Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.): Luận án Tiến sỹ Sinh học và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH

HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC.

Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật

Mã số: 62.42.01.12

Người hướng dẫn khoa học:

1. Chức danh, tên GV1: TS. NGUYỄN HỮU HỔ

2. Chức danh, tên GV2: PGS.TSKH. NGÔ KẾ SƯƠNG

Hà Nội – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng

để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được

cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn:

- Các thầy giáo hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS.TSKH. Ngô Kế

Sương luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý

báu.

- Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học của

Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi và quan tâm sâu sắc trong công

việc và thực hiện nghiên cứu.

- Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp và Bạn bè đã hỗ trợ trong công tác

chuyên môn, ủng hộ tinh thần và cho những ý kiến xác đáng trong quá trình thực

hiện nghiên cứu.

Đặc biệt, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến Ba, Mẹ và Gia đình

luôn hỗ trợ về vật chất và tinh thần.

Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch

iii

TÓM TẮT

Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) là một cây dược liệu quan trọng, rễ

cây chứa thành phần chính là Plumbagin, một naphthoquinone có nhiều đặc tính

dược liệu được quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm

và kháng côn trùng. Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng

Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà, trên cơ sở: chọn cơ

quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu quả chuyển gen dưới tác

động đồng thời của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone; xác định tác động

đồng thời của một số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng và

elicitor) lên khả năng sinh trưởng, tích lũy Plumbagin trong rễ tơ và đánh giá

biểu hiện tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin.

Kết quả nghiên cứu đã xác định lá là cơ quan được chọn để chuyển gen

tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà, có sự tác động đồng thời giữa thời gian ủ và hàm

lượng acetosyringone lên hiệu quả chuyển gen theo đó Acetosyringone 134,09

µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC

11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%). Khả năng phát triển của rễ tơ

cây Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: môi trường MS,

rễ được nuôi ở điều kiện tối và môi trường ở dạng lỏng là điều kiện tối ưu cho sự

phát triển sinh khối rễ tơ.

Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá

tác động đồng thời của nhiều yếu tố (dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh

trưởng và tích lũy Plumbagin, qua đó đã chọn lọc và xác định được điều kiện

môi trường nuôi cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L,

salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả tối ưu với trọng

iii

lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135

mg.

Ngoài ra, hoạt tính của Plumbagin cũng được kiểm chứng qua việc cảm

ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi sự cân bằng trong

biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào HepG2, thông qua

mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm, sự phân mảnh của nhân và sự biểu

hiện của gene (bax và bcl-2) liên quan đến quá trình apoptosis.

ABSTRACT

Plumbago zeylanica L. is an important pharmaceutical plant. Its roots

contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects

against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects. This research aims to

produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L. hairy roots

on the selection of suitable plant segment for transgene. The study also identifies

the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone

concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and

elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy

roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma.

This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was

achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47

days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134.09 µM

acetosynringone. P. Zeylanica L. hairy roots showed to be grow best in liquid

MS media and in dark condition.

Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse

efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and

accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water,

100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone. With the

listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry

weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.135 mg.

Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells. It also

affects some apoptotic genes of HepG2 cells. The results showed that there were

a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression

of apoptotic bax and bcl-2 genes.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

TÓM TẮT ............................................................................................................ iii

ABSTRACT ......................................................................................................... iv

MỤC LỤC ............................................................................................................ v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................... vi

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... viii

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1 .......................................................................................................... 4

TỔNG QUAN ...................................................................................................... 4

1.1. Cây Bạch hoa xà ........................................................................................... 4

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................ 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 4

1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 5

1.1.4. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX ........................................ 6

1.2. Plumbagin ..................................................................................................... 7

1.2.1. Cấu trúc và đặc tính hóa học ............................................................... 7

1.2.2. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật ................................................... 7

1.2.3. Hoạt tính của Plumbagin ..................................................................... 8

1.2.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa............................................................... 8

1.2.3.2. Hoạt tính kháng viêm .................................................................... 9

1.2.3.3. Hoạt tính kháng ung thư .............................................................. 10

1.2.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 12

1.2.3.5. Hoạt tính kháng nấm ................................................................... 13

1.2.4. Độc tính của plumbagin ...................................................................... 13

1.2.5. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật... 16

1.3. Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật ................................................................ 20

1.3.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật ............................................................. 20

1.3.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp ................................... 21

1.3.3. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật ............................... 24

1.4. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp ........................... 25

1.4.1. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật ........................................................... 27

1.4.2. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes ...................... 28

1.4.2.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .................. 28

1.4.2.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế

bào thực vật ............................................................................................ 29

1.4.2.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

trong mô thực vật ................................................................................... 32

1.4.2.4. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes .................. 39

1.5. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật ............................................................................ 40

1.5.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ ................................................................. 41

1.5.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy ......................................... 41

1.5.3. Ảnh hưởng của elicitor ....................................................................... 43

1.5.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp ............................ 44

CHƯƠNG 2 ......................................................................................................... 48

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 48

2.1. Vật liệu ......................................................................................................... 48

2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 48

2.1.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .................................................. 49

2.2. Phương pháp thực nghiệm ......................................................................... 49

2.2.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho

chuyển gen ...................................................................................................... 49

2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu ............................................. 49

2.2.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ ... 50

2.2.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro ................................. 52

2.2.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch

hoa xà in vitro .......................................................................................... 52

2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ ..................... 54

2.2.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ ................................................... 54

2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn

hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR ............ 56

2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt

chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà .......................... 58

2.2.3.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường .............................................. 58

2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng

của rễ tơ .................................................................................................. 59

2.2.3.3. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ .. 59

2.2.3.4. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu ................................................. 60

2.2.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng ............................................. 60

2.2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ ............................................................................................. 61

2.2.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ ...................... 62

2.2.4.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC ......................... 62

2.2.4.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) .................. 63

2.2.4.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC .......................................... 63

2.2.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của

Plumbagin ................................................................................................ 64

2.2.6. Xử lý số liệu .......................................................................................... 67

CHƯƠNG 3 ......................................................................................................... 68

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 68

3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro ............................................................ 68

3.1.1. Xác định điều kiện khử trùng mẫu ..................................................... 68

3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ ..... 70

3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro .......................................... 73

3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa

xà in vitro ........................................................................................................ 75

3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà ...................................................... 79

3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ ..................... 79

3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ ............................ 85

3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin ...... 87

3.3.1. Trạng thái môi trường ......................................................................... 87

................................................................................................................................

3.3.2. Điều kiện chiếu sáng............................................................................ 88

3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ

tơ...................................................................................................................... 89

3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi

cấy ................................................................................................................... 91

3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng ....................................................... 92

3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy ..................................................................... 94

3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin

................................................................................................................. 101

CHƯƠNG 4 ....................................................................................................... 107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 107

4.1. Kết luận ...................................................................................................... 107

4.2. Đề nghị ........................................................................................................ 108

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................... 109

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................... 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................

PHỤ LỤC ..............................................................................................................

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3MeDAB Aminoazobenzene 3-methyl-4-dimethyl

Bạch hoa xà BHX

Anthraquinone AQ

Breast cancer BRCA

Caffeic acid CADs

CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Con A Concanavalin A

Estrogen receptor ER

Glutathione GHS

HaCaT Human keratinocyte line

Human Embryonic Kidney HEK

Interleukin IL

Methyl jasmonate MeJA

Matrix metalloproteinases MMPs

NPAAs Non-protein amino acids

NSCLC Non-small cell lung cancer

Ornithine cyclodeaminase OCD

Reactive oxygen species ROS

Secondary metabolism SM

Trọng lượng khô TLK

Nghiệm thức NT

Trọng lượng tươi TLT

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate TPA

NF-kB Nuclear factor-kappaB

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

Poly polymerase ADP-ribose PARP

Matrix metalloproteinase-2 MMP-2

ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABCG2

Salicylic acid SA

Tryptophan Trp

McCown-Lloyd McC

Murashige and Skoog MS

Gamborg's B-5 B5

6-benzyladenine BA

Naphthalene Acetic Acid NAA

Indole-3-acetic acid IAA

Gibberellin A3 GA3

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D

Indole-3-butyric acid IBA

Glutathione GSH

Glucosinolate GSL

Sulfur induced resistance SIR

vii

DANH MỤC BẢNG

SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG

1.1 Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận 16, 17,

18, 19 Plumbagin.

2.1. Điều kiện khử trùng đoạn thân cây Bạch hoa xà để tạo mẫu in 49

vitro.

2.2. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm 51

tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà.

2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 53

thực vật đến khả năng hình thành và phát triển rễ bất định

mẫu in vitro.

2.4. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên 55

tỉ lệ chuyển gen.

58 2.5. Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR.

60 2.6. Một số loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm.

62 2.7. Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh

trưởng rễ tơ.

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và thời 69

gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà

3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh 71

trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của

vii

cây Bạch hoa xà.

3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây 75

Bạch hoa xà từ chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy.

3.4. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ 76, 77

bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy.

3.5. Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi 83

và tỉ lệ mẫu chuyển gen.

3.6. Dữ liệu dự đoán tỉ lệ chuyển gen theo thuật toán. 84

3.7. Ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh 87

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà.

3.8. Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây 89

Bạch hoa xà.

3.9. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX 90

nuôi cấy.

3.10. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ 92

tơ BHX nuôi cấy.

3.11. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời 94

gian.

3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự 95

sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.

3.13. Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự 96

sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.

vii

3.14. Ảnh hưởng của 4 yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi 97

cấy.

3.15. Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình 100

D-Optimal.

3.16. Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ 102

khác nhau.

3.17. Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi 104

comet/chiều dài comet.

viii

DANH MỤC HÌNH

SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG

1.1. Cây Bạch hoa xà 5

1.2. Cấu trúc phân tử của Plumbagin 7

1.3. Con đường sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật 8

1.4. Sơ đồ tóm tắt hoạt động của Plumbagin 16

1.5. Sinh tổng hợp và trao đổi các chất thứ cấp ở các bào quan 23

1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes 29

1.7. Sự tương tác A.rhizogenes và cơ chế chuyển T-DNA 32

1.8. Sơ đồ nuôi cấy rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium 40

rhizogenes

3.1. Mẫu Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy in vitro 68

3.2. Mẫu đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy 72

3.3. MS + 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA sau 4 tuần nuối cấy 72

3.4. Các nghiệm thức E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6 sau 2 tuần nuôi 74

cấy

3.5. Rễ bất định từ lá (a) và đoạn thân (b) 76

3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi chung với vi khuẩn 79

viii

3.7. Rễ tơ giả định hiển vi (vật kính 40) 80

3.8. Đoạn rễ tơ hiển vi (vật kính 40) 80

3.9 Rễ tơ nuôi trên môi trường lỏng lắc sau 30 ngày 81

3.10. PCR gen rolB 81

3.11. PCR gen rolC 82

3.12. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone 83

theo mặt phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu nhũn.

3.13. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone theo 84

mặt phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu chuyển gen

3.14. Sắc ký lớp mỏng định tính Plumbagin 86

3.15. Sắc ký đồ xác định Plumbagin bằng hệ thống HPLC 86

3.16. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng Plumbagin 87

3.17 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh 87

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà

3.18 Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây 88

Bạch hoa xà

3.19. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây 90

BHX nuôi cấy

3.20. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ 92

tơ BHX nuôi cấy

viii

3.21. Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây Bạch hoa xà 93

3.22. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng 98

khô

3.23. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng 99

tươi

3.24. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến hàm lượng 99

Plumbagin

3.25. Hình thái tế bào HepG2 102

3.26. Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2 103

3.27. Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 được cảm ứng bởi 105

Plumbagin

3.28. Sự biểu hiện của gene Bcl-2 và Bax ở mức phiên mã của tế 106

bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ khác

nhau

MỞ ĐẦU

Cây Bạch hoa xà (tên khoa học Plumbago zeylanica L.) thuộc họ

Plumbaginaceae, là cây dược liệu có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc Châu Á [7],

phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Australia, Châu Á và Châu Phi

[256].

Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà (BHX) được dùng để điều trị một

số bệnh về da như bị vết thương, chàm, ghẻ, phong [6]. Nhiều kết quả nghiên

cứu cho thấy, rễ và hạt của cây được sử dụng làm dược liệu vì trong đó chứa một

quinonoid được gọi là Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone)

màu vàng.

Rễ cây BHX được sử dụng làm dược liệu ở Ấn Độ từ khoảng 750 năm

trước công nguyên như: là dược liệu kháng ký sinh, bổ tim, bảo vệ gan và bảo vệ

thần kinh. Có nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ và dịch chiết từ

rễ như phenolic acid, tannin, anthocyanin,… có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt

là các vi khuẩn gây bệnh [189], [256].

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, Plumbagin chiết từ cây Bạch hoa xà

có khả năng kháng ung thư [150], kháng khuẩn [54], kháng ký sinh trùng sốt rét

[170], ức chế hoạt động phân chia tế bào [25], kháng sâu, kháng đột biến [127]

và có khả năng làm giảm cholesterol [187].

Vai trò của Plumbagin như một chất kháng ung thư đã được ghi nhận bởi

nhiều tác giả [97], [170], [162], [234], cũng như kháng ung thư tuyến tiền liệt

[182], ung thư phổi [87], [100], ung thư thanh quản [161], ung thư buồng trứng

[228] và ung thư da [259].

Hoạt tính kìm hãm tăng trưởng tế bào ung thư của Plumbagin được biểu

hiện qua khả năng ngăn chặn chu kỳ phân chia tế bào S-G2/M bởi sự kích thích

p12 –nhân tố kìm hãm enzyme cyclin-dependent kinase [106], [130] ở ung thư

ruột; kìm hãm enzyme NAD(P)H oxidase [55] ở tế bào khối u não và thận; kìm

hãm các enzyme liên quan đến hoạt động kháng ung thư [97], [106] và ức chế

hoạt động của yếu tố phiên mã NF-KB (NF-KB: nuclear factor-kappaB) và các

sản phẩm gen được điều hòa bởi NF-KB, kết quả là làm tăng sự chết theo chương

trình và ức chế sự phát triển của tế bào khối u [8]. Ngoài tác động kháng ung

thư¸ Plumbagin cũng kích thích tính nhạy cảm của tế bào ung thư đối với bức xạ

qua các thí nghiệm với tế bào khối u ở chuột cũng như các tế bào khối u in vitro

[51], [74].

Cho đến nay, trong nước đã ghi nhận được một số công trình công bố về

kết quả nghiên cứu ở cây BHX, chủ yếu là khảo sát các hoạt chất thứ cấp và tác

dụng dược lý, chưa ghi nhận được công trình công bố về thu hoạt chất thứ cấp từ

nuôi cấy rễ cây BHX in vitro.

Do có tác dụng dược lý như đã nêu, song việc trồng cây BHX ở điều kiện

tự nhiên để thu hoạt chất đòi hỏi nhiều thời gian, nên việc nghiên cứu tìm nguồn

nguyên liệu chứa Plumbagin cao thông qua kỹ thuật công nghệ nuôi cấy rễ tơ

cây BHX được đề xuất thông qua việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo rễ tơ

cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo

Plumbagin trong nuôi cấy in vitro”.

Các nội dung chính của đề tài bao gồm:

- Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen.

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ.

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất

Plumbagin trong nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà.

- Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin.

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Cây Bạch hoa xà

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Bạch hoa xà thuộc họ Plumbaginaceae, có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc

Châu Á. Họ Plumbaginaceae có 10 chi và 280 loài, nhiều loài thuộc chi

Plumbago phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [7], [135], [256], [258].

Ở Việt Nam, cây Bạch hoa xà (còn có nhiều tên khác: Bạch tuyết hoa, cây

Chiến, cây Đuôi công [1], Đuôi công trắng, Bươm bướm trắng) là cây hoang dại,

phân bố ở các tỉnh miền Trung và đồng bằng trung du Bắc bộ hoặc được trồng ở

vườn các gia đình và các cơ sở khám chữa bệnh y học cổ truyền. Vị trí phân loại

của cây như sau [288]:

Giới Thực vật

Phân giới Plantae

Lớp Magnoliopsida

Phân lớp Caryophyllidae

Bộ Plumbaginales

Họ Plumbaginaceae

Chi Plumbago

Loài Plumbago zeylanica L.

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Bạch hoa xà là một loài cây sống lâu năm, cao khoảng 0,3 – 0,6 m, thân có

đốt và nhẵn [1], cành có gốc màu lục. Lá mọc so le, hình trứng đầu nhọn, dài từ

4 – 10 cm, mép nguyên, không có lông, nhưng mặt dưới hơi trắng nhạt [1]. Hoa

màu trắng, hợp thành bông khá dày đặc ở ngọn. Lá thuôn, nhọn ngắn bằng 1/3

đài hoa. Đài hoa hình trụ, có cạnh rõ, phủ đầy lông tuyến ở mặt ngoài, phía trên

xẻ 5 răng nhọn, ngắn. Tràng hình ống nhỏ, dài gấp đôi đài, 5 thùy hình trứng

ngược, có mũi nhọn. Hoa có 5 nhị, nhẵn; bao phấn thuôn màu vàng; Bầu noãn

bé, 1 vòi nhụy dài hình chỉ. Cây ra hoa quanh năm nhưng nhiều nhất vào các

tháng 5 – 6 [1] (Hình 1.1).

Rễ

Hoa

Lá

Hình 1.1: Cây Bạch hoa xà: a. lá và thân; b. hoa; c. rễ

1.1.3 Thành phần hóa học

Hoạt chất chính trong thành phần hóa học của cây Bạch hoa xà là chất

Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone), có ở dạng đơn (hydro

plumbagin, dihydro plumbagin, hydroxyl plumbagin (droseron), dihydroxy

hydro plumbagin (idoshinanolon), chloro plumbagin, plumbagin acid); dạng

ghép đôi (hai phân tử nối với nhau tạo thành biplumbagin: chitanon, zeylanon,

isozeylanon và maritinon); có khi hai phân tử plumbagin và zeylanon ghép lại

với nhau thành plumbazeylanon làm thành một triplumbagin.

Ngoài ra, cây còn chứa một số keton (elliptinon, vanilic acid), aminoacid

(aspartic acid, tyrosin, tryptophan, threonin, alanin, histidin, glycin, methionin,

hydroxy prolin ...), ester (nonyl nonamoat, nonyl ethyl dodecanoat, benzyl

dihydroxy methoxy benzoat, stigmasterol acetal, lupeol acetat, keto dihydroxy

ursenedioic acid dimethyl ester), terpenoid (bakuchiol, lupeol, sisterol, amyrin,

taraxasterol),… Đặc biệt ở Việt Nam, ngoài linolenic và palmitic acid, Bạch hoa

xà còn chứa 31 hóa chất ở trong thân, 13 trong lá và 13 trong rễ cây.

1.1.4 Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX

Theo Đông y, Bạch hoa xà có vị đắng, chát, tính hơi ôn, có độc tính; có tác

dụng khử phong, giảm đau, tán ứ, tiêu thũng, giải độc, sát trùng. Rễ có vị đắng,

chát, gây nôn. Toàn cây trị tràng nhạc, bạch huyết, bế kinh, tăng huyết áp; viêm

tuyến vú, viêm hạch cấp, nấm, nhọt, rò hậu môn [1], [6].

Thành phần hóa học chủ yếu có trong dịch ly trích từ rễ là Plumbagin nên

đã có nhiều nghiên cứu nhằm xác định công dụng của Plumbagin ly trích từ cây

Bạch hoa xà, một số kết quả nghiên cứu được ghi nhận:

- Kháng ung thư: hiệu quả kháng ung thư của Plumbagin được biểu hiện ở

việc ức chế một vài loại ung thư như ung thư tuyến tiền liệt [182], ung thư phổi

[87], [100] ung thư thanh quản [161], [228], ung thư buồng trứng [228] và ung

thư da [259]. Tại Ấn Độ, Plumbagin chiết từ rễ cây Bạch hoa xà được sử dụng để

điều trị khối u, ung thư thực nghiệm trên chuột, kết quả là đã làm kích thước

khối u giảm 70%.

- Kháng một số vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris và Candida albicans [186],

Helicobacter pylori [263].

- Kháng nấm: Alternaria alternata, Aspergillus niger, Bipolaris oryzae,

Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani, Rhizopus

stolonifer var. stolonifer và Sclerotinia sclerotiorum [216].

1.2 Plumbagin

1.2.1 Cấu trúc và đặc tính hóa học

Plumbagin, 2-methoxy-5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone (C11H8O3) (Hình

1.2), là sản phẩm tự nhiên được khẳng định có trong rễ cây Plumbago indica L.,

trọng lượng phân tử 188,18; màu vàng và điểm hòa tan 78-79oC. Plumbagin tan

nhẹ trong nước nóng và tan tốt trong các dung môi alcohol, acetone, chloroform,

benzene và acetic acid. Plumbagin hấp thụ tốt ở các bước sóng 212, 266, 410 và

423 nm [160].

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Plumbagin [255]

1.2.2 Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật

Trao đổi các hợp chất thứ cấp ở thực vật thường được hình thành qua

trung gian trao đổi glucose nhờ các con đường shikimic, acetate và amino acid

[79]. Hầu hết các Naphthoquinone được bắt nguồn từ con đường Shikimate, tuy

nhiên Plumbagin hiện diện trong các loài Plumbago spp. đều được tổng hợp từ 6

đơn vị C2 qua con đường acetate-malonate, Hình 1.3 [56].

α-ketoglutatate

CoASH+NAD+

CO2+NADH

glutamate

COOH

ScoA

H3C

COOH

Alanine - aminotransferase

NH2

Pyruvate-dehydrogenase

L-alanine

Acetyl CoA

OH O

O O O

OH OH

oxidation

Pyruvate

Reduction aldol condensatio

SCoA

decarboxylation

CH3

O O

Plumbagin

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật.

1.2.3 Hoạt tính của Plumbagin

1.2.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính sinh học của một số chất thuộc nhóm 1,4-Naphthoquinone, trong

đó có Plumbagin đã được nghiên cứu ở tế bào sừng của người (HaCaT). Các hợp

chất thuộc nhóm 1,4-Naphthoquinone gây độc tế bào, gây cảm ứng mạnh phản

ứng oxy hóa chuyên biệt và làm suy giảm glutathione. Tilak và cs (2004) [243]

nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của Plumbagin từ rễ có trong các chế phẩm

thuốc biểu hiện qua khả năng ức chế sự peroxide lipid. Các nghiên cứu về sự

phân ly các phân tử do bức xạ hạt nhân được ghi nhận, các nhóm hydroxyl, alkyl

peroxyl, linoleic peroxyl acid và bức xạ glutathinyl tạo ra bức xạ phenoxyl khi

tương tác với Plumbagin. Từ những kết quả nhận được, Tilak và cs (2004) [243]

cho rằng thành phần hoạt chất của dịch chiết từ P. zeylanica là Plumbagin có

hoạt tính kháng oxy hóa với hiệu quả cao [243].

Demma và cs (2009) [50] đã tiến hành nghiên cứu và xác nhận Plumbagin

có khả năng làm giảm tổn thương DNA khi bị kích thích bởi catechol và cho

rằng Plumbagin cũng có hoạt tính như một chất kháng oxy hóa ở nồng độ thấp (<

0,25 ng/ml). Khi theo dõi tác động của Plumbagin (nồng độ 1-16 mg/kg trọng

lượng cơ thể) lên chuột, đo nồng độ peroxide lipid sau 24 giờ, đã ghi nhận được

Plumbagin ức chế ascorbate ở chuột, Sankar và cs (1987) [204] nhận thấy

Plumbagin chỉ tác động lên hoạt tính peroxide lipid phụ thuộc NADPH, nhưng

không có tác dụng đối với sự peroxy lipid phụ thuộc cumene hydroperoxide

[204]. Ngoài ra, Plumbagin còn có hoạt tính làm suy giảm glutathione (GSH)

trong gan và hàm lượng glucose-6-phosphatase trong microsome. Các kết quả

thu được cũng cho thấy Plumbagin sở hữu cả hai hoạt tính: kháng stress oxy hóa

và kháng oxy hóa. Đây là hoạt tính ưu việt của nhiều hợp chất tự nhiên [9], [10],

[92], [115], [222].

1.2.3.2 Hoạt tính kháng viêm

Sinh lý bệnh viêm khớp dạng thấp liên quan đến viêm nhiễm, sự phân chia

nguyên bào sợi (synoviocyte Proliferation), hình thành mạch và quá trình suy

thoái bắt nguồn từ phức hợp metalloproteinase. Plumbagin được biết là một chất

ức chế topoisomerase-II, ức chế một số enzyme tham gia sinh lý bệnh của viêm

khớp dạng thấp và ức chế hoạt tính bạch cầu trung tính, hình thành mạch máu và

biểu hiện collagenase. Những nghiên cứu này cho thấy, các chất ức chế

topoisomerase-II, như Plumbagin, có thể được khám phá như nhân tố điều trị

sinh lý bệnh viêm khớp dạng thấp [105].

1.2.3.3 Hoạt tính kháng ung thư

NF-kB là một yếu tố phiên mã phổ biến, giữ vai trò trung tâm trong việc

điều hòa nhiều quy trình như: tăng sinh tế bào, biểu hiện của một số gen miễn

dịch và cảm ứng gây chết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào bạch cầu, đáp

ứng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi… Plumbagin được ghi nhận là kìm hãm

hoạt tính NF-kB trong các tế bào khối u và có ảnh hưởng đến chức năng sinh học

của tế bào bạch cầu thông qua các đáp ứng miễn dịch. Checker và cs (2009) [38]

mô tả hiệu ứng miễn dịch của Plumbagin thông qua ức chế tăng sinh tế bào T

dưới tác động của chất Concanavalin A bằng cách “đóng” chu kỳ tế bào. Nó

cũng biểu hiện khả năng ức chế hoạt tính của marker CD69 và CD25 ở các tế

bào T khi được kích hoạt. Tuy nhiên, Plumbagin không làm suy giảm khả năng

ức chế miễn dịch của tế bào lympho (ở nồng độ 5 µM). Tương tự, hiệu quả ức

chế miễn dịch đã được xác nhận dựa trên mức cytokine ở thí nghiệm in vivo. Tín

hiệu điều hòa đầu dòng của hoạt tính liên kết NF-kB-DNA bởi Plumbagin và sự

ức chế NF-kB ở tế bào ung thư vú (BRCA) cũng đã được xác nhận. Đây được

xem là một cơ chế quan trọng về ảnh hưởng sinh học của Plumbagin [9].

Plumbagin được coi là một yếu tố hoạt động đa mục tiêu [130] nên đây

được xem là một yếu tố chống ung thư hiệu quả đối với nhiều loại ung thư khác

nhau, như: hoạt tính kháng ung thư vú (BRCAs) của Plumbagin được biểu hiện

thông qua điều hòa biểu hiện Bcl-2 và hoạt tính NF-kB [9]; ung thư tuyến tiền

liệt (RWPE-1) [15], [182]; ung thư buồng trứng (BRCA1-silenced) thông qua sự

liên kết và điều hòa ER-α [241]; ung thư tụy (Panc-1 và BxPC-3) thông qua điều

hòa ngược của Bax, sự suy giảm đặc tính truyền màng ở màng ty thể, biểu hiện

yếu tố kích thích apoptosis trong bào tương, phân cắt pro-caspase-9 và PARP

(poly polymerase ADP-ribose) [39]; ung thư được phát triển từ các tế bào huyết

tương thông qua ức chế cả hai: sự phosphoryl STAT-3 được kích thích bởi

interleukin (IL) -6 và biểu hiện quá mức hiệu quả hoạt động STAT-3 ức chế

apoptosis [203]; ung thư phổi (H460 và A549 NSCLC) thông qua điều hòa tín

hiệu đầu dòng EGFR trong tế bào và bắt giữ chu kỳ tế bào (kích hoạt caspase-3)

và cảm ứng của apoptosis [100]; ung thư da [140], [183], [259] thông qua kích

thích tăng hàm lượng p21 và giảm hàm lượng cyclin B1, cyclin A, cdc2 và

Cdc25C; ung thư thận nhờ hoạt tính ức chế hoạt động Nox-4 (một NAD(P)H

oxidase của thận) [55]; ung thư gan thông qua sự điều hòa đầu dòng nhân tố

MMP-2 và uPA [215], ức chế hoạt động histone acetyltransferase và acetyl hóa

qua trung gian P300 của p53 trong in vivo [191]; ung thư bạch cầu [114] được

biểu hiện qua sự suy giảm hoạt tính topoisomerase-II; ung thư cổ tử cung [151],

[161], [228] qua kích hoạt các caspase-3, caspase-9, di chuyển của phosphatidyl

serine, ngưng tụ hạt nhân và phân mảnh DNA,…

Ngoài ra, Plumbagin còn có tác động gây nhạy cảm bức xạ: Nair và cs

(2008) [161] đã ghi nhận vai trò tiềm năng của Plumbagin khi kết hợp với bức xạ

có thể làm tăng hiệu quả sự ức chế tăng trưởng tế bào ung thư khi so sánh với

việc chỉ sử dụng một mình bức xạ ở liều cao. Sự kết hợp này đã làm cho hoạt

tính caspase-3 tăng gấp năm lần ở tế bào C33A. Ngoài ra, hoạt tính của các yếu

tố khác liên quan đến quá trình điều hòa apoptosis, như Bcl-2, Bax và survivin

cũng đã được tìm thấy là đều bị ảnh hưởng bởi điều trị phối hợp xạ trị với

Plumbagin [161]. Hiệu quả của việc điều trị kết hợp xạ trị bằng tia gamma Co-60

với Plumbagin cũng được phát hiện thấy khi nghiên cứu điều trị ung thư cổ

trướng Ehrlich in vivo. Plumbagin (5 mg/kg trọng lượng cơ thể) đã tạo ra một tín

hiệu làm gia tăng đáng kể tỷ lệ phần trăm tế bào ở giai đoạn S cũng như các tế

bào G2-M và giảm tương ứng các tế bào ở giai đoạn G1 vào các thời điểm sau

điều trị. Sử dụng đơn thuần bức xạ (7.5Gy, RT) đã tạo ra ức chế ở giai đoạn G2

trong thời gian 1 giờ và duy trì sự gia tăng liên tục trong suốt thời gian quan sát

sau điều trị. Việc điều trị kết hợp tạo ra một hiệu ứng tương tự như của RT trên

các tế bào G2-M, nhưng ảnh hưởng của nó vào giai đoạn G1 là nhiều hơn. Tế

bào khối u ác tính ở chuột khi chỉ điều trị riêng bằng Plumbagin ở hàm lượng 0,5

mg/ml trong 60 phút hoặc sau bức xạ gamma 2 Gy đã tạo ra tín hiệu suy giảm

đáng kể các tế bào ở ngày 3 và 4 [183]. Tóm lại, những phát hiện nêu trên càng

nhấn mạnh thêm sự tăng nhạy cảm bức xạ của tế bào ung thư khi được kích thích

bởi Plumbagin.

1.2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi trùng lao in vitro của Plumbagin được biểu hiện qua

trung gian hydrazine của phản ứng catalase - peroxidase và hình thành một phức

hợp enzyme oxyferrous phản ứng với O2 ở Mycobacteria ferric KatG [262].

Hoạt tính này cũng biểu hiện ở chủng kháng Mycobacterium tuberculosis H37Rv

[30], [155]. Sử dụng phương pháp đánh dấu in vitro, Mossa và cs (2004) [155]

đã xác định Plumbagin ức chế một số loài vi khuẩn lao khác tùy thuộc nồng độ

sử dụng.

Đã phát hiện hiệu quả kháng khuẩn S. aureus của đại thực bào trong cơ

thể chuột khi sử dụng Plumbagin in vivo [5], khả năng diệt khuẩn tăng lên theo

nồng độ Plumbagin. Hoạt động ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori, A.

baumannii CLL., E. coli và S. aureus của Plumbagin cũng đã được ghi nhận

[129], [172].

Hoạt tính kháng khuẩn của Plumbagin được minh chứng như một tiền chất

của yếu tố vận chuyển cassette liên kết với ATP (ABCG2) [219] và là một chất

ức chế chuyên biệt qua trung gian ABCG2 của mitoxantrone và nó ức chế sự liên

kết của tiền chất [125I] Iodoarylazidoprazosin thành ABCG2 [219].

1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm

Hoạt tính kháng nấm của Plumbagin đã được chứng minh bởi khả năng ức

chế sự tăng trưởng đáng kể của 12 chủng nấm men gây bệnh và nấm sợi khác

nhau: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Alternaria sp., Candida albicans,

Candida glabrata, Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Candida

tropicalis, Cladosporium sp., Geotrichum candidum, Fusarium sp. và

Penicillium sp. Kết quả đề nghị, Plumbagin như một nhân tố tiềm năng sử dụng

để kháng nấm [57]. Plumbagin cũng có khả năng ức chế hoàn toàn nấm

Aspergillus flavus [138] và nấm Pleurotus sajorcaju [45] khi sử dụng ở hàm

lượng cao.

Plumbagin của dịch ly trích từ cây Diospyros anisandra cũng giữ vai trò

chính trong hoạt tính kháng một số loại vi sinh vật khác như: Bacillus subtilis,

Colletotrichum gloeosporioides và Staphylococcus aureus [29]. Các hoạt động

Antimycobacterial và Antigonorrhoeal của Plumbagin ly trích từ cây Diospyros

canaliculata và Diospyros crassiflora cũng có thể hiện [128].

1.2.4 Độc tính của Plumbagin

Mặc dù dịch ly trích từ thực vật có chứa Plumbagin đã được sử dụng từ

lâu và đã có nhiều bằng chứng cho thấy dịch ly trích chứa Plumbagin có giá trị

tiềm năng như là một liệu pháp hóa trị hoặc nhân tố ngăn ngừa ung thư. Tuy

nhiên, mối lo ngại về sự an toàn của nó do tác động làm phồng da, gây sẩy thai

và một số tác dụng gây độc khác như: gây tiêu chảy, phát ban da, tăng tế bào

máu trắng và bạch cầu trung tính, tăng phosphatase huyết thanh và nhiễm độc

gan đã được ghi nhận [223].

Đã có một số nghiên cứu quan tâm đến tác động gây độc của Plumbagin

như: dựa trên phân tích với các tế bào E. coli AQ634, đo tần số quay ngược Trp-

thành Trp+, Farr và cs (1985) [61] đã ghi nhận Plumbagin không gây đột biến

trong tế bào ở trạng thái bình thường nhưng gây đột biến đối với tế bào ở trạng

thái phân chia. Santhakumari và cs (1980) [205] kiểm tra ảnh hưởng của

Plumbagin trong nuôi cấy nguyên bào sợi phôi gà đã quan sát thấy những tác

động chủ yếu là sự ức chế tăng trưởng và phân chia tế bào và giảm chỉ số phân

bào với sự tập trung của các tế bào ở giai đoạn metaphase. Từ kết quả ghi nhận

được, các tác giả có kết luận rằng Plumbagin ở nồng độ thấp hoạt động như một

chất độc qua ức chế chuyển phase của các tế bào khi phân chia, ở nồng độ cao

hơn, nó thể hiện bức xạ gây độc cho nhân và tế bào. Bằng cách sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp - ghép khối phổ, Hsieh và cs (2006) [99] đã xác định

được giá trị sinh học của Plumbagin qua đường uống ở chuột là 38,77 ± 5%.

Có một số bằng chứng cho thấy hợp chất này có hiệu quả gây độc chọn

lọc chống lại tế bào ung thư và kích thích ở mức thấp hoặc không có hoạt tính

gây độc với tế bào bình thường. Nghiên cứu trên tế bào BRCA chứng minh rằng:

Plumbagin ức chế sự tăng trưởng tế bào MDAMB-231 và MCF-7 BRCA thông

qua cảm ứng apoptosis, không có bất kỳ ảnh hưởng nào đáng kể lên các tế bào

MCF-10A, không gây đột biến đối với tế bào bình thường [9]. Trong một nghiên

cứu trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt, Aziz và cs (2008) [15] ghi nhận hiệu quả

cảm ứng của quá trình apoptosis bởi Plumbagin trong các tế bào ung thư tuyến

tiền liệt (DU145, CWR22rv1 và LNCaP) nhưng không có tác động đáng kể

trong đột biến tế bào biểu mô tuyến tiền liệt RWPE-1.

Để tăng cường hiệu quả chống khối u và làm giảm độc tính của

Plumbagin, một dạng gel tiêm poly (lactic-co-glycolic) acid của Plumbagin đã

được tạo ra [223]. Theo đó, độc tính của Plumbagin đã giảm ở chuột BALB/c

sau khi tiêm dưới da của gel có chứa Plumbagin so với gel không chứa

Plumbagin và hiệu quả về thời gian tăng gấp đôi. Vì vậy, các tác giả cho rằng

cách tiếp cận này có thể là một loại hệ thống phân phối thuốc hiệu quả, có thể

không chỉ làm giảm độc tính mà còn có thể tăng cường hiệu quả điều trị của

Plumbagin. Ngoài ra, việc sử dụng các chất mang có thể điều khiển sự bài tiết

Plumbagin là hướng tăng hiệu quả và giảm độc tính của Plumbagin, đã được tiến

hành và thử nghiệm cho các hoạt tính chống khối u và kháng khả năng phân chia

tế bào. Niosome và albumin microsphere được sử dụng như các chất mang, khi

cho hàm lượng 5 mg/kg qua màng bụng, albumin microsphere cho thấy kích

thích kháng khối u và kháng khả năng phân chia tế bào so với noisome và

microsome có mang Plumbagin. Dữ liệu sống sót của động vật cũng cho thấy sự

cải thiện nhẹ trong tỷ lệ sống cũng như hoạt tính kháng ung thư [120]. Tiwari và

cs (2002) [244] đã tạo ra liposom có kích thước nhỏ nhờ phương pháp hydrat

hóa film mỏng và rung siêu âm (tạo ra các hạt có kích thước nhỏ hơn 0,19 µm),

kết quả cho thấy, các hạt liposom chứa Plumbagin là tác nhân chống ung thư tốt

hơn đáng kể khi tiêm tĩnh mạch cho chuột mang khối u ác tính C57BL/6J so với

chuột dùng Plumbagin tự do với liều lượng tương tự. Ngoài ra, phức hợp

Plumbagin được tạo ra ở dạng kết hợp với chất b-cyclodextrin biểu hiện độc tính

thấp hơn và tăng cường hiệu quả chống khối u [223]. Từ các kết quả ghi nhận

được, Padhye và cs (2010) [166] đã mô phỏng hoạt động của Plumbagin như sau

(Hình 1.4):

kích thích

- Phản ứng oxy hóa

kìm hãm

chuyên biệt

Plumbagin

- Tế bào chết theo chương trình

- Gây lỗi chu kỳ tế

bào

- NF-kB - Bcl-2 - Akt - Topoisomerase-II - STAT-3 - NMPs - uPA - Phát triển của vi

- Cảm ứng bức xạ

sinh vật

Hình 1.4. Sơ đồ tóm tắt hoạt động của Plumbagin [166].

1.2.5. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật

Các nghiên cứu về thu nhận hoạt chất Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

đã được thực hiện trên hai hướng chính: vi nhân giống và tổng hợp plumbagin

trong nuôi cấy in vitro, một số kết quả đã được công bố (Bảng 1.1):

Bảng 1.1. Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận

Plumbagin

Loài thực Nguồn Môi Chất ĐHSTTV và Nguồn thu Tài liệu

vật mẫu trường một số chất bổ sung nhận trích dẫn

Plumbagin

Drosera Thân, B5 2,4-D 0,2 mg/L, 0,2 Mô sẹo, tế bào [2]

burmanni lá, mg/L NAA

phát

hoa ½ MS [3]

P. Lá MS 4,44 μM BA + 1,42 Mô sẹo, chồi [198]

zeylanica hoặc μM IAA

thân

Long MS 0,5-1 mg/L BA + Chồi [199]

Thân 0,01 mg/L IAA

2,46 mμM IBA + Chồi [212]

Lóng MS 27,2 mμM Ads

thân

6,7 μM BA + 1,4 [48]

Lá MS μM IAA Chồi

Drosophll Heller 0,25 mg/L NAA + 5 Dịch huyền [160]

um Lóng mg/L IBA phù tế bào

lusitanicu thân + 0,05 mg//L BA

Plumbago Lá LS 0,2 mg/L NAA +0,2 Mô sẹo và dịch

zeylanica non (Lins mg/L 2,4-D huyền phù tế [42]

bào maier-

Skoog

,1965)

Plumbago Lá B5 1 mg/L NAA + 0,1 Rễ [169]

rosea non mg/L kinetin

1 mg/L IAA + 0,5 Mô sẹo và dịch [125]

Lá mg/L NAA huyền phù tế

+ 0,3 mg/L BA bào

Bảng 1.1. Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận

Plumbagin

Loài thực Nguồn Môi Chất ĐHSTTV và Nguồn thu Tài liệu

vật mẫu trường một số chất bổ sung nhận trích dẫn

Plumbagin

P. indica Lá MS 6,7 μM BA + 1,4 μM Chồi [48]

IAA

+ 370 μM Ads

Thân MS 1,5 mg/L kinetin + Mô sẹo [207]

2,5 mg/L 2,4-D

Chồi ½ MS 3 mg/L BA Chồi [36]

Rễ tơ B5 Rễ tơ [239]

Dionea Toàn McC 0,22 mg/L 2,4-D Dịch huyền [98]

muscipula cây (McC + 0,18 mg/L NAA phù tế bào

own-

Lloyd,

1981)

Drosera Đoạn ¼ MS 0,5 mg/L BAP Toàn cây [242]

indica thân

Plumbago Cành MS 0,49 mmol/L IBA Rễ tơ [252]

zeylanica non

Bảng 1.1. Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận

Plumbagin

Loài thực Nguồn Môi Chất ĐHSTTV và Nguồn thu Tài liệu

vật mẫu trường một số chất bổ sung nhận trích dẫn

Plumbagin

P. indica Rễ, MS 0,2 mg/L NAA, 0,2 Dịch huyền [175]

Thân, mg/L 2,4-D + 0,5 phù tế bào

Lá mg/L kinetin

MS 0,2 mg/L NAA + 0,2 Mô sẹo

mg/L 2,4-D + 0,5

mg/L kinetin

30 g/L sucrose. Rễ tơ MS

MS Plumbago Lá 1,0 mg/L IBA và 0,5 Rễ bất định [225]

zeylanica mg/L NAA và rễ tơ

Plumbago Rễ tơ MS GA3 +NAA [75]

indica (0,5mg/L)

Plumbago Chồi MS 2,0 mg/L IAA – 0,02 Mô sẹo [257]

scandens mg/L BAP – 0,5

L mg/L GA3

P. rosea L. Rễ tơ MS 0 Rễ tơ [178]

Drosera Mô B5 2 mg/L NAA và 0,5 Tế bào [185]

burmani sẹo mg/L BAP

1.3 Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật

1.3.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp nhiều loại dược liệu quan trọng vì chúng có

thể tạo ra các đơn vị hóa học và các phân tử có hoạt tính sinh học khác nhau qua

quá trình trao đổi chất. Tế bào thực vật thực hiện cả hai quá trình chuyển hóa sơ

cấp và thứ cấp. Chuyển hóa sơ cấp liên quan đến việc tổng hợp các

polysaccharide, protein, chất béo, RNA và DNA thông qua việc sử dụng các loại

đường, amino acid, axid béo và nucleotide. Trong khi trao đổi chất thứ cấp được

kích hoạt chỉ trong giai đoạn đặc biệt của sự tăng trưởng và phát triển hoặc khi bị

stress như thiếu hụt các chất dinh dưỡng hoặc sự tấn công của vi sinh vật [278].

Các chất chuyển hóa thứ cấp phân bố rất hạn chế so với các chất chuyển

hóa sơ cấp trong thực vật. Chúng thường được tìm thấy chỉ trong một loài thực

vật hoặc một nhóm liên quan đến phân loại học của các loài. Nồng độ cao của

chất chuyển hóa thứ cấp có thể làm tăng tính kháng của thực vật. Việc tạo ra các

chất thứ cấp được cho là tiêu tốn năng lượng, làm giảm khả năng tăng trưởng và

sinh sản ở thực vật [110], [220]. Do đó, các chất chuyển hóa có đặc tính kháng

(còn gọi là prohibitin hoặc phytoanticipin) và các chất được kích thích chuyển

hóa hình thành để đáp ứng với nhiễm trùng liên quan đến con đường tổng hợp

enzyme (được gọi là phytoalexin) [89], [249]. Phytoanticipin tiêu thụ nhiều năng

lượng, carbon và biểu hiện tính thích nghi trong điều kiện tự nhiên [142], nhưng

được ghi nhận là loại bảo vệ đầu tiên trước các tác nhân gây bệnh. Ngược lại, sản

xuất phytoalexin có thể mất hai hoặc ba ngày do hệ thống enzyme cần phải được

tổng hợp [89].

Chất chuyển hóa thứ cấp thường được tạo ra bởi quá trình chuyển hóa,

như quá trình methyl hóa, hydroxyl hóa và glycosyl hóa các chất chuyển hóa sơ

cấp. Do đó, các chất chuyển hóa thứ cấp là đa dạng hơn các chất chuyển hóa sơ

cấp và được phân loại trên cơ sở cấu trúc hóa học (vòng thơm, đường), thành

phần (có chứa nitơ hay không), khả năng hòa tan trong các dung môi khác nhau

hoặc con đường mà chúng được tổng hợp [41]. Hiện nay, các hợp chất thứ cấp

được chuyển hóa bởi thực vật được chia làm 4 nhóm chính [145]:

- Nhóm terpen: Được tạo thành nhóm lớn nhất của các chất chuyển hóa thứ

cấp và được thống nhất bởi các chất này có nguồn gốc chung là sinh tổng hợp từ

acetyl-CoA hoặc qua trung gian glycolytic [69], [83], [90]. Các terpen được cho

là tham gia vào việc bảo vệ thực vật, như là chất có độc tố và đe dọa các loài côn

trùng và động vật ăn thực vật [83].

- Nhóm hợp chất phenolic: Thực vật tạo ra một lượng lớn các sản phẩm có

chứa một nhóm phenol, một nhóm chức năng hydroxyl gắn trên vòng thơm.

Nhóm phenolic có thể là một phần quan trọng của hệ thống bảo vệ ở thực vật

nhằm chống sâu bệnh và bệnh tật như rễ bị bệnh tuyến trùng ký sinh [273].

- Nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp có chứa lưu huỳnh: Chúng bao gồm

GSH (glutathione), GSL (glucosinolate), phytoalexin, thionin, defensin và allinin

đã được liên kết trực tiếp hoặc gián tiếp với việc bảo vệ ở thực vật chống lại tác

nhân gây bệnh của vi sinh vật [91], [93], [201] và một số trong số chúng được

cho là tham gia vào các SIR (Sulfur induced resistance) [26].

- Nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp có chứa Nitơ: Chúng bao gồm các

alkaloid, glucosides cyanogenic và các axit amin không protein. Hầu hết trong số

chúng được sinh tổng hợp từ các amino acid phổ biến.

1.3.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp

Các nghiên cứu dựa trên đánh dấu đồng vị phóng xạ [52], [211] và sử

dụng công cụ di truyền (loại bỏ các gen có vai trò quan trọng để chia cắt con

đường chuyển hóa thứ cấp ở thực vật) [147], đã xác định một số con đường tạo

ra cyanogenic glycoside, glucosinolate, alkaloid và các amino acid không protein

(NPAAs), amin, flavonoid và một số terpen, các enzyme xúc tác các bước riêng

lẽ. Một số gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme trong con đường tạo ra isoquinolin,

indole, pyrrolidin, pyrrolizidine, tropane alkaloid, flavonoid, coumarin, NPAAs,

mono-, sesqui và triterpene, đã được phân lập và xác định [176], [209], [280].

Mặc dù chất chuyển hóa thứ cấp rất đa dạng, song đều được tạo ra từ các

tiền chất có nguồn gốc từ đường qua trao đổi chất sơ cấp sinh ra trên một số con

đường chuyển hóa như glycolysis, chu trình Krebs hoặc shikimate.

Các hợp chất thứ cấp được tạo ra có định hướng từ các cơ chất ít chuyên

biệt bằng một số con đường chuyển hóa hạn chế thông qua sự điều hòa sinh tổng

hợp bởi các enzyme. Một số enzyme tham gia vào việc phân cắt sản phẩm trao

đổi thứ cấp đã được xác định như glucosidase, esterase và hydrolase,…Sinh tổng

hợp các hợp chất thứ cấp là một quá trình phối hợp, trong đó bao gồm trao đổi và

vận chuyển qua các kênh trên màng tế bào (Hình 1.7). Kênh có thể liên quan đến

các loại tế bào khác nhau và cô lập các hoạt động. Các quá trình này đảm bảo

một quá trình tổng hợp cụ thể và tránh lỗi trong quá trình trao đổi chất [104],

[271].

Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp được chuyên biệt hóa trong

tế bào thực vật (Hình 1.5). Mặc dù hầu hết các con đường sinh tổng hợp đều xảy

ra trong tế bào chất, song có một số alkaloid (như coniine, quinolizidine và

caffeine), furanocoumarin và một số terpen (như monoterpene, diterpene, đường

phosphate) lại được sinh tổng hợp trong lục lạp [194], [270]. Sesquiterpene,

sterol và dolichol được sản xuất trong lưới nội chất (ER) hoặc bào tương (ngăn

cytosolic). Sinh tổng hợp coniine và amin được xác định là xảy ra trong ty thể

[194], [269], còn các bước sinh tổng hợp protoberberine xảy ra trong túi nội chất

[280]. Bước hydroxyl hóa thường được xúc tác bởi các enzyme liên kết màng và

trong lưới nội chất. ER không hạt cũng có lẽ là vị trí để tổng hợp các hợp chất

khác tan trong dầu.

Lưới nội chất (thực hiện bước thủy giải các hợp chất béo)

Dịch bào (hầu hết các chất phân cực)

Lục lạp: một vài alkaloid (coniine, quinolizidines, caffeine) và một vài terpene

nc

Ty thể (một vài amine, conium, alkaloid)

2 4 GS-SM

3 SM H+

ATP

5

ADP

1 SM

ATP

ADP

H+

H+ H+

H+

ATP

Vi thể (một vài alkaloid, protoberberine)

H+

ADP

Không bào (Alkaloid, NPAA, cyanogen, glucosinolate, glycoside, saponin, anthocyanin, flavonoid, cardenolides, sugar)

6

Hình 1.5. Sinh tổng hợp và trao đổi các chất thứ cấp ở các bào quan: SM -

Secondary Metabolites; GS-SM - Conjugate of SM with glutathione; NPAAs -

Non-Protein Amino Acids; ATP - Adenosine Triphosphate; ADP - Adenosine

Diphosphate; mt - Mitochondrion; cp - Chloroplast; nc - Nucleus; 1- Passive

transport; 2 - Free diffusion; 3 - H+/SM antiporter; 4 - ABC transporter for SM

conjugated with glutathione; 5 - ABC transporter for free SM; 6 - H+-ATPase.

1.3.3. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật

Thực vật như là một nguồn cung cấp dược liệu quan trọng thông qua

những khám phá về vai trò của các chất có hoạt tính sinh học khác nhau như

taxol, vincristin, vinblastine, metformin, morphine,…Thuốc aspirin tổng hợp

được sử dụng rộng rãi hiện nay cũng được phát hiện từ thực vật [190]. Nhiều loại

thuốc có nguồn gốc từ thực vật như Prostratin, Capsorol và hơn 60 hợp chất

chống ung thư đang được thử nghiệm hoạt tính tiền lâm sàng cùng với việc nhiều

loài thảo dược được bổ sung ở dạng thực phẩm chức năng và qua chế độ ăn uống

[202], [230].

Thuốc từ thực vật thường được tạo ra thông qua ly trích các hoạt chất vẫn

đang giữ một vai trò quan trọng. Ghi nhận cho thấy, có sự suy giảm hoạt tính của

các hợp chất tương tự được tổng hợp bằng con đường hóa học. Đó có thể là do

các hợp chất thứ cấp thường có cấu trúc rất phức tạp với nhiều trung tâm không

đối xứng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sinh học và thường rất khó có

được bằng con đường tổng hợp [124], [177].

Hiện nay, môi trường sống tự nhiên của nhiều loài thực vật đang dần biến

mất do mất ổn định môi trường và khai thác không phù hợp, do đó làm cho thực

vật không có điều kiện thuận lợi để tích lũy các chất chuyển hóa thứ cấp và

nhiều hợp chất hữu ích khác còn chưa được khám phá. Nuôi cấy tế bào thực vật

được coi là một lựa chọn đầy hứa hẹn cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh

học khó có thể thu được bằng cách tổng hợp hóa học [124].

Nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật đã được thực hiện dựa trên thực tế là

mỗi tế bào thực vật có khả năng phát triển và nhân sinh khối ở môi trường có

kích thích, trong đó các tế bào có đầy đủ các gen cần thiết cho tất cả các chức

năng của một cây hoàn chỉnh, bao gồm cả sự trao đổi chất thứ cấp [253]. Hệ

thống nuôi cấy tế bào có lợi thế trong việc nuôi cấy ở quy mô lớn của các tế bào

thực vật, tạo thành một nguồn liên tục và đáng tin cậy của các chất chuyển hóa

thứ cấp và có thể được tinh sạch dễ dàng do sự vắng mặt của một lượng đáng kể

của các sắc tố. Phương pháp này loại bỏ tất cả những hạn chế theo mùa và loại

bỏ những rào cản địa lý để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp [112]. Nuôi cấy

mô thực vật đã được áp dụng để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp trên quy

mô thương mại từ cuối năm 1950, như atropine được tổng hợp và tích lũy trong

rễ và trong mô sẹo của Atropa belladonna [267].

1.4. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp

Các hợp chất có nguồn gốc thực vật là nguồn có giá trị, được sử dụng

trong dược phẩm, hương liệu, thuốc nhuộm, dầu và các loại nhựa [19], [173].

Các hợp chất này thường có cấu trúc rất phức tạp và đối xứng. Do đó, trong một

số trường hợp tổng hợp hữu cơ thường không có hiệu quả và ly trích từ thực vật

được xem là giải pháp chính được sử dụng để sản xuất các hợp chất thứ cấp quan

trọng [19], [53]. Tùy thuộc vào loài thực vật, phương pháp canh tác [116], mầm

bệnh và sự thay đổi khí hậu sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp.

Nuôi cấy dịch treo tế bào đã được coi là một sự thay thế cho quá trình sản

xuất nông nghiệp để thu nhận các hợp chất thứ cấp. Mặc dù đã có một số sản

phẩm đã được thương mại hóa dựa trên nuôi cấy tế bào thực vật [46], [72],

[116], thách thức lớn nhất của sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy dịch treo

tế bào thực vật là các hợp chất này thường được tạo ra bởi các tế bào chuyên biệt

và ở giai đoạn phát triển khác nhau [19]. Một số hợp chất không được tổng hợp

nếu tế bào không ở trạng thái đã được biệt hóa [23]. Do đó, tế bào thực vật nuôi

cấy chưa biệt hóa thường bị mất một phần hoặc hoàn toàn khả năng tích lũy các

hợp chất thứ cấp [37], [196]. Mặc dù có một số ghi nhận sự nuôi cấy đồng thời

với các mô đã biệt hóa (ví dụ như chồi, rễ) đang được sử dụng để tạo ra các hợp

chất thứ cấp [137], [233], song hiện nay đang tập trung vào hướng rễ được

chuyển gen (rễ tơ).

Rễ tơ thường phát triển nhanh bằng hoặc nhanh hơn so với nuôi cấy tế bào

thực vật [37], [67] và không yêu cầu bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật

trong môi trường nuôi cấy. Lợi thế lớn nhất của rễ tơ là khả năng sinh tổng hợp

các hợp chất thứ cấp bằng hoặc cao hơn so với cây bố mẹ [20], [122]. Ngay cả

trong trường hợp các hợp chất thứ cấp chỉ tích lũy ở các bộ phận trên mặt đất của

cây hoàn chỉnh, nhưng nuôi cấy rễ tơ đã được chứng minh có khả năng tích lũy

các chất chuyển hóa này. Như chất lawsone thường chỉ tích lũy ở phần trên

không của cây, nhưng rễ tơ của cây Lawsonia inermis nuôi ở môi trường MS

hoặc ½ MS [158] có thể tạo ra lawsone trong điều kiện tối [18]. Ngoài ra, do

không xác định được vị trí chèn của T –DNA trong bộ gen của tế bào chủ nên

các rễ được chuyển gen cho thấy tốc độ tăng trưởng và tích lũy các hợp chất thứ

cấp khác nhau. Rễ tơ có đặc tính di truyền độc lập, sinh tổng hợp ổn định và

không bị mất đặc tính trong quá trình nuôi cấy tạo ra các chất trao đổi thứ cấp

[67].

Sinh tổng hợp chất chuyển hóa từ rễ tơ trong điều kiện in vitro bị ảnh

hưởng bởi yếu tố môi trường và dinh dưỡng. Ngoài ra, khi bổ sung một số yếu tố

ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy như: chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tiền

chất và elicitor cũng ảnh hưởng đến sự phát triển rễ tơ và hàm lượng các hoạt

chất. Đã có nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện và tăng cường khả năng sinh tổng

hợp các hợp chất thứ cấp từ rễ tơ, như cải thiện điều kiện nuôi cấy, sàng lọc dòng

chuyển gen, lựa chọn dòng vi khuẩn,... Tuy nhiên, chất cảm ứng thường được áp

dụng để nâng cao năng suất trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ. Nhiều yếu tố hóa học,

sinh học và vật lý khác nhau gây cảm ứng làm thay đổi hàm lượng và chất lượng

các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học, kích thích qua con đường enzyme

[12], [27].

1.4.1. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật

Rễ tơ được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes do kết quả của

việc chuyển DNA (T -DNA) trong Ri- plasmid ở vi khuẩn được chuyển và biểu

hiện ở tế bào thực vật. Quá trình chuyển gen tạo ra sản phẩm phụ và rễ tơ sẽ xảy

ra tại hoặc gần vị trí nhiễm. Ngoài ra, các opine tạo ra được sử dụng như nguồn

thức ăn cho vi khuẩn [40].

T- DNA của A.rhizogenes gồm hai đoạn không tiếp giáp của DNA, TL-

DNA và TR- DNA, được chuyển nạp một cách riêng biệt vào nhiễm sắc thể thực

vật [102], [109]. Sự tích hợp của TL- DNA, đặc biệt là gen rol (rolA, rolB, rolC

và rolD) vào bộ gen của cây để kích thích hình thành rễ tơ. Những gen rol trên

TL- DNA chịu trách nhiệm chủ yếu sự biểu hiện của rễ tơ [227], [268]. TR -DNA

chứa gen aux (aux1 và aux2) giữ vai trò là điều kiện nhưng không cần thiết trong

hình thành rễ tơ [34], [268].

Trong tự nhiên, vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chuyển các đoạn

DNA vào các loài thực vật hai lá mầm để tạo ra các amino acid bất thường

(opine) làm nguồn dinh dưỡng cho nó. Rễ tơ có đặc tính tăng trưởng nhanh, di

truyền và sinh hóa ổn định, tăng trưởng trong môi trường không có chất điều hòa

sinh trưởng thực vật, điều này đã thúc đẩy việc sử dụng nuôi cấy rễ tơ trong

nghiên cứu về công nghệ sinh học thực vật: Đầu tiên, rễ tơ nuôi cấy được sử

dụng như hệ thống mô hình cho sự trao đổi chất và sinh lý học thực vật và sau đó

được sử dụng như một giải pháp thay thế kỹ thuật nuôi cấy dịch huyền phù để

thu nhận hoạt chất dùng trong y dược và hoạt chất chuyên biệt [214].

1.4.2. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes

1.4.2.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes là một loài vi khuẩn gram âm, gây bệnh trên

tầng lông hút ở rễ cây song tử diệp. A. rhizogenes chứa plasmid có khả năng tạo

rễ, được gọi là “Ri plasmid”. Đoạn T-DNA của Ri plasmid sẽ được chuyển vào

nhân tế bào thực vật. Phần lớn các loài Agrobacterium chỉ chứa một đoạn T-

DNA, trong khi vài loài khác (như kiểu Ri-plasmid mang agropine) lại mang hai

đoạn T-DNA độc lập, được biểu diễn là TL-DNA và TR-DNA (Hình 1.6). TR-

DNA có tính tương đồng cao đối với T-DNA của Ti-plasmid ở A. tumefaciens,

trong khi TL-DNA khác biệt đáng kể [164]. Cả TL-DNA và TR-DNA được độc

lập chuyển vào bộ gen của tế bào thực vật chủ, trong khi quá trình chuyển TL-

DNA lại cần thiết cho sự cảm ứng hiện tượng tạo rễ tơ, quá trình chuyển TR-

DNA không gây ra sự hình thành rễ [164], [213]. TR-DNA chứa hai gen, iaaM

và iaaH, chịu trách nhiệm sinh tổng hợp auxin và các gen khác chịu trách nhiệm

sinh tổng hợp các opine manopine (mas1’ và mas2’) và agropine (ags). TL-DNA

mang 18 khung đọc mở (ORF), bốn trong số đó cần thiết cho sự hình thành rễ tơ:

ORF10, ORF11, ORF12 và ORF15 lần lượt tương ứng với các gen rolA, rolB,

rolC và rolD. Gen rolB cần thiết cho sự cảm ứng tạo rễ. Thậm chí khi biểu hiện

một mình, gen rolB cũng có khả năng cảm ứng hình thành rễ tơ [164]. Các gen

khác của đoạn DNA chuyển vào làm trung gian hình thành những kiểu hình mới

như khối u và rễ tơ, tiết ra môi trường một chất gọi là các opine được

Agrobacterium sử dụng làm nguồn dinh dưỡng [266].

Hình 1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes [268]

1.4.2.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế

bào thực vật

Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes được

trải qua nhiều bước khác nhau (Hình 1.7):

- Sự cảm ứng các hợp chất hóa học từ thực vật: Khi bị tổn thương, thực vật

giải phóng một hợp chất có bản chất phenol lôi cuốn vi khuẩn. Người ta tìm thấy

có bảy hợp chất phenol cần thiết cho việc nhận biết ký chủ thích hợp khi ở nồng

độ rất thấp (10-7 M) và hoạt hóa gen vir ở nồng độ cao hơn (khoảng 10-5-10-4 M).

- Sự tiếp xúc và gắn vào tế bào thực vật: Khi tiếp xúc với thực vật, A.

rhizogenes gắn chặt vào thụ quan trên bề mặt tế bào thực vật và bắt đầu việc tổng

hợp cellulose, tạo ra mối liên hệ chắc chắn giữa hai tế bào. Các polysaccharide

trên bề mặt vi khuẩn được chứng minh có vai trò quan trọng trong quá trình xâm

nhiễm và tương tác với ký chủ. Phản ứng giải phóng đường và các hợp chất phổ

biến khác có trong rễ xảy ra ở giai đoạn này. Các nhân tố di truyền thuộc nhiễm

sắc thể giữ vai trò gắn vi khuẩn lên tế bào thực vật gồm có các locus:

 chva và chvb có liên quan đến sự tổng hợp và tiết β-1,2 glucan.

 chve cần để gia tăng lượng đường cho sự cảm ứng các gen vir và các

hợp chất hóa học từ vi khuẩn, chịu trách nhiệm cho sự tổng hợp các sợi

cellulose.

 psca (exoC) giữ vai trò tổng hợp cylic glucan và succinoglycan acid.

 Att liên quan đến các protein trên bề mặt tế bào.

- Hoạt hóa các gen vir: Việc chuyển T-DNA qua trung gian bởi các sản

phẩm được mã hóa bởi vùng vir nằm trên Ri plasmid. Chức năng của các protein

Vir đóng vai trò trong sự chuyên biệt về phạm vi ký chủ của chủng vi khuẩn đối

với các loài thực vật khác nhau. Vùng này có kích thước 30-40 kb, bao gồm:

 6 operon thiết yếu: virA, virB, virC, virD, virE và virG

 2 operon ít thiết yếu virF và virH (chỉ có ở Ti plasmid octopine)

Số gen ở mỗi operon khác nhau, virA, virG và virF chỉ có một gen; virE, virC

và virH có hai gen; virD và virB lần lượt có 4 và 11 gen. Các operon được biểu

hiện chủ yếu là virA và virG mã hóa cho một hệ thống gồm hai thành phần: yếu

tố thụ cảm và yếu tố điều hòa (VirA-VirG). Các hợp chất phenol tác động thông

qua hệ thống này và hoạt hóa sự phiên mã của gen vir khác.

- Hoạt hóa VirA, VirG: VirA là một protein kinase (trên bề mặt tế bào vi

khuẩn) cảm ứng xuyên màng hai cấu tử, nhận biết các phân tử tín hiệu và sau đó

chuyển nhóm phosphoryl đến một protein khác (VirG). Ở trạng thái phosphoryl

hóa protein VirG hoạt động như một nhân tố điều hòa sự biểu hiện của gen vir,

kích thích sự phiên mã các gen trên Ri - plasmid.

Các tín hiệu cho sự hoạt hóa protein VirA gồm có pH acid, các hợp chất

phenol (acetosyringone) và một số loại monosaccharide giữ vai trò hỗ trợ. Ngoài

ra còn phụ thuộc một số nhân tố bên ngoài như nhiệt độ và pH. Người ta nhận

thấy, ở mô thuốc lá bị tổn thương sản xuất một số hợp chất phenol là

acetosyringone (4-acetyl-2, 6-dimethoxylphenol) và -hydroxy-acetosyringone

(4-(2-hydroxy-acetyl)-2-6-dimethoxylphenol). Các thí nghiệm chuyển gen hầu

hết đều sử dụng acetosyringone trong thời gian gây nhiễm.

Ở nhiệt độ cao hơn 320C các gen vir không biểu hiện vì có sự thay đổi về

cấu hình trong sự xoắn gập của VirA và do đó hoạt tính của nó cũng mất đi.

- Chuyển T-DNA: Bất kỳ DNA nào nằm giữa hai bờ trên cấu trúc Ri-

plasmid của A. rhizogenes sẽ được chuyển vào thực vật và sáp nhập vào genome.

Các protein tham gia vào quá trình này gồm có:

 Protein VirD1 và VirD2: Nhận biết các trình tự bờ và đánh dấu ở cuối

chuỗi của mỗi trình tự. Liên kết cộng hóa trị của VirD2 với đầu 5’ còn để ngăn

cản sự thủy giải của ss-T và giúp phân biệt đầu 5’ của phức hợp chuyển T- DNA.

VirD1 tương tác với vùng mở đầu của chuỗi ss-T, cần thiết cho sự cắt của

VirD2. Protein VirC1: Chức năng vẫn chưa được xác định rõ, có thể liên quan

đến sự tổng hợp chuỗi T-DNA.

 Protein VirE2: là một protein nối cộng hóa trị với DNA mạch đơn chứa

hai tín hiệu định vị nhân. Phức hợp protein ss-T-DNA được chuyển vị đến nhân

qua màng, vách tế bào và các khoảng gian bào. Sự liên kết với VirE2 giúp ngăn

cản sự tấn công của các nuclease và làm giảm đường kính của phức hợp giúp cho

sự chuyển vị qua các kênh trên màng dễ dàng hơn.

 VirD2: chứa một tín hiệu định vị nhân, cũng như VirE2, giữ vai trò quan

trọng nhất khi phức hợp được chuyển vào trong tế bào thực vật. Tuy nhiên, sự

mất đi tín hiệu định vị nhân ở một số các protein này chỉ làm giảm đi chứ không

hoàn toàn ức chế chuyển và sáp nhập T-DNA vào genome thực vật.

 VirB là các protein có đặc tính tương tự với protein liên kết với màng, có

vai trò trong sự phát sinh cấu trúc bề mặt tế bào thích hợp cho sự di chuyển của

các phức hợp ss-T-DNA từ vi khuẩn đến thực vật.

 Hai operon phụ có mặt trong Ti-plasmid octopine là virF và virH. Operon

virF mã hóa cho protein 23 kDa thực hiện chức năng khi phức hợp T-DNA vào

bên trong tế bào thực vật. Operon virH bao gồm hai gen mã hóa cho hai protein

VirH1 và VirH2. Những protein Vir này không thiết yếu nhưng có thể làm tăng

cường hiệu quả chuyển gen vào bên trong tế bào thực vật, khử độc các hợp chất

thực vật có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn [108].

Hình 1.7. Sự tương tác A.rhizogenes và cơ chế chuyển T-DNA.

1.4.2.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

trong mô thực vật

A. rhizogenes gây ra sự phát triển rễ tơ ở thực vật thông qua việc chuyển

một hoặc hai đoạn T-DNA kích thích rễ tơ từ Ri- plasmid vào bộ gen thực vật

chủ [102], [109], [268]. Trong số 18 vùng ORF của Ri T-DNA [76] thì bốn vùng

tương ứng với vị trí của 4 gen: rolA, B, C và D là các đột biến bất hoạt ở vùng

này của A. rhizogenes [284. Những gen này tương ứng với ORF 10, 11, 12 và 15

của TL-DNA [76].

Trong số các gen rol thì rolC đã được nghiên cứu nhiều nhất vì có hiệu

quả nhất trong số các gen tham gia vào việc cải thiện các giống. RolC tác động

làm giảm ưu thế ngọn, thay đổi hình thái lá và giảm sản lượng hạt [210]. Ngoài

việc cải thiện chiều cao và sự gia tăng chồi bên làm cho cây có một kiểu hình

rậm rạp, cây mang gen rolC cho nhiều hoa hơn, hoa nhỏ và hoa được cải thiện.

Đáng ngạc nhiên hơn là các cây này có hệ rễ tốt hơn và biểu hiện nhanh những

đặc điểm mong muốn.

Các cây chứa gen rolB cho hoa đa hình và nhiều rễ bất định [34], [102];

các cây mang gen rolA cho lá nhăn nheo và giảm chiều dài lóng [210], [34]. Ảnh

hưởng của rolD cũng đã được chứng minh là giữ vai trò khởi đầu và kích thích

ra hoa ở cả cây Thuốc lá trồng lẫn ở cây thuốc lá nuôi cấy mô [224].

Sự hình thành rễ tơ từ các tế bào bị nhiễm được điều hòa bởi các gen rolA,

rolB và rolC [34], [210], [227]. Trong số này, các vùng rolB được cho là quan

trọng nhất đối với sự kích thích ra rễ tơ [14], [33]. Gen rolB độc lập có thể kích

thích ra rễ, trong khi rolC và ORF13 và ORF14 của TL-DNA trong Ri- plasmid

cần sự kích thích hỗ trợ của gen rolB trong cảm ứng tạo rễ [14].

 Đặc tính của gen rolB

Gen rolB được xem là yếu tố gây ra sự hình thành rễ bất định ở thực vật,

đặc biệt nó kích thích tạo ra nhiều rễ trong điều kiện nuôi cấy mô [33]. Những

hiện tượng này chỉ ra rằng protein rolB có ảnh hưởng rất quan trọng đến sự hình

thành của cả hai loại rễ thứ cấp và rễ bất định. Do đó, việc làm sáng tỏ được các

chức năng của protein rolB có thể giúp hiểu biết sâu hơn về sự hình thành rễ ở

thực vật.

Sự khác nhau về khả năng tăng trưởng giữa các dòng rễ tơ là do sự thay

đổi mức biểu hiện của gen rolB [237], [238]. Thực nghiệm cho thấy, sự biểu hiện

quá mức của gen rolB dưới sự điều hòa của RNA promoter CAMV35S (P35S)

sẽ ức chế sự hình thành rễ bất định [240] và kích thích sự chết của tế bào trong

cả hai trường hợp mô sẹo và lá non [210].

Protein rolB là beta–glucosidase. Trong các thí nghiệm in vitro nhận thấy

protein rolB làm tăng hàm lượng indoleacetic acid tự do (IAA, auxin nội sinh)

bằng cách bất hoạt hoạt tính indoleacetic acid qua sự kết hợp với glucose [59].

Tuy nhiên, IAA - glucoside trong mô thực vật không phải là cơ chất cho protein

rolB [163]. Chức năng của protein rolB còn được xem như một Tyrosine

phosphatase hoặc như là một protein liên kết auxin [64], [65].

Gen rolB có thể hoạt động như một yếu tố tiền hoạt động/trung gian phiên

mã [154]. Các protein 1724 rolB tương tác chặt chẽ với Nt14 - 3-3 omegaII ở tế

bào thực vật [154]. Mặc dù đặc tính kích thích rễ bất định gây ra bởi protein

1724 của rolB vẫn còn chưa rõ, nhưng protein 1724 của rolB được quan tâm bởi

sự tương tác giữa protein 1724 rolB với Nt14 -3 -3- omega- II. Protein của họ

gen rolB có thể thay đổi linh hoạt trong cây bằng cách liên kết với các protein

thực vật khác [154]. Sự phát triển hệ thống mô hình thực vật mang rolB là rất

quan trọng trong kỹ thuật sinh học sản xuất các chất thứ cấp từ thực vật.

Ở cây Rubia cordifolia hàm lượng anthraquinone (AQ) tăng lên rất nhiều

ở mẫu chuyển gen rolC và rolB so với mẫu không chuyển gen. Methyl

jasmonate và salicylic acid tăng mạnh tích lũy AQ trong mô sẹo chuyển gen và

không chuyển gen, do đó các chất này có thể được cho là tín hiệu tiềm năng

trong chuyển hóa hợp chất thứ cấp ở thực vật [31]. Kết quả tương tự cũng nhận

được trong nuôi cấy tế bào Vitisamurensis và mô sẹo chuyển gen rolB, hàm

lượng hoạt chất resveratrol có đến 3,15% trọng lượng khô [121].

Điều thú vị là con đường tín hiệu mà các gen rolB kích hoạt các phản ứng

bảo vệ thực vật không phụ thuộc vào tín hiệu oxy hóa. Trong thực tế, tác dụng

kích thích của gen trong việc tạo stilben đã bị loại bỏ khi mô sẹo mang gen rolB

- được nuôi cấy trong sự hiện diện của một trong hai chất ức chế: Phenylarsine

oxit và Na- orthovanadate của Tyr phosphatase [121]. Những kết quả này chỉ ra

rằng sự phosphoryl hóa Tyr thực sự có liên quan đến chức năng kích thích của

gen rolB. Do đó, có một sự liên hệ giữa các tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp

stilben với sự phosphoryl hóa Tyr trong các tế bào Vitis amurensis. Nghiên cứu

gần đây cho thấy, sự phosphoryl hóa protein Tyr thực hiện chức năng quan trọng

trong thực vật như tín hiệu điều hòa hoạt động của MAP kinase, tín hiệu điều

hòa các yếu tố phiên mã và phản ứng oxy hóa chuyên biệt [132]. Kiselev và cs

(2007) [121] đề nghị bổ sung thêm một vai trò Phosphoryl hóa Tyr trong trao đổi

các chất thứ cấp ở thực vật. Điều này cho thấy, rolB giữ vai trò quan trọng trong

chuyển hóa các chất thứ cấp ở thực vật.

 Đặc tính của gen rolC

Những ảnh hưởng gen rolC đã được thử nghiệm rộng rãi trong nhiều loài

thực vật. Gen rolC ảnh hưởng đến kích thước và hình dạng của cây như làm giảm

chiều cao cây, chiều dài lóng, tăng khả năng sinh sản nhị đực, tăng ưu thế đỉnh và

tăng số lượng hoa [226]. Các tác động về hình thái: kích thước, màu sắc và hình

dạng lá phụ thuộc vào một số yếu tố như vị trí chèn vào của gen, số lượng bản

sao, sự đột biến, sự thay đổi nhiễm sắc thể và những thay đổi trong mức biểu hiện

[84], [123].

Các tác động lên hình thái của cây do gen rolC có thể là do hoạt tính

Cytokinin-beta-glucosidase làm tăng mức cytokinin [35], [59]. Ngoài ra, tế bào

Nhân sâm chuyển gen rolC chịu ảnh hưởng bởi một số loại carbohydrate. Trong

thực tế, hoạt tính của p-và-D-galactosidase và 1,3-p-D-glucanase tăng lên trong

các tế bào mang gen chuyển rolC so với các tế bào đối chứng [31]. Như vậy hoạt

động của gen rolC được quan tâm nhiều nhằm tìm hiểu xem cách biểu hiện gen

có thể gây ảnh hưởng gì đến trao đổi chất của các chất thứ cấp.

Tác dụng kích thích của rolC lên sự trao đổi các chất thứ cấp đã được

chứng minh bởi một số nghiên cứu với các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp khác

nhau như: Alkaloid tropane, Alkaloid pyridin, Indole alkaloid, Ginsenoside [28],

[167]. Gen rolC kích thích mạnh sinh tổng hợp các Anthraquinone phytoalexin

từ Shikimate trong nuôi cấy mô sẹo chuyển gen của cây Rubia cordifolia [34],

[35]. Khảo sát các con đường dẫn truyền tín hiệu cho thấy, các tín hiệu qua trung

gian gen rolC không liên quan đến các con đường bảo vệ thực vật. Đặc biệt, con

đường Ca2+-phụ thuộc NADPH oxidase cũng như qua trung gian Salicylic acid

và con đường Octadecanoid không bị ảnh hưởng trong các tế bào được chuyển

gen rolC của cây Rubiacordifolia [31], [32].

Gần đây, tác dụng ức chế của gen rolC trong việc tạo ra Rabdosiin và

Rosmarinic acid đã được phát hiện [32]. Giải thích cho các kết quả nhận được

qua tác động của rolC trong trao đổi chất thứ cấp là do có sự tương tác giữa gen

rolC với các yếu tố điều hòa có trong cây. Tuy chưa được biết về chuỗi các con

đường điều hòa tác động đến gen nhưng sự có mặt của protein Phosphatase có

thể là mục tiêu của gen rolC [32].

 Đặc tính của rolD

Các gen rolD gây khối u ở thực vật kích thích quá trình chuyển đổi phân

chia ở thực vật. Trong Cà chua, chèn rolD có nhiều tác dụng ảnh hưởng đến các

đặc tính liên quan đến năng suất cây trồng cũng như đến phản ứng tự vệ của cây

đối với tác nhân gây bệnh. Gen rolD được cho là có tác động đến sự gia tăng hoa

nhờ những thay đổi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở cây chuyển

gen [144]. Ở cây thuốc lá, gen rolD kích thích bổ sung quá trình ra hoa và làm

tăng số lượng hoa liên quan đến sự tích lũy Proline hoặc suy giảm của Ornithine

[144].

Kết quả phân tích sinh hóa cho thấy rolD mã hóa Ornithine

cyclodeaminase (OCD) với hoạt động xúc tác phụ thuộc NAD + chuyển

Ornithine thành Proline. Nồng độ Proline cao trong hoa Cà chua đã khiến một số

tác giả tranh luận về vai trò của rolD qua trung gian proline trong sự ra hoa

[246]. Tất cả thực vật chứa gen rolD được biểu hiện tính kháng mạnh đối với

độc tố ở các thí nghiệm có lượng ion được bổ sung cao hơn so với trong điều

kiện bình thường. Proline được tạo ra bởi hoạt động của gen rolD qua enzyme

OCD có thể giúp làm sáng tỏ về vai trò của protein này trong sự phát triển rễ tơ.

Trong thực tế đã ghi nhận được một sự gia tăng đáng kể hàm lượng proline trong

vùng đang tăng trưởng của rễ Ngô sơ cấp ở điều kiện ít nước. Phát hiện này cho

thấy vai trò sinh tổng hợp của Proline trong việc duy trì tăng trưởng rễ dưới các

điều kiện thiếu nước [254].

Sự gia tăng hàm lượng proline có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ sinh tổng hợp

các Glycoprotein chứa nhiều Hydroxyproline. Các protein này là thành phần cấu

trúc của vách tế bào thực vật và được cho là giữ vai trò quan trọng trong việc

điều hòa phân chia tế bào, tự gắn kết vách tế bào và nới rộng tế bào [251]. Ngoài

ra, kích thích tăng trưởng rễ thông qua sự biểu hiện gen rolD có liên quan đến sự

suy giảm Ornithine, một tiền chất Polyamine. Polyamine cũng được hỗ trợ bởi

các bằng chứng liên quan đến sự biểu hiện ở mức cao bất thường của Arginine

decarboxylase - enzyme tham gia vào sinh tổng hợp Polyamine, làm tăng hàm

lượng Putrescine và suy giảm sự tăng trưởng rễ ở cây Thuốc lá [246].

 Đặc tính của gen rolA và ORF13

Hoạt động của Protein rolA được coi như một yếu tố phiên mã [149] liên

quan đến sự trao đổi chất của Giberelin, như làm suy giảm hàm lượng Giberelin

ở cây Thuốc lá chuyển gen rolA [49], điều này được chứng minh qua cung cấp

chất ức chế sinh tổng hợp Giberellin [49]. Gen rolA cũng đáp ứng sự thay đổi

trong chuyển hóa polyamine bằng cách ức chế sự kết hợp của Protein rolA [141],

[235]. Đặc biệt khi theo dõi đặc tính vận chuyển qua màng của protein rolA cho

thấy tế bào chất của cây Thuốc lá chuyển gen rolA nhạy cảm với auxin hơn

[143].

Trình tự của ORF13 được bảo tồn cao trong Ri- plasmid kiểu Agropine,

Mannopine, Cucumopine và Mikimopine, đã được xác nhận ở cây Thuốc lá

(Nicotiana tabacum [NtORF13]) và (Nicotiana glauca [NgORF13]) [14], [71].

Trước đây, ORF13 được cho là mã hóa một yếu tố điều hòa sinh trưởng liên

quan đến tín hiệu hormone [94]. Tuy nhiên, một kết quả trái ngược đã được ghi

nhận, trong đó chức năng sinh hóa liên quan đến hormone cho các sản phẩm gen

orf13 bị loại [133]. Stieger và cs (2004) [232] cho rằng ORF13 biểu hiện đặc

tính tăng sự phân chia tế bào ở đỉnh sinh trưởng thực vật và hình thành nhanh

vòng mô phân sinh của lá.

1.4.2.4. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes

Có một số điều kiện cần thiết khi thiết lập hệ thống nuôi cấy rễ tơ cho các

loài thực vật. Đó là chủng vi khuẩn tạo rễ, mô thực vật thích hợp, kháng sinh để

giới hạn vi khuẩn lạ sau khi nhiễm Agobacterium và môi trường nuôi cấy phù

hợp. Dựa vào các opine tạo ra, các giống Agrobacterium rhizogenes được chia

làm 5 dòng: octopine, agropine, nopaline, mannopine và cucumopine [285].

Dòng agropine thường được sử dụng nhiều nhất vì dòng này có khả năng kích

thích ra rễ mạnh nhất. Hầu hết các vật liệu thực vật như trụ hạ diệp, lá, thân, đỉnh

rễ, lá mầm, tế bào chất, rễ,… đều có thể được dùng làm vật liệu tạo rễ tơ [16],

[86], [126]. Tuy nhiên, việc chọn vật liệu tạo rễ cũng phụ thuộc vào loài và độ

tuổi của thực vật. Để kích thích tạo rễ tơ, mô thực vật cần được làm tổn thương

và sau đó nuôi chung hoặc ủ chung với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.

Thường 2-3 ngày sau đó mô được chuyển vào môi trường lỏng với 1 trong các

kháng sinh sau: cefotaxime sodium, carbencilin disodium, vancomycin,

ampicillin sodium, claforan, streptomycin sulphate hoặc tetracycline …, hàm

lượng thay đổi từ 100 đến 500 µg/mL [86], [126]. Thời gian kích thích ra rễ tơ

tương đối ngắn, có thể từ 1 tuần đến vài tháng tùy theo loài thực vật. Rễ tơ đã

hình thành có thể nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng

thực vật. Các rễ tơ này sau đó được chọn lọc để nhân sinh khối thu hoạt chất

hoặc phục vụ nhân giống (Hình 1.8) [179].

Rễ tơ

NhiễmA.rhizogenes vào mô thực vật

Chọn dòng in vitro

Loài thực vật cần chuyển gen

Chọn lọc dòng rễ tơ

Biểu hiện gen của loài rễ tơ chọn lọc

Nhân giống từ rễ tơ

Nuôi cấy rễ tơ trên môi trường rắn và lỏng

Nuôi cấy trong Bioreactor

Hình 1.8. Sơ đồ nuôi cấy rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes [179].

1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp

chất thứ cấp

Cho đến nay, đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong việc kích thích sự hình

thành và tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ. Các nhân tố ảnh

hưởng đến sự gia tăng hoặc làm giảm hoạt tính sinh tổng hợp của nuôi cấy rễ tơ

đều được quan tâm để cố gắng hiểu về sự đa dạng, cũng như để có được hàm

lượng cao các hợp chất thứ cấp cần thiết. Ở thực vật, các con đường biến dưỡng

thứ cấp bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, như nguồn dinh dưỡng, các

nhân tố gây stress, ánh sáng và chất điều hoà tăng trưởng thực vật [85]. Vì vậy,

sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng rễ tơ cũng bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi

cấy [119].

Nhiều yếu tố khác nhau có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tạo sản phẩm

trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ. Các yếu tố như nguồn và hàm lượng

carbon; loại và hàm lượng các ion trong môi trường, pH, ánh sáng, chất điều hòa

sinh trưởng thực vật, nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi

thứ cấp [153], [250]. Các ion kim loại nặng, hàm lượng P, N, ammonia cũng

được nghiên cứu [174]. Ngoài ra, ảnh hưởng của auxin và các elicitor làm tăng

mức trao đổi thứ cấp cũng được quan tâm nghiên cứu [193], [221], [250].

1.5.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ

Ngoài việc lựa chọn cây bố mẹ cho sản phẩm mong muốn, các chủng

Agrobaterium rhizogenes cũng được quan tâm nghiên cứu để tạo ra các dòng rễ

tơ có hàm lượng hoạt chất mong muốn, vì các chủng vi khuẩn khác nhau có thể

có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả chuyển gen và chất lượng sản phẩm

chuyển gen. Giri và cs (2001) [86] chỉ ra rằng sự khác biệt giữa các chủng A4,

15834, K599, LBA 9402 và chủng 9340 thuộc A. rhizogenes, trong đó chủng

LBA 9365 được khẳng định là có khả năng cảm ứng tạo rễ ở A. annua với hàm

lượng artemisinin thu được cao hơn. Tuy nhiên, một số loài thực vật khác có thể

đáp ứng tốt hơn với một chủng A. rhizogenes khác nào đó [119].

1.5.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy

Thành phần của môi trường nuôi cấy rễ tơ giữ vai trò quan trọng trong

việc quyết định sự phát triển và tạo các hợp chất thứ cấp [85]. Sự tối ưu hoá

nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) và sự kết hợp thường

mang lại hiệu quả [119]. Việc thay đổi các yếu tố môi trường (mức độ dinh

dưỡng, ánh sáng, nguồn carbon,...) có hiệu quả góp phần làm gia tăng năng suất

[119], [264] như giảm lượng phosphat thường kích thích sự tích lũy sản phẩm

- sẽ làm tăng tổng hợp artemisinin ở rễ tơ của Thanh hao

[119]. Nguồn Nitrogen cũng đóng vai trò quan trọng [260], giảm nồng độ NH4

và tăng nồng độ NO3

hoa vàng (Artemisiaannua), trong khi hàm lượng nitrogen tổng cao lại ức chế sự

phát triển và sản suất hợp chất thứ cấp [260], [264].

Các yếu tố môi trường và thành phần dinh dưỡng tác động đến khả năng

tạo ra hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro. Tác động của ánh sáng, nhiệt độ

và pH (thông số quan trọng của môi trường nuôi cấy) đã được nghiên cứu và

được coi như là những yếu tố có thể sử dụng để kích thích tạo hiệu quả các hợp

chất thứ cấp.

Ánh sáng là rất cần thiết cho quá trình phát sinh hình thái như khởi sự cho

sự hình thành chồi, rễ và tạo phôi soma. Loại ánh sáng và cường độ của ánh sáng

cũng như thời gian chiếu sáng là rất quan trọng cho sự thành công nhất định

trong nuôi cấy tế bào thực vật. Ánh sáng đóng một vai trò quan trọng trong sự

phát triển, sự biệt hóa, hình thành mô, tạo ra các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp.

Ánh sáng cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và tích lũy các chất thứ

cấp. Ví dụ nuôi cấy rễ tơ cây Tagetes patula trong điều kiện sáng làm giảm

lượng sinh khối rễ tơ và hàm lượng thiophene thu được [157]; Rễ tơ cây

Ambrosia artemisiifolia khi nuôi ở điều kiện ánh sáng cũng cho thấy giảm sinh

khối và không tích lũy thiarubrine A (TA). Ánh sáng ảnh hưởng đến việc mở các

con đường chuyển hóa về phía hình thành các hợp chất thứ cấp thông qua thay

đổi màu sắc của mẫu cấy (rễ tơ nuôi trong bóng tối có màu hồng nhạt sẽ chuyển

thành màu đỏ khi chuyển sang nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng [24]. Sinh tổng

hợp shikonin ở Lithospermum erythrorhizon bị ức chế mạnh bởi ánh sáng, mặc

dù các điều kiện môi trường đã được tối ưu hóa [277]. Trái lại, ở một số thực vật

sinh tổng hợp isoflavones ở mô sẹo của loài Genista được kích thích bởi ánh

sáng [136].

Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh giữa 5 và 6 trước khử

trùng và giảm trong suốt thời gian đồng hóa amoniac và làm tăng quá trình hấp

thu nitrate [146]. Những thay đổi pH trong nuôi cấy tế bào bởi các phản ứng

chuyển hóa là cần thiết cho sự hấp thụ chất dinh dưỡng và duy trì tăng trưởng

khi nuôi cấy [63]. Mức pH thấp từ 3,5 – 4,5 làm giảm tích lũy các alkaloid trong

rễ tơ cây Brugmansia candida, nhưng ở độ pH 4,5 sự bài tiết các hợp chất thứ

cấp lại tăng lên đáng kể. Acetic acid và Citric acid kích thích sự bài tiết

scopolamine và hyoscyamine [180].

1.5.3. Ảnh hưởng của elicitor

Elicitor là yếu tố cảm ứng gây ra những thay đổi sinh lý khác nhau của

sinh vật. Theo nghĩa rộng thì 'elicitor' cho một thực vật nào đó, tùy thuộc yếu tố

tác động từ ngoài có thể gây ra phản ứng sinh lý biểu hiện qua thay đổi hình thái

và tích lũy phytoalexin tạo thành một hệ thống cơ chế bảo vệ ở thực vật. Hậu quả

thường dẫn đến sự gia tăng khả năng tổng hợp hoặc bài tiết các chất thứ cấp

[282].

Dựa vào nguồn gốc phát sinh các elicitor có thể được phân thành hai nhóm

chính: elicitor sinh học và elicitor không sinh học. Các elicitor sinh học là các

đại phân tử như oligosaccharide (ví dụ, chitin, chitosan), polysaccharide có

nguồn gốc từ vách tế bào thực vật (như pectin hoặc cellulose), phospholipid và

glycoprotein, các hợp chất phân tử lượng nhỏ như hydrogen peroxide, ethylene,

methyl jasmonate và salicylic acid. Elicitor không sinh học thường là các muối

vô cơ như thủy ngân clorua (HgCl2), đồng sunfate (CuSO4), calcium chloride

(CaCl2) và vanadyl sulfate (VSO4), kể cả các tác nhân vật lý gây stress như bức

xạ tia cực tím, vết thương cũng như các hóa chất gây tổn thương màng. Elicitor

tương tác với tế bào thực vật thông qua các cơ chế riêng biệt và phức tạp [22],

[47].

Các elicitor sinh học và không sinh học được sử dụng để kích thích sự

hình thành các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ, giúp rút ngắn thời gian và

đạt được sản phẩm có hàm lượng cao, đồng thời gia tăng sinh khối nuôi cấy

[188]. Các elicitor như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, polysaccharide,

glycoprotein, enzyme bất hoạt, xanthan, chitosan và muối của kim loại nặng

thường làm gia tăng tích lũy các hợp chất thứ cấp [119], [195]. Kết quả của một

số khảo sát cho thấy, artemisinin được tạo ra bởi rễ tơ A. annua tăng gấp 6 lần so

với đối chứng và đạt 1,8 g/mg sinh khối khô chỉ sau 6 ngày nuôi cấy nhờ bổ

sung 150 mg chitosan/L. Mức độ gia tăng phụ thuộc vào hàm lượng các elicitor

được sử dụng. Tương tự, bổ sung methyl jasmonate (0,2 mM) hoặc dịch chiết

nấm men (2 mg/ml) đã làm tăng sự sản xuất artemisinin lần lượt là 1,5 và 0,9

g/mg [184].

1.5.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp

Để công nghệ nuôi cấy thu nhận rễ tơ có giá trị, nhiều tiêu chí cần được

đáp ứng. Một trong số đó là đảm bảo có thể thu được hàm lượng các sản phẩm

trao đổi thứ cấp ở mức cần thiết. Yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến sự tích lũy

các hợp chất thứ cấp trong rễ tơ là thành phần các yếu tố dinh dưỡng và chất cảm

ứng elicitor. Thông thường, thành phần môi trường liên quan đến nồng độ và tỷ

lệ giữa carbon, nitơ, phốt pho và các nguồn chất dinh dưỡng khác. Phân tích đa

biến các thông số này, sau đó tìm ra những tương tác "môi trường dinh dưỡng –

sinh khối- hàm lượng các hợp chất thứ cấp" liên quan đến các hợp chất hóa học

trong hệ thống sinh học [81].

Nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy hiệu quả của việc ứng dụng nuôi

cấy rễ tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp như: rễ tơ cây Neem được nuôi cấy trên

môi trường Ohyama và Nitsch (1972) [165] tạo ra tối đa hàm lượng azadirachtin

so với môi trường Gamborg’s và MS [206]. Li và cs (2008) [134] đã ghi nhận

môi trường ½ MS lỏng phù hợp nhất cho khả năng tăng trưởng sinh khối khi

nuôi cấy rễ tơ cây Anisodus acutangulus và tạo ra tropane alkaloid. Romero và

cs (2009) [197] ghi nhận rằng việc sử dụng ½ khoáng đa lượng của môi trường

Gamborg’S B5, bổ sung 3,0% sucrose cho hiệu quả tăng rễ tơ cây Echinacea

hơn hai lần với các môi trường khác. Shinde và cs (2010) [218] đã đánh giá sự

- theo tỷ lệ 20:10, với

tăng trưởng và tích lũy các isoflavone trong nuôi rễ tơ cây Corylifolia Psoralea

+ và NO3

khi nuôi trên môi trường MS có bổ sung đủ NH4

kết quả ghi nhận được: năng suất daidzein tăng khi nuôi cấy trong môi trường có

hàm lượng sucrose tăng, trong khi hàm lượng sucrose giảm lại thích hợp cho

3- ở nồng độ thấp. Nuôi cấy rễ tơ cây Arachis hypogaea trên môi

việc tạo genistein. Rễ tơ tạo ra daidzein và genistein mức cao nhất trong sự hiện

-) đã

diện của PO4

+ và 22,85 mM NO3

trường MSV (Murashige và Skoog chứa 7,7 mM NH4

tạo ra tối đa hàm lượng resveratrol, arachidin-1 và arachidin-3 so với môi trường

Gamborg’s [43].

Tùy thuộc vào mối quan hệ giữa các sản phẩm sinh tổng hợp và thông số

phát triển rễ, môi trường sau đó được tối ưu hóa cho cả sinh trưởng và tạo hợp

chất đồng thời hoặc hai giai đoạn (sinh tổng hợp theo sau sinh trưởng) chiến lược

nuôi cấy sau đó có thể được phát triển [82]. Trong những năm gần đây, các

phương pháp đáp ứng bề mặt đã được sử dụng rộng rãi để tối ưu hóa trong nhiều

lĩnh vực nghiên cứu và tiến trình phát triển trong hóa học và công nghệ sinh học,

như áp dụng mô hình này để xác định điểm tối ưu hóa hàm lượng hyoscyamine

là 212,7% với chất cảm ứng là jacmonic acid (JA) đối với rễ tơ cây Datura

stramonium trong môi trường B5-OP (tối ưu) so với đối chứng (môi trường B5)

[200].

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến nhiều tiến trình phát

triển khác nhau, từ khi hạt nảy mầm đến sự hình thành rễ, chồi và hình hoa, liên

quan đến tăng trưởng thực vật, phát sinh hình thái và sự trao đổi chất thứ cấp.

Theo hầu hết các trường hợp, một hormone riêng lẻ có thể điều hòa nhiều con

đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Các chất điều hòa tăng trưởng thực

vật và elicitor được sử dụng để tăng cường sự phát triển và tạo các hợp chất thứ

cấp trong nuôi cấy rễ tơ thực vật. Jasmonic acid và methyl ester của jasmonic

acid, gọi chung là jasmonate, đã được xác định là yếu tố kích thích sinh tổng hợp

nhiều hợp chất thứ cấp ở nhiều loài thực vật khác nhau gồm các alkaloid,

terpenoid, glucosinolate và phenylpropanoid [66], [148]. Nitric oxide (NO) là

một khí hòa tan đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong mạng lưới tín

hiệu dẫn đến sinh tổng hợp các chất thứ cấp ở thực vật [261], [275], [287]. Ghi

nhận gần đây cho thấy sử dụng salicylic acid và ethylene (ethephon) làm tăng

đáng kể vinblastine, vindoline và catharanthine trong khi abscisic acid (ABA) và

gibberellic acid lại ức chế mạnh sự tích lũy một số alkaloid quan trọng trong cây

C. roseus [168].

Elicitor không sinh học cũng giữ vai trò quan trọng trong sự tích lũy các chất

trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ ở thực vật. Ánh sáng có tác dụng lên tỷ lệ

tăng trưởng và sinh tổng hợp các chất có nguồn gốc caffeic acid (CADs) trong

nuôi cấy rễ tơ cây Echinacea purpurea [4]. Kết quả cho thấy nuôi cấy rễ ở điều

kiện sáng có hình thái mỏng so với trong tối và rễ tơ phát triển dưới ánh sáng

tăng mức tích lũy anthocyanins. Ngoài ra, sinh tổng hợp các hợp chất liên quan

đến các gen Cinnamyl alcohol dehydrogenase gồm cichoric acid, caftaric acid,

chlorogenic acid và caffeic acid đã được tăng lên đáng kể trong nuôi cấy rễ tơ ở

điều kiện chiếu sáng. Việc tăng cường tích lũy CADs và anthocyanin trong nuôi

cấy rễ tơ cây E. purpurea liên quan với hoạt động kích thích sáng của

phenylalanine amoni lyase [4].

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Nguyên vật liệu

- Cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) thu nhận ngoài tự nhiên (ở

Phú Yên: cây có độ cao 0,5 m) được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tạo mẫu in

vitro.

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325, chứa plasmid mang các

gen rolB và rolC là các gen mục tiêu để tạo rễ tơ (được cung cấp từ công ty

ATCC, USA) dùng trong thí nghiệm chuyển gen.

- Tế bào ung thư biểu mô gan (dòng HepG2) do phòng công nghệ tế bào

động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh cung cấp được

dùng trong thí nghiệm kiểm tra hoạt tính của Plumbagin từ dịch ly trích rễ tơ.

- Plumbagin chuẩn được cung cấp bởi Công ty Sigma.

- Dung dịch Javel 8% (Công ty sigma).

- Khoáng đa lượng và vi lượng được cung cấp bởi công ty Duchefa.

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Công ty Sigma).

- Acetosyringone (Công ty Sigma).

- Chitosan (76kD, Công ty Fluka).

- Pepton (Công ty Sigma).

- Salicylic acid (Công ty Sigma).

- Casein (Công ty Clarion Casein Ltd., Ấn Độ).

2.1.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường khoáng cơ bản: MS [158], B5, N. Nuôi cấy: nhiệt độ 26±2oC,

RH = 65%, cường độ ánh sáng 22,2 µmolm-2 s-1, thời gian chiếu sáng 10

giờ/ngày.

2.2. Phương pháp thực nghiệm

2.2.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho

chuyển gen

2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng để

tạo mẫu in vitro (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Điều kiện khử trùng đoạn thân cây Bạch hoa xà để tạo mẫu in vitro.

Nghiệm thức (NT) Nồng độ Javel (%) Thời gian khử trùng (phút)

J1 2 10

J2 2 20

J3 2 30

J4 4 10

J5 4 20

J6 4 30

J7 6 10

J8 6 20

J9 6 30

J10 8 10

J11 8 20

J12 8 30

Mô tả thí nghiệm: Mẫu sử dụng nghiên cứu là đoạn thân chứa chồi bên

thu nhận từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên, được xử lý vô trùng và nuôi cấy

tuần tự theo các bước sau: Rửa dưới vòi nước máy 10-15 phút; rửa tiếp 3-4 lần

bằng nước khử ion vô trùng, lắc 10 phút trong cồn 70%, rửa sạch cồn bằng nước

khử ion vô trùng. Mẫu được khử trùng tiếp bằng dung dịch Javel theo Bảng 2.1;

tiếp đó mẫu được rửa bằng nước khử ion vô trùng 3-4 lần, loại bỏ những đoạn tế

bào chết và cấy mẫu lên môi trường MS.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần với 30 mẫu/nghiệm thức.

Các chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy:

- Tỷ lệ mẫu cấy vô trùng (%) = (số mẫu cấy vô trùng / tổng số mẫu) x 100.

- Tỷ lệ mẫu cấy có khả năng phát triển (%) = (số mẫu cấy có khả năng phát

triển/tổng số mẫu vô trùng) x 100.

- Tỷ lệ mẫu nảy chồi.

2.2.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ

Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ tối ưu chất điều hòa sinh

trưởng thực vật để tạo chồi làm nguyên liệu cho chuyển gen.

Phương pháp tiến hành:

Các đoạn thân (chứa chồi bên) được tạo ra từ nghiệm thức 2.2.1.1. được

nuôi cấy tiếp trên môi trường MS có bổ sung 1,0 – 2,5 mg/L BA và 0,1 – 0,5

mg/L IBA (Bảng 2.2).

Bố trí nghiệm thức:

- Số mẫu cấy/bình: 3 mẫu.

- Số bình/nghiệm thức: 3 bình.

- Số lần lặp lại: 3 lần.

Các chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy:

- Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) = (số mẫu cấy tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x

100.

- Số chồi trung bình/mẫu cấy.

- Chiều cao chồi (cm).

Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm tạo

chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà.

Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L)

1,0 A1 0,1

1,0 A2 0,2

1,0 A3 0,3

1,0 A4 0,4

1,0 A5 0,5

1,5 B1 0,1

1,5 B2 0,2

1,5 B3 0,3

1,5 B4 0,4

1,5 B5 0,5

2,0 C1 0,1

2,0 C2 0,2

2,0 C3 0,3

2,0 C4 0,4

2,0 C5 0,5

2,5 D1 0,1

D2 2,5 0,2

D3 2,5 0,3

D4 2,5 0,4

D5 2,5 0,5

2.2.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro

Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ tối ưu chất điều hòa sinh

trưởng thực vật tạo cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro.

Phương pháp tiến hành:

Các chồi in vitro tạo ra từ nghiệm thức 2.2.1.2. được nuôi cấy tiếp trên môi

trường MS có bổ sung 0,1 – 0,5 mg/L IBA.

Bố trí nghiệm thức:

- Số mẫu cấy/bình: 3 mẫu.

- Số bình/nghiệm thức: 3 bình.

- Số lần lặp lại: 3 lần.

Các chỉ tiêu theo dõi sau 2 tuần nuôi cấy:

- Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) = (số mẫu cấy tạo rễ/tổng số mẫu cấy) x 100.

- Số rễ trung bình/mẫu cấy.

- Số lá trung bình/mẫu cấy.

- Chiều dài rễ (cm).

2.2.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch

hoa xà in vitro

Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ tối ưu chất điều hòa sinh

trưởng thực vật đến khả năng hình thành và phát triển rễ bất định mẫu in vitro.

Phương pháp tiến hành:

Các mẫu (lá và đoạn thân được lấy từ gốc lên cách chồi ngọn 1 lá thật của

cây in vitro hoàn chỉnh) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,1 – 1,5

mg/L NAA và IBA (Bảng 2.3).

Bố trí nghiệm thức:

- Số mẫu cấy/bình: 5 mẫu.

- Số bình/nghiệm thức: 3 bình.

- Số lần lặp lại: 3 lần.

Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật

đến khả năng hình thành và phát triển rễ bất định mẫu in vitro.

Nghiệm thức IBA (mg/L) NAA

(mg/L)

0 0,0 R1

0 0,1 R2

0 0,5 R3

0 1,0 R4

0 1,5 R5

0,1 0,0 R6

0,1 0,1 R7

0,1 0,5 R8

0,1 1,0 R9

0,1 1,5 R10

0,5 0,0 R11

0,5 0,1 R12

0,5 0,5 R13

0,5 1,0 R14

0,5 1,5 R15

1,0 0,0 R16

1,0 0,1 R17

1,0 0,5 R18

1,0 1,0 R19

1,0 1,5 R20

1,5 0,0 R21

1,5 0,1 R22

1,5 0,5 R23

1,5 1,0 R24

1,5 1,5 R25

Các chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy: Trọng lượng rễ trung bình

(gTLT/nghiệm thức).

2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ

2.2.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ

Lá trưởng thành từ cây in vitro (lá thứ 2 từ ngọn xuống) được dùng làm

nguồn mẫu cho quá trình chuyển gen. Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC

11325 được chuyển vào mẫu lá.

Quá trình chuyển gen:

Vi khuẩn bảo quản ở -80oC được hoạt hoá bằng cách ủ trên môi trường bán

rắn LB (Luria Bertani): trypton 10 g/L, YE 5 g/L, NaCl 10 g/L và pH 7,2 trong 2

ngày tại 25oC. Sau đó sinh khối vi khuẩn được chuyển vào môi trường lỏng LB,

lắc 80 vòng/phút tại 25oC trong 24 giờ. Acetosyringone (10 - 150 M) được

thêm vào môi trường MS bán rắn không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng nhằm

làm tăng khả năng cảm ứng chuyển gen của vi khuẩn.

Mẫu lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn trong 30 phút. Sau đó, mẫu

lá được làm khô bằng cách gắp vào đĩa petri có sẵn giấy thấm vô trùng. Chuyển

tiếp mẫu lá này sang môi trường thạch khoáng MS, ủ 1, 3, 7 ngày trong tối tại

25oC. Mẫu lá được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng để loại bỏ vi khuẩn bề mặt

và sau đó được chuyển sang môi trường thạch khoáng MS bổ sung cefotaxime

(10- 150 g/ml) để loại ra những vi khuẩn phát triển còn sót lại.

 Thí nghiệm được bố trí với 12 nghiệm thức (Bảng 2.4), 1000 mẫu/nghiệm

thức:

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên tỉ

lệ chuyển gen.

Nghiệm thức Thời gian ủ (ngày) Acetosyringone (M)

1 1 10

2 1 50

3 1 100

4 1 150

5 3 10

6 3 50

7 3 100

8 3 150

9 7 10

10 7 50

11 7 100

12 7 150

Hiệu quả chuyển gen được đánh giá dựa trên % số mẫu tiếp nhận được

gen chuyển (dựa vào thuật toán đáp ứng bề mặt để tìm điểm tối ưu thông qua

phần mềm thống kê SAS).

2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn

hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR

 Kiểm tra kết quả chuyển gen

+ Tách chiết DNA thực vật nhằm thu nhận DNA cho thí nghiệm phân tích

PCR gen mục tiêu (tách chiết DNA nhiễm sắc thể rễ giả định chuyển gen và mẫu

rễ đối chứng).

5 g mẫu lá cắt nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Nghiền mẫu trong dung

dịch tách chiết, sau đó bổ sung 30 µl dung dịch SDS 20% và ủ ở 65oC trong 10

phút. Thêm 400 µl phenol/chloroform, trộn đều hỗn hợp và ly tâm ở tốc độ

13000 vòng/phút trong vòng 5 phút. Thu dịch nổi giữ vào ống eppendorf mới,

thêm vào 300 µl isopropanol và giữ lạnh 10 phút. Ly tâm ở tốc độ 3000

vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa tủa thu được với 100 µl ethanol

70%. Ly tâm loại bỏ ethanol và để khô mẫu khoảng 20-30 phút. Hòa tan mẫu

trong 40 µl TE. RNA còn lại trong mẫu bị loại bỏ khi thêm vào 2 µl Rnase, ủ ở

37oC trong 30 phút. DNA thu được có thể sử dụng ngay hay bảo quản ở -20oC.

+Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325

Sử dụng kit-QIAGEN (Đức) để tách chiết và tinh sạch plasmid DNA

(Miniprep kit-QIAGEN, Đức)

Cấy 1 khuẩn lạc riêng lẻ của chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

11325 (ATCC, Mỹ) vào 2 ml môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/l,

nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 37 oC qua đêm. Ly tâm thu tế bào vi khuẩn ở

tốc độ 13000 vòng/phút với nhiệt độ 4oC trong 1 phút. Hút bỏ phần môi trường

phía trên và để ráo tế bào vi khuẩn. Hoà vi khuẩn trong 100 µl dung dịch lysis

buffer (50 mM glucose, 10 mM EDTA và 25 mM Tris), vortex mạnh để phá vỡ

vỏ tế bào vi khuẩn, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút. Thêm 200 µl

dung dịch 0,2 M Na0H chứa 1% SDS, hoà tan hỗn hợp bằng cách đảo ống

eppendorf và giữ trong đá khoảng 10 phút. Thêm 200 µl dung dịch 3 M Na-

Acetate pH 5,2 (đã để lạnh), nhẹ nhàng hoà tan bằng cách trộn đều, sau đó ủ

trong đá khoảng 10 phút. Ly tâm mẫu 10 phút ở 13000 vòng/phút. Kết tủa DNA

bằng 900 µl cồn 100% (-20 oC), ủ mẫu khoảng 1 giờ. Ly tâm 10 phút ở tốc độ

13000 vòng/phút. Loại bỏ dịch trên và đảo đầu ống eppendorf vào giấy thấm để

hút nước. Rửa plasmid DNA bằng 200 µl cồn 70%. Ly tâm 5 phút ở 13000

vòng/phút, loại bỏ cồn để DNA khô trong tủ hút vô trùng khoảng 10 phút. Hoà

tan DNA trong 50 µl dung dịch T10 E1. Thêm 1 µl RNase A (10mg/ml), ủ khoảng

30 phút ở 37 oC. Bảo quản DNA ở - 20 oC.

 Phân tích PCR để kiểm tra quá trình chuyển gen

Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi Công ty ATCC

(Bảng 2.5) và thành phần phản ứng được thực hiện như sau [279]:

- 2,5 ml 10 x buffer PCR.

- 0,2 mM dNTP’s.

- 0,4 mM mồi.

- 1,0 Unit Taq polymerase.

- 200 ng DNA template.

- Thể tích hỗn hợp cuối cùng 25 ml.

Bảng 2.5. Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR.

Sản phẩm PCR (bp) Gen Tên mồi Trình tự (5’-3’)

B1 TCAAGTCGCCGAGGTTTCTT RolB 610 B2 AAACGCTCCGCGGTGGT

C1 TTGACCTATGTGCTCTTT RolC 530 C2 CTCCATTCCAAATTTGCATT

 Chương trình phản ứng PCR [279]

+ Chương trình nhiệt bắt đầu ở 94oC thời gian 2 phút, tiếp theo sau 30 chu

kỳ với nhiệt độ:

- 94oC trong 1 phút.

- 55oC trong 1 phút.

- 72oC trong 1 phút.

+ Kết thúc 30 chu kỳ nhiệt độ được giữ ở 72oC trong 5 phút.

2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt

chất Plumbagin trong nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà

2.2.3.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường

Điều kiện nuôi cấy: 1 g mẫu rễ tơ được nuôi cấy trong bình erlen chứa 60

ml môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/L, pH 5,8-5,9; Nhiệt độ 25oC ±2oC;

độ ẩm = 65%.

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức: nuôi trên môi trường có

agar (agar 8 g/L) và không có agar (lắc tốc độ 80 vòng/phút).

- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần 3

bình erlen (250 ml).

- Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định trọng lượng tươi rễ tơ (gTLT/bình).

2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng

của rễ tơ

Điều kiện nuôi cấy: Điều kiện tối ưu nhận được ở thí nghiệm 2.2.3.1.

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức: nuôi trong tối và sáng.

- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần 3

bình erlen (250 ml) chứa 60 ml môi trường lỏng, mỗi bình erlen cấy 1 g mẫu rễ.

- Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định trọng lượng tươi rễ tơ (gTLT/bình).

2.2.3.3. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ.

Mục đích thí nghiệm: Xác định môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng

và tích lũy Plumbagin của rễ tơ.

Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25±2oC; độ ẩm = 65%; nuôi cấy lỏng lắc ở

tốc độ 80 vòng/phút trong điều kiện tối.

Bố trí thí nghiệm:

- Rễ tơ được nuôi cấy trên 3 môi trường khoáng cơ bản B5, MS và N

(bảng 2.6).

- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần 3

bình erlen (250 ml) chứa 60 ml môi trường lỏng.

- Mỗi thí nghiệm cấy 1g mẫu rễ.

- Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Bảng 2.6. Một số loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm

STT Ký hiệu MT Môi trường nuôi cấy

1 MS M1

2 B5 M2

3 N M3

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định trọng lượng tươi rễ tơ (gTLT/bình).

2.2.3.4. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu

Điều kiện nuôi cấy: Điều kiện tối ưu nhận được ở thí nghiệm 2.2.3.3.

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức: 1, 2, 3, 4 g rễ ban đầu.

- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần 3

bình erlen (250 ml) chứa 60 ml môi trường lỏng.

- Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Trọng lượng tươi sau 4 tuần nuôi - Trọng lượng tươi 0 ngày nuôi

Chỉ số sinh trưởng

Trọng lượng tươi 0 ngày nuôi

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định chỉ số sinh trưởng rễ tơ [252].

2.2.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng

Điều kiện nuôi cấy: điều kiện tối ưu của nghiệm thức 2.2.3.4.

Bố trí thí nghiệm:

- Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (3 bình/lần lặp lại).

- Thí nghiệm được nuôi trong tối, nhiệt độ 25oC ±2oC; độ ẩm = 65%.

Chỉ tiêu theo dõi: Khả năng phát triển của rễ tơ được ghi nhận sau 0, 1, 2,

3,4, 5, 6 tuần nuôi cấy, với chỉ tiêu theo dõi:

+ Trọng lượng tươi (gTLT/bình).

+ Hàm lượng Plumbagin (µg/g TLT).

2.2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ

Điều kiện nuôi cấy: Điều kiện tối ưu nhận được ở thí nghiệm 2.2.3.5.

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được thiết lập với 12 nghiệm thức, cho 7 yếu tố: Nước dừa

(10-30%), chitosan (10-100 mg/L), salicylic acid (100-300 mg/L), đường (10-50

g/L), dịch chiết nấm men (100-1000 mg/L), casein (100-500 mg/L) và peptone

(100-500 mg/L) (Bảng 2.7). Mức thấp (-1) và mức cao (+1) của các yếu tố được

thiết lập bởi ma trận Plackett-Burman [181], qua phần mềm Design Experment

7.0 để chọn ra 4 yếu tố ảnh hưởng đến thông số cần khảo sát từ đó tìm điểm tối

ưu dựa trên thuật toán D-Optimal.

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình erlen chứa 60 ml môi

trường lỏng.

- Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi: Xác định trọng lượng tươi (TLT), trọng lượng khô

(TLK) và hàm lượng Plumbagin trong mỗi nghiệm thức.

Bảng 2.7. Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh trưởng rễ

tơ.

Nghiệm X1- X2 - X3- X4 - X5 - dịch X6 - X7 -

thức Nước chitosan salicylic đường trích nấm casein peptone

(10-100 acid –SA (10-50 men (100- (100- dừa

mg/L) (100-300 g/L) (100- 500 500 (10-

mg/L) 1000 mg/L) mg/L) 30%)

mg/L)

-1 +1 +1 -1 +1 -1 1 -1

-1 -1 +1 -1 -1 +1 2 +1

-1 +1 -1 +1 +1 +1 3 +1

-1 +1 +1 +1 -1 -1 4 +1

+1 -1 -1 -1 +1 -1 5 +1

-1 -1 -1 +1 +1 +1 6 -1

+1 +1 -1 -1 -1 +1 7 +1

+1 -1 +1 +1 -1 +1 8 -1

-1 -1 -1 -1 -1 -1 9 -1

+1 -1 +1 +1 +1 -1 10 +1

+1 +1 +1 -1 +1 +1 11 -1

+1 +1 -1 +1 -1 -1 12 -1

2.2.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ

2.2.4.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC

10 mg mẫu chuẩn Plumbagin được pha loãng với 5 ml acetonitrile trong

bình flask thể tích 10 ml, sau khi hòa tan hoàn toàn thể tích acetonitrile được

thêm cho vừa đủ 10 ml (dung dịch mẹ). Các nồng độ khác nhau được chuẩn bị từ

dung dịch mẹ.

Nghiền 1 g mẫu rễ khô và ly trích với chloroform trong máy ly trích

soxhlet ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Cho bay hơi dịch ly trích để loại chloroform và

thu được bột ly trích thô [107].

Hòa tan 5 mg bột ly trích thô với 5 ml acetonitrile trong bình flask thể tích

10 ml, thêm dung dịch acetonitric đến vừa đủ 10 ml (dung dịch mẹ). Các nồng

độ khác nhau được chuẩn bị từ dung dịch mẹ và được dùng để chạy sắc ký lỏng

cao áp (các mẫu được giữ ở nhiệt độ 2-8oC).

Trước khi phân tích các mẫu Plumbagin đều được lọc qua màng lọc có

kích thước lỗ 0,45 µm.

2.2.4.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được định tính cùng với chất chuẩn

Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng như sau:

- Sử dụng bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 20 x 20cm.

- Dung dịch ly giải: Ether dầu hỏa: ethyl acetate = 7:3.

- Thuốc thử: NaOH 10% trong cồn.

2.2.4.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC [88]

HPLC được tiến hành trên cột pha đảo C-18, (250×4.6), kích thước 5 μm.

Dung môi để phân tách là acetonitrile (50 mM potassium dihydrogen phosphate:

actonitrile với tỉ tệ (45:55)) ở pH 3,5, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Hệ thống hoạt

động ở nhiệt độ 26oC. Thể tích mẫu nhồi vào cột 20 μl. Sắc ký được ghi nhận ở

270 nm để xác định Plumbagin cùng với chất chuẩn.

2.2.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của

Plumbagin

Nuôi tế bào ung thư biểu mô gan:

- Tế bào ung thư gan HepG2 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ

sung 10% FBS, 1% kháng sinh Penicillin và Streptomycin:

- Xử lý mẫu tế bào HepG2 sau khi lấy ra khỏi bình nitơ lỏng: Sát khuẩn

mẫu bằng cồn 70o, ủ 30 giây ở 37oC.

- Cho 0,5 - 1 ml môi trường DMEM vào và huyền phù đến khi tan hết

mẫu.

- Hút toàn bộ dịch huyền phù tế bào và cho vào ống 15 ml chứa 4 ml

môi trường DMEM.

- Ly tâm 1500 vòng/phút, 25oC, 5 phút, thu tủa và thêm môi trường

DMEM vào, huyền phù kĩ tủa trong môi trường DMEM, chia đều ra

các đĩa/bình nuôi.

- Cho vào tủ nuôi 5% CO2 ở 37oC.

- Sau khoảng 2-3 ngày hoặc đến khi môi trường đổi màu do tế bào sử

dụng hết chất dinh dưỡng thì thay môi trường nuôi mới.

- Khi tế bào mọc đạt từ 80 đến hơn 90% độ phủ bề mặt thì tiến hành cấy

chuyền, cứ cấy chuyền liên tục đến khi đủ lượng tế bào cho các thí

nghiệm sau.

Quy trình cấy chuyền:

- Hút bỏ môi trường nuôi, rửa PBS 2 lần, mỗi lần 2 ml.

- Cho 0,5 ml Trypsin-EDTA 0,25% vào mỗi đĩa, vỗ mạnh vào thành đĩa

5 phút.

- Thêm 1,5 ml môi trường DMEM chứa FBS, trộn đều, hút cho vào ống

15 ml, ly tâm 1500 vòng/phút, 5 phút, 25oC.

- Hút bỏ dịch nổi, cho 1 ml môi trường vào ống, huyền phù kĩ, chia đều

ra các đĩa/bình nuôi chứa sẵn 2 ml môi trường (đĩa Ø35), 4 ml (đĩa Ø

60) và 4-5 ml (bình nuôi 25 cm2).

- Tế bào HepG2 được cảm ứng (xử lý) bằng Plumbagin ở các nồng độ

khác nhau: 0 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM và 20 µM: thể tích môi trường

nuôi trên đĩa nuôi cấy là cố định, nên sau khi pha stock của Plumbagin,

cho dung dịch Plumbagin với các thể tích khác nhau vào môi trường

nuôi để đạt được nồng độ muốn thử nghiệm.

- Ứng với mỗi nồng độ, sau 3 ngày nuôi cấy, tế bào sẽ được tách khỏi bề

mặt đĩa nuôi cấy bằng enzyme Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco), đếm

bằng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào trong mỗi ml, qua

đó cho thấy được sự ức chế tăng sinh gây ra bởi Plumbagin đối với tế

bào ung thư.

RT-PCR: Tách RNA tổng bằng phương pháp sử dụng Trizol (Intront)

- Sau khi thu tủa tế bào, thêm 1 ml Trizol, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng,

vortex đến khi tan hết.

- Thêm 0,2 ml chloroform, lắc đều trong 15 giây, ủ 2-3 phút ở nhiệt độ

phòng.

- Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 4oC.

- Hút phần dịch trong suốt ở lớp trên cùng và cho vào eppendorf mới.

- Thêm 0,5 ml isopropyl alcohol, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 12000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.

- Đổ bỏ phần dịch nổi, thêm 1 ml ethanol 75o, vortex.

- Ly tâm 7500 vòng/phút, 5 phút, 4oC, bỏ dịch nổi.

- Để eppendorf khô ở nhiệt độ phòng 2 phút.

- Thêm 30-50µl nước DEPC, trộn đều để hòa tan RNA, bảo quản ở -

80oC.

RT-PCR gồm 2 phản ứng: phản ứng RT (phiên mã ngược RNA trở về

cDNA), phản ứng PCR (khuếch đại số lượng sản phẩm của phản ứng RT).

Quá trình apoptosis được xác định thông qua các gen, với trình tự các mồi

được thiết kế theo, trong đó:

Gen bax:

- Mồi xuôi: 5’-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3’.

- Mồi ngược: 5’-GCCACGTGGGCGTCCCAAAGT-3’.

Gen bcl-2:

- Mồi xuôi: 5’-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3’.

- Mồi ngược: 5’ AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3’.

Gene beta-actin:

- Mồi xuôi: 5’- GTGGGGCGCCCCAGGACCA-3’.

- Mồi ngược: 5’- CTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’.

Chu kì phản ứng: 42oC trong 45 phút, 94oC trong 5 phút, 40 chu kì: 94oC

trong 45 giây, 56oC trong 45 giây, 72oC trong 45 giây, 72oC trong 10 phút. Sản

phẩm khuếch đại của các gene bax, bcl-2, beta-actin có kích thước lần lượt là

479 bp, 304 bp, 516 bp.

Sản phẩm khuếch đại của 3 gene bax, bcl-2 và beta-actin lần lượt được

xác định dựa vào kích thước có sẵn và thang DNA.

Đánh giá sự phân mảnh của nhân tế bào: Đặc trưng của quá trình

apoptosis là sự phân mảnh của nhân tế bào. Phương pháp nhuộm đơn bằng

acridine orange được áp dụng để quan sát hiện tượng này ở tế bào sau khi xử lý

Plumbagin: Hút bỏ môi trường nuôi trong đĩa nuôi cấy. Cho 1 ml

paraformaldehyde 4%, ủ 30 phút, hút bỏ, rửa với 1 ml PBS (2 lần), mỗi lần 10

phút. Cho 1 ml Triton X100 0,1%, ủ 30 phút, hút bỏ, rửa với 1 ml PBS (2 lần),

mỗi lần 10 phút. Cho 1 ml acridine orange (20 µg/ml), ủ 30 phút, hút bỏ, rửa với

1 ml PBS (2 lần), mỗi lần 10 phút. Tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh

quang, cho ánh sáng màu xanh lá.

Comet assay:

Sau khi xử lý với các nồng độ Plumbagin khác nhau tế bào được tách

khỏi bề mặt đĩa nuôi bằng enzyme Trypsin-EDTA 0,25%. Thu gom và huyền

phù tế bào trong dung dịch agarose 0,5% nhiệt độ nóng chảy thấp, trải trên

miếng lame. Ngâm miếng lame chứa tế bào 1 giờ trong dung dịch ly giải (2,5 M

NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100, pH13). Điện di miếng lame

chứa tế bào ở 35 V trong 20 phút, rửa nước cất 2 lần. Ngâm miếng lame chứa tế

bào trong thuốc nhuộm acridine orange (20 µg/ml) trong 30 phút, rửa nước cất 2

lần. Quan sát tế bào trên lame dưới kính hiển vi huỳnh quang, chụp hình từng tế

bào đơn, phân tích sự phân mảnh DNA ở từng tế bào bằng phần mềm

CometScore

2.2.6. Xử lý số liệu :

Thu thập số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

2003, Design Experment 7.0, SigmaPlot và SAS.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro

3.1.1. Xác định điều kiện khử trùng mẫu

Kết quả khảo sát khả năng khử trùng mẫu của Javel ở các nồng độ và thời

gian khác nhau đối với đoạn thân cây Bạch hoa xà cho thấy: dùng Javel ở nồng

độ thấp và thời gian ngắn thì số mẫu cấy bị nhiễm cao, khi tăng nồng độ Javel và

thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sống và mẫu nảy chồi giảm. Ở nghiệm thức sử

dụng Javel 8% và thời gian 20 phút có tỷ lệ mẫu vô trùng 72,33%, tỷ lệ mẫu

sống 53,49% và tỷ lệ nảy chồi 96,50% (Bảng 3.1; Hình 3.1) là điều kiện tối ưu

trong các nghiệm thức khảo sát (38,67% mẫu đạt yêu cầu). Tùy theo nguồn

nguyên liệu và dung môi sử dụng khử trùng sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả khử

trùng. Theo ghi nhận của Wei và cs (2006) [265] tạo mẫu vô trùng (từ hạt) cây

này đã sử dụng 20% (v/v) dung dịch clorua với 2 phút và 0,1% (w/v) dung dịch

thủy ngân clorua từ 5–10 phút sau khi khử trùng trong cồn 75% trong 5 phút.

Gbadamosi và Egunyomi (2010) [77] sử dụng 2 lần sodium hypochlorite (10%

khử trùng để tạo mẫu in vitro cây BHX.

Chồi mới hình thành từ chồi bên

sodium hypochlorite trong 20 phút và 5% sodium hypochlorite trong 10 phút) để

Hình 3.1. Mẫu Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy in vitro.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và thời gian

khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà.

Nghiệm % mẫu vô Tỷ lệ mẫu sống Tỷ lệ nảy

thức trùng (%) chồi(%)

J1 1,67 h 100a 100 a

J2 2,33 h 100 a 100 a

J3 10,00 gh 100 a 100 a

J4 14,38 fg 75,39 b 100 a

J5 43,78 e 62,57 c 100 a

J6 64,11 cd 46,56 f 100 a

J7 22,50 f 64,89 c 100 a

J8 49,67 e 60,25 cd 100 a

J9 78,83 ab 44,92 f 100 a

J10 61,70 d 56,95 de 100 a

J11 72,33 bc 53,49 e 96,50 b

J12 84,83a 20,28 g 85,67 c

Tương tác javen *thời gian, có:

P <0,01 <0,01 <0,01

CV 9,29 3,54 1,18

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt

giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range

Tests .

3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ

Cytokinin là nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng kích

thích sự phát triển chồi bên, đặc biệt là khi tương tác với auxin ở nồng độ thích

hợp sẽ làm tăng khả năng phân chia tế bào, thúc đẩy tế bào phân chia trong mô

phân sinh đỉnh, nâng cao tỷ lệ tạo chồi, số lượng chồi hình thành nhiều hơn so

với khi không bổ sung hai nhóm chất này [192]. Cả hai quá trình, tái sinh chồi

trực tiếp và gián tiếp yêu cầu tế bào thực vật phải trải qua quá trình khử phân hóa

và phân hóa. Hai tiến trình này được xác định không chỉ chịu sự tác động của

chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh từ môi trường mà còn phụ thuộc

vào hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh [245]. Các mô khác

nhau có hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh khác nhau, vì vậy

loại mô thực vật tác động có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật [265]. Kết quả khảo sát khả năng tạo chồi từ chồi bên trong nuôi cấy mô cây

Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy nhận thấy:

+ Ở nghiệm thức DC (đối chứng) không bổ sung BA và IBA chỉ phát triển

từ 1 chồi bên ban đầu, không tạo thêm các chồi mới. Chồi phát triển theo hướng

gia tăng về chiều cao (5,33 cm) (Hình 3.2).

+ Nghiệm thức A1 (1,0 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) cho chiều cao trung

bình của chồi là 1,57 cm với số lượng chồi trung bình là 4,49 chồi/mẫu, còn ở

nghiệm thức B1 (1,5mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) - chiều cao trung bình của chồi

thấp hơn, chỉ đạt 1,40 cm, nhưng lại đạt số lượng chồi trung bình lên đến 4,68

chồi/mẫu (Bảng 3.2; Hình 3.3).

+ Ở các nghiệm thức khác, khi tăng nồng độ BA và IBA thì số lượng chồi

giảm, chiều cao của chồi thấp.

Hình 3.3. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA sau 4 tuần nuôi cấy.

Hình 3.2. Mẫu đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà

BA (mg/L) IBA (mg/L) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)

A1 1,0 0,1

A2 1,0 0,2

A3 1,0 0,3

A4 1,0 0,4

A5 1,0 0,5

B1 1,5 0,1

Chiều cao chồi trung bình (cm) 1,57 b 1,47 c 1,59 a 1,31 f 1,12 h 1,40 e 1,44 d B2 1,5 0,2 88,48 b 77,52 d 83,22 c 77,85 d 55,91 f 99,00a 88,89 b Số chồi trung bình/mẫu 4,49 b 4,19 c 2,66 f 3,51 e 3,78 d 4,68a 4,34 c

B3 1,5 0,3

B4 1,5 0,4

B5 1,5 0,5

C1 2,0 0,1

0,68 o 0,73 m 0,87 k 1,33 f 1,06 j C2 2,0 0,2 88,22 b 98,17 a 77,11 d 98,33 a 87,89 b 1,83 i 2,40 g 3,73 d 2,44 g 1,85 i

C3 2,0 0,3

C4 2,0 0,4

C5 2,0 0,5

D1 2,5 0,1

D2 2,5 0,2

D3 2,5 0,3

D4 2,5 0,4

D5 2,5 0,5 77,78 d 98,33 a 77,78 d 88,89 b 88,57 b 87,89 b 65,00 e 67,00 e 1,36 kj 2,78 f 3,58 e 1,46 j 1,21 k 2,46 g 1,72 i 2,13h 0,83 l 1,10 i 1,26 g 1,04 j 0,68 on 1,27 g 0,51 p 0,70 n

Tương tác BA*IBA, có: P CV <0,01 2,1 <0,01 2,39 <0,01 0,89

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests.

Kết quả cho thấy, khi không có cytokinin thì cây chỉ gia tăng sự kéo dài tế

bào, không kích thích sự phát triển các chồi bên, đồng thời nồng độ cytokinin và

auxin cao không quyết định sự tạo chồi từ chồi bên in vitro mà chính tỷ lệ thích

hợp giữa cytokinin và auxin đã làm tăng khả năng tạo chồi. Kết quả ghi nhận

được cũng phù hợp với kết quả của nhiều tác giả khác: có sự liên hệ giữa

cytokinin và auxin lên sự kích thích nhiều chồi và sự phát triển chồi ở nhiều loài

thực vật [80]; Tỷ lệ chồi cao nhất khi sử dụng phôi và mầm phôi cây Bạch hoa

xà trong môi trường Murashige và Skoog (MS) được bổ sung naphthalene acetic

acid (NAA) (0,01 – 0,05 mg/L) và benzyl amino purine (BAP) (2,0 -4,5 mg/L);

Cuống lá và lá cây Bạch hoa xà cho tỷ lệ chồi cao nhất ở môi trường MS có bổ

sung: (1) 1,5 mg/L BA + 0,25 mg/L IAA + 50 mg/L AD + 10% CM, (2) 1,0

mg/L BA + 0,5 mg/L NAA + 10% CM và (3) 2,0 mg/L BA + 0,75 mg/L NAA

[265] (Wei và cs., 2006); môi trường MS bổ sung 8,87 mmol/L BAP và 0,49

mmol/L IBA cho tỷ lệ chồi 3,5 ± 0,5 chồi/ mẫu [252].

Với mục tiêu tạo số lượng lớn chồi trực tiếp từ chồi bên cho quá trình nhân

nhanh in vitro, nghiệm thức B1 (1,5 mg/L BA và 0,5 mg/L IBA) được chọn là

nghiệm thức thích hợp cho sự tạo chồi in vitro cây Bạch hoa xà.

3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro

Sự hình thành và phát triển của hệ rễ mới in vitro là điều kiện quan trọng để

cây phát triển.Vì thế, trong thí nghiệm này, IBA được sử dụng để kích thích ra

rễ. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức đều có tạo rễ,

nhưng có sự khác nhau về số lượng và chiều dài rễ ở các nghiệm thức (Bảng 3.3;

Hình 3.4):

+ Các nghiệm thức đều cho 100% tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ.

+ Nghiệm thức có bổ sung IBA 0,15 mg/L có kết quả tạo số rễ trung bình

cao nhất (12,99 rễ/mẫu).

+ Nghiệm thức có bổ sung 0,1 mg/L IBA cho số lá trung bình cao nhất

(6,62 lá/mẫu).

+ Nghiệm thức bổ sung 0,35 mg/L IBA cho kết quả cây kém phát triển về

số rễ trung bình (5,59 rễ/mẫu), số lá trung bình (4,69 lá/mẫu) và chiều dài rễ

trung bình (0,66 cm). Điều đó chứng tỏ ở nồng độ này IBA đã ức chế sự phát

triển của cây Bạch hoa xà. Kết quả này cũng được ghi nhận bởi Verma và cs

(2002) [252] khi nuôi cấy chồi cây Bạch hoa xà trong môi trường MS có bổ sung

0,74 mmol/L IBA cho các thông số về sự phát triển cây thấp hơn khi bổ sung

0,49 mmol/L tương ứng là: 4,50±0,86 rễ/mẫu và 8,75±0,43 rễ/mẫu.

Auxin có tác dụng kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích ra rễ

nên rất cần thiết cho sự hình thành rễ của các chồi in vitro. Kết quả khảo sát xác

nhận được môi trường E1 (0,1 mg/L IBA) là môi trường tối ưu cho sự phát triển

cây Bạch hoa xà. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu ghi nhận về hiệu quả tác động

của auxin lên khả năng tái sinh cây từ chồi: Wei và cs (2006) [265] ghi nhận khả

năng tái sinh cây tốt nhất trong môi trường MS (94,12 %) được bổ sung 0,25

mg/L IBA và ½ MS (100 %) được bổ sung 0,1 mg/L IBA, 0,25 mg/l IBA và môi

trường ½ MS bổ sung 0,1 mg/L IBA được đề nghị là tối ưu cho khả năng tái sinh

cây từ chồi in vitro có nguồn gốc từ trụ hạ diệp, đoạn thân và cuống lá của cây

Bạch hoa xà; môi trường ½ MS bổ sung 0,49 mmol/L IBA tạo rễ tối ưu ở cây

Bạch hoa xà với số lượng rễ trung bình 8,75 ± 0,43 (rễ/mẫu) và chiều dài rễ

trung bình 2 ± 0,5 cm [252] và môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA là điều

kiện tối ưu cho khả năng tạo rễ từ chồi ở cây P. rosea L. [208].

Hình 3.4. Các nghiệm thức E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6 sau 2 tuần nuôi cấy.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây Bạch hoa

xà từ chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy.

Nghiệm IBA(mg/L) Tỷ lệ tạo Số rễ trung Chiều dài Số lá

thức rễ (%) bình/mẫu rễ (cm) trung

bình/mẫu

E0 0,00 100 4,31 g 4,03g 2,92 a

E1 0,10 100 11,32 c 6,62a 2,28 b

E2 0,15 100 12,99 a 6,33 b 1,31 c

E3 0,20 100 9,12 e 5,37d 1,16 d

E4 0,25 100 10,32 d 4,99e 1,16 d

E5 0,30 100 12,67 b 5,61c 0,96 e

E6 0,35 100 5,59 f 4,69f 0,66 f

Ảnh hưởng IBA lên sự tạo rễ, có:

P <0,01 <0,01 <0,01

CV 1,32 3,55 1,76

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa

các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests.

3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa

xà in vitro

Cảm ứng tạo rễ bất định ở lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ sung

các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở nồng độ khác nhau nhằm xác định loại

mô có khả năng tạo rễ tốt để sử dụng làm nguồn nguyên liệu chuyển gen, kết

quả được ghi nhận ở Bảng 3.4, Hình 3.5.

b

a

Hình 3.5. Rễ bất định từ lá (a) và đoạn thân (b)

Bảng 3.4. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định

từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy.

Hàm lượng Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức

(mg/L) (gTLT)

Nghiệm thức IBA NAA Đoạn thân Lá

0,0 0,0 1,21 m 0,43 o R1

0,0 0,1 2,63 b 0,68 n R2

0,0 0,5 2,53 c 0,82 l R3

0,0 1,0 1,83 h 1,13 k R4

0,0 1,5 1,70 jk 1,23 gh R5

0,1 0,0 1,63 k 1,23 gh R6

0,1 0,1 2,05 g 1,75 a R7

0,1 0,5 2,10 fg 1,54 c R8

0,1 1,0 2,18 ef 0,85 l R9

Bảng 3.4. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định

từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy.

Hàm lượng (mg/L) Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (gTLT)

Nghiệm thức IBA NAA Đoạn thân Lá

1,5 0,1 2,39 d 1,67 b R10

0,0 0,5 1,72 j 1,44 e R11

0,1 0,5 3,06a 1,23 gh R12

0,5 0,5 1,70 jk 0,77 m R13

1,0 0,5 1,80 h 1,15 jh R14

1,5 0,5 1,80 h 1,26 g R15

0,0 1,0 1,82 h 0,85 l R16

0,1 1,0 2,14 f 0,75 m R17

0,5 1,0 2,24 e 1,49 d R18

1,0 1,0 2,39 d 1,19 ijh R19

1,5 1,0 2,55 c 0,84 l R20

0,0 1,5 1,85 h 0,76 m R21

0,1 1,5 2,35 d 1,31 f R22

0,5 1,5 1,74 ij 1,22 ghi R23

1,0 1,5 1,30 l 1,15 jh R24

1,5 1,5 1,26 lm 1,17 ijk R25

Tương tác IBA*NAA, có:

P <0,01 <0,01

CV 1,70 1,90

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests.

Kết quả khảo sát ghi nhận được: tất cả các nghiệm thức đều tạo rễ bất định

sau 4 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, nồng độ 0,5 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA là tối

ưu cho sự hình thành rễ bất định ở lá với trọng lượng rễ trung bình đạt được 3,06

g TLT/nghiệm thức; 0,1 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA là tối ưu cho sự tạo rễ ở

đoạn thân với trọng lượng rễ trung bình đạt được 1,75 gTLT/nghiệm thức (Bảng

3.4 và Hình 3.5); mô lá là cơ quan có khả năng tạo rễ tốt hơn so với đoạn thân.

Kết quả nhận được cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009)

[225] khi khảo sát hiệu quả kích thích tạo rễ từ mẫu lá và đoạn thân của cây

Bạch hoa xà nuôi cấy in vitro: khi bổ sung IAA ở nồng độ 0,5 mg/L kích thích

tạo rễ ở mẫu cấy lá và thân (9,2 và 5,6 rễ/mẫu) cây Bạch hoa xà, việc gia tăng

hàm lượng IAA không kích thích tạo rễ ở cả hai nguồn mẫu; khi bổ sung IBA ở

nồng độ 0,1-1,0 mg/L khả năng kích thích ra rễ tăng; NAA cho tỷ lệ tạo rễ cao

nhất ở nồng độ 0,5 mg/L với số lượng rễ 12 và 9,6 tương ứng với lá và đoạn

thân, khi tăng NAA thì có hiện tượng tạo mô sẹo cùng với tạo rễ. Ngoài ra, có sự

tương tác giữa IBA và NAA đến khả năng tạo rễ, trên môi trường MS bổ sung

1,0 mg/L IBA và 0,5 mg/L NAA cho khả năng tạo rễ cao nhất (19,2 và 14

rễ/mẫu tương ứng với lá và đoạn thân) và trọng lượng tươi trọng lượng khô

tương ứng: 3,91 g và 0,64 g. Hiệu quả tác động của auxin lên sự tạo rễ bất định

cũng được ghi nhận bởi Panichayupakaranant và Tewtrakul (2002) [169] khi

nghiên cứu khả năng tạo rễ cây Plumbago rosea. Từ kết quả nhận được, mô lá

được sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Bạch hoa xà.

3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà

3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ

Mô lá được xử lý với vi khuẩn và nuôi chung trong điều kiện môi trường chứa

acetosyringone thay đổi (10, 50, 100, 150 M) và thời gian ủ chung kéo dài 1, 3,

7 ngày; mỗi nghiệm thức được tiến hành với 1000 mẫu. Sau thời gian nuôi

chung, tiến hành chọn lọc và xác định các mẫu rễ chuyển gen, kết quả nhận

được theo Bảng 3.5, Hình 3.6.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi chung với vi khuẩn: a. Nuôi chung

mẫu cấy với vi khuẩn 1 ngày; b. Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 3 ngày; c.

Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 7 ngày.

Dựa vào quan sát hình thái rễ qua kính hiển vi (Hình 3.7, 3.8), so sánh khả

năng phát triển của rễ khi nuôi trên môi trường MS cùng với mẫu rễ đối chứng

(Hình 3.9) và kiểm tra PCR (Hình 3.10, 3.11) đã chọn được 4 dòng rễ chuyển

gen, trong đó chỉ có một dòng mang cả 2 gen rolB và rolC. Gen rolB được quan

tâm vì chức năng của nó là kích thích sự hình thành rễ bất định ở thực vật, kích

thích tạo nhiều rễ trong điều kiện nuôi cấy mô [33]. Sự khác biệt trong khả năng

sinh trưởng giữa các dòng rễ tơ là nguyên nhân bởi sự thay đổi mức biểu hiện

của gen rolB [237], [238] và mức độ thích hợp của biểu hiện gen rolB cho sự

tăng trưởng rễ tơ là cần thiết bởi vì sự biểu hiện mức cao hay thấp của gen rolB

liên quan tới tăng trưởng của rễ tơ. Tác dụng chèn gen rolB vào thực vật đã được

nghiên cứu nhiều và liên quan đến sự phát triển rễ tơ, nhờ đó mà thực vật

chuyển gen biểu hiện sự phát triển rễ mà không có sự bổ sung auxin [78].

Hình 3.7. Rễ tơ giả định hiển vi (vật kính 40).

Hình 3.8. Đoạn rễ tơ hiển vi (vật kính 40).

L N P P1 P2 P3 P4

10.000 bp

3.000 bp

1.000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

Hình 3.9. Rễ tơ nuôi trên môi trường lỏng lắc sau 30 ngày.

Hình 3.10. PCR gen rolB (N: mẫu âm tính, P: mẫu dương tính, P1,

P2, P3, P4: các mẫu rễ nhận được sau chọn lọc).

L N P P1 P2 P3 P4

10.000 bp

3.000 bp

1.000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

Hình 3.11. PCR gen rolC.

Sử dụng phần mềm SAS để phân tích mối tương quan đáp ứng bề mặt, tìm

điểm tối ưu cho thấy (Bảng 3.5):

- Có sự tương quan chặt chẽ (R2= 0,9996 và CV=0,8518) theo chiều

hướng thuận giữa thời gian ủ với hàm lượng acetosyringone ảnh hưởng tới tỉ lệ

mẫu bị nhũn. Theo đó, thời gian ủ càng lâu và nồng độ acetosyringone càng cao

thì tỉ lệ mẫu nhũn càng tăng (Hình 3.12).

- Sự ảnh hưởng giữa thời gian ủ và nồng độ acetosyringone không có

tính tương quan chặt chẽ (R2= 0,4834 và CV=190,1575) lên tỉ lệ mẫu chuyển gen

nhận được (Hình 3.13).

- Kết quả nhận được ở điều kiện acetosyringone 50 µm/L và 7 ngày ủ

chung mẫu với vi khuẩn cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,2%).

Bảng 3.5. Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi và tỉ lệ

Ngày ủ

Hàm lượng acetosyringone (µM)

Tỉ lệ mẫu lá bị nhũn (%)

1 1 1 1 3 3 3 3 7 7 7 7

10 50 100 150 10 50 100 150 10 50 100 150

Tỉ lệ mẫu rễ chuyển gen thu nhận được (%) 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,2 0 0 0,4834

28 28 28.5 30 54,5 55 56,5 57,67 60 63 65 67,5 0,9996

R2 CV

190,1575

0,8518

mẫu chuyển gen.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone theo mặt

phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu nhũn.

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone theo

mặt phẳng đồng mức cho tỉ lệ mẫu chuyển gen.

Bảng 3.6. Dữ liệu dự đoán tỉ lệ chuyển gen theo thuật toán.

Yếu tố Thông số dự đoán

Thời gian (ngày) 3,47

Hàm lượng acetosyringone (µM) 134,09

Tỉ lệ chuyển gen dự đoán (%) 0,025

Từ kết quả phân tích cho thấy điểm tối ưu cho khả năng tạo mẫu chuyển

gen cao nhất được dự đoán là: thời gian ủ chung mẫu với vi khuẩn là 3,47 ngày,

hàm lượng acetosyringone 134,09 µM và tỉ lệ mẫu chuyển gen nhận được 0,025

Kết quả khảo sát cho thấy, có sự ảnh hưởng giữa thời gian ủ và hàm lượng

acetosyringone lên hiệu quả chuyển gen. Tuy nhiên, kết quả thu nhận được thấp

hơn so với kết quả của Verma và cs (2002) [252]: hiệu suất đạt được 0,9 ±

0,05%, khi nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes MTCC 532 và

Sivanesan và Jeong (2009) [225] là 93 % mẫu cấy (lá non in vitro) khi sử dụng

Agrobacterium rhizogenes 532 (MTCC). Nhiều ghi nhận cho thấy hiệu quả

chuyển gen còn phụ thuộc vào giống vi khuẩn: như khảo sát trên cây Plumbago

rosea tỷ lệ mẫu chuyển gen nhận được giống 15834 (7,82± 0,31), LBA9402

(3,02 ±0,11) và TR105 (4,21 ±0,26) [279], sự phụ thuộc vào giống vi khuẩn

cũng được ghi nhận khi khảo sát trên cây Rubia tinctorum [58] và Arachis

hypogaea [111].

3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ

Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được định tính thông qua sắc ký

lớp mỏng cùng với chất chuẩn Plumbagin (Hình 3.14).Kết quả ghi nhận được

Plumbagin

cho thấy dịch ly trích từ rễ tơ có chứa hoạt chất Plumbagin.

Hình 3.15. Sắc ký đồ xác định

Hình 3.14. Sắc ký lớp mỏng

Plumbagin bằng hệ thống HPLC.

định tính Plumbagin

Hàm lượng Plumbagin trong dịch ly trích rễ tơ được xác định thông qua

chất chuẩn và bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp với các thông số được miêu tả

bởi Gopinath và cs (2009) [88]. Qua sắc ký đồ, Plumbagin chuẩn được ghi nhận

có thời gian lưu ở phút thứ 7,326 (Hình 3.15), phù hợp với ghi nhận của Babulaa

và cs (2005) [17]. Sự thay đổi hàm lượng Plumbagin chuẩn được ghi nhận ở các

mức khác nhau (Hình 3.16) và sự tương quan giữa hàm lượng với diện tích peak

được thể hiện qua phương trình: y = 30905x + 42796 và R² = 0,994. Qua ghi

nhận cho thấy các thông số dùng để xác định Plumbagin có độ chính xác cao nên

được sử dụng để xác định hàm lượng Plumbagin trong mẫu rễ tơ.

Hình 3.16. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng Plumbagin

3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin

3.3.1. Trạng thái môi trường

Kết quả nhận được cho thấy, trạng thái môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến

sự phát triển của rễ tơ cây Bạch hoa xà như: trọng lượng tươi của mẫu được nuôi

cấy trên môi trường không có agar cho kết quả tốt hơn so với môi trường có bổ

sung agar (Bảng 3.7; Hình 3.17). Sự khác biệt này do ở môi trường lỏng rễ được

tiếp xúc tốt với môi trường và được lắc nên khả năng hấp thu dinh dưỡng và sự

thoáng khí tốt hơn so nuôi trên môi trường rắn. Kết quả này cũng được ghi nhận

khi nuôi cấy rễ cây họ đậu [62], rễ cây Narcissus confuses [152] và ở cây Cicer

arietinum L. [103].

Hình 3.17. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà

Bảng 3.7. Ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh trưởng

rễ tơ cây Bạch hoa xà.

Trạng thái môi trường Trọng lượng rễ (g TLT/bình)

Lỏng 2,57a

Rắn 2,32b

LSD0,01: 2,448

CV: 0,225

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).

3.3.2. Điều kiện chiếu sáng

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng cho quá trình tăng trưởng và tạo ra các

chất trao đổi thứ cấp. Nhiều dòng rễ tơ khi tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang

màu xanh và hình thành lục lạp hoàn chỉnh để thực hiện chức năng quang hợp

[68]. Tùy dòng rễ và loài thực vật mà rễ tơ được tạo ra có thể được kích thích

hoặc kìm hãm bởi ánh sáng: như ở rễ tơ cây Ipomoea aquatic nuôi cấy ở điều

kiện sáng kích thích sinh khối tăng gấp 2 lần và hàm lượng peroxidase tăng gấp

4 lần so với điều kiện tối [240]; Ngược lại, ánh sáng kìm hãm sự phát triển sinh

khối và hàm lượng thiophene khi nuôi cấy rễ tơ cây Tagetes patula [157].

Kết quả nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà cho thấy ở điều kiện tối sinh khối

thu được cao hơn so với điều kiện sáng, mặc dù sự khác biệt này không có ý

nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.8; Hình 3.18). Kết quả này cũng phù hợp với ghi

nhận của Sivanesan và Jeong (2009) [225] khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà

được tạo ra bởi dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 532 (MTCC). Kết quả

ghi nhận được cho phép chọn điều kiện tối để nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây

Bạch hoa xà

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây

Bạch hoa xà.

Điều kiện nuôi Trọng lượng rễ (g TLT/bình)

Sáng 2,66a

Tối 2,78a

LSD0,01: 0,129

CV: 1,266

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).

3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ

tơ

Thành phần môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển của rễ tơ

nuôi cấy [85]. Kết quả khảo sát cho thấy, rễ tơ phát triển tốt trên cả 3 loại môi

trường, mặc dù môi trường MS cho chỉ số trọng lượng rễ cao nhất nhưng không

có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 loại môi trường còn lại (Bảng 3.9, Hình

3.19). Kết quả cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009) [225]

khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes MTCC 532 nuôi trên 3 môi trường MS, SH và B5, trong đó môi

trường MS là tốt nhất (6,3 g TLT; 0,99 gTLK). Việc gia tăng hàm lượng

ammonium trong môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng tăng trưởng trong khi

tăng hàm lượng nitrat có tác động đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp và tích

lũy hoạt chất alkaloid. Ngoài ra, sinh khối và tích lũy alkaloid cao nhất khi giảm

hàm lượng nitrogen, kết quả này được ghi nhận khi nuôi cấy rễ tơ cây Nhân sâm,

yếu tố khoáng có vai trò quan trọng trong sự điều hòa tăng trưởng và thu nhận

sinh khối [229]. Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và cs (2009) [274] thì rễ tơ cây

Angelica gigas phát triển tốt nhất trong môi trường SH so với MS và B5; trong

môi trường ON rễ tơ cây Neem tăng trưởng tốt hơn so với trong môi trường MS

và B5 [206]. Điều này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng

lớn đến sự sinh trưởng của rễ tơ, nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài của

thực vật.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy

Môi trường MS B5 N Trọng lượng rễ (g TLT) 2,84a 2,60a 2,52a

LSD0,01 0,35 CV 4,36 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).

Hình 3.19. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây BHX

nuôi cấy.

3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi

cấy

Tỷ lệ giữa lượng mẫu nuôi cấy ban đầu và thể tích môi trường nuôi có ảnh

hưởng đến sự sinh trưởng của rễ tơ, kết quả cho thấy, lượng mẫu ban đầu 1 g

(TLT/60 ml môi trường) cho chỉ số tăng trưởng cao nhất; có sự thay đổi về chỉ

số sinh trưởng của rễ ở các nghiệm thức có lượng mẫu nuôi ban đầu là 2, 3, 4

(gTLT/60 ml) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10,

Hình 3.20). ). Ở cùng điều kiện nuôi cấy nhưng lượng mẫu khác nhau cho chỉ số

sinh trưởng khác nhau, điều này có thể do cạnh tranh về thành phần dinh dưỡng

trong môi trường; sự thiếu hụt lượng oxy hòa tan trong môi trường [183], khả

năng phát triển rễ tơ cây Thanh hao hoa vàng tối ưu khi lượng oxy trao đổi trong

môi trường bằng hoặc cao hơn lượng oxy rễ hấp thu.

Hình 3.20. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ

BHX nuôi cấy.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ tơ

BHX nuôi cấy.

Nghiệm thức Trọng lượng Trọng lượng sau 4 Chỉ số sinh

ban đầu (g tuần nuôi cấy trưởng

TLT) (gTLT)

1 1,05 2,13 1,03a

2 2,02 2,98 0,48b

3 3,02 3,99 0,42b

4 4,00 5,68 0,32b

LSD 0,01 0,25

CV 16,33

Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì

khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.

z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các

nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).

3.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng

Nuôi cấy 1 g rễ trên môi trường MS ở trạng thái lỏng (0 g/L agar; lắc ở tốc

độ 80 vòng/phút) trong điều kiện tối, nhiệt độ 25oC ±2oC trong 6 tuần, khảo sát

sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) và hàm lượng Plumbagin trong các mẫu thu

được sau mỗi tuần nuôi cấy (Bảng 3.11, Hình3.21).

Hình 3.21. Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây Bạch hoa xà.

- Trọng lượng tăng chậm trong tuần đầu nuôi cấy, sau đó rễ phát triển

mạnh đến tuần thứ 5 và sau đó chậm lại và gần như không phát triển thêm nữa.

Thời gian đầu rễ ở trạng thái thích nghi và hồi sinh, sau đó rễ phát triển mạnh.

Sau giai đoạn phát triển này, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, đồng thời có

sự tích lũy các chất chuyển hóa trong môi trường. Zhang và cs (2013) [281] khi

nuôi cấy rễ bất định cây Psammosilene tunicoides cũng đã ghi nhận được hiện

tượng này.

- Hàm lượng plumbagin trong sinh khối rễ tơ tăng chậm trong giai đoạn

đầu (tuần 1 và 2), sau đó tăng nhanh từ tuần thứ 3, 4 và 5. Mặc dù ở tuần thứ 6

hàm lượng Plumbagin cũng còn tăng nhưng đã chậm lại, ghi nhận này cũng phù

hợp với báo cáo của Zhang và cs (2013) [281] ở rễ bất định cây Psammosilene

tunicoides nuôi cấy. Như vậy, ở giai đoạn đầu môi trường dinh dưỡng thuận lợi

cho sự phát triển nên tích lũy sinh khối, sau đó khi các chất dinh dưỡng trong

môi trường suy giảm quá trình trao đổi chất thứ cấp xảy ra mạnh trong rễ.

Bảng 3.11. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời

gian.

Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plumbagin (µg/g

TLK)

0 1,030 153,808

1 1,085 88,28

2 1,340 94,701

3 1,863 137,16

4 2,828 193,144

5 2,955 201,416

6 2,960 208,605

Tùy theo loài thực vật mà thời gian cho giai đoạn sinh trưởng và tích lũy

hoạt chất của rễ tơ có thay đổi, như ở cây Fagopyrum tataricum giai đoạn phát

triển chậm trong 9 ngày đầu, giai đoạn phát triển nhanh từ ngày thứ 12-24, tương

ứng với hàm lượng flavonoid trong rễ ở hàm lượng thấp trong 15 ngày đầu sau

đó tăng nhanh từ ngày 16-30 [284]; ở cây Gentiana scabra: 2 tuần đầu rễ tơ phát

triển chậm, tuần thứ 3-5 rễ tơ phát triển nhanh, sau đó phát triển chậm; hàm

lượng gentiopicroside tăng nhanh ở tuần thứ 3 -5, sau đó giảm [101].

3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy

7 yếu tố được khảo sát về mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh

trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy. Dựa vào mức ảnh hưởng của chúng để sàng lọc

các yếu tố có ảnh hưởng chính đến các thông số cần quan tâm.

Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi

cấy

Các nghiệm thức được thiết lập theo thiết kế Plackett-Burman, kết quả

được ghi nhận ở Bảng 3.12.

Dựa trên thông số thực tế, ma trận Plackett-Burman thu được trọng lượng

tươi 4,02-4,78 g, trọng lượng khô 0,36-0,56 g và hàm lượng Plumbagin 0,169-

1,154 mg trong 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.12). Giá trị ảnh hưởng của

từng yếu tố lên trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin được

tính toán bằng phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.13). 4 yếu tố có giá trị

ảnh hưởng lớn (mang giá trị dương) ở các thông số trọng lượng tươi, trọng lượng

khô và hàm lượng Plumbagin (p < 0,05) của rễ tơ BHX nuôi cấy được chọn là:

nước dừa, chitosan, salicylic acid và pepton. Kết quả cho thấy nước dừa có tác

động mạnh nhất đến tăng trưởng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của rễ, còn

pepton và chitosan có ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy Plumbagin.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.

Nghiệm Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng Plumbagin

thức (g) (g) (mg)

Thí Mô hình Thí Mô Thí Mô

nghiệm hình nghiệm hình nghiệm

4,82 4,78 0,54 0,56 1,184 1 1,154

4,22 4,02 0,403 0,36 0,899 2 0,731

4,41 4,78 0,415 0,47 0,956 3 0,591

3,37 4,02 0,253 0,36 0,945 4 1,154

4,25 4,02 0,427 0,45 0,008 5 0,169

0,439 3,61 4,02 6 0,36 0,380 0,591

0,557 5,14 4,78 7 0,45 0,221 0,169

0,559 5,28 4,78 8 0,56 0,860 0,731

0,423 4,4 4,78 9 0,47 0,351 0,731

0,563 5,32 4,02 10 0,45 1,42 1,154

0,585 4,62 4,78 11 0,56 0,353 0,591

0,346 3,34 4,02 12 0,45 0,361 0,169

Bảng 3.13. Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.

Yếu tố Giá trị khảo sát Mức tác động

Trọng Trọng Hàm lượng

lượng tươi lượng khô Plumbagin

Nước dừa (%) 10 30 0,76 0,108 -0,014

Peptone (mg/L) 100 500 0,34 -0,00467 0,563

Dịch trích nấm

men (mg/L) 100 1000 0,277 0,020 0,005

Chitosan(mg/L) 100 300 -0,08 0,013 0,422

Casein(mg/L) 100 500 0,01 0,003 -0,119

SA (mg/L) 10 100 0,067 0,009 0,107

Đường (g/L) 10 50 -0,413 -0,088 -0,072

Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy

Plumbagin

Sau khi sàng lọc các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và

tích lũy Plumbagin, kế hoạch hóa thực nghiệm được thực hiện theo đáp ứng bề

mặt (RSM-DOD), xử lý bằng Design expert® 7.0.0. Giá trị hàm đáp ứng theo

thực nghiệm và tiên đoán theo mô hình được trình bày trong Bảng 3.14.

Hàm lượng

Trọng lượng

Hàm lượng

tươi (g)

khô (g)

Plumbagin (mg)

Nước

Chitosan SA Peptone

Thí

Mô

Thí

Mô

Thí

Mô

dừa

nghiệm

hình

nghiệm

hình

nghiệm

hình

175

249

2,92

3,00

0,38

10,59

9,93

100

500

2,95

2,79

0,35

0,34

10,59

10,28

264

100

2,94

2,87

0,37

10,57

11,38

300

100

2,90

3,01

0,38

0,36

7,61

8,79

100

292

3,10

3,24

0,36

0,35

10,92

10,29

278

290

4,97

4,89

0,51

0,50

5,06

5,74

300

500

2,69

2,75

0,43

0,44

6,71

7,46

100

2,52

2,74

0,34

0,35

7,97

6,91

100

426

2,66

2,58

0,38

0,35

14,70

14,56

300

100

3,10

3,12

0,29

0,31

9,35

8,29

196

500

2,57

2,53

0,34

0,35

12,46

12,10

300

100

3,1

2,94

0,45

0,43

10,35

10,42

100

500

2,99

2,96

0,34

0,39

13,68

11,86

100

426

3,32

3,04

0,38

0,37

9,92

10,77

196

500

2,24

2,25

0,28

0,27

8,33

7,61

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của 4 yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy

100

3,66

3,81

0,47

10,03

11,06

300

500

100

3,29

3,31

0,39

0,36

6,86

7,72

203

100

2,98

2,97

0,36

0,38

6,78

7,39

300

310

2,85

2,94

0,40

9,19

7,60

100

2,92

2,84

0,38

0,39

8,66

10,3

300

310

2,83

2,94

0,43

11,59

10,42

300

500

2,58

2,79

0,34

10,67

10,73

100

500

100

3,32

3,01

0,34

0,36

8,27

8,19

222

344

100

2,90

3,04

0,35

0,37

11,14

10,38

100

3,06

2,96

0,44

0,39

10,60

11,91

Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy được dùng như là

một mô hình để tiên đoán cho từng hàm mục tiêu thu được. Thông quá giá trị

phân tích, ảnh hưởng và mức tương quan ảnh hưởng giữa các yếu tố (nước dừa,

chitosan, salicylic acid và pepton) đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

Plumbagin thể hiện ở Bảng 3.15 và các Hình 3.22, 3.23, 3.24.

Hình 3.22. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng khô

Hình 3.23. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng

tươi

Hình 3.24. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến hàm lượng

Plumbagin.

100

Bảng 3.15. Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình D-

Optimal.

Thông số Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng

Plumbagin

0,864 0,994 R2 (R- 0,927

Squared)

C.V% 7,852 6,988 10,510

Phương Y1 = 3,278– 0,352x1- Y2 = 0,35– 0,031x2 Y3 =

trình tuyến 0,536x2-0,144x3 + +0,036x1x3- 7,03+1,31x1-

tính tương 0,426x1x2 + 0,439x1x3 – 0,044x1x4 – 0,75x3- 0,97x1x2

quan giữa 0,983x1x4-0,526x2x3+ 0,038x2x3 + + 1,21x1x3 +

2 –

các yếu tố 0,240x3x4+ 0,386x1 0,025x3x4 – 0,95x2x3–

2-0,714x3

2+ 0,1x4

1,310x2 0,068x3 1,41x2x4 –

2 +

+1,265x4 0,029x1x2x3+ 0,90x3x4

0,813x1x2x3+0,266x1x2x4 0,023x1x2x4+ +2,22x2

2–

+ 0,048x1x3x4+ 1,48x3

2x2

1,156x1x3x4+0,669x1 0,065x1 2,00x1x3x4-

2x2

0,73x1

x1, x2, x3, x4 lầnlượt tương ứng: nước dừa, chitosan, salicylic acid và peptone.

Từ kết quả nhận được, mô hình đáp ứng bề mặt (D-Optimal) đã dự đoán

được điểm tối ưu cho sự sinh trưởng và tích lũy Plumbagin là nước dừa: 14,33%,

chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L, với kết quả

nhận được tương ứng: trọng lượng tươi 4,968 g/ 60 ml MT, trọng lượng khô:

0,451 g/ 60 ml MT và hàm lượng Plumbagin:11,135 mg/ 60 ml MT. Từ những

ghi nhận có được cho thấy, có nhiều yếu tố tác động đến sinh trưởng và tích lũy

101

Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà. Kết quả này góp phần khẳng định vai trò của

một số yếu tố trong quá trình sinh trưởng và tích lũy hoạt chất trong nuôi cấy mô

thực vật của Naha´lka và cs (1998) [159], Putalun và cs (2010) [185] và

Thaweesak và cs (2011) [242].

3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin

Ảnh hưởng của plumbagin lên sự tăng sinh của tế bào HepG2

Plumbagin đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự tăng sinh của

nhiều loại tế bào ung thư như tế bào ung thư phổi [87], ung thư biểu bì

[97],…thông qua chết theo chương trình do cảm ứng và do đó làm thay đổi mật

độ của tế bào. Trong nghiên cứu này, tế bào HepG2 được Plumbagin ở các nồng

độ khác nhau cảm ứng. Sau ba ngày nuôi cấy, mật độ tế bào HepG2 giảm dần

khi nồng độ Plumbagin gây cảm ứng tăng dần. Mật độ trung bình tế bào HepG2

ở nồng độ 2,5 µM Plumbagin là 115,33x104 tế bào/ml. Ở nồng độ này, mật độ tế

bào HepG2 tăng so với mật độ tế bào ban đầu (100x104 tế bào/ml) sau 3 ngày

cảm ứng. Điều đó chứng tỏ nồng độ Plumbagin 2,5 µM chưa đủ sức gây chết tế

bào HepG2. Mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm khi nồng độ Plumbagin ở

5 µM (58x104 tế bào/ml), 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm mạnh ở nồng độ

20 µM (23,33x104 tế bào/ml) (Bảng 3.16). Hình 3.25 mô tả hình thái của tế bào

HepG2 khi bị Plumbagin ở các nồng độ khác nhau gây cảm ứng. Ở nhóm đối

chứng, quần thể tế bào HepG2 phát triển bình thường với mật độ cao, ở nồng độ

2,5 µM Plumbagin bắt đầu ức chế sự tăng sinh của tế bào HepG2. Ở nồng độ

Plumbagin 5 µM và 10 µM, mật độ tế bào thưa dần và ở nồng độ 20 µM, mật độ

tế bào giảm mạnh nhất (Hình 3.25)

102

Bảng 3.16. Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác

nhau.

Nồng độ Plumbagin (µM)

Đối chứng 2,5 5 10 20

Mật độ tế 137,67 115,33±1,45b 58,00±1,00c 57,33±1,20c 23,33±0,88d bào ±1,76a (x104)

a,b,c,d: Khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤0,05)

Hình 3.25. Hình thái tế bào HepG2. A: Đối chứng. B, C, D, E: HepG2 được cảm

ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ 2,5, 5, 10, 20 µM.

Để xác định những biến đổi của nhân trong quá trình apoptosis, phương

pháp nhuộm đơn với thuốc nhuộm Acridine Orange được áp dụng trong việc

đánh giá hình thái của nhân [231]. Kết quả nhuộm nhân cho thấy nhóm tế bào

đối chứng có hình thái nhân bình thường - đều, màng nhân liên tục và không

thấy nhân bị phân mảnh (Hình 3.26A). Trong khi đó ở các nhóm tế bào được xử

103

lý Plumbagin đều xuất hiện sự phân mảnh của nhân. Nhân tế bào HepG2 được

cảm ứng Plumