh m c c c ch vi t t t

WW i u kiện tưới nướ y

WS i u kiện x l h n

SH hi u o th n l

LRL hi u i r i nhất

FWS Tr ng lượng tư i th n l

FWR Tr ng lượng tư i r

DWS Tr ng lượng kh th n l

DWR Tr ng lượng kh r

IM M i trường l y nhi m

CCM M i trường ng nu i ấy

REM M i trường nu i ph h i

ECM M i trường h n l m s o

SeM M i trường ph t sinh h i

RM M i trường r r

M Đ U

y ng l y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n u, l m t trong

n m y lư ng thự h nh a th giới. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i

sống on người ũng như ng v t r thể ược ng d ng trong nhi u ng nh như

ược phẩm .Ở nước Trung Mỹ, N m Á v h u Phi, người ta s d ng ng l m

lư ng thự h nh ho người với phư ng th c rất ng theo vùng ị l v t p

qu n mỗi n i. Ng l y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n i trong

Việt N m. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như

ng v t r thể ược ng d ng trong ng nh kh như ược phẩm. G n y th n

ng ngo i việc s d ng l m hất ốt n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng

sinh h c.

S n lượng ng h ng n m ị gi m sút ng kể bởi rất nhi u nh n tố sinh v t

(biotic) ũng như phi sinh (abiotic). Trong h n h n l nguy n nh n phi sinh

quan tr ng nhất khi n s n lượng ng mất m t l n n h n 70%. ất kh ằn c ng

với lượng nướ mư ph n ố kh ng u dẫn tới k t qu thu ho ch chỉ n 1,3 tấn/ha

gi m ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ ha [64]. Ch nh sự kh ằn ã l

t ng tố qu tr nh lão h l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn n gi m sút

s n lượng [84].

ytokinin v i tr thi t y u n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển

c a thực v t ặc biệt trong sự ph n hi t o [68]. Trong ng nghệ nu i ấy m

t o in vitro, ytokinin v i tr rõ r ng trong việ giúp m l t h rời ch m tho i

h iệp l c tố. Ngay c trong thực ti n th việc x l ytokinin ũng m ng nghĩ

thư ng m i rất lớn v ytokinin giúp uy tr sự xanh tư i l u h n a rau sau thu

ho h v kéo i tu i th c a hoa sau khi cắt khỏi y [45].

Trong khi những phư ng ph p nh t truy n thống ã những th nh ng

nhất ịnh trong việc t o ra những giống y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t

ng nghệ sinh h v o việc t o y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng

ã ướ u ch ng minh ược k t qu c m nh. ã những nghi n u v bi n

n p gen ipt- mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n n sinh t ng hợp

1

cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v ihy roze tin v o m t số y tr ng. K t

qu cho thấy trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea

[72] v x l h- Lactuca sativa L. cv Evola [65], thuố l [84], ng [58], l c[78]

v ng [85] u t những th nh ng nhất ịnh. Nhằm ướ u t o ra giống ng

kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh t i “Nghiên cứu tạo c c dòng ngô

mang gen isopentenyl transferase (ipt) ằng ph ng ph p i n nạp nh vi

huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m ti u:

 Bi n n p th nh ng gen ipt v o m t số ng ng h n l c

 Kiểm tra sự mặt c a gen ipt bằng kỹ thu t sinh h ph n t

 ướ u nh gi kh n ng hịu h n ở y on th hệ T1

2

Ch ng –T NG QUAN

1.1 Nguồn gốc cây ngô

Ng hay bắp t n kho h l Zea mays L. Trong ti ng Anh từ “m ize” ắt

ngu n từ ti ng T y n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online

edition). Từ “ orn” thường hay s d ng hiện n y l h g i rút g n c “In i n

orn” nghĩ l “ y lư ng thực c người nh i ng” (“M ize”-Oxford English

Dictionary online edition.).

ảng 1: Phân oại thực vật

Giới (kingdom):

Plantae

(kh ng ph n h ng):

Angiosperms

(kh ng ph n h ng):

Monocots

(kh ng ph n h ng):

Commelinids

B (order):

Poales

H (family):

Poaceae

Chi (genus):

Zea

Lo i (species):

Z. mays

nhi u gi thuy t ượ ư r v ngu n gốc c ng trong n i l n 4 nh n

ịnh: 1.Sự thu n h trực ti p từ cỏ teosinte 2.Ngu n gốc từ y l i giữ ng thu n

h v ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h a c ng ho ng

d i v teosinte 4.Ti n h từ y l i c a Z. diploperennis thu lo i Trips um [73,

102]. Những nghi n u v i truy n h g n y ho rằng qu tr nh thu n h ng

i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n n l lo i

ỏ teosinte ho ng i g n giống nhất với ng ng y n y vẫn n m trong lưu vự

s ng ls s [36]. George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y trong

nghi n u c m nh v ngu n gố y ng [27]. Trướ v o n m 1926 Vavilop

ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th nhất v

3

vùng núi Andet thu Peru l trung t m ph t sinh th hai c y ng [98]. ng

qu n iểm với ng l Galinat v K to l n lượt v o n m 1977 v 1988 [42, 55].

Theo những nghi n u v kh o c h người t t m thấy những h th ch bắp ng

t i h ng Guil N quitz trong thung lũng O x ni n i kho ng n m 4250 T N,

v nhất l t i h ng ng Tehu n, Pue l ni n i 3450 TCN [86]. n nh

những nghi n u v o n m 2009 hỉ ra rằng ã những ng bằng ược

ho l ùng ể nghi n ng ở lớp tr m t h 8700 n m tu i [77, 80].

Từ ngu n gố ng ã l n r ng h t vùng thu h u Mỹ. L n ph ắc,

s ng ph T y N m Ho kỳ v n ũng như xuống ph N m hile, E u or,

olum i v nhi u vùng thu r zin. Qu qu tr nh thự n h h u Mỹ c a

người h u Âu m khởi u l huy n th m hiểm c olom us n m 1493 v ặc

biệt l huy n th m hiểm th h i n m 1494, Ng ã ượ ư v o u ti n t i T y

n Nh v l n truy n khắp vùng n l i c h u Âu [21]. Người t nh nh h ng

nh n bi t ượ gi trị c y ng v ph bi n húng ng y ng r ng rãi. V o

những n m u th kỷ XVI, ằng ường th y t u o Nh , T y n

Nh , It li ã ư y ng r h u h t l ị th giới ũ. N m 1517, ng

xuất hiện ở i p, Th Nhĩ Kỳ, Ph p, , s u l n m h u Âu v ắ Phi.

N m 1521, ng n ng Ấn v qu n o In onesi . V o kho ng n m 1575

ng ượ ư n Trung Quố [37].

Theo nh h L Qu n trong “V n i lo i ngữ”, ng ượ ư v

Việt N m qu huy n i s Trung Quố (thời Kh ng Hy) ng Tr n Th Vinh

(người huyện Ti n Phong, S n T y) v o uối th kỷ XVII. Với ặ t nh qu u l

kh n ng th h ng r ng tr n nhi u ị h nh t i Việt N m , ng ã ượ nh n r ng

u ti n t i S n T y v vùng kh , ặ iệt l những vùng o kh ng kh

n ng tưới nướ thường xuy n. Ng sớm ượ hấp nh n v ã trở th nh y lư ng

thự ng th h i hỉ s u lú nướ t i Việt N m.

4

1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới

y ng ược tr ng r ng rãi khắp n i tr n th giới, v s n lượng ng h ng

n m nhi u h n ất c lo i ngũ ố n o. Theo số liệu n m 2009, t ng s n lượng ng

s n xuất ượ tr n th giới l 817 triệu tấn nhi u h n lú nước (678 triệu tấn) hay

lú m (682 triệu tấn). Trong s n lượng c a Mỹ l o nhất chi m n 40%, ti p

n l Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn , Ph p, rgentin , N m Phi,

Ukraine (theo FAOSTAT 2009). Trong n m 2009, h n 159 triệu h ng ược tr ng

khắp n i tr n th giới với s n lượng trung nh l 5 tấn/ha.

ảng 2: T nh h nh sản xuất ngô trên th giới nh ng năm g n đây

(FAOSTAT 04/08/2014)

Diện tích

Năng suất

Sản ng

Năm

(Triệu ha)

(Tấn/ha)

(Triệu tấn/ha)

144,7

4,5

645,2

2003

147,5

4,9

728,9

2004

148

4,8

713,7

2005

146,7

4,8

706,8

2006

158,4

4,98

790,1

2007

162,7

5,1

830,6

2008

158,7

5,17

820,2

2009

164

5,19

851,3

2010

172,3

5,15

887,9

2011

178,6

4,89

872,8

2012

184,2

5,52

1016,7

2013

Theo thống k uối n m 2014 u n m 2015 th t ng s n lượng ng s n xuất

ượ tr n th giới l n tới tr n 1 tỷ tấn (vượt tr i so với lú nước 740 triệu tấn v lú

mỳ 715 triệu tấn). H i nướ ng u v s n lượng vẫn l Mỹ (35%) v Trung

Quốc (21%), ti p n l r zil, rgentin , Ukr ine (theo F OST T 2015). Diện

t h tr ng v n ng suất u t ng so với n m 2012 trở v trước.

5

Như v y trong nhưng n m g n y, n ng suất v iện t h tr ng ng t ng

nhưng kh ng th y i ng kể kéo theo t ng s n lượng ng ũng hỉ t ng nh . Theo

dự o thực hiện n m 2003 c a viện nghi n u hư ng tr nh lư ng thực th giới

IPRI nhu c u v ng sẽ n t ng cao h n nữa v o n m 2020 [76]. Tuy nhi n, rất

nhi u y u tố nh hưởng n n ng suất ũng như s n lượng ng . o g m y u tố

ngu n gốc từ sinh v t ( ioti ) như ỏ d i, s u ệnh… v y u tố phi sinh

( ioti ) như nhiệt , nh s ng, ngu n nướ …

Những ti n b v khoa h n i hung h y huyển gen n i ri ng u nhằm m c

h khắc ph c những vấn v ũng t ược m t số th nh tựu kh quan. ng

thời ng huyển gen ũng ượ ưu ti n theo hướng rõ r ng h n. Quy tr nh ể

ph t triển y ng t i sinh từ m t t o i n n p ể ược t n suất cao với m c

ti u ặt ra: tố , u ra, kiểu gen c l p v v t ch ph t triển b n vững l ưu ti n

quan tr ng h ng u trong ng nghệ sinh h c thực v t. ể t m r quy tr nh

lo i m kh nh u l n lượt ược th nghiệm ể kiểm tra kh n ng t i sinh o g m:

ch i ỉnh, l , th n, tr tr n v ưới l m m, ph i non v h t [96].

Sự ph t triển nu i ấy m thực v t ặc biệt l ngũ ố ược thực hiện c

l p với những nỗ lực chuyển n p gen li n qu n. ho n khi kỹ thu t bi n n p ược

ph t triển tr n y thuố l th người ta mới t nh n việc ng d ng ho y ngũ

cố . V v y, qu tr nh ph t triển nu i ấy m v i n n p hư ượ ph t triển m t

h song song. Nỗ lực bi n n p u ti n oe v S rk r v o n m 1966 l tr n

phấn c y ng [34]. G n y noãn ã th phấn ã ượ th nghiệm th nh ng

như l m t ối tượng i n n p ởi nh kho h Trung Quố [33].

Ph i non ược s d ng r ng rãi trong việ t i sinh v i n n p ng từ khi

o o u ti n v m s o to n n ng ng kh n ng t i sinh [47]. V o n m

2006 l- e ã nh n r kiểu gen ng v i tr qu n tr ng trong việ ph t triển

ph i non th nh m s o, h y n i h kh việ t m r ng ng kh n ng

k h ng th nh m s o l ti n qu n tr ng trong việ huyển gen s u n y [17].

hai lo i m s o: m s o lo i I ng rắn ặ h n v kh n ng ph t sinh

qu n, m s o lo i II ở h n v kh n ng ph t triển ph i. M s o lo i II xuất hiện

với t ng số thấp h n nhưng l i kh n ng t i sinh o h n lo i I [22]. n nh

6

, việ tối ưu h th nh ph n m i trường ũng rất qu n tr ng, th nh ph n ã

ượ nghi n u h n l kỹ ng [28, 38, 106]. Tuy nhi n, những h hất ặ

iệt hỉ th h hợp với m t v i ối tượng thể [46]. V v y việ h nh th nh hệ

thống m i trường th h hợp ho m t v t liệu mới rất ấp thi t, ặ iệt trong huyển

gen [75]. Việ tối ưu h i u kiện ể h nh th nh m s o to n n ng kh n ng t i

sinh từ ph i non ti p t ượ nghi n u v ã t ượ k t qu . J ku ekov v

ng sự ã t i sinh th nh ng từ ph i non h i ng ng 18 v 19 ể r ượ

y ho n hỉnh [54].

n n m 2014, Lee v Zh ng ã ng ố quy tr nh ho n thiện v huyển gen

v o ng từ v t liệu n u l ph i non th ng qu vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens [60].

Những th nh ng u ti n v ng huyển gen thu v ng huyển gen

kh ng s u v thuố trừ ỏ. Tuy nhi n, m t mối nguy hiểm ặt r l t n t i sự trao

i v t chất di truy n giữ y huyển gen v ỏ d i khi n thuốc diệt cỏ mất t

d ng. m t gi i ph p ược Tilney- ssett ư r l huyển gen kh ng v o l c

l p. DNA l c l p sẽ di truy n theo ng m v kh ng l n truy n qua h t phấn [97].

ặc biệt g n y gen chịu h n rất ượ qu n t m. Tuy nhi n, kh n ng

chịu h n l m t t nh tr ng ph c t p, nghi n u ã hỉ ra rằng m t chi n lược

ch n t o y ng hịu h n bi n i gen hiệu qu l hi n lược s d ng ùng m t lú

nhi u gen chịu h n hiệu qu hoặc s d ng hỉ m t gen i u khiển t ng i u

khiển nhi u gen th m gi qu tr nh hịu h n. n nh gen i u khiển n gen

mã h ho protein h n ng th m gi v o những ph n ng uối ( ownstre m)

trong huỗi p ng, giúp k h ho t những ph n ng ặ iệt p l i sự thi u h t

nướ o h n h n.

Theo nghi n u c Nelson v ng sự v o n m 2007 th gen ZmNF-

YB2 giúp t ng n ng suất giống ng i n i gen l n h n gấp hai l n so với y ối

ch ng. y huyển gen iểu hiện chịu h n tốt với kh n ng uy tr qu ng

hợp, h m lượng diệp l c tố n ịnh, gi m héo rũ. Gen ZmNF-YB2 l gen ược

x ịnh từ b gen c y m h nh Arabidopsis v ngu n gốc từ lo i h

7

h ng y ng ượ ng ty Mons nto u tư v thư ng m i h s n phẩm ng

chuyển gen chịu h n [71].

N m 2009, ssem ã nghi n c u chuyển gen NPK1 (Nicotiana Protein

Kin se) v o giống ng i p th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens. Gen NPK1 li n

qu n n kh n ng hịu p suất thẩm thấu giúp ng hống chịu ượ t nh tr ng

thi u nướ ũng như sống trong m i trường n ng muối cao. ssem n k t

hợp chuyển gen bar- gen kh ng thuốc trừ cỏ như l m t nh n tố ch n l c thực v t.

K t qu chuyển gen th nh ng với hai lo i ng i p (Gz 639 v Gz 649) v

ng ng Mỹ A188 với sự trợ giúp a promoter 35S C4 PPDK [23].

Gen DREB ( ehy r tion-responsive element- in ing) l nh n tố phi n mã

th m gi t h ự v o qu tr nh hống hịu với i u kiện ất lợi m i trường

ằng h k h ho t sự ho t ng gen th m gi trự ti p hống l i i u

kiện ất lợi m i trường như h n h n, mặn, l nh. Gen DREB ã ượ i n n p

v o ng g m DREB1A/CBF3 t h từ r i opsis [16] hay ZmDREB ượ t h

từ h nh gen giống ng 73 [62].

Gen ipt mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se, enzyme n y t ng t ng

n ng ytokinin th ng qu việ t ng hợp ti n hất trong qu tr nh t ng hợp.

Khi qu tr nh h gi l ượ nh n i t ởi promoter, n ng ytokinin trong

m sẽ ượ t ng l n giúp tr hoãn qu tr nh . Qu tr nh n y l m t ng n ng h -

m n hệ thống nhưng l i kh ng l m th y i lớn v kiểu h nh. V o n m 2004,

Ro son v ng sự ã nghi n u chuyển gen ipt từ vi khuẩn Argrobacterium s

d ng promoter PSEE1 từ ng ể l m h m qu tr nh lão suy ở l . ng ng

biểu hiện gen chuyển ã ượ ph n t h hi ti t ở ấp biểu hiện kh nh u

tr n kiểu h nh. M t trong ng ng ã những biểu hiện rõ r ng. Nghi n u

n y ã h ng minh ược việc chuyển gen kh n ng l m h m qu tr nh lão h

thực hiện ượ tr n y m t l m m n i hung h y ng n i ri ng [85]

n nh n hướng nghi n u nhằm t ng o những ặ t nh

lợi cho thực v t như huyển gen t o y s n xuất protein ng v t [88, 89]. Chuyển

gen th y i h m lượng v hất lượng hất inh ư ng c y [59].

8

Giống ng huyển gen u ti n ượ hấp nh n l SYN-EV176-9 t i Ho Kỳ

o ng ty Syngent ng k v o n m 1995. y l giống ng huyển gen hống

thuố trừ ỏ glufosin te v kh ng s u nh v y Lepi opter . V s u g n 20 n m, n m 2013 giống ng huyển gen hịu h n roughtG r TM l n u ti n ượ tr ng

ũng t i Ho kỳ. ho n n y 4 sự kiện ng huyển gen chịu h n ã ượ thư ng

m i h t i Mỹ, trong 01 sự kiện n t nh tr ng l MON87460 m ng gen cspB (gen

ph n l p từ Bacillus subtilis)-t n thư ng m i: Genuity® roughtG r ™ v 03 sự kiện

t nh tr ng ượ l i t o từ sự kiện tr n: (1). MON87460 x MON89034 x

MON88017: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), kh ng s u nh ng

(cry3Bb1), nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (2). MON87460 x

MON89034 x NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps),

kh ng s u nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (3). MON87460 x

NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), chịu h n (cspB)

(ISAAA,2015).

1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam:

Ở Việt N m, ng l y lư ng thự ng h ng th h i s u lú nước. Ph n ố

r ng khắp c nước ở h u h t vùng sinh th i với 8 vùng h nh: vùng ng ng

bằng Bắc b , vùng ng Việt Bắ v ng ắc b , vùng ng T y ắc b , Vùng ng

Bắc Trung b , vùng ng uy n h i Nam Trung b , vùng ng T y Nguy n, vùng ng

ng N m v vùng ng ng bằng s ng u Long. Diện t h gieo tr ng v n ng

suất, s n lượng ng ũng t ng m nh, từ h n 200 ng n h với n ng suất 1 tấn/ha

(n m 1960) nhờ mở r ng giống ng lai s n xuất v i thiện iện ph p nh

t , n n m 2009 ã vượt ngư ng 1 triệu ha với n ng suất 4,3 tấn/ha. So với

nước tr n th giới th n ng suất ng ở ta vẫn thu c lo i kh thấp, ưới m n ng

suất trung nh t i thời iểm l 5tấn/ha (theo FAOSTAT, 2009). ặc biệt t i m t

số ị phư ng mi n núi vùng s u, vùng x tỉnh L i h u, S n L , Th nh

H , Qu ng N m, L m ng… m t số ng o n t t người s d ng ng l

ngu n lư ng thực, thực phẩm h nh, s d ng giống ng ị phư ng v t p qu n

nh t l c h u n n n ng suất ng ở y hỉ t tr n ưới 1 tấn/ha. Theo số liệu

9

thống k mới nhất từ FAOSTAT-2015, s n lư ng ng a Việt Nam n m 2013 l

5,2 triệu tấn với diện t h gieo tr ng t ng nh so với n m 2010 n 1170 ngh n h

t n ng suất 4,44 tấn/h t ng h n 3% so với n m 2012. M t ng trưởng n y

kh ng thể p ng nhu u trong nước, h ng n m húng t n ph i nh p khẩu kh

nhi u ng h t (trị gi tr n 500 triệu US ) ể s n xuất th n gi sú .

ảng 3: T nh h nh sản xuất ngô ở Việt Nam nh ng năm g n đây

(FAOSTAT 04/08/2014)

Diện tích

Năng suất

Sản ng

Năm

(Ngh n h

(Tấn/ha)

(Triệu tấn/ha)

912,7

3,44

3,1363

2003

991,1

3,46

3,4309

2004

1.052,6

3,60

3,7871

2005

1.033,1

3,73

3,8545

2006

1.096,1

3,93

4,3032

2007

1.440,2

3,18

4,5731

2008

1.089,2

4,01

4,3717

2009

1.126,3

4,09

4,6068

2010

1.121,2

4,31

4,8357

2011

1.118,2

4,30

4,8032

2012

1.170,3

4,44

5,1909

2013

Hiện n y v trong những n m tới, ng vẫn l y ngũ ố v i tr qu n tr ng

ở nước ta. Gi trị inh ư ng c ng kh o với 10,6% protein (zein), 4-5% lipit

(50% l xit linolei , 31% l xit olei , 13% l xit p nmiti v 3% l Ste ri ), 69%

gluxit (ch y u l tinh t v m t số ường n v kép), hất kho ng (gi u photpho,

nghèo nxi) v vit min ( 1, rotene- ti n vitamin A). Ng rất nhi u ng

d ng, tất c ph n c y ng từ h t, n th n, l u thể s d ng ượ ể

l m lư ng thực, thực phẩm ho người, th n ho gi sú , l m nguy n liệu cho

ng nghiệp như rượu ng , s n xuất eth nol ể ch bi n x ng sinh h c, th m h

n n h bi n t o ra m t số v t d ng ùng, trang s c c a ph nữ . H u h t

ph n c ng h a m t số chất v i tr như m t lo i thuốc chữa bệnh

10

nhờ ch h m lượng kali cao. H t ng v m m ng giúp t ng ường kh n ng hấp

th inh ư ng, trị i ngo i ph n sống, l ng r u ng ru t bấ th n ng un nước

uống t ng lợi tiểu, lõi ng un nướ l vị thuốc chữa ch ng bệnh ra m h i

[1]. Ngo i r ph n bỏ i thể l m hất ốt.

ảng 4: Thành ph n dinh d ng trong g hạt - nguồn: en.wikipedia.org

ũng như nướ kh tr n th giới Việt N m ũng ối mặt với những i u

kiện bất lợi n s n lượng ng như ỏ d i, s u bệnh bao g m những lo i s u ệnh

h nh s u. S u h i ng : s u x m, s u x nh, s u th n, s u ắn l , s u g i, rệp h i

ng , h u hấu h i ng , m t h i ng g y r lo i bệnh ho ng . M t số lo i bệnh

thường thấy ở ng như ệnh h i h t, bệnh thối th n o nấm hay vi khuẩn, bệnh kh

vằn, bệnh b ch t ng, bệnh phấn en, ệnh sợi en, ệnh ốm l v ệnh rỉ sắt.

Nhưng tr n h t h n h n mới l nguy n nh n qu n tr ng nhất nh hưởng n qu

tr nh sinh trưởng ng l m gi m n ng suất [40].

Hệ thống tưới ti u th s n n việc tr ng ng ở Việt Nam ph thu c ch y u từ

“nước trời” chi m tr n 70%, diện t h h ng tưới chỉ kho ng 30%. Ngu n nước

cung cấp ho ng ượ hi r l m h i ngu n h nh g m nướ mư v từ ao h

s ng suối. Tuy lượng mư trung nh h ng n m nướ t v o kho ng 1700-2000 mm

cho nhu c u sinh trưởng v ph t triển c y ng nhưng lượng mư l i t p trung

theo mù n n v o mù kh y ng thường bị thi u nước. Với những hiện tượng

i n i kh h u g n y, h n h n nguy x y thường xuy n h n [87]. M g n

11

y nhất l ợt h n h n từ uối n m 2014 n t n giữ n m 2015 ở tỉnh N m

Trung ặ i t l Ninh Thu n khi n t nh h nh s n xuất h n 6.100 h ất ph i

t m ngừng s n xuất. Nhu u t o r giống y tr ng hịu h n n i hung h y ng

hịu h n n i ri ng l ấp thi t h n o giờ h t.

Ng chuyển gen chịu h n l th h th c lớn ngay c ối với huy n gia

h ng u tr n th giới bởi v n ph thu v o nhi u gen kh nh u h kh ng ph i

n gen. nh kho h c Việt N m ã s d ng phư ng ph p truy n thống

k ross (l i ngượ ) ể l i t o t nh tr ng chịu h n v o m t số ng ng thư ng

m i. Hay ng ng sinh h ph n t v o h n giống ể t n ng giống s n

ở Việt N m. ng hú nhất g n y l “ t i nghi n u huyển gen n ng

cao t nh hịu h n v o m t số ng ng ố m ng ượ p ng trong s n xuất”,

m t t i cấp nh nướ , mang mã số KC.04.02/11-15 do TS ùi M nh ường-

Viện ph Viện nghi n u Ng l h nhiệm t i. V o u n m 2014 Viện

Nghi n u Ng ũng ã th ng o ã huyển th nh ng 3 gen hịu h n o g m

DREB2A, HVA1 v CspB v o 3 ngu n v t liệu ng Việt N m ằng phư ng

ph p huyển gen th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens.

ùng với phư ng ph p h n t o giống truy n thống ng y ng hiệu qu h n

th việc ng d ng ng nghệ sinh h ể t o r giống ng i n i gen kh

n ng chống chịu với i u kiện bất thu n sinh h v phi sinh h c ũng ã ược triển

khai t i Viện Di Truy n N ng Nghiệp. Từ n m 2003, l n u ti n ở Việt N m,

Ph m Thị L Thu ã nghi n u x y ựng hệ thống t i sinh ở ng ph v ho

huyển gen ằng Agrobacterium v súng ắn gen t o y huyển gen b n vững

bằng phư ng ph p n y tr n ng ng ngu n gố n ới như 188, H99.

Viện ã t o ượ ng ng huyển gen b n vững m ng gen: kh ng thuốc

diệt cỏ, gen GFP, gen kh ng kh ng sinh, gen t ng ường hấp th nit v gen hịu

l nh [8-10]. V v o n m 2007 ã ti n h nh i n n p gen gus/p t v o ng ng

m h nh (HR8 HR9) [7] .

N m 2009, Nguy n V n ng v ng sự ã những th nh ng ướ u

trong nghi n u kh n ng ph t sinh m s o ph i h v m t i sinh y ho n

chỉnh từ ph i non a m t số ng ng Việt Nam [3]. Nghi n u n y ũng l ước

12

ệm c hư ng tr nh ng Nghệ Sinh H N ng Nghiệp t o i u kiện cho những

th nh ng s u n y. Ph i kể n l i n n p th nh ng gen Cry 1Ac v o 2 ng

ng m h nh HR8 v HR9 [4]. H n th nữa l n u ti n t i Việt N m, gen kh ng

s u Cry 1Ac ã ược bi n n p th nh ng v o ng ng h n l c [5]. Nghi n

c u v bi n n p gen kh ng h n v o m t số ng ng h n l th ng qu vi khuẩn A.

tumefaciens ũng ng ướ u ược triển kh i nghi n u v t ược m t số k t

qu nhất ịnh [6]. Ph n l p v thi t k ve tor m ng gen i u khiển t nh hịu h n

ph c v ng t t o giống y tr ng chuyển gen ũng ng thực hiện ở Viện Di

Truy n N ng Nghiệp [13]. ước ti p c n với vấn chuyển gen chịu h n v o

ng ng ở Việt N m ũng ng thời ược triển khai t i ph ng th nghiệm tr ng

iểm ng Nghệ T o Thực V t – Viện Di Truy n N ng Nghiệp.

Việ tr ng th nghiệm y tr ng i n i gen mặ ù vẫn ng tr nh ãi,

nhưng từ n m 2011, N ng nghiệp v Ph t triển n ng th n ã ấp phép kh o

nghiệm nh gi nh hưởng n m i trường v ng sinh h m t số giống

ng huyển gen ã ượ thư ng m i h như: (1) ng ty Syngent kh o nghiệm

ng huyển gen G 21 kh ng s u th n v ng t11 kh ng thuố trừ ỏ. (2)

ng ty eK l kh o nghiệm ng MON89034 kh ng s u nh v y v ng

NK603 kh ng thuố trừ ỏ. (3) ng ty Pioneer Hi- re kh o nghiệm ng EVENT

T 1507 kh ng s u nh phấn. ướ kh o nghiệm n n y (n m 2015) ã

k t thú v mới y ã ấp h ng nh n ho h i ng ty eK l v Syngent

ượ n r ng rãi ng i n i gen tr n thị trường Việt N m. H i ng ty n y ng

triển kh i m h nh iểm tr ng th nghiệm giống ng i n i gen n y t i tất

vùng tr ng ng tr ng iểm tr n to n quố .

1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p

Agrobacterium tumefaciens

Hiện n y rất nhi u kỹ thu t chuyển gen kh nh u v o t o song kỹ thu t

chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens vẫn ược ng d ng r ng rãi l nhờ những

ưu iểm sau:

 Kh ng i hỏi d ng c ặc biệt

 Số lượng b n copy thấp v n ịnh ở th hệ on h u

13

 D th o t invitro, l m

 y l kỹ thu t n gi n, hi ph thấp

1.4.1 Ti-Plasmid

Ti-pl smi l m t plasmid lớn với k h thước kho ng 200k . Tr n Ti-plasmid

o n T- N (tumor N ) ược giới h n bằng bờ ph i (right or er) v ờ tr i

(left or er). Tr nh tự nucleotid c a bờ ph i v ờ tr i tư ng tự nhau. T- N l

m t o n k h thước 25kb ch gen t ng hợp opine v o n n y sẽ ược

chuyển v o t o thực v t gắn v o nhi m sắc thể c a t o y h v g y r

bệnh u.

H nh 1: Cấu trúc Ti-plasmid Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i [14]

Ngo i T- N , tr n Ti-pl smi n vùng vir (vir region) chịu tr h nhiệm

ho t ng l y nhi m, chuyển n p ( onjug tive tr nsfer) v ti u h opine (opine

catabolism).

Dự v o h n y on người lợi d ng vi khuẩn ất ể chuyển gen mong

muốn ho m nh tr n sở thi t k l i hệ thống Ti-plasmid c a vi khuẩn sao cho vẫn

m b o ược ch n ng chuyển gen nhưng kh ng m ng gen g y ho y.

Người t ã t o r ng vector mới ể chuyển gen l những ve tor li n hợp (co-

intergr te ve tor) v ve tor nhị thể (Binary vector).

a. H thống vector ng li n hợp

Hệ thống ve tor li n hợp (co-integr te ve tor) l k t qu c a sự li n hợp hai

lo i plasmid: Ti-pl smi ã lo i trừ vùng gen g y khối u v gen t o hợp chất

opine nhưng vẫn giữ l i vùng vir v vùng ờ tr i, ờ ph i. Th y v o những gen bị

cắt bỏ l o n tư ng ng với m t o n tr n pl smi th hai (plasmid trung gian)

ể ph c v cho việ li n hợp hai lo i pl smi . Pl smi trung gi n l m t plasmid

14

t h ng từ vi khuẩn E.coli v thể t i sinh ược ở Agrobacterium. Pl smi n y

h vùng gắn gen c n chuyển n p, gen hỉ thị ph c v việc ch n l v

mặt o n tư ng ng. Khi ho tư ng t h i lo i pl smi n y với nh u húng sẽ

li n hợp qua sự tr o i héo giữ h i o n tư ng ng v h nh th nh n n ve tor

li n hợp. Ve tor li n hợp n y nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens v ho t ng theo

h chuyển gen th ng thường c a vi khuẩn ất. Do t n số ư pl smi trung gi n từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) n n ve tor n y t ược s d ng.

H nh 2 : Hệ thống vector iên h p Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003),“T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i [14]

b. H thống vector p

Hệ thống vector nhị thể kh với ve tor li n hợp l húng h i ve tor

(pl smi ) ùng mặt v ho t ng trong Agrobacterium. M t pl smi t h ng

từ E.coli trong thi t k vùng ờ tr i v ờ ph i, nằm giữ húng l gen hỉ

thị v vùng gắn gen c n chuyển. Plasmid th h i l Ti-plasmid c i ti n: to n

vùng T- N v vùng ờ tr i v ờ ph i bị cắt bỏ chỉ giữ l i vùng vir, pl smi n y

ược g i l pl smi hỗ trợ. Hệ thống ve tor n y ũng ho t ng theo h chuyển

gen c a vi khuẩn ất A. tumefaciens m t h rất hữu hiệu.

H nh 3 : Hệ thống vector nh th ( ép Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i [14]

15

Thực t cho thấy, plasmid với h i n vị s o hép thể kh ng n vững

trong E.coli khi c h i vùng n y ho t ng. Tuy nhi n, ve t nhị thể m t số ưu

iểm sau:

+ Kh ng x y r qu tr nh t i t hợp giữ pl smi .

+ K h thướ ve t kh nhỏ.

Nhờ v y, hiệu qu chuyển gen giữa E.coli với Agrobacterrium t ng l n. Hiện

nay, ve t nhị thể ược s d ng r ng rãi với rất nhi u lo i ược thi t k phù hợp

với y u u c qu tr nh huyển gen

1.4.2 Chức năng c T-DNA

H nh 4: Cấu trúc T-DNA

Khi y nhi m A. tumefaciens, o T- N n p v o trong hệ gen y h

ắt u ho t ng v s n sinh r uxin, ytokinin v opine, to n sinh trưởng

y ị rối lo n, t o ph n hi v t h v t o r khối u. Opine ượ vi

khuẩn s ng như m t lo i “thức ăn”. Nhờ gen huyển h opine tr n Ti-plasmid.

Ph n t h i truy n v ng d ng kỹ thu t l p b n li n k t gen ho phép

húng t hiểu ược ch n ng vùng m ng T- N , vùng n y ược thể hiện theo

sự li n hợp nhất. T- N ượ ư v o N thực v t trong nh n t o. Vị tr gắn

v o thường l ngẫu nhi n, tuy nhi n thường l những vùng kh n ng s o hép.

Sự t ng hợp opine ượ i u khiển bởi T-DNA. Những enzime như: o topine

synth se, nop line synth se ượ mã h tr n T-DNA t i những loci: ocs v nos

theo th tự, những vùng a T- N kh quen thu c với c hai plasmid: octopine

v nop line.

1.4.3 C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens

t o thực v t bị t n thư ng sẽ ti t r hợp chất h h c dẫn d vi

khuẩn như: etosyringone, hy roxyl- etosyringone… ưới t d ng c hợp

chất n y, A. tumefaciens nh n bi t r i m v o th nh t o h v huyển T-DNA

16

v o t o thực v t. Qu tr nh n y ược sự trợ giúp ặc biệt c gen Vir v R ,

L . ũng h nh hợp chất n y, với v i tr m ng, giúp ho gen vùng vir

ho t ng v t ng ường biểu hiện.

Ho t ng c gen vir sinh ra sợi n T- N l m xuất hiện b n copy sợi

n ưới c a T-DNA. Chỉ o n sợi n N giữ h i tr nh tự i n (L v R ) a

T-DNA mới ược chuyển v o t o thực v t, v ược gắn v o genome c a t o.

l y u tố ho t ng cis c a hệ thống v n chuyển T-DNA. Protein vir D1, D2

ng v i tr l h kh trong ướ n y, húng nh n r tr nh tự i n T- N v ắt

sợi n ưới t i mỗi n. iểm cắt l iểm u v k t thú a sợi t i sinh. S u ,

protein vir D2 vẫn n gắn k t với u cuối 5‟ a sợi T- N v t o thực v t.

N u g y t bi n hay lo i bỏ o n R th h u như mất ho n to n kh n ng huyển

T- N , n n u t bi n LB sẽ l m gi m hiệu qu chuyển T- N . i u h ng

tỏ t ng hợp sợi T-DNA từ u 5‟ n 3‟, ược bắt u từ o n R v k t thú ở LB.

Phư ng tiện ể chuyển o n T- N v o nh n t o thực v t l ph c protein

v sợi T- N . Theo số nh kho h c cho rằng, ph c hợp sợi n T-DNA-vir

2 ược bao b c bởi protein vir E2 tr ng lượng 96 kDa. Sự phối hợp n y giúp

ng n n sự tấn ng nu le se, h n nữa sợi n T-DNA duỗi thẳng l m gi m

k h thước c a ph c xuống xấp xỉ 2 nm, t o i u kiện thu n lợi ho qu tr nh i

chuyển qu k nh ẫn truy n tr n m ng t o. Protein vir E2 ch ựng h i t n

hiệu ịnh vị trong nh n t o thực v t v m t protein vir D2. Thực t cho thấy 2

protein n y v i tr qu n tr ng trong việ n x p sự hấp th ph v o trong nh n

t o thực v t. N u lo i bỏ t n hiệu ịnh vị trong nh n th m t trong protein n y

bị gi m, nhưng kh ng c ch ho n to n qu tr nh huyển T- N v tư ng t giữa

T-DNA với genome t o thực v t, ch ng tỏ m t th nh vi n kh thể m

nh n m t ph n tối thiểu v i tr a protein bị thi u. Protein vir E c n thi t ối với

qu tr nh i xuất protein vir E2 sang t o thực v t.

Protein vir 4 kh ng thể thi u ối với sự v n chuyển ph c ss-T-DNA. Ch c

n ng protein vir 4 l li n k t với TP c l p với ph c protein c n thi t ối

với qu tr nh huyển T-DNA.

17

nghi n u ng ố trướ y ã mi u t v i tr protein vir k h

thướ 9,5 k trong qu tr nh s n sinh cấu trú mặt c a t o ối với sự v n

chuyển ph c từ vi khuẩn sang t o thực v t.

Protein vir l protein t nh kị nướ tư ng tự protein k t hợp tr n m ng

kh . Ph n lớn protein vir ã ượ ph t hiện giống như k nh protein xuy n m ng.

Tuy nhi n, ũng thể v i protein vir kh ượ ph n phối l i trong qu tr nh

ph t sinh sinh v t v thực hiện ch n ng k nh k t hợp qua t o v n chuyển.

ng hú l trong protein vir 2, vir 11 l th nh ph n n c a b m y v n

chuyển T-DNA từ t o vi khuẩn sang t o thực v t. Sau khi T- N qu m ng

t o, húng i thẳng v o nh n v k t hợp với hệ gen thực v t, bắt u ho t ng

v s n sinh r uxin, ytokinin v opine g y n n sự ph t triển th i qu h ng

lo t t o l n n dẫn n sự h nh th nh khối u.

Hiện n y nh nghi n u ã t m r h ng A. tumefaciens mẫn c m với

y 1 l m m trong ng , lú ...v ã nh n ượ y huyển gen hữu th

[53]. A. tumefaciens ng v i tr qu n tr ng trong kĩ thu t di truy n thực v t ũng

như nghi n u n v sinh h ph n t . A. tumefaciens ược s d ng r ng

rãi v ưu iểm h n hẳn phư ng ph p huyển gen trực ti p kh thể l : số

b n s o ược chuyển v o t o thực v t thấp o t ng kh n ng huyển gen b

vững v hiệu qu chuyển gen o. Ngo i r phư ng ph p n y tr nh ược sự h nh

th nh y huyển gen thể kh m [39].

Hiệu qu bi n n p th ng qu A. tumefaciens n ph thu v o m t số y u tố

kh như: h ng lo i A. tumefaciens, cấu trú ve tor chuyển gen, kiểu gen thực v t,

h x l m thực v t, ngu n v t liệu g y nhiểm, m t vi khuẩn,thời gi n ng

nu i ấy, th nh ph n c m i trường nu i ấy, nhiệt ... ặc biệt l kh n ng t i

sinh c a thực v t sau khi bi n n p

1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a

hygromycin

ể ch ng minh gen m ti u mặt trong m thực v t hay lo i bỏ ũng như

t h những m h y t o huyển gen ra khỏi m kh ng ược chuyển gen,

nh nghi n u thường s d ng gen chỉ thị v gen ch n l c. Những gen n y ược

18

lắp ghép trong NA pl smi v ùng ược chuyển v o t o nh n với gen m c

ti u.

Gen ch n l thường ược s d ng l gen mã h ho m t số enzyme chỉ

trong vi khuẩn ch kh ng trong thực v t ở i u kiện tự nhi n. S u khi huyển

gen n u thấy sự ho t ng c a enzyme vi khuẩn th thể ho l gen ch n l ũng

như gen m ti u ã ược gắn v o m y i truy n c a thực v t.

M t gen chỉ thị hay ch n l ượ xem l hữu h khi n kh ng g y h i n sự

tr o i chất c y, thể ùng ng v nh y c m với th nghiệm ph t

hiện. M t số gen hiện n y thường ùng ể chỉ thị trong kỹ thu t chuyển gen: gus,

gal, luc, cat, nos v gen h n l c: nptII, hpt, gent, aat, bleo, bar, bxn.

Hygromy in phosphotr nsfer se mã h từ gen hpt l m t gen ch n l th h

hợp cho c ng lẫn thực v t. Gen n y ượ ph n l p v ng h từ m t t bi n ở

E. oli. Gen n y ng ược s d ng r ng rãi trong ng nghệ sinh h c thực v t.

Enzyme hpt t ng bất ho t hygromycin.

Những t o kh ng huyển gen sẽ bị c ch sự ph t triển. Biểu hiện l sự

ch t hay sự mất m u x nh a m nh m v huyển d n s ng m u trắng. Những t

b o gen huyển sẽ s n xuất r enzyme hygromy in phosphotr nsfer se t

d ng phosphoryl h hygromy in v l m mất ho t t nh kh ng sinh n y. Nhờ v y m

những m huyển gen thể ph t triển nh thường.

1.5 C ch ch u hạn hiện t ng già h và gen IPT

1.5.1 C ch ch u hạn c thực vật

h hịu h n ở thự v t ượ hi l m lo i:

 Kh n ng y thể ho n th nh hu kỳ sống n trướ khi sự thi u h t

nướ xuất hiện

 Kh n ng y tể sống ,ph t triển v ho n ng suất trong i u kiện ung

ấp nướ h n h hoặ th ng tr i qu gi i o n thi u nướ v ti p t ph t triển khi i u kiện trở l i nh thường

 Kh n ng y tr ng hống l i sự thi u h t nướ ằng h uy tr nướ trong

m t o o

19

1.5.2 Hiện t ng già h và c c y u tố ảnh h ởng

Sự gi h l gi i o n ph t triển cuối ùng a thực v t. Ở gi i o n n y bao

g m m t chuỗi sự kiện trong xuất hi n sự t i hấp thu hất inh ư ng, dẫn

n sự ph h y t ch c t o v k t thú l sự ch t c a t o. iểu hiện c a gi

h th ng qu việc mất kh n ng ph n hi t o, ph h y i ph n t như

RNA, protein, diệp l c tố, ph v o qu n, t ng kh n ng ph n gi i, gi m kh

n ng t ng hợp. Gi h a ở l ắt u bằng sự v ng l ở mép r i s u l n trong.

Sự gi h bị k h th h ởi stress m i trường như ường chi u s ng y u,

thi u h t inh ư ng, kh h n, ng p nước, sự t h rời c a thực v t hay sự tấn ng

c a vi sinh v t [43, 93].

1.5.3 Đi u hò sự già h và v i trò c Cyto inin

nhi u y u tố t ng d n việ i u h qu tr nh h gi l như: nh

s ng, nitrogen, ường, cytokinin [103]. y u tố n y t ng trực ti p hoặ gi n

ti p n việ t ng ường h y k m hãm sự h gi c l .

ytokinin l m t nh m h -m n thự v t ng v i tr i u khiển nhi u quy

tr nh sinh h o g m ph n ng l i với i u kiện ất lợi m i trường ằng

m ng lưới t n hiệu ph t p. Tuy h n y hư th t sự rõ r ng nhưng sự th y i

n ng ytokinin v những t n hi u li n qu n nh hưởng l n h i huỗi ph n ng

sinh h s isi i ( ): ph thu v kh ng ph thu . h i

huỗi ph n ng n y giúp thự v t th h ng với những i u kiện ất lợi m i

trường [48].

H n h n h nh l nguy n nh n c ch sự t ng hợp v v n chuyển cytokinin

[104] N ng cyokinin thấp g y r c ch sự sinh trưởng, gi m kh n ng hịu h n

v khởi u cho sự gi h [57]. V thực t chỉ ra rằng, sự gi h x y ra khi n ng

cytokinin s t gi m ưới i u kiện thi u nướ nh n t o ũng như tự nhi n [70].

V o uối th p kỷ 50, Ri hmon v L ng ã hỉ ra rằng thể tr hoãn qu tr nh gi

h bằng h s d ng cytokinin [83]. Tuy nhi n s d ng cytokinin từ n ngo i

kh ng em l i hiệu qu kinh t .Ho t t nh ph n t ũng như v i tr a cytokinin

ũng ã ượ ng ố [30, 63]. M t hướng nghi n u ượ ặt r l t o ra enzyme

isopentenyl transferase nhằm t ng ường t ng hợp cytokinin trong thực v t th ng

20

qua gen ipt. Gen ipt ượ h ng minh l kh n ng gi m sự gi h ở l , t ng

ường v uy tr qu tr nh qu ng hợp trong i u kiện ị stress kéo theo việ gi m

ng kể thiệt h i v n ng suất [48].

1.5.4 Gen ipt và promoter pSARK12

Gen ipt ã ượ t m thấy trong plasmid vi khuẩn A. tumefaciens bởi Akiyoshi

v rry c l p nghi n u v o n m 1984 [15, 26]. Gen n y ượ hèn ởi m t

intron 252 p mã h ho m t polypeptide ch a 329 amino aci tr ng lượng

ph n t 37.2 kD. Gen nằm ở vị tr th 4 trong plasmid c a vi khuẩn A. tumefaciens

mã h ho enzyme isopentenyl transferase [66], l enzyme th y gi i ướ u ti n

c on ường sinh t ng hợp cytokinin [32].

Tuy nhi n m ytokinin qu o l i g y nh hưởng n sự t ng trưởng v

sinh s n [61, 67, 94]. ể khắ ph i u n y n ph i m t promoter ể x ịnh

v ịnh hướng sự ho t ng gen. Hiện n y hỉ m t v i promoter thể s ng

hiệu qu , trong promoter SARK (pSARK: senescence associated receptor protein

kinase). Gen SARK ượ t h từ u ve (Phaseolus vulgaris). Gen hỉ iểu hiện

ở thời kỳ uối trướ gi i o n h gi [49]. u iểm promoter SARK l thể

ti t h h m lượng ytokinin v i u hỉnh m t h n ằng giữ nhu u

ytokinin trong i u kiện thi u nướ v tr nh nh hưởng n ng ytokinin t ng

cao l n sự sinh trưởng v ph t triển y tr ng [35].

Việc nghi n u gen pSARK-IPT ã ược thực hiện tr n m t số ối tượng:

thuố l [84], ng [58], l c [78], lú [74, 79, 81].

1.6 C c ph ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp

1.6.1 Ph ng ph p Southern blot

Phư ng ph p Southern lot ượ E win Southern thu i E in urgh

ph t triển v o n m 1975, ho phép nghi n u v ph t hiện m t o n N ặ hiệu

trong to n gen, giúp kiểm tr k t qu huyển gen v số opy hoặ kiểm tr sự

mặt m t gen n o trong gen t o [95]. ể thự hiện ượ qu

tr nh l i, u ti n, người t ph i t h DNA gen. S ng enzyme ắt giới h n ể

ắt ph n t N th nh những o n nhỏ, iện i tr n gel g rose ể t h những

o n k h thướ kh nh u. G y i n t nh N tr n gel ằng ung ị h NaOH

21

0,5M, s u , huyển N từ gel s ng m ng l i (nitro ellulose). Trong qu tr nh

huyển, vị tr N ượ giữ nguy n.

DNA ố ịnh tr n m ng ượ l i với mẫu ( nh ấu ph ng x hoặ kh ng),

ở nhiệt t h hợp v thời gi n l i kho ng 8-16 giờ. S u qu tr nh l i người t r

m ng l i ể lo i ỏ những mẫu kh ng ắt ặp huy n iệt với N ố ịnh tr n

m ng l i.

uối ùng, người t ùng kĩ thu t hiện m u hoặ ph ng x tự ghi ể ịnh vị

ph n t l i.

1.6.2 Ki m tr hả năng ch u hạn ở t i cây con

Kh n ng hịu h n y ượ nh gi qu nhi u y u tố o g m: i u

chỉnh p suất thẩm thấu, sự ng mở lỗ kh , ho t t nh hất iệp l , kh n ng

giữ nướ l , khối lượng v thể t h r , iện t h l , t ng v t hất kh …Sự sinh

trưởng v ph t triển ũng như n ng suất ng ị nh hưởng h y u v o h i thời

kỳ: thời kỳ y on v thời kỳ trỗ ờ – l m h t [25]. S n xuất ng t i vùng nhiệt

ới thường gặp t nh tr ng y vừ m 1-2 l nhưng s u kh ng mư hoặ

mư mu n g y r thiệt h i lớn v kinh t .

Trong y u tố th tố sinh trưởng r ng v i tr rất qu n tr ng,

tố sinh trưởng r t ng h y r n s u v r ng giúp y t n ng ượ

nướ ở ưới s u h y s ng nướ triệt ể theo hi u ng ng. Tố sinh trưởng

r o kéo theo hi u i r v t ng khối lượng hất kh t ng, h i y u tố rõ r ng

ể nh gi kh n ng hịu h n [25]. nh gi r y ở thời kỳ y on thể

ư r ự o n g n úng v sự sinh trưởng r khi tr ng thự t ở gi i o n

mu n h n [82].

Kh n ng hấp th nước ở vùng ất kh h n ph thu v o k h thước

ph n ố b r , lo i r kh nh u ph n ng kh nh u với m thi u h t

nước [69]. V r ốt thể xuy n s u v o lớp ất c ng n n t mẫn c m với h n

h n lo i r kh [101]. giống kh nh u kiểu r kh nh u. M t số sinh

nhi u r ốt, số kh l i sinh nhi u r th cấp. Ch n l ng khối lượng r lớn l

m t chỉ ti u hữu h ẫn n t ng n ng suất trong i u kiện h n vừa. Chi u i r

ốt s i kh nh u nghĩ giữ v t liệu ng trong i u kiện h n khẳng ịnh

22

rằng nhi u giống ng nhiệt ới nhi u r ốt h n, giúp y hút ẩm ở t ng ất mặt

tốt h n th ng qu h i u chỉnh p suất thẩm thấu khi gặp h n tốt h n với r th

cấp [69] .

Tốc i l xu hướng mẫn c m nhi u h n i r . Tố i l t ng

trong khi gặp h n ược s d ng r ng rãi ể t o giống chịu h n c ở gi i o n trỗ

lẫn gi i o n sinh trưởng inh ư ng v n tư ng qu n hặt với tố t h luỹ

v t chất kh [29].

23

Ch ng – VẬT LIỆU VÀ PH NG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Nguy n liệu ược s d ng trong nghi n u l ph i ng non a 3 ng ng

kh n ng ti p nh n gen ngo i l i v t i sinh tốt: VH1, CM8 v CH9 ượ ung

ấp ởi Ph ng Th nghiệm Tr ng iểm ng nghệ T o Thự v t- Viện i truy n

N ng nghiệp. y ng m cho bắp th nghiệm ược tr ng trong nh lưới ặt t i Tr i

th nghiệm Viện i truy n N ng nghiệp t i V n Gi ng, Hưng Y n.

2.1.2 Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen

Ch ng A. tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen pSIChyg-2 h gen

kh ng h n ipt ượ i u khiển ởi promoter S RK v gen hỉ thị h n l hpt với

promoter CaMV 35S. Vector pSIChyg-2 ượ ung ấp ởi Ph ng th nghiệm Hệ

gen h u tư ng v i truy n ph n t , i h t ng hợp Misouri ( olum i , Mỹ)

k h thướ 10441 p

H nh 5 : S đồ cấu trúc vector pSIChyg-2

2.1.3 H chất và thi t b sử d ng

2.1.3.1 H chất

M i trường ược s d ng trong nghi n u nu i ấy m t o v nu i ấy vi

khuẩn ùng ho th nghiệm chuyển gen bao g m: IM, CCM, REM, ECM, SeM,

24

RM,YEP, ABC. Th nh ph n m i trường ượ n u như trong ph l 1.

kh ng sinh, hất i u ti t sinh trưởng ượ ùng trong th nghiệm t i sinh

v huyển gen như: N , P, Acetosyringone (AS), kanamycine, cefotacime,

hygromycine, strepomycine, spectinomycine, rifampicin… ược cung cấp bởi

hãng: New England Biolabs (Anh), Sigma (Mỹ), Merk ( )…

H hất sinh h ph n t ượ ung ấp ởi Thermo v Ro he (Mỹ)

2.1.3.2 Thi t b

T nu i ấy v trùng, n i kh trùng, m y o pH, m y o O , t n nhiệt, t

nu i lắ , m y li t m, v thi t bị m y m kh thu ph ng th nghiệm tr ng

iểm ng nghệ t o thự v t –Viện Di truy n N ng nghiệp

2.2 Ph ng ph p nghiên cứu

2.2.1 Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn

Agrobacterium tumefaciens

T o dịch huy n ph vi huẩn Cấy tr i Agrobacterium cất giữ trong glycerol ở -80o l n ĩ m i trường

sung 30 mg/l rifampicin v 50 mg/l kanamycin, 100 mg/l spectinomycin, 100 mg/l streptomycin, nu i ở 280C trong 2-3 ng y. S u lấy 1

khuẩn l c vi khuẩn nu i trong m i trường YE ặ sung 50 mg/l kanamycin 100 mg/l spectinomycin, 100 mg/l streptomycin, 280C trong 2-3 ng y. Trước khi

bi n n p, lấy 2 khuẩn l h t n v o 5ml m i trường l y nhi m IM tới OD550

0,35, b sung 200 mg/l S. Ti p t nu i lắ 4-5 giờ s u ịch huy n phù vi

khuẩn n y ược s d ng ể l y nhi m ngay với ph i.

Lây nhi m vi khuẩn với phôi ngô non

ắp non s u khi th phấn kho ng 7-13 ng y ượ thu ể t h ph i. Kh trùng mặt ngo i ắp ằng eth nol 700, ỏ l o ngo i v t h

ph i trong i u kiện v trùng. Ph i non s u ượ r 3 l n với ung ị h IM v

ng m trong dịch huy n phù vi khuẩn tr n trong 30 phút

uôi c ng sinh

S u khi nhi m khuẩn, ph i non ượ huyển s ng ấy trong m i trường nu i

ng sinh M với ph n t o v y hướng l n tr n, ph n tr ph i ti p xú với

25

mặt m i trường, nu i trong tối, ở nhiệt 200C, thời gi n 3 ng y.

uôi ph c h i

Chuyển ph i ã i n n p từ m i trường M s ng m i trường ReM, nu i

trong tối ở 28oC , thời gi n 7 ng y.

Chọn lọc ô sẹo chuyển gen

M s o t o th nh từ ph i non ã i n n p tr n m i trường REM ược cấy

chuyển sang m i trường ECM , nu i trong tối ở 28oC, thời gian 14 ng y.

T o ch i chuyển gen

M s o ph i ho t o th nh tr n m i trường ch n l c ECM ược cấy chuyển

s ng m i trường SeM ể t i sinh h i, nu i s ng ở 28oC, thời gian 14 ng y.

i sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh

Ch i t i sinh trong m i trường ch n l SeM ược cấy chuyển s ng m i trường t o y ho n hỉnh RM (m i trường n n l MS), nu i s ng ở 25oC , thời gian

10-20 ng y.

Th nh ph n m i trường xem ph l 1

C c chỉ ti u theo dõi và nh gi

C th ng số s u ượ qu n t m ể nh gi hiệu qu c qu tr nh nu i ấy v

bi n n p gen:

Tỷ lệ ph c h i c ph i ng s u i n n p (%) = Số ph i sống s t s u huyển

gen*100%/T ng số ph i i n n p.

Tỷ lệ t o m s o chuyển gen (%) = Số m s o chuyển gen t o th nh*100%/T ng

số ph i ph c h i sau bi n n p.

Tỷ lệ t i sinh y huyển gen (%) = Số y huyển gen t i sinh*100%/T ng số

m s o chuyển gen ph i h

T n số chuyển gen gi ịnh (%) = Số y ư r ất*100%/ T ng số ph i i n

n p

Hiệu suất bi n n p gen (%) = số y ư r ất hữu th v ư ng t nh với

PCR*100%/ T ng số ph i i n n p

26 Nuôi huẩn

Chuẩn b mẫu thực vật

H t n khuẩn l trong IM- S n

Bắp ng v t liệu 7-13 ng y s u th phấn  T h

ph i non trong i u kiện v trùng  IM-AS.

OD550 0,35 ; nu i l th m 4-5 giờ

Lây nhiễm – đồng nuôi cấy L y nhi m ph i non với dịch huy n phù vi khuẩn : 30phút. huyển s ng m i trường M, nu i tối ở 20o trong 3 ng y.

Ph c hồi Chuyển ph i s ng m i trường REM, nu i tối ở 28o trong 7 ng y.

Chọn lọc

Chuyển m s o s ng m i trường ECM , nu i tối ở 28oC trong 14 ng y.

T i sinh chồi

Chuyển m s o ph i h s ng m i trường SeM nu i s ng ở 28oC trong 14-20 ng y.

Tạo rễ và t i sinh cây hoàn ch nh

Chuyển ch i t i sinh s ng m i trường RM, nu i s ng ở 25oC trong 10-20 ng y.

R u đất

y t i sinh tr n m i trường RM 2-3 l , 3-4 r ược chuyển ra u ất

H nh 6 : S đồ quy tr nh chuy n gen

2.2.2 Phân tích cây chuy n gen bằng ph ng ph p sinh học phân tử.

y huyển gen t i sinh tr ng tr n ất xuất hiện 2-3 l mới ược ti n h nh

thu mẫu l ể ti n h nh ph n t h P R v Southern lot.

T h hi t DNA t ng số từ mẫu l y ng huyển gen t i sinh theo

27

phư ng ph p T llen [19] i ti n ho phù hợp với i u kiện ph ng th

nghiệm (th nh ph n T xem ph l 2). Kiểm tra n ng v tinh s ch c a

DNA t ng số bằng m y qu ng ph n no rop, s u ti n h nh iện i tr n gel g rose

1%. Dự v o k t qu iện i ể kiểm tr tinh s h v t nh nguy n v n N

ượ m o, thể ùng l m khu n ho ph n t h P R h y Southern lot.

Quy tr nh:

- Thu kho ng 1 g mẫu l ng v o ống eppen orf 2ml h i s , ng m

trong nit lỏng trong 10 phút. Nghi n th nh t mịn ằng m y lắ nghi n bi (ball

mill shaker) trong 90 gi y.

- Th m 800ul ệm CTAB ở 65o , votex trong 2 phút. Ủ ở bể n nhiệt 65o t

nhất 1giờ.

- Th m 1,5 l RN se 10mg/l ở ể n nhiệt 30 phút

- Th m 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Lắ u trong 10 phút. Ly t m 15 phút ở 13.000

v/ph.

- Hút lớp dịch n i v th m isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1. - ư v o t - 20oC qu m ể thu ượ lượng k t t a lớn nhất. - Ly t m thu t v r a s ch bằng c n 75o t nhất 2 l n.

- Th i kh DNA ã r a s h v h t n ằng TE.

2.2.2.1 Phân tích PCR

Ph n t h P R ti n h nh với cặp m i HPT-F1/HPT-R1 ặc hiệu cho gen hpt

v ặp m i pSARK-F1/IPT-R1 ặc hiệu cho gen ipt ; th nh ph n P R ược b sung

et ine v MSO ể t ng nh y; chu tr nh ph n ng với cặp m i HPT-F1/HPT- R1 l 94o /5 phút, 94o /30 gi y, 53o /30 gi y, 72o /60 gi y, lặp l i trong 35 chu k , 72o /5 phút, k t thúc 4o , o n N ượ khu h i k h thướ 219bp; chu tr nh ph n ng với cặp m i pSARK-F1/IPT-R1 l 95o /5 phút, 95o /30 gi y, 57o /30 gi y, 72o /60 gi y, lặp l i trong 35 hu k , 72o /5 phút, k t thú 4o , o n

N ượ khu h i k h thướ 419bp; S n phẩm P R ược kiểm tra bằng

iện i tr n gel g rose 1%.

28

ảng 5: Tr nh tự mồi

Tên mồi HPT-F1 HPT-R1 pSARK-F1 IPT-R1

Tr nh tự mồi 5‟- ACGCCATGTAGTGTATTGACCGATT-3„ 5‟- GAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTTA-3„ 5‟- GGTCATTGGCTTAGGGTTC-3‟ 5‟- GGAAGAACTGAAAGGAACGA-3‟

STT 1 2 3 4

2.2.2.2 Phân tích Southern ot

DNA t ng số t h từ y ng huyển gen k t qu ư ng t nh với PCR

ược x l với enzyme BamHI, ph n t ch bằng iện i tr n gel g rose 1,2%, iện

di trong thời gian 6-10 ti ng ở hiệu iện th 40V. S u ti n h nh nhu m với

Ethium bromide 0,002%.

Ph n t h Southern lot ược ti n h nh theo phư ng ph p l i kh ng ng vị

ph ng x , nh gi số b n copy c a gen s d ng Kit DIG High Prime DNA

Labeling and Detection Starter Kit I (Roche) theo quy tr nh:

- ặt gel trong H l 0.25 M trong 15 phút ở nhiệt ph ng. R a l i bằng

nước cất 2-3 l n, s u i n t nh gel trong 1,5M N l + 0,5M N OH 2 l n,

mỗi l n 15 phút. R a l i bằng nước cất từ 2-3 l n, ti p t ặt gel v o trong

dung dị h trung t nh trong 15 phút.

- Chuyển N từ gel l n m ng nylon Hy on N + ằng phư ng ph p m o

ẫn s d ng dung dịch 20X SSC.

- Cố ịnh DNA tr n m ng l i ằng UV rosslinking 120mJ trong thời

gian 1 phút.

- S u ho v o ống lai, b sung 15 ml dung dịch ti n lai

(prehy riz tion), ặt v o t l i 42º trong t nhất 30 phút.

- Bi n t nh mẫu (probe) ở 98 º trong 10 phút v ặt ng y v o .

dung dịch trong ống l i i, sung 4 ml dung dịch ti n l i s u th m tỷ lệ 25ng probe/100 cm2 m ng l i ặt v o t l i 42º trong 16 giờ.

- R m ng 2 l n, mỗi l n 15 phút trong 50ml ung ịch 2X SSC + 0,1%

S S trong l l i 68º .

29

- R m ng 2 l n, mỗi l n 15 phút trong 50ml ung ịch 0,5X SSC +

0,1% SDS trong l l i 68º .

- ặt m ng 2 phút trong Buffer 1 (0,1M M lei i + 0,15M N l) tr n

m y lắc ở nhiệt ph ng.

- 30 phút trong lo king solution (45ml uffer 1 + 5ml lo king regent

10X) tr n m y lắc ở nhiệt ph ng.

- 30 phút trong nti-DIG solution (Anti-DIG : Blocking regent 1X = 1:

5000) tr n m y lắc ở nhiệt ph ng.

- R m ng 2 l n, mỗi l n 15 phút với dung dịch Washing Buffer (Buffer

1 h 0,3%Tween 20) tr n m y lắc ở nhiệt ph ng.

- Ng m m ng 2 phút trong uffer 3 ( ete tion uffer)

- B sung 200 l N T/ IP sto k solution trong 10 ml ete tion uffer

(trong tối), ể tối trong kho ng 16 giờ.

Lấy m ng r s ng kho ng 1 phút ể ho n th nh qu tr nh hiện m u,

dung dịch hiện m u v ừng ph n ng ằng ung dịch TE 1X.

2.2.3 Đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i

cây con.

K t hợp phư ng ph p Nelson v phư ng ph p L Tr n nh v L Thị

Mu i ể kh o s t nh gi kh n ng hịu h n ng ng huyển gen ã

ư ng t nh với P R v Southern lot [2, 71].

Mỗi ng v ối ch ng ượ gieo v o u t v ng s h k h 16x18

lỗ ở y với số lượng 5 h t/ u, l n nhắ l i. Mỗi th nghiệm hi th nh 2

nh m, nh m tưới nướ nh thường- well w ter (WW) v nh m ti n h nh x l

h n- water stress (WS).

B u t ược chuẩn bị với tr ng lượng 2kg v ượ l m ẩm bằng 200ml nước

cất. Ti n h nh gieo h t v n l t ằng h h t n NPK v o nước cất r i tưới u

với lượng 0.2g/ b u t.

u ất s u khi ược gieo h t ượ h m s nh thường: tưới 2 ng y

m t l n với lượng nướ l 50ml ho n khi y 3 l . Ti n h nh tỉ ỏ 2 y, giữ

30

l i mỗi u 3 y. Khi y 3 l th nh m WW vẫn h m s nh thường trong

khi nh m WS ngừng tưới ho n to n (ti n h nh việc test h n).

S u khi test h n 10 ng y

Thu to n mẫu c a c h i nh m ể ti n h nh o với c hỉ ti u: chi u i

th n (SH), r (LRL) v tr ng lượng tư i th n l v r (FWS-FWR), tr ng lượng

kh th n l v r (DWS-DWR)

2.2.4 Đ nh gi sự h già c trong đi u iện c t h i cành

L th 3 ng ng huyển gen v ối h ng tư ng ng ở gi i o n 5

l (V2) [91] ượ thu ằng h ắt ắt mẩu iện t h 2x2 m. mẩu l ượ ng m trong nướ ất trong ĩ petri ở 30o trong tối. Mẫu ượ qu n s t v ghi

hú ở gi i o n 2, ng y 4 ng y v 7 ng y ể qu n s t sự ph n h y iệp l

v l .

2.3 Đ đi m, th i gi n và ph ng ph p xử ý số liệu

Th nghiệm ược thực hiện t i ph ng th nghiệm tr ng iểm t o thực v t,

Viện Di truy n N ng nghiệp, Ph m V n ng-Từ Li m-H N i.

Thời gian thực hiện: 1/2013- 6/2015

Số liệu ược thu th p, x l t nh to n ằng ph n m m Ex el v SPSS

31

Ch ng - K T QUẢ

3.1 K t quả c qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c ba giống ngô

K thừa s n phẩm c t i T o ng ng i n i gen kh ng s u/kh ng

thuốc diệt cỏ, húng t i s d ng ph i non a ba giống ng VH1, M8 v H9 l m

v t liệu ể chuyển gen. Ba giống n y ược khẳng ịnh l giống kh n ng t i

sinh ũng như ti p nh n gen l tốt. Tuy nhi n, kh n ng huyển gen c ve tor

mang gen chuyển kh nh u l kh ng giống nhau, o mặ ù giống ng tr n

ã k t qu kh tốt với ve tor huyển gen kh ng s u v thuố iệt ỏ nhưng hư

thể khẳng ịnh iểu hiện húng với ve tor gen h n. Nh n chung kh n ng ti p

nh n gen c giống ng n i kém kéo theo việ huyển gen gặp nhi u kh kh n.

K t qu t ng thể th nghiệm ượ tr nh y ở ng 6

ảng 6: K t quả t ng h p thí nghiệm chuy n gen ch u hạn

o n

CCM

ReM

EcM

SeM

VH1

28117

9972

4478

1656

CM8

19398

8364

3250

1276

C8H9

13303

5704

2983

1141

ổn

60818

24040

10711

4073

117

60.00%

50.00%

40.00%

30.00%

20.00%

10.00%

0.00%

VH1

CM8

CH9

36.41%

41.93%

42.77%

43.95%

39.16%

52.63%

ỷ lệ p ô s ng sót ỷ lệ o mô sẹo p ô óa yển gen

36.72%

39.58%

38.04%

ỷ lệ ồi ái sinh yển gen

H nh 7: Khả năng ph c hồi- ti p nhận- t i sinh c c c giống ngô

32

ự v o ti u h nh gi : o g m kh n ng ph c h i c ph i non s u

qu tr nh l y nhi m v ng nu i ấy, kh n ng t o m s o chuyển gen ũng như

kh n ng ph t sinh h i trong m i trường ch n l c hygromycin 5mg/L.

K t qu ho thấy s u qu tr nh l y nhi m v ng nu i ấy, kh n ng ph h i

ã sự kh iệt. Giống VH1 ho tỷ lệ thấp nhất với 36,41%, kém h n h i giống

n l i với m nghĩ (p=0.008 &p=0.004). H i giống M8 v H9 tỷ lệ l n

lượt l 41,93% v 42,77%, nhưng sự h nh lệ h n y kh ng nghĩ v mặt thống

k (p<0.05). (xem ph l 4)

Kh n ng ti p nh n gen ngo i l i giống ng iểu hiện qu tỷ lệ t o m

s o ph i h trong m i trường h n l ph i non s u qu tr nh nu i ph h i.

K t qu xuất hiện sự kh iệt ở giống với H9 o nhất t 52,63%, ti p n l

VH1 43,95%, uối ùng l M8 39,16%. Sự s i kh kh ng lớn nhưng nghĩ

v mặt thống k với p=0.000 (xem ph l 4).

0.40%

0.33%

0.35%

0.30%

0.25%

0.20%

0.12%

0.15%

0.10%

0.05%

0.00%

VH1

CM8

CH9

H nh 8: T n số chuy n gen giả đ nh

33 A

B

C

D

F

G

H

E

J

K

M

I

L

N

O

P

H nh 9: Một số h nh ảnh c c gi i đoạn chuy n gen : gi i o n u M; : gi i o n uối M; : gi i n u ReM; : gi i o n uối ReM; E: gi i o n u E M; F: gi i o n uối E M; G: gi i o n u SEM; H: gi i o n uối SEM; I,J,H,L: gi i o n RM; M: y huyển gen ắt u r ờ; N: y huyển gen so với ối h ng ( ối h ng vị tr uối ùng); O: ắp huyển gen M8; P: ắp huyển gen CH9

34

Kh n ng t i sinh y huyển gen ti p t ượ nh gi qu tỷ lệ ph t

sinh ch i chuyển gen. C 3 giống u cho k t qu t i sinh t o ch i kh tốt v ng

u với l n lượt ở giống VH1, M8 v H9 l 36,72%, 39,58% v 38,04%. Sự

s i kh kh ng m ng nghĩ thống k (xem ph l 4)

ự tr n k t qu ượ giống ng qu quy tr nh huyển gen ằng vi

khuẩn Agrobacterium với hệ thống h n l hygromi yn 5mg/L, h y n i h kh

ự v o số y sống s t r ất kh n ng sinh ắp từ t ng số ph i em i n n p

tr i qu hệ thống h n l ã x ịnh ượ t n số huyển gen gi ịnh. T n số

huyển gen gi ịnh giống sự h nh lệ h kh rõ ượ thể hiện ở h nh 8.

C thể l H9 t tỷ lệ cao nhất với 0.33%, ti p n l M8 với 0.2% v uối ùng

VH1 t tỷ lệ 0.12%. Sự kh iệt n y nghĩ v mặt thống k p= 0.000 (xem

ph l 5).

3.2 Ki m tr ằng ph ng ph p sinh học phân tử

3.2.1 K t quả t ch chi t NA t ng số

ể kiểm tr sự hiện iện gen ằng phư ng ph p sinh h ph n t ,

ng ng gi ịnh m ng gen ượ thu mẫu l v ti n h nh t h hi t theo phư ng

ph p T i ti n. Mẫu N s u khi t h hi t ượ o n no rop v iện i

tr n g rose gel 0,8% ể kiểm tr tinh s h. K t qu iện i ũng như n no rop

ho thấy hất lượng N t ng số t h từ mẫu tư ng ối tốt. Kh ng thấy xuất

hiện những vệt sme r ( ốm ẩn n ưới s n phẩm iện i) h ng tỏ RN ã ượ

lo i ỏ ho n to n v mẫu kh ng ị t gẫy. S n phẩm thu ượ t ti u huẩn ể

thự hiện ướ ti p theo.

35

H nh 10: K t quả điện di NA t ng số

3.2.2 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen

hpt

ể x thự ng ng huyển gen gi ịnh, húng t i ti n h nh ph n t h

PCR những ng ng sống s t v hữu th ể x ịnh hiệu suất chuyển gen c a ba

giống ng VH1, M8 v H9.

Ph n t h P R ho thấy trong 32 y hữu th trong t ng số 117 y huyển

gen gi ịnh ã ượ x ịnh chỉ 7 y ho k t qu ư ng t nh với gen hpt cho

k h thướ ng kho ng 219 p phù hợp với k h thướ gen h với cặp m i ược

thi t k trong vector. l ng: CH9.I.5; CH9.I.6; CH9.I.7; CH9.I.15;

CM8.I.1; CM8.I.2; CM8.I.8

36

H nh 11: K t quả phân tích PCR gen hpt th hệ T 1: 1k plus l er; 2: IPT pl smi ; 3: ối h ng H9; 4: H9.I.5; 5: H9.I.6; 6: H9.I.7; 7: H9.I.15; 8: M8.I.1; 9: M8.I.2; 10: M8.I.8; 11: ối h ng M8; 12: ối h ng H2O

3.2.3 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen ipt

H nh 12: K t quả phân tích PCR gen ipt th hệ T 1: 1kb plus ladder; 2: IPT plasmid; 3: ối h ng CH9; 4: CH9.I.5; 5:CH9.I.6; 6: CH9.I.7; 7: CH9.I.15; 8: CM8.I.1; 9: CM8.I.2; 10: CM8.I.8; 11: ối h ng CM8; 12: ối h ng H2O

y ư ng t nh với gen hpt ti p t ượ P R kiểm tr l i với gen h

ipt. K t qu 7 ng u ư ng t nh với gen h v ho k h thướ ng kho ng

419k phù hợp với k h thướ gen h với cặp m i ược thi t k trong vector.

Từ k t qu ph n t h nh n ượ t giống CM8 thu ượ 3 y ư ng t nh

với ph n ng P R t hiệu suất chuyển gen l 0.015%. o nhất l giống CH9 với

37

4 y ư ng t nh với ph n ng P R t hiệu suất 0.03%. Ri ng giống VH1 hư

thu ượ y y huyển gen.

7 ng ư ng t nh ti p t ượ tr ng r th hệ T1, k t qu ph n t h P R

ở th hệ T1 ho thấy 7 ng u xuất hiện y ư ng t nh với gen h ipt.

mẫu n y ượ s ng ể ti n h nh Southern lot.

H nh 13: K t quả phân tích PCR gen ipt th hệ T 1: 1k plus l er; 2: IPT pl smi ; 3: ối h ng H9; 4: H9.I.5.1; 5:CH9.I.6.1; 6: CH9.I.6.5; 7:

CH9.I.6.7; 8: CH9.I.7.2; 9: CH9.I.15.1; 10: CH9.I.15.4;11 : CM8.I.1.1; 12: CM8.I.2.6; 13:

CM8.I.8.1; 14:CM8.I.8.3; 15: CM8.I.8.4; 16: ối h ng M8; 17: ối h ng H2O

3.2.4 K t quả phân tích Southern ot c c dòng ngô chuy n gen th hệ

T1

Mẫu trong th nghiệm Southern lot ượ t ng hợp từ ph n ng P R nh n

o n gen ipt từ ặp m i khu h i pS RK-F1 v IPT-R1 k h thướ 419 p

ượ tinh s h, x ịnh n ng v s ng ể nh ấu với IG ằng phư ng

ph p r n om primer. S ng 500ng s n phẩm ể nh ấu với IG (t ng thể t h

l 20 l) trong 20h thu ượ lượng N ượ nh ấu với IG n ng l

91ng/ l

S ng 30 g DNA genome mẫu huyển gen ũng như ối h ng

ượ x l ằng enzyme h n h BamHI l lo i enzyme th ng ng v kh ng

38

iểm ắt n trong o n mẫu . H n nữ enzyme n y kh n ng ắt tốt với

mẫu lượng G o như ng .

K t qu ph n t h Southern lot ho thấy tất mẫu u xuất hiện nhi u ng

h y n i h kh mỗi ng u xuất hiện nhi u n opy. Mẫu ối h ng M8 ã

xuất hiện ng n i sinh trùng với mẫu huyển gen. Ngo i trừ ng n i sinh th

số n opy những mẫu huyển gen l n lượt l :

ảng 7: Số copy gen chuy n

CH9.I.5.1

CH9.I.6.5

CH9.I.7.2

CH9.I.15.1

CM8.I.1.1

CM8.I.2.6

CM8.I.8.4

A

B

H nh 14: K t quả Southern ot c c dòng chuy n gen ở th hệ T : K t qu iện i s n phẩm ắt; : k t qu hiện m ng Southern blot

39

3.3 K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i

cây con.

Th nghiệm hi th nh 2 nh lưới với nh lưới th nhất l ối ch ng H9 v 4

ng huyển gen ipt l H9.I.5.1, H9.I.6.5, H9.I.7.2, H9.I.15.1. Nh lưới th 2

l M8 v 3 ng huyển gen ipt l M8.I.1.1, M8.I.2.6, M8.I.8.4.

* hà l ới số 1: g m ng ối ch ng H9 v 4 ng huyển gen ipt l

CH9.I.5.1, CH9.I.6.5, CH9.I.7.2, CH9.I.15.1.

K t qu nh gi v chi u o y, hi u i r i nhất, tr ng lượng tư i v

tr ng lượng kh y on ược thể hiện chi ti t qu H nh 16,17,18.

H nh 15: Đ nh gi hả năng ch u hạn ở gi i đoạn cây con ở nhà ới số rễ c c c cây xử ý hạn mẫu theo th tự tr i qu ph i: H9.I.5.1, CH9.I.6.5, CH9.I.7.2, CH9.I.15.1, CH9

( A: tưới nướ y ; B: x l h n; : R y x l h n)

40 A

B

H nh 16: K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ vào chi u c o thân và chi u dài rễ dài nhất tại nhà ới số

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

A

B

H nh 17: Kêt quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ vào trọng ng t i tại nhà ới số .

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

A

B

H nh 18: K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ vào trọng ng hô tại nhà ới số

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

41 Từ iểu tr n thể thấy y huyển gen so với y ối ch ng tuy sự

h nh lệch c v chi u o th n, hi u i r i nhất, tr ng lượng tư i ũng như

tr ng lượng kh ở c th n v r nhưng sự s i kh n y h u như kh ng nghĩ v

mặt thống k với p> 0,05 ở nh m tưới nướ y v nh m x l h n (xem Ph

l c 6 ).

V kiểu h nh th y ối h ng H9 ở nh m x l h n ấu hiệu héo rũ

v r p xuống h n so với y huyển gen. Tuy nhi n khi ti n h nh o t th

chi u o kh ng kh iệt nhi u so với ng huyển gen. Duy chỉ tr ng lượng

tư i th n ng H9.I.15.1 sự s i kh nghĩ với p= 0,48< 0,05. C thể

ng H9.I.15.1 tr ng lượng th n tư i (1,38g) o h n ối ch ng CH9 (1g)

(post-hoc test dunnet p= 0,011< 0,05) (xem Ph l c 6 ).

* hà l ới số 2: g m ng ối ch ng M8 v 3 ng huyển gen ipt l

CM8.I.1.1, CM8.I.2.6, CM8.I.8.4.

K t qu nh gi v chi u o y, hi u i r i nhất, tr ng lượng tư i v

tr ng lượng kh y on ược thể hiện chi ti t qu H nh 20,21,22.

Trong i u kiện tưới nướ y , từ iểu tr n thể d ng nh n thấy

tất c hỉ ti u nh gi : hi u o th n, hi u i r i nhất, tr ng lượng kh v

tư i th n ũng như r u xấp xỉ như nh u. Sự s i kh nhỏ v kh ng

nghĩ v mặt thống k (xem Ph l c 6).

Trong i u kiện x l h n th ngược l i, sự kh iệt thể hiện rõ r ng h n.

Chi u o th n ng huyển gen o h n ng ối ch ng CM8 (p=

0,005< 0,05) (H nh 20B). Khi s d ng post-ho test unnett ể x l s u h n th so

với ối ch ng, chỉ ng M8.I.8.4 l sự kh iệt nghĩ thống k v

chi u o th n với p= 0,001 (xem Ph l c 6).

Chi u i r i nhất c ối ch ng CM8 l i o h n so với ng huyển

gen (p=0,026) (H nh 20B). V vẫn ng huyển gen CM8.I.8.4 l thể hiện sự kh

biệt nghĩ so với ối ch ng M8 khi ph n t h post-hoc test (p= 0,008) (xem

Ph l c 6).

Tr ng lượng tư i th n h i ng huyển gen M8.I.1.1 v CM8.I.8.4 cao

h n ng ối ch ng CM8 với sự kh iệt so với ối ch ng l n lượt l p= 0,28 v

42

p= 0,05. Chỉ tr ng lượng tư i r c ng CM8.I.8.4 l lớn h n nghĩ so với

ối ch ng CM8 với p= 0,13 (H nh 21B).

H nh 19: Đ nh gi hả năng ch u hạn ở gi i đoạn cây con ở nhà ới số rễ c c c cây xử ý hạn mẫu theo th tự tr i qu ph i: CM8.I.1.1,

CM8.I.2.6, CM8.I.8.4 v ối h ng M8

( A: tưới nướ y ; B: x l h n; : R y x l h n)

A

B

H nh 20: K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ vào chi u c o thân và chi u dài rễ dài nhất tại nhà ới số

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

43 A

B

H nh 21: K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ và trọng ng t i tại nhà ới số

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

A

B

H nh 22: K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn gi i đoạn cây con căn cứ vào trọng ng hô tại nhà ới số

A: đi u kiện t ới n ớc đ y đ & B: xử ý hạn

Tr ng lượng kh th n h i ng huyển gen CM8.I.2.6 v M8.I.8.4 cao

h n so với ối ch ng với sự kh iệt nghĩ p l n lượt l 0,002 v 0,000. Tr ng

lượng kh a r ng CM8.I.8.4 o h n ối ch ng nhưng kh ng nghĩ v

mặt thống k trong khi ng M8.I.1.1 v CM8.I.2.6 tr ng lượng kh thấp h n

(p= 0,000 v p= 0,001) (H nh 22B).

T m l i, trong 7 ng ipt nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on t i

nh lưới số 1 v nh lưới số 2 th hỉ ng CM8.I.8.4 l iểu hiện rõ r ng ở tất

c hỉ ti u nh gi th nghiệm trong i u kiện x l h n. hỉ số u

44

o h n ối ch ng CM8 l n lượt: chi u o th n (34,2 m so với 23,2 cm c ối

ch ng); tr ng lượng th n tư i (0,97 g so với 0,62 g c ối ch ng); tr ng lượng r

tư i (1,13 g so với 0,76 g c ối ch ng); tr ng lượng th n kh (0,20 g so với 0,07

g c ối ch ng); tr ng lượng r kh (0,46 g so với 0,43 g c ối ch ng). Như v y,

so với ối ch ng chi u o th n ng M8.I.8.4 ã t ng 47,19%, sinh khối t ng

52,97%. Ri ng hỉ ti u hi u i r i nhất, h u như ng chuyển gen u biểu

hiện kém h n so với ối ch ng.

3.4 K t quả đ nh gi qu tr nh h già c hi c t

H nh 23: Đ nh gi qu tr nh h già c CH Th tự mẫu t nh từ tr i qu ph i, từ tr n xuống: CH9.I.5.1, CH9.I.6.5, CH9.I.7.2, CH9.I.15.1, CH9 : mới ắt u; :S u 4 ng y ; : S u 7 ng y

H nh 24: Đ nh gi qu tr nh h già c CM Th tự mẫu t nh từ tr i qu ph i, từ tr n xuống: CM8.I.1.1, CM8.I.2.6, CM8.I.8.4, CM8 : mới ắt u; :S u 4 ng y ; : S u 7 ng y

Th nghiệm ượ qu n s t h ng ng y v lưu k t qu v o ng y th 4 v th 7. K t qu ho thấy s u 7 ng y mẫu l ắt u huyển s ng m u v ng v hiện tượng thối rữ . Tuy nhi n vẫn h i mẫu H9.I.7.2 v M8.I.8.4 mẫu l tư ng ối giữ ượ m u x nh.

45

Ch ng – THẢO LUẬN

4.1 Chuy n gen thông qu vi huẩn

Kể từ khi Green v Phillips ng ố k t qu v kh n ng t i sinh ph i non

ng v o n m 1975 [47]. rất nhi u nghi n u tr n lo i m kh

nhi u kiểu gen kh nh u ng ũng ã ượ t i sinh. Tuy nhi n ph i non vẫn l

ối tượng hiệu suất t i sinh hiệu qu nhất [108].

S u qu tr nh l y nhi m v ng nu i ấy, nhi u kh n ng ph i non sẽ ị ho i

t h y mất kh n ng ph t triển. Ở ng , ph i non s u qu tr nh ng nu i ấy h t i

ã ượ p n [50]. Ngo i y u tố như tu i ph i, n ng khuẩn ũng

như thời gi n l y nhi m v ng nu i ấy nh hưởng n s sống ph i non,

giống ng s ng ũng l m t y u tố n xem xét. Trong nghi n u n y giống

ng ượ s ng l giống ưu tú ượ k thừ từ t i t o ng ng i n i

gen kh ng s u / kh ng thuốc diệt cỏ: VH1, M8 v H9. giống u thể hiện

kh n ng ph h i s u i n n p kh tốt tư ng ư ng k t qu s u i n n p

huyển gen kh ng s u [11].

Tuy giống VH1 ho tỷ l tư ng ối thấp h n so với h i giống n l i với hỉ

36,41% nhưng vẫn p ng y u u ho những ướ ti p theo. Sự s i kh

nghĩ thống k nhưng s i kh kh ng qu lớn. Mặ ù v y, so với những giống m

h nh như 188 [53, 107] th tỷ lệ n y vẫn kh thấp v n ũng nh hưởng trự ti p

n hiệu suất huyển gen. y ũng l nhượ iểm hung giống ng ở Việt

Nam.

K t qu ũng hỉ r rằng giống ng u kh n ng ti p nh n gen khi

giống u h nh th nh m s o sống s t trong m i trường h n l với tỷ lệ kh

nh u rõ rệt. Sự sống s t m s o n y l o gen hpt mã h ho enzyme

hygromy in phosphotr nsfer se, enzyme n y t ng ất ho t hygromy in giúp

m s o ượ t o th nh ti p t sống s t, sinh trưởng v ph t triển qu gi i o n u

qu tr nh h n l . Những m s o kh ng ượ huyển gen sẽ xuất hiện hiện

tượng như th m n u en (gỗ h ), kh ng ph t triển ũng như t ng k h thướ v

h t i trong khi những m s o huyển gen ở ng m u trắng xốp v kh n ng

ph t triển m nh h n hẳn. Giống H9 thể hiện sự tối ưu khi t tỷ lệ o nhất, nhi u

46

kh n ng y l giống ng l i giữ giống ng n i M8 v giống m h nh HR9 n n

m t số ưu th nhất ịnh trong sự ti p nh n gen. H i giống n i VH1 v M8 vẫn

thể hiển ti m n ng m nh khi tỷ lệ t o m s o huyển gen kh ng thấp h n qu

nhi u. Tuy nhi n k t qu trong nghi n u n y tỷ lệ t o m s o thu ượ thấp

h n so với k t qu nghi n u huyển gen kh ng s u với ng l n lượt l

73% v 78,9% 64,43 tư ng ng với ng M8, VH1 v H9 [5] . Nguy n

nh n thể l o ấu trú h i gen kh nh u ẫn n kh n ng ti p nh n ũng

sự kh iệt.

Mỗi m s o huyển gen thường ượ ph t triển th nh 1 n 3 h i ( h y u l

1 h i) n u húng vẫn ti p t sống s t ở gi i o n h n l ti p theo. Ph n ng

lo i m nu i ấy ể h nh th nh h i ph thu v o kiểu gen [28, 64]

ưới sự i u khiển rất ph t p. o kh ng ph i tất những mẫu m s o kh ng

hygromy in thể ph t triển th nh h i. M t số vẫn t n t i trong m i trường h n

l nhưng kh ng thể ph t triển h i (h nh 9H). Kh n ng t o h i giống

ng VH1, M8 v H9 g n như tư ng ng, sự kh iệt kh ng lớn v ũng kh ng

mang nghĩ v mặt thống k . h n l trong gi i o n n y ũng rất qu n tr ng v

nh n i t khi h i t o r rất kém n u kh ng m ng gen huyển

4.2 Phân tích ằng ph ng ph p sinh học phân tử

Phư ng ph p h n l v ph n t h y huyển gen ằng hất h n l l

phư ng ph p thự hiện, hi ph kh ng o. Tuy nhi n phư ng ph p n y kh ng

thể x ịnh hắ hắn gen n huyển ã ượ ư v o y h y hư , gen

ho t ng h y kh ng. V v y phư ng ph p n y h y u hỉ ể lo i ỏ ớt

những y kh ng m ng gen trong qu n thể t i sinh s u nu i ấy. ể x ịnh rõ

r ng n ph i những ph n t h s u h n ở ấp ph n t .

Theo l thuy t th gen ngo i l i s u khi ượ x m nh p v o thể v t h

thể t n t i ở tr ng th i: (1) tr ng th i t m thời l N tự o; (2) tr ng th i

l u i h n ưới ng m t pl smi l p v thể tự nh n l n; (3) tr ng th i n

ịnh như m t o n N gen v t h v ượ nh n l n theo t o v t h .

Tr ng th i th 3 h nh l tr ng th i mong ợi y huyển gen v t nh n vững

ũng như n ịnh v mặt i truy n n . Tuy nhi n tr ng th i n y ho n to n ph

47

thu v o qu tr nh t i t hợp. Vẫn thể xuất hiện hiện tượng gen trong nh n

v t h kh ng tư ng hợp với gen l khi h ng v o N nh n o vị tr

o n gen l ượ ghép nối nh hưởng n iểu hiện h nh n h y gen

v t h g n . i u n y gi i th h nguy n nh n t i s o số lượng y r ất kh lớn

nhưng k t qu ph n t h P R l i hỉ 7 y ho k t qu ư ng t nh ở h i giống

M8 v H9. Th m h ở giống VH1 kh ng y huyển gen gi ịnh r ất hữu

th n o ư ng t nh với ph n ng P R. Những y ư ng t nh kể tr n ã ượ kiểm

tr ng thời h i ặp m i ể nh n i t sự hiện iện ng thời h i gen: gen

h n l hpt v gen h ipt.

Tuy nhi n k t qu P R ư ng t nh ũng kh ng ng nghĩ với huyển gen th nh

ng, m t số nguy n nh n thể ư r ể gi i th h ho hiện tượng N mặt

trong mẫu ph n t h l : (1) Vi khuẩn A. tumefaciens m ng gen huyển thể n

t n t i trong khối m h y trong gi n o mẫu ph n t h; (2) Gen huyển t n

t i ở ng tự o trong t o hất; (3) Gen huyển kh ng ho t ng h y n i h

kh gen huyển kh ng ượ phi n mã v iểu hiện r protein h n ng sinh

h . o k t qu P R hỉ gi trị ịnh hướng n u khi ph n t h y huyển

gen. Hiện tượng ư ng t nh gi xuất hiện ở h i nguy n nh n u ti n (1) (2) thể

ượ lo i trừ n u mẫu ph n t h tr i qu qu tr nh sinh s n hữu t nh. o , 7 mẫu

ư ng t nh ở th hệ T0 ượ gieo v ti p t ph n t h P R ở th hệ T1. Từ k t qu

ho thấy 7 ng ư ng t nh với k t qu P R ở T0 u cho y iểu hiện ư ng

t nh ở T1.

ể khẳng ịnh l i sự t n t i gen huyển ũng như x ịnh số opy trong

y huyển gen, kỹ thu t l i Southern l kỹ thu t th ng ng v ng tin y. Mặ

ù ph n ng ở Southern lot kh nh y nhưng i hỏi lượng N từ mẫu ph n t h

lớn h n, o phư ng ph p n y tr nh ượ trường hợp ư ng t nh gi o ph n ng

qu nh y như ở phư ng ph p P R. Ngo i r , vị tr hèn v o ng kh

nh u kh ng giống nh u, o sẽ t o ng k h thướ kh nh u s u khi hiện m u,

kh n ng t p nhi m ượ h n h s u khi ph n t h k t qu . K t qu ho thấy rõ

r ng số n opy từng ng y huyển gen ượ hỉ r ở ng 7, kh ng những

th n hỉ r ượ gen n i sinh ở ng ối h ng. i u n y thể ượ gi i

48

th h ởi tư ng ng tư ng ối o gen ipt n i sinh với gen ipt ượ huyển

v o. o mẫu (k h thướ 419k ) thể ắt ặp v o ở gen n i sinh ũng

như gen huyển. Th m v o , pro e s ng trong th nghiệm ượ t ng hợp tr n

khu n s n phẩm P R gen ipt nhưng h t ng hợp kit n y l s ng

những m i ngắn oligonu leoti e ngẫu nhi n (random primer). o , pro e ượ

t o th nh kh ng ho n to n l những o n với k h thướ 419bp m những o n

k h thướ é h n (tùy v o m i ngẫu nhi n), t ng kh n ng ắt ặp với gen ipt

n i sinh. Tuy nhi n gen n i sinh thể ng nh n r ởi tất mẫu u xuất

hiện ng n i sinh với ùng k h thướ . opy gen huyển ượ gắn v o

những vị tr kh nh u n n s u khi to n genome ượ x l với enzyme h n h

ũng sẽ những k h thướ kh nh u. Hiện tượng n opy ùng k h

thướ kh n ng x y r nhưng với tỷ lệ rất thấp.

4.3 Đ nh gi s ộ i u hiện ch u hạn c cây con ở đi u iện phòng thí nghiệm

Như ã p ở ph n tr n, mặ ù gen huyển v o th nh ng nhưng vẫn

kh n ng gen kh ng ượ phi n mã h y ị h mã. H y n i h kh gen t n

t i ưới ng gen im lặng (silen e gen) v kh ng iểu hiện r protein h n ng

sinh h . iểu hiển gen huyển thường li n qu n n số n opy huyển v o

th nh ng [52]. Số lượng opy thấp sẽ kh n ng iểu hiện n vững h n so với

y huyển gen số n opy o [92]. Theo Qingr n Kong v ng sự th số

lượng opy ng lớn sẽ ẫn n hiện tượng gen k m hãm h iểu hiện

nhau [56]. N u nhi u n opy ng thời gắn v o ùng m t vị tr thể g y r sự

ất ho t (tr nsgene silen ing). Tuy nhi n ối với phư ng ph p huyển gen th ng

qu vi khuẩn Agrobacterium th i u n y rất hi m khi x y r [90]. Nhưng g n y,

Yuexing W ng v ng sự khi nghi n u sự iểu hiện số lượng opy kh nh u

nh hưởng n hi u i h t l i hỉ r k t qu ngượ l i, nghĩ l số lượng opy

ng lớn th hi u i h t ng t ng l n [100]. H y trong nghi n u

Hernandez tr n u tư ng hỉ r rằng gen gfp iểu hiện n m o nhất ở

những mẫu r h số n copy cao nhất [51]. Trong th nghiệm n y th ng

CM8.I.8.4 mang 2 copy. Ngo i số lượng opy nh hưởng n m iểu hiện

gen th vị tr gen ư hèn v o ũng ng v i tr nhất ịnh (position effe t). Gen

49

huyển ượ hèn v o vị tr kh nh u tr n ùng m t nhi m sắ thể ũng thể

những iểu hiện kh nh u, hiện tượng n y u ti n ượ qu n s t tr n ru i giấm

v s u n y tr n nhi u ối tượng kh [18].

Th ng thường phư ng ph p huyển gen ằng Agrobacterium ho k t qu với

số n opy thấp [105]. Tuy nhi n từ k t qu Southern lot ho thấy số n opy

ng kh o (từ 1-5 copy). H n nữ , kh n ng t o thể ng hợp tư ng ối

kh kh n o giống ng M8 v H9 kho ng h tr ờ v phun r u ( SI) kh

i, tự th ắt u rất kh ti n h nh h y hỉ ti n h nh ượ uy nhất m t l n. o

, th nghiệm nh gi s iểu hiện hịu h n tr n y on ở i u kiện ph ng th

nghiệm ượ ti n h nh ể i nh n t ng qu n v kh n ng iểu hiện gen

huyển trong i u kiện thự t .

ùng với gi i o n r ho th gi i o n y on ũng l m t trong những thời

kỳ mẫn m nhất ối với i u kiện kh h n [12].

Trong qu tr nh nu i ấy m ũng như h n l ể r y huyển gen, những

y kiểu h nh ất thường ượ ghi nh n rất lớn. i u n y ặt r nghi vấn

promoter S RK k h ho t sự iểu hiện gen ipt trong suốt qu tr nh t i sinh. Tuy

nhi n, khi th nh gi với i u kiện tưới nướ y , ng huyển gen v ối

h ng g n như kh ng sự kh iệt n o. i u n y hững tỏ promoter S RK

kh ng k h ho t trong i u kiện nh thường. Những ất thường ượ ghi nh n

trong qu tr nh nu i ấy m thể o m t số nguy n nh n kh . Hu Qin v ng

sự ũng thu nh n k t qu tư ng tự tr n ối tượng l khi s ng ùng ấu trú

pSARK:IPT [78].

K t qu ho thấy iểu hiện ng huyển gen kh ng th t sự rõ r ng, sự

kh iệt n u số u kh ng m ng nghĩ thống k (6/7 ng). Ri ng hỉ

ng M8.I.8.4 l iểu hiện sự kh iệt. Th ng thường ở ng , khi hịu t ng

h n h n t o y ị t n thư ng ng thời sự sinh trưởng v ph t

triển ũng ị h n h [31]. i u n y kéo theo hi u o y h y hi u i r ũng ị

h n h theo. Trong nghi n u n y giống CM8.I.8.4 hi u o y o h n so

với ối h ng M8 ở m nghĩ tuy nhi n hi u i r l i thấp h n so với

ối h ng. i u n y thể ượ gi i th h o nh hưởng sự t h t ytokinin

50

trong r g y ng h v k m hãm sự kéo i r [44, 99]. i v ng sự khi nghi n

u huyển gen ipt v o y ã y n th o ũng k t qu tư ng tự, tuy nhi n nh

hưởng n y hỉ xuất hiện trong gi i o n u, ở những gi i o n s u y huyển gen

ph t triển nh thường như y ối h ng [24]. ytokinin n t ng i u

hỉnh sự sinh trưởng r kh nh u với hệ thống r h nh ũng như r hùm [20].

Kh n ng hịu h n tốt h y kh ng n ph thu v o kh n ng t o sinh khối y.

Như Rivero v o n m 2007 v Peleg v o n m 2011 ã ghi nh n tr n h i ối tượng

thuố l v lú nướ , trong i u kiện thi u nướ , những y huyển gen kh n ng

hịu h n tốt h n sẽ kh n ng t o sinh khối tốt h n so với ối h ng kh ng

huyển gen [74, 84]. ể kiểm tr sinh khối thu ượ trong th nghiệm n y, tr ng

lượng tư i ũng như tr ng lượng kh th n v r u ượ so s nh với ối

h ng. Ngo i trừ tr ng lượng kh r o h n nhưng kh ng nghĩ thống k ,

hỉ số n l i ng CM8.I.8.4 u o h n so với ối h ng CM8.

51

Ch ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH

5.1 K t uận

Kh o s t v nh gi kh n ng i n n p gen ipt v o ng ng VH1, M8

v H9 th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens ướ u thu ược m t số k t qu :

Kh n ng sống s t qu ng nu i ấy, h nh th nh m s o, t i sinh từ ph i non

c ba giống l kh ng u. S u qu tr nh h n l thu ượ H9 l giống t hiệu

suất bi n n p cao nhất 0.03%, ti p n l M8 0.015%.

K t qu thu ượ ã ược kiểm tra bằng phư ng ph p P R v Southern lot

với 3 ng M8 v 4 ng H9 u cho k t qu ư ng t nh.

ướ u nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on thu ượ ng

CM8.I.8.4 k t qu kh iệt so với ối h ng

5.2 Ki n ngh

Ti p t nh gi t nh n vững ng ng huyển gen thu ượ ở

th hệ s u

Ti p t kh o s t t ng gen ipt l n sự sinh trưởng v ph t triển y:

kiểu h nh…

nh gi m iểu hiện gen ipt như: X ịnh h m lượng ytokinin

ng huyển gen, h m lượng iệp l , proline…

52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài iệu ti ng Việt

1. 2.

10.

11.

12.

13.

14.

ỗ Tất Lợi. (2004). Những y thuố v vị thuốc Việt Nam. NXB Y h c. 220. L Tr n nh, L Thị Mu i. (1998), Ph n l p gen v h n ng hống chịu ngo i c nh bất lợi ở y lú , NX i H c Quố Gi , H N i. Nguy n V n ng v s .(2009). Nghi n u kh n ng ph t sinh m s o ph i h v m c t i sinh y ho n hỉnh từ ph i non a m t số ng ng Việt Nam. T p h ng nghệ sinh h c 7(4): 1-8. Nguy n V n ng v s. (2010). K t qu ướ u trong nghi n u chuyển gene kh ng s u Cry 1Ac v o ph i non ng ng m h nh. T p h ng nghệ Sinh h c 7(4): 1-8. Nguy n V n ng v s. (2010). Nghi n u kh n ng ti p nh n gene kh ng s u CryIAc th ng qu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens c a m t số ng ng Việt Nam. T p h Khoa h v ng nghệ N ng nghiệp, Số 6, 36-41. Nguy n V n ng v s.(2013). Nghi n u kh n ng ti p nh n gene kh ng h n v o m t số ng ng h n l th ng qu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. T p h Kho h v ng nghệ N ng nghiệp, Số 2, 61-67. Ph m Thị L Thu .(2007). Nghi n u x y ựng hệ thống t i sinh từ ph i non v x ịnh phư ng ph p huyển gen th h hợp ở ng . Lu n n ti n sĩ Sinh h c. Viện ng nghệ Sinh h c, Viện Khoa h v ng nghệ Việt Nam. Ph m Thị L Thu, L Huy H m, ỗ N ng Vịnh. (2003). nh gi kh n ng sinh trưởng, ph t triển v t i sinh y từ ph i non h i ng ng nh p n i HR8, HR9 trong i u kiện Việt Nam. T p h N ng nghiệp v Ph t triển n ng th n, số 9, 726- 729. Ph m Thị L Thu, L Huy H m, ỗ N ng Vịnh. (2005). Ảnh hưởng c a m t số y u tố n hiệu qu chuyển gen ở ng th ng qu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. T p h N ng nghiệp v Ph t triển N ng th n, số 10, 28-31. Ph m Thị L Thu, L Huy H m, ỗ N ng Vịnh. (2006). Ho n thiện quy tr nh huyển gen ở ng ằng súng ắn gen. T p h N ng nghiệp v Ph t triển N ng th n, số 8, 31-35. Ph m Thị L Thu v CS. (2013). Nghi n u huyển gen kh ng s u v o ph i hợp t hư trưởng th nh ng ng l i F1. T p h kho h v ng nghệ. số 2, 55-60. Ph m Thị Th nh Nh n, hu Ho ng M u, Nguy n Thị T m. (2007). M t số ặ trưng hịu h n m t số giống ng n p (Zea may L.) ị phư ng ở gi i o n m v y non. o o kho h t i h i nghị to n quố 2007- Những vấn nghi n u n trong kho h sự sống, Nxn KH KT, 784-787. Ph m Xu n H i. (2011). Ph n l p v thi t k ve tor m ng gen i u khiển t nh hịu h n ph c v ng t t o giống y tr ng chuyển gen. Thư viện B N ng nghiệp v PTNT- DT20101456. L Thị Thu Hi n. (2003). T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng", Lu n v n Ti n sĩ sinh h c, Viện ng nghệ sinh h c, H N i.

Tài iệu ti ng Anh

15.

16.

Akiyoshi, D. E., Klee, H., Amasino, R. M., Nester, E. W., & Gordon, M. P. (1984). T- DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 81(19), 5994-5998. Al-Abed, D., Madasamy, P., Talla, R., Goldman, S., & Rudrabhatla, S. (2007). Genetic Engineering of Maize with the DREB1A/Gene Using Split-Seed Explants. Crop Science, 47(6), 2390-2402.

53

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36. 37.

Al-Abed, D., Rudrabhatla, S., Talla, R., & Goldman, S. (2006). Split-seed: a new tool for maize researchers. Planta, 223(6), 1355-1360. Alberts, B., Johnson, A., Lewis,J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002). Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science. ISBN 0-8153-4072-9. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., & Thompson, W. F. (2006). A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide. Nature protocols, 1(5), 2320-2325. Aloni, R., Aloni, E., Langhans, M., & Ullrich, C. I. (2006). Role of cytokinin and auxin in shaping root architecture: regulating vascular differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Annals of Botany, 97(5), 883-893. Andrews, J. (1993). Diffusion of Mesoamerican food complex to Southeastern Europe. Geographical Review, 194-204. Armstrong, C. L., & Green, C. E. (1985). Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline. Planta,164(2), 207-214. Assem, S. K., Hussein, E. H., Hussein, H. A., & Basry, M. (2009). Genetic transformation of the Nicotiana protein kinase (NPK1) gene confers osmotic tolerance in Egyptian maize. Australian journal of basic and applied sciences,3(2), 828-835. Bai, L. J., Ye, C. J., Lu, J. Y., Yang, D. E., Xue, H., Pan, Y.,Cao, P.X., Wang, B., Liu, M. (2009). ipt gene transformation in Petunia by an Agrobacterium mediated method. Journal of Immuno ss y n Immuno hemistry®, 30(2), 224-231. änziger, M. (2000). Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize: from theory to practice. Cimmyt. Barry, G. F., Rogers, S. G., Fraley, R. T., & Brand, L. (1984). Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, 81(15), 4776-4780. Beadle, George W. (1939), "Teosinte and the origin of maize", Journal of Heredity. 30(6), 245-247. Binott, J. J., Songa, J. M., Ininda, J., Njagi, E. M., & Machuka, J. (2008). Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids through somatic embryogenesis. African Journal of Biotechnology, 7(8). 981-987. ol ños, J., E me es, G. O. (1993). Eight cycles of selection for drought tolerance in lowland tropical maize. I. Responses in grain yield, biomass, and radiation utilization. Field Crops Research, 31(3), 233-252. u hm nn, I., M rner, F. J., S hrö er, G., W ffens hmi t, S., S hrö er, J. (1985). Tumour genes in plants: T-DNA encoded cytokinin biosynthesis. The EMBO journal, 4(4), 853. Camacho, R. G., & Caraballo, D. F. (1994). Evaluation of morphological characteristics in Venezuelan maize (Zea mays L.) genotypes under drought stress. Scientia Agricola, 51(3), 453-458. Retrieved November 03, 2015. Chen, C. M. (1997). Cytokinin biosynthesis and interconversion. Physiologia Plantarum, 101(4), 665-673. Chen, L., Cong, Y., He, H., & Yu, Y. (2014). Maize (Zea mays L.) transformation by Agrobacterium tumefaciens infection of pollinated ovules.Journal of biotechnology, 171, 8- 16. Coe, E. H., & Sarkar, K. R. (1966). Preparation of nucleic acids and a genetic transformation attempt in maize. Crop Science, 6(5), 432-435. Delatorre, C. A., Cohen, Y., Liu, L., Peleg, Z., & Blumwald, E. (2012). The regulation of the SARK promoter activity by hormones and environmental signals. Plant science, 193, 39-47. Doebley, J. (2004). The genetics of maize evolution. Annu. Rev. Genet., 38, 37-59. Dowsell, C. R., Paliwal, R. L., & Cantrell, R. P. (1996). Maize in the third world. Westview Press.

54

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

Du, W. P., Xu, L. Y., Yu, G. R., Wang, Y., & Zhong, C. S. (2007). System Establishment of Maize Immature Embryos Culture in Vitro [J]. Journal of Maize Sciences, 2, 019. Enr quez-O reg n, G. ., V zquez-P r n, R. I., Prieto-Samsonov, D. L., Gustavo, A., & Selman-Housein, G. (1998). Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation.Planta, 206(1), 20-27. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., & Basra, S. M. A. (2009). Review article Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. 29(1), 185-212. Fu, Y., Ding., Liu, X., Sun, C., Cao, S., Wang, D., He, S., Wang, X., Li, L., Tian, W. (1998). Rice transformation with a senescence-inhibition chimeric gene, Chin Sci Bull 43: 1810- 1815. Galinat, W. C., Sprague, G. F., & Dudley, J. W. (1988). The origin of corn. Corn and corn improvement. Third edition., 1-31. Gan, S., & Amasino, R. M. (1997). Making sense of senescence (molecular genetic regulation and manipulation of leaf senescence). Plant Physiology,113(2), 313. Gan, S., & Amasino, R. M. (1995). Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270(5244), 1986-1988. Gepstein, S., & Thimann, K. V. (1981). The role of ethylene in the senescence of oat leaves. Plant Physiology, 68(2), 349-354. Gorji, A. H., Zolnoori, M., Jamasbi, A., & Zolnoori, Z. (2011, August). In vitro plant generation of tropical maize genotypes. In International Conference on Environmental, Biomedical and Biotechnology IPCBEE (Vol. 16, pp. 52-59). Green, C. E., & Phillips, R. L. (1975). Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science, 15(3), 417-421. Ha, S., Vankova, R., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., & Tran, L. S. P. (2012). Cytokinins: metabolism and function in plant adaptation to environmental stresses. Trends in plant science, 17(3), 172-179. Hajouj, T., Michelis, R., & Gepstein, S. (2000). Cloning and Characterization of a Receptor-Like Protein Kinase Gene Associated with Senescence. Plant Physiology, 124(3), 1305–1314. Hansen, G. (2000). Evidence for Agrobacterium-induced apoptosis in maize cells. Molecular plant-microbe interactions, 13(6), 649-657. Hernandez-Garcia, C. M., Bouchard, R. A., Rushton, P. J., Jones, M. L., Chen, X., Timko, M. P., & Finer, J. J. (2010). High level transgenic expression of soybean (Glycine max) GmERF and Gmubi gene promoters isolated by a novel promoter analysis pipeline. BMC plant biology, 10(1), 237. Hernandez-Garcia, C. M., Martinelli, A. P., Bouchard, R. A., & Finer, J. J. (2009). A soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression in transgenic soybean. Plant cell reports, 28(5), 837-849. Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T., & Kumashiro, T. (1996). High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature biotechnology, 14(6), 745-750. J ku ekov , M., Pret'ov , ., O ert, . (2011). Som ti em ryogenesis n pl nt regeneration from immature embryo induced callus of maize (Zea mays L.). Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 1(4): 478-487. Kato, A. (1988), Cytological Classification of Maize Race Populations and Its Potential Use. Preeding of Global Maize Germplasm Worshop. Pp: 106-117. Kong, Q., Wu, M., Huan, Y., Zhang, L., Liu, H., Bou G., Lou, Y.,Mu, Y., Liu, Z. (2009) Transgene Expression Is Associated with Copy Number and Cytomegalovirus Promoter Methylation in Transgenic Pigs. PLoS ONE 4(8). Kudoyarova, G. R., Vysotskaya, L. B., Cherkozyanova, A., & Dodd, I. C. (2007). Effect of partial rootzone drying on the concentration of zeatin-type cytokinins in tomato (Solanum lycopersicum L.) xylem sap and leaves. Journal of Experimental Botany, 58(2), 161-168.

55

58.

59.

60.

61.

62.

63.

Kuppu, S., Mishra, N., Hu, R., Sun, L., Zhu, X., Shen, G., Blumwald, E., Payton, P., Zhang, H. (2013). Water-deficit inducible expression of a cytokinin biosynthetic gene IPT improves drought tolerance in cotton. PLoS ONE8 (5):e64190. Lai, J., & Messing, J. (2002). Increasing maize seed methionine by mRNA stability. The Plant Journal, 30(4), 395-402. Lee, H., & Zhang, Z. J. (2014). Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) immature embryos. In Cereal Genomics . Humana Press, 273-280. Li, Y., Hagen, G., & Guilfoyle, T. J. (1992). Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs.Developmental biology, 153(2), 386-395. Liu, S., Wang, X., Wang, H., Xin, H., Yang, X., Yan, J., Li, J., Tran, L. S. P., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K.,Qin, F. (2013). Genome-Wide Analysis of ZmDREB Genes and Their Association with Natural Variation in Drought Tolerance at Seedling Stage of Zea mays L. PLoS Genetics, 9(9), e1003790. Liu, X., Huang, B., Banowetz, G. (2002). Cytokinin effects on creeping bentgrass responses to heat stress. Crop Science, 42(2), 457-465.

64. Machuka, J., Oduor, R., Runo, S., Adam, R., Matheka, J., Bedada, L., Seth, M., Kuria, E.,

Masiga, C., Mugoya, C. (2010). Genetic engineering of maize for drought tolerance in Eastern and Central Africa. Kenyatta University and AGROBIO- ASARECA, 1-14. 65. McCabe, M. S., Mohapatra, U., Schepers, F., Van Dun, K., Power, J. B., Davey, M.

(1998). Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene, J. Exp. Bot. Suppl., 49:49.

66. McGaw, B. A., & Burch, L. R. (1995). Cytokinin biosynthesis and metabolism. In Plant

Hormones. Springer Netherlands, 98-117

67. Medford, J. I., Horgan, R., El-Sawi, Z., & Klee, H. J. (1989). Alterations of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene. The Plant Cell, 1(4), 403-413.

68. Mok, D. W., & Mok, M. C. (2001). Cytokinin metabolism and action. Annual review of

plant biology, 52(1), 89-118.

69. Muthukuda, D. H., & Bingham, I. J. (2004), Performance of maize (Zea mays L.)

70.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

genotypes during post-germination drought, In The 8th Asian Regional Maize workshop, Bangkok – Thai Lan. CIMMYT Mexico, 427-440. Naqvi, S .(1995). Plant/crop hormones under stressful conditions. Pessarakli M Ed, Handbook of plant and crop physiology, NewYork, Marcel Dekker Inc,645–650. Nelson, D. E., Repetti, P. P., Adams, T. R., Creelman, R. A., Wu, J., Warner, D. C., Anstrom, D.C., Bensen, R.J., Castiglioni, P.P., Donnarummo, M.G., Hinchey, B.S., Kumimoto, R.W., Maszle, D.R., Canales, R.D., Krolikowski, K.A., Dotson, S.B., Gutterson, N., Ratcliffe, O.J., & Heard, J. E. (2007). Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres.Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(42), 16450-16455 Nguyen, K. H. T., Kane, E. J., & Dix, P. J. (1998). Hormonal regulation of senescence in cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis)(abstract no. 96).Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century, 164. Ordish, G., & Hyams, E. (1996). The last of the Incas: the rise and fall of an American empire. New York: Barnes & Noble. Peleg, Z., Reguera, M., Tumimbang, E., Walia, H., & Blumwald, E. (2011). Cytokinin‐mediated source/sink modifications improve drought tolerance and increase grain yield in rice under water‐stress. Plant Biotechnology Journal,9(7), 747-758. Phillips, G. C. (2004). In vitro morphogenesis in plants-recent advances. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 40(4), 342-345. Pingali, P. L., & Pandey, S. (1999). Meeting world maize needs: Technology opportunities and priorities for the private sector. CIMMYT, 2000.

56

77.

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

91.

92.

Piperno, D. R., Ranere, A. J., Holst, I., Iriarte, J., & Dickau, R. (2009). Starch grain and phytolith evidence for early ninth millennium BP maize from the Central Balsas River Valley, Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(13), 5019-5024. Qin, H., Gu, Q., Zhang, J., Sun, L., Kuppu, S., Zhang, Y., ... & Zhang, H. (2011). Regulated expression of an isopentenyltransferase gene (IPT) in peanut significantly improves drought tolerance and increases yield under field conditions. Plant and Cell Physiology, 52(11), 1904-1914. Raineri, J., Wang, S., Peleg, Z., Blumwald, E., & Chan, R. L. (2015). The rice transcription factor OsWRKY47 is a positive regulator of the response to water deficit stress. Plant molecular biology, 1-1. Ranere, A. J., Piperno, D. R., Holst, I., Dickau, R., & Iriarte, J. (2009). The cultural and chronological context of early Holocene maize and squash domestication in the Central Balsas River Valley, Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(13), 5014-5018. Reguera, M., Peleg, Z., Abdel-Tawab, Y. M., Tumimbang, E. B., Delatorre, C. A., & Blumwald, E. (2013). Stress-induced cytokinin synthesis increases drought tolerance through the coordinated regulation of carbon and nitrogen assimilation in rice. Plant physiology, 163(4), 1609-1622. Rezaeieh, K. A., & Eivazi, A. (2011). Evaluation of morphological characteristics in five Persian maize (Zea mays L.) under drought stress.African Journal of Agricultural Research, 6(18), 4409-4411. Richmond, A. E., Lang, A. (1957). Effect of kinetin on protein content and survival of detached xanthium leaves. Science 125: 650–651. Rivero, R. M., Kojima, M., Gepstein, A., Sakakibara, H., Mittler, R., Gepstein, S., & Blumwald, E. (2007). Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(49), 19631-19636. Robson, P. R., Donnison, I. S., Wang, K., Frame, B., Pegg, S. E., Thomas, A., & Thomas, H. (2004). Leaf senescence is delayed in maize expressing the Agrobacterium IPT gene under the control of a novel maize senescence‐enhanced promoter. Plant Biotechnology Journal, 2(2), 101-112. Roney, J. (2009). The Beginning of Maize Agriculture. Archaeology Southwest. Vol23. No1 Winter, 4. Salinger, M. J., Sivakumar, M. V. K., & Motha, R. (2005). Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary and recommendations. Climatic Change, 70(1-2), 341-362. Samyn-Petit, B., Gruber, V., Flahaut, C., Wajda-Dubos, J. P., Farrer, S., Pons, A., ... & Delannoy, P. (2001). N-glycosylation potential of maize: the human lactoferrin used as a model. Glycoconjugate journal, 18(7), 519-527. Samyn‐Petit, B., Wajda Dubos, J. P., Chirat, F., Coddeville, B., Demaizieres, G., Farrer, S., ... & Delannoy, P. (2003). Comparative analysis of the site‐specific N‐glycosylation of human lactoferrin produced in maize and tobacco plants. European Journal of Biochemistry, 270(15), 3235-3242. Schubert, D., Lechtenberg, B., Forsbach, A., Gils, M., Bahadur, S., & Schmidt, R. (2004). Silencing in Arabidopsis T-DNA transformants: the predominant role of a gene-specific RNA sensing mechanism versus position effects. The Plant Cell, 16(10), 2561-2572. Sekhon, R. S., Lin, H., Childs, K. L., Hansey, C. N., Buell, C. R., de Leon, N., & Kaeppler, S. M. (2011). Genome‐wide atlas of transcription during maize development. The Plant Journal, 66(4), 553-563. Shou, H., Frame, B. R., Whitham, S. A., & Wang, K. (2004). Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation. Molecular Breeding, 13(2), 201-208.

57

93.

94.

95.

96.

97.

98.

99.

Smart, C. M. (1994). Tansley Review No. 64. Gene expression during leaf senescence. New Phytologist, 419-448. Smart, C. M., Scofield, S. R., Bevan, M. W., & Dyer, T. A. (1991). Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production in Agrobacterium. The Plant Cell, 3(7), 647-656. Southern, E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of molecular biology,98(3), 503-517. Thorpe, T. A. (1994). Morphogenesis and regeneration. In Plant cell and tissue culture . Springer Netherlands, 17-36. Tilney-Bassett, R. A. E. (1984). The genetic evidence for nuclear control of chloroplast biogenesis in higher plants. In Ellis, R. J. (ed.) Chloroplast Biogenesis, Society for Experimental Biology Seminar Series 21, Cambridge University Press, Cambridge, pp. 13– 50. Vavilov, N.I (1926). Studies on the Combining Ability of CIMMYT Gemplas. CIMMYT Rearch Highlight, 24-33. Verdonk, J. C., Shibuya, K., Loucas, H. M., Colquhoun, T. A., Underwood, B. A., & Clark, D. G. (2008). Flower‐specific expression of the Agrobacterium tumefaciens isopentenyltransferase gene results in radial expansion of floral organs in Petunia hybrida. Plant biotechnology journal, 6(7), 694-701.

100. Wang, Y., Xiong, G., Hu, J., Jiang, L., Yu, H., Xu, J., ... & Ye, W. (2015). Copy number

variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice. Nature genetics, 47(8), 944-948.

101. Westgate, M. E., & Boyer, J. S. (1986). Reproduction at low and pollen water potentials in

maize. Crop Science, 26(5), 951-956.

102. Wilkes, Garrison. (2004). "Chapter 1.1 Corn, strange and marvelous: but is a definitive origin known?". In Smith, E. C. .; Runge; etr n, J vier. orn: Origin, History, Technology, and Production. Wiley. pp. 3–63.

103. Wingler, A., Von Schaewen, A., Leegood, R. C., Lea, P. J., & Quick, W. P. (1998).

Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and light effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase. Plant Physiology, 116(1), 329-335.

104. Yang, J., Zhang, J., Wang, Z., Zhu, Q., & Liu, L. (2002). Abscisic acid and cytokinins in

the root exudates and leaves and their relationship to senescence and remobilization of carbon reserves in rice subjected to water stress during grain filling. Planta, 215(4), 645- 652.

106.

107.

108.

105. Xinping, Y. I., & Deyue, Y. U. (2006). Transformation of multiple soybean cultivars by infecting cotyledonary-node with Agrobacterium tumefaciens. African Journal of Biotechnology, 5(20). Zhang, L. J., Zhao, C. H., & Ge, C. (2008). Regeneration system and influencing factors of maize. J. Maize Sci, 16(2), 77-79. Zhao, Z. Y., Gu, W., Cai, T., Tagliani, L., Hondred, D., Bond, D., ... & Pierce, D. (2002). High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding, 8(4), 323-333. Zhu, Y., Zhao, F., & Zhao, D. (2011). Regeneration and transformation of a maize elite inbred line via immature embryo culture and enhanced tolerance to a fungal pathogen Exserohilum turcicum with a balsam pear class I chitinase gene. African Journal of Agricultural Research, 6(7), 1923-1930.

58

PH L C

Ph c : Th nh ph n m i trường huyển gen

IM-AS 10ml

N6 salt, 100X

1ml

CCM 10ml 1ml

ReM 10ml 1ml

EcM 10ml 1ml

SeM RM 10ml 1ml

10ml 1ml

N6VTM, 1000X MS Salts,100X MS VTM, 1000X Glycine (0,2g/500ml)

5ml

Sucrose (g/l)

68.5g

30g

60g

Glucose (g/l)

36g

L-proline (g/l)

0,7g

Mes (g/l)

0,5g

2,4D (mg/l)

1,5mg

Gellan-gum (g/l)

5,5-6

8 – 9

100mg

Agar (g/l) Myo-inositol (mg/l) BAP of Kinetin (1.67 mg/ml)

1 ml

AS (200mM)

1 ml

5,8

5,2

5,8

5,8 0,85 mg

10 mg

1 ml

AgNO3 Cefotaxim ( 250mg/ml) Hygromycine (5mg/ml)

1ml

59

Ph c : Th nh ph n m i trường

50 ml

AB salts, 20X

Components H20 MES pH 5.6 w/NaOH

0.1L 80ml 0.39g

NH4Cl MgSO4. 7H20 KCl CaCl2 FeSO4.7H2O Filter sterilize/40C AB buffer, 20X

1.5g 5 ml 5 ml 2 ml

Bacto-difco agar AB salts, 20X AB buffer, 20X Glucose 0.25g/ml Appropriate antibiotics for Agrobacterium

1g 0.3g 0.15g 0.01g 0.0025g 3g 1g

12.5 g

K2HPO4 NaH2PO4 Filter sterilize/40C Stock C Glucose Filter sterilize/40C

Ph c : Th nh ph n ung ị h ệm T

Thành ph n 10% CTAB 1M Tris-HCL (pH 8.0) 0.5M EDTA(pH 8.0) 5M NaCl

1 2 3 4 5 H2O 5

200ml 40ml 20ml 8ml 56ml 76ml 4 ml

100ml 20ml 10ml 4ml 28ml 38ml 2 ml

50ml 10ml 5ml 2ml 14ml 19ml 1ml

β-mercaptoethanol – b sung sau ùng trong t hút

Ph c : Ph n ti h thống k i n n p gen

Chú th h: i n 1,2,3 l n lượt l giống VH1, M8 v H9

Descriptives

95% Confidence Interval

for Mean

Std. Std. Lower Upper

N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum

1 Ty le phoi song sot 14 36.50 4.274 1.142 34.03 38.97 30 43

2 10 41.93 4.384 1.386 38.79 45.06 34 48

3 8 42.77 2.952 1.044 40.30 45.24 38 47

Total 32 39.76 4.885 .864 38.00 41.52 30 48

60

Ty le mo seo phoi hoa 14 43.95 5.577 1.490 40.73 47.17 1 36 55

chuyen gen 10 39.15 3.633 1.149 36.56 41.75 2 34 45

8 52.63 2.424 .857 50.60 54.65 3 49 57

Total 32 44.62 6.677 1.180 42.21 47.03 34 57

Ty le choi tai sinh 14 36.72 3.115 .832 34.92 38.52 1 32 42

chuyen gen 10 39.58 3.488 1.103 37.08 42.08 2 33 45

3 8 38.04 3.948 1.396 34.74 41.34 33 43

Total 32 37.95 3.558 .629 36.66 39.23 32 45

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

.639 2 29 .535 Ty le phoi song sot

Ty le mo seo phoi hoa 3.477 2 29 .051 chuyen gen

Ty le choi tai sinh chuyen .747 2 29 .483

gen

ANOVA

Mean

Sum of Squares df Square F Sig.

Ty le phoi song sot Between Groups 268.226 2

Within Groups

134.113 8.249 .001 16.257 Total 471.459 29 739.685 31

Ty le mo seo phoi hoa chuyen gen Between Groups 817.988 2

Within Groups

408.994 21.022 .000 19.456 Total 564.211 29 1382.199 31

Ty le choi tai sinh chuyen gen Between Groups 47.744 2

Within Groups

23.872 2.008 .152 11.887 Total 344.727 29 392.470 31

61

Multiple Comparisons

Tukey HSD

95% Confidence Interval

(I) (J) Mean Difference (I- Std. Lower Upper

Dependent Variable Giong Giong J) Error Sig. Bound Bound

Ty le phoi song sot 1 2 -5.427* 1.669 .008 -9.55 -1.30

3 -6.270* 1.787 .004 -10.68 -1.86

2 1 5.427* 1.669 .008 1.30 9.55

3 -.843 1.913 .899 -5.57 3.88

3 1 6.270* 1.787 .004 1.86 10.68

2 .843 1.913 .899 -3.88 5.57

Ty le mo seo phoi hoa chuyen 1 2 4.791* 1.826 .036 .28 9.30

gen 3 -8.682* 1.955 .000 -13.51 -3.85

2 1 -4.791* 1.826 .036 -9.30 -.28

3 -13.473* 2.092 .000 -18.64 -8.31

3 1 8.682* 1.955 .000 3.85 13.51

2 13.473* 2.092 .000 8.31 18.64

Ty le choi tai sinh chuyen gen 1 2 -2.858 1.428 .130 -6.38 .67

3 -1.320 1.528 .667 -5.09 2.45

2 1 2.858 1.428 .130 -.67 6.38

3 1.537 1.635 .620 -2.50 5.58

3 1 1.320 1.528 .667 -2.45 5.09

2 -1.537 -5.58 2.50

1.635 .620 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

62

Descriptives Tan so chuyen gen gia dinh

95% Confidence Interval for Mean

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum

1 14 .12 .043 .012 .10 .15 0 0

2 10 .20 .053 .017 .16 .23 0 0

3 8 .33 .081 .029 .26 .40 0 0

32 .20 .102 .018 .16 .23 0 0

Total

Test of Homogeneity of Variances

Tan so chuyen gen gia dinh

Levene Statistic df1 df2 Sig.

.527 2 29 .596

ANOVA

Tan so chuyen gen gia dinh

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .224 2 34.033 .000

Within Groups .095

.112 .003 .320 29 31

Total

Multiple Comparisons Tan so chuyen gen gia dinh

Tukey HSD

95% Confidence Interval (I) (J) Mean Difference

Giong Giong (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

1 -.13 -.02 2 -.075* .024 .011

-.27 -.15 3 -.210* .025 .000

2 .02 .13 1 .075* .024 .011

-.20 -.07 3 -.135* .027 .000

3 .15 .27 1 .210* .025 .000

.07 .20 2 .135* .027 .000

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

63

Ph c 6: Ph n t h thống k nh gi kh n ng hịu h n

Nh lưới số 1

hú th h: i n 1,2,3,4,5 l n lượt l ng ph n t h: CH9.I.5.1, CH9.I.6.5, CH9.I.7.2, CH9.I.15.1 v H9

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean

Std. N Mean Deviation Std. Error Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound

1 PH 9 31.1667 6.64267 2.21422 26.0607 36.2727 23.50 40.50

2 9 31.7778 6.70406 2.23469 26.6246 36.9310 24.00 46.00

3 3 33.3333 2.02073 1.16667 28.3136 38.3531 31.50 35.50 Chiều cao ân ều kiện ây h n

4 9 30.5000 4.16083 1.38694 27.3017 33.6983 25.00 38.50

5 9 35.3333 5.59576 1.86525 31.0321 39.6346 26.50 44.00

Total 39 32.2821 5.70987 .91431 30.4311 34.1330 23.50 46.00

1 LRL 9 38.1111 5.04218 1.68073 34.2353 41.9869 30.50 47.50

2 9 35.3889 7.65987 2.55329 29.5010 41.2768 23.00 46.00

3 3 37.3333 5.13160 2.96273 24.5857 50.0809 33.00 43.00 Chiề dà rễ dà n ất ều kiện ây n

4 9 36.0556 6.14636 2.04879 31.3310 40.7801 24.00 44.50

5 9 39.8889 3.41667 1.13889 37.2626 42.5152 35.00 44.50

Total 39 37.3590 5.69851 .91249 35.5117 39.2062 23.00 47.50

1 FWS 9 1.21844 .335696 .111899 .96041 1.47648 .796 1.801

2 9 1.15878 .285619 .095206 .93923 1.37832 .771 1.654

3 3 1.25833 .152893 .088273 .87853 1.63814 1.144 1.432

Trọng l n ơ ân ều kiện ây h n 4 9 1.37889 .211817 .070606 1.21607 1.54171 1.058 1.684

5 9 1.00200 .141586 .047195 .89317 1.11083 .851 1.297

Total 39 1.19482 .270894 .043378 1.10701 1.28263 .771 1.801

64

.12167 .026693 .008898 .10115 .14218 .083 .160 9 DWS 1

.12056 .026087 .008696 .10050 .14061 .085 .174 9 2

.12933 .003055 .001764 .12174 .13692 .126 .132 3 3

Trọng l n k ô ân ều kiện ây h n .14289 .022116 .007372 .12589 .15989 .102 .173 9 4

.11544 .020082 .006694 .10001 .13088 .091 .143 9 5

Total 39 .12546 .024241 .003882 .11760 .13332 .083 .174

.92233 .254111 .084704 .72701 1.11766 .601 1.360 9 FWR 1

.85300 .179737 .059912 .71484 .99116 .582 1.087 9 2

.92533 .147950 .085419 .55780 1.29286 .788 1.082 3 3

Trọng l n ơ rễ ều kiện ây h n 9 1.00789 .251584 .083861 .81450 1.20127 .573 1.286 4

9 .89033 .219232 .073077 .72182 1.05885 .643 1.281 5

Total 39 .91892 .219304 .035117 .84783 .99001 .573 1.360

.14644 .031989 .010663 .12186 .17103 .095 .194 9 DWR 1

.15400 .029513 .009838 .13131 .17669 .112 .196 9 2

.13733 .020404 .011780 .08665 .18802 .115 .155 3 3

Trọng l n k ô rễ ều kiện ây h n .14944 .054139 .018046 .10783 .19106 .080 .264 9 4

.14922 .034781 .011594 .12249 .17596 .107 .220 9 5

Total 39 .14882 .036203 .005797 .13708 .16056 .080 .264

PH_WW 1 9 4.40000E1 6.878408 2.292803 38.71279 49.28721 37.000 56.000

9 4.56111E1 10.916667 3.638889 37.21982 54.00240 25.500 58.000 2

3 3.96667E1 8.326664 4.807402 18.98209 60.35125 33.000 49.000 3

Chiều cao ân ều kiện ới n ớ ầy ủ 9 3.78889E1 7.423686 2.474562 32.18254 43.59524 31.000 54.000 4

9 4.62778E1 12.316430 4.105477 36.81053 55.74502 34.000 64.500 5

Total 39 4.31538E1 9.678485 1.549798 40.01644 46.29125 25.500 64.500

LRL_WW 1 9 37.5556 6.19700 2.06567 32.7921 42.3190 30.50 49.00

9 31.6667 3.54436 1.18145 28.9422 34.3911 25.50 36.50 2 Chiề dà rễ dà n ất

65

3 3 35.5000 2.29129 1.32288 29.8081 41.1919 33.00 37.50

ều kiện ớ n ớc ầy ủ 4 9 31.8889 5.95177 1.98392 27.3140 36.4638 26.00 45.00

5 9 32.0000 3.21131 1.07044 29.5316 34.4684 27.00 36.50

Total 39 33.4487 5.17559 .82876 31.7710 35.1265 25.50 49.00

FWS_WW 1 1.4367 .31804 .10601 1.1922 1.6811 1.00 1.98 9

2 1.1838 .32931 .10977 .9307 1.4369 .76 1.64 9

3 1.4843 .12552 .07247 1.1725 1.7962 1.34 1.57 3

Trọng l n ơ ân ều kiện ới ầy ủ 4 1.2986 .27868 .09289 1.0843 1.5128 .81 1.72 9

5 1.5297 .34189 .11396 1.2669 1.7925 1.08 2.21 9

Total 39 1.3716 .32164 .05150 1.2673 1.4758 .76 2.21

DWS_WW 1 .1336 .01981 .00660 .1183 .1488 .10 .16 9

2 .1300 .05554 .01851 .0873 .1727 .03 .20 9

3 .1377 .02468 .01425 .0763 .1990 .12 .16 3

Trọng l n k ô ân ều kiện ới ầy ủ 4 .1344 .03150 .01050 .1102 .1587 .08 .18 9

5 .1476 .02712 .00904 .1267 .1684 .10 .19 9

.03 .20 Total 39 .1365 .03420 .00548 .1254 .1476

FWR_WW 1 1.0849 .23978 .07993 .9006 1.2692 .75 1.50 9

2 .8770 .31042 .10347 .6384 1.1156 .21 1.24 9

3 1.2970 .19975 .11533 .8008 1.7932 1.09 1.49 3

Trọng l n ơ rễ ều kiện ới ầy ủ 4 1.0193 .15933 .05311 .8969 1.1418 .83 1.30 9

5 1.1548 .25782 .08594 .9566 1.3530 .82 1.66 9

Total 39 1.0542 .26235 .04201 .9692 1.1393 .21 1.66

DWR_WW 1 .1330 .05016 .01672 .0944 .1716 .08 .21 9

2 .1233 .02542 .00847 .1038 .1429 .08 .17 9

3 .1310 .01952 .01127 .0825 .1795 .11 .15 3

Trọng l n k ô rễ ều kiện ới ầy ủ 4 .1310 .03632 .01211 .1031 .1589 .08 .17 9

66

5 9 .1384 .03393 .01131 .1124 .1645 .09 .19

Total 39 .1314 .03512 .00562 .1200 .1428 .08 .21

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

1.690 4 34 .175 PH

.982 4 34 .430 LRL

2.390 4 34 .070 FWS

1.510 4 34 .221 DWS

.858 4 34 .499 FWR

.981 4 34 .431 DWR

1.584 4 34 .201 PH_WW

1.770 4 34 .158 LRL_WW

.623 4 34 .649 FWS_WW

2.578 4 34 .055 DWS_WW

.529 4 34 .715 FWR_WW

1.825 4 34 .147 DWR_WW

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

PH Between Groups 129.175 4 32.294 .989 .426

Within Groups 1109.722 34 32.639

Total 1238.897 38

67

LRL Between Groups 112.919 4 28.230 .856 .500

Within Groups 1121.056 32.972 34

Total 1233.974 38

FWS Between Groups .668 4 .167 2.679 .048

.062 Within Groups 34 2.120

Total 38 2.789

DWS Between Groups .004 4 .001 1.871 .138

.001 Within Groups 34 .018

Total 38 .022

FWR Between Groups .118 4 .029 .586 .675

.050 Within Groups 34 1.710

Total 38 1.828

DWR Between Groups .001 4 .000 .120 .974

.001 Within Groups 34 .049

Total 38 .050

PH_WW Between Groups 434.577 4 108.644 1.182 .336

Within Groups 3125.000 91.912 34

Total 3559.577 38

LRL_WW Between Groups 233.786 4 58.447 2.534 .058

Within Groups 784.111 23.062 34

Total 1017.897 38

FWS_WW Between Groups .667 4 .167 1.736 .165

68

3.265 34 .096 Within Groups

3.931 38 Total

DWS_WW Between Groups .002 4 .000 .317 .864

.043 34 .001 Within Groups

.044 38 Total

FWR_WW Between Groups .570 4 .142 2.368 .072

2.045 34 .060 Within Groups

2.615 38 Total

DWR_WW Between Groups .001 4 .000 .196 .939

.046 34 .001 Within Groups

.047 38 Total

Multiple Comparisons

Dunnett t (2-sided)

Mean 95% Confidence Interval

(J) Difference

Dependent Variable (I) Dong Dong (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

PH -4.16667 2.69316 .371 -11.1077 2.7744 1 5

-3.55556 2.69316 .512 -10.4966 3.3855 2 5

-2.00000 3.80870 .962 -11.8162 7.8162 3 5

-4.83333 2.69316 .247 -11.7744 2.1077 4 5

LRL -1.77778 2.70687 .919 -8.7542 5.1987 1 5

-4.50000 2.70687 .309 -11.4764 2.4764 2 5

69

3 5 -2.55556 3.82810 .914 -12.4217 7.3106

4 5 -3.83333 2.70687 .450 -10.8098 3.1431

FWS .216444 .117718 .228 -.08695 .51984 1 5

2 5 .156778 .117718 .504 -.14662 .46017

3 5 .256333 .166479 .375 -.17273 .68540

4 5 .376889* .117718 .011 .07349 .68028

DWS .006222 .010937 .949 -.02197 .03441 1 5

2 5 .005111 .010937 .974 -.02308 .03330

3 5 .013889 .015467 .795 -.02598 .05375

4 5 .027444 .010937 .058 -.00074 .05563

FWR .032000 .105708 .995 -.24044 .30444 1 5

2 5 -.037333 .105708 .991 -.30978 .23511

3 5 .035000 .149494 .998 -.35029 .42029

4 5 .117556 .105708 .654 -.15489 .39000

1 5 DWR -.002778 .017916 1.000 -.04895 .04340

2 5 .004778 .017916 .997 -.04140 .05095

3 5 -.011889 .025338 .974 -.07719 .05341

4 5 .000222 .017916 1.000 -.04595 .04640

Nh lưới số 2

hú th h: i n 1,2,3,4 l n lượt l ng ph n t h: M8.I.1.1, M8.I.2.6,

M8.I.8.4 v M8

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

70

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean

Std. N Mean Deviation Std. Error Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound

1 PH 8 28.1250 7.23952 2.55956 22.0726 34.1774 18.50 40.00

2 6 29.0000 8.04984 3.28634 20.5522 37.4478 20.00 41.00

3 9 34.2222 4.19904 1.39968 30.9946 37.4499 27.00 40.00

4 9 23.2500 3.99812 1.33271 20.1768 26.3232 18.25 32.00

Total 32 28.6328 6.96681 1.23157 26.1210 31.1446 18.25 41.00

1 LRL 6 42.0833 9.29740 3.79565 32.3263 51.8404 32.00 59.00

2 8 41.1250 11.85252 4.19050 31.2160 51.0340 20.00 60.00

3 9 33.9444 6.71027 2.23676 28.7865 39.1024 23.00 44.00

4 9 48.2778 8.87451 2.95817 41.4562 55.0993 33.00 62.50

Total 32 41.2969 10.37200 1.83353 37.5574 45.0364 20.00 62.50

1 FWS .9046 .20093 .07104 .7366 1.0726 .66 1.21 8

2 .7140 .22602 .09227 .4768 .9512 .48 1.00 6

3 .9738 .19340 .06447 .8251 1.1224 .74 1.34 9

4 .6165 .14536 .05934 .4640 .7690 .37 .80 6

Total 29 .8270 .23357 .04337 .7382 .9159 .37 1.34

1 FWR .4990 .11146 .04550 .3820 .6160 .36 .65 6

2 .6222 .23493 .08306 .4258 .8187 .31 .92 8

3 1.1305 .22172 .09052 .8978 1.3632 .76 1.35 6

4 .7591 .26936 .08979 .5521 .9662 .36 1.09 9

Total 29 .7444 .30775 .05715 .6273 .8614 .31 1.35

DWS 1 8 .1034 .03636 .01285 .0730 .1338 .05 .17

71

2 6 .1403 .02932 .01197 .1096 .1711 .08 .17

3 9 .2022 .04546 .01515 .1673 .2372 .13 .25

4 9 .0699 .01941 .00647 .0550 .0848 .05 .11

Total 32 .1287 .06191 .01094 .1064 .1510 .05 .25

6 DWR 1 .2365 .05082 .02075 .1832 .2898 .17 .32

2 8 .2902 .08268 .02923 .2211 .3594 .20 .46

3 6 .4547 .07538 .03077 .3756 .5338 .35 .56

4 9 .4324 .06965 .02322 .3789 .4860 .33 .54

.17 .56 Total 29 .3573 .11326 .02103 .3142 .4004

PH_WW 1 9 35.8889 7.51157 2.50386 30.1150 41.6628 22.00 47.00

2 7 36.8571 5.69879 2.15394 31.5866 42.1276 27.00 44.00

3 9 38.0556 8.55294 2.85098 31.4812 44.6299 21.00 49.00

4 9 44.5000 8.94427 2.98142 37.6248 51.3752 28.50 57.50

Total 34 38.9412 8.29546 1.42266 36.0468 41.8356 21.00 57.50

1 6 43.0833 5.55353 2.26722 37.2553 48.9114 35.00 49.00 LRL_W W 2 7 48.5714 14.88688 5.62671 34.8034 62.3395 33.00 78.00

3 9 41.0000 10.46721 3.48907 32.9542 49.0458 24.50 54.00

4 9 48.4444 11.98031 3.99344 39.2356 57.6533 29.00 69.00

Total 31 45.2742 11.35550 2.03951 41.1090 49.4394 24.50 78.00

1 6 1.2842 .22640 .09243 1.0466 1.5218 .97 1.62 FWS_W W 2 7 1.4594 .35942 .13585 1.1270 1.7918 1.20 2.23

3 9 1.6333 .31925 .10642 1.3879 1.8787 1.20 2.13

4 9 1.7151 .60307 .20102 1.2516 2.1787 .68 2.50

Total 31 1.5502 .42994 .07722 1.3925 1.7079 .68 2.50

FWR_W 1 6 .7505 .21129 .08626 .5288 .9722 .48 1.04

72

7 W .8679 .21769 .08228 .6665 1.0692 .52 1.11 2

9 1.1543 .50900 .16967 .7631 1.5456 .49 1.99 3

9 1.0553 .39726 .13242 .7500 1.3607 .53 1.99 4

Total 31 .9827 .39035 .07011 .8396 1.1259 .48 1.99

9 .1674 .06176 .02059 .1200 .2149 .08 1 .25 DWS_W W 9 .1799 .03536 .01179 .1527 .2071 .11 2 .24

9 .2110 .04331 .01444 .1777 .2443 .16 3 .31

9 .2297 .05631 .01877 .1864 .2729 .13 4 .32

Total 36 .1970 .05418 .00903 .1787 .2153 .08 .32

7 .3226 .06430 .02430 .2631 .3820 .22 1 .42 DWR_ WW 7 .3396 .05180 .01958 .2917 .3875 .26 2 .40

9 .3397 .05762 .01921 .2954 .3840 .27 3 .45

9 .4098 .08896 .02965 .3414 .4782 .30 4 .60

.22 Total 32 .3556 .07382 .01305 .3290 .3822 .60

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

PH 28 3 2.696 .065

LRL 28 3 .678 .573

FWS 25 3 .635 .599

FWR 25 3 1.441 .255

DWS 28 3 2.683 .066

DWR 25 3 .552 .651

PH_WW 30 3 .536 .661

LRL_WW 27 3 .671 .577

73

1.768 3 27 .177 FWS_WW

2.061 3 27 .129 FWR_WW

1.547 3 32 .221 DWS_WW

.478 3 28 .700 DWR_WW

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

PH Between Groups 544.817 3 181.606 5.298 .005

Within Groups 959.811 34.279 28

Total 1504.628 31

LRL Between Groups 929.069 3 309.690 3.604 .026

Within Groups 2405.861 85.924 28

Total 3334.930 31

FWS Between Groups .585 3 .195 5.166 .006

25 .038 Within Groups .943

28 Total 1.527

FWR Between Groups 1.377 3 .459 9.002 .000

25 .051 Within Groups 1.275

28 Total 2.652

DWS Between Groups .086 3 .029 24.174 .000

28 .001 Within Groups .033

31 Total .119

74

DWR Between Groups .231 3 .077 15.055 .000

Within Groups .128 25 .005

Total .359 28

PH_WW Between Groups 399.414 3 133.138 2.134 .117

Within Groups 1871.468 62.382 30

Total 2270.882 33

LRL_WW Between Groups 359.775 3 119.925 .923 .443

Within Groups 3508.645 129.950 27

Total 3868.419 30

FWS_WW Between Groups .789 3 .263 1.494 .239

27 .176 Within Groups 4.756

30 Total 5.546

FWR_WW Between Groups .728 3 .243 1.706 .189

27 .142 Within Groups 3.843

30 Total 4.571

DWS_WW Between Groups .022 3 .007 2.883 .051

32 .003 Within Groups .081

35 Total .103

DWR_WW Between Groups .038 3 .013 2.722 .063

28 .005 Within Groups .131

31 Total .169

75

Multiple Comparisons

Dunnett t (2-sided)

95% Confidence Interval Dependent (J) Mean Difference

Variable (I) Lines Lines (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

PH 4.87500 2.84493 .233 -2.2148 11.9648 1 4

5.75000 3.08576 .179 -1.9400 13.4400 2 4

10.97222* 2.75999 .001 4.0941 17.8503 3 4

LRL -6.19444 4.88545 .463 -18.3694 5.9805 1 4

-7.15278 4.50417 .288 -18.3775 4.0720 2 4

-14.33333* 4.36968 .008 -25.2229 -3.4437 3 4

FWS .28813* .10488 .028 .0274 .5489 1 4

.09750 .11213 .705 -.1813 .3763 2 4

.35728* .10236 .005 .1028 .6117 3 4

FWR -.26011 .11901 .099 -.5595 .0393 1 4

-.13686 .10972 .484 -.4129 .1391 2 4

.37139* .11901 .013 .0720 .6708 3 4

DWS .03349 .01671 .137 -.0081 .0751 1 4

.01812 .002 .0253 .1156 2 4 .07044*

.01621 .000 .0919 .1727 3 4 .13233*

DWR .03771 .000 -.2908 -.1011 1 4 -.19594*

.03477 .001 -.2297 -.0547 2 4 -.14219*

.02222 .03771 .893 -.0726 .1171 3 4

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.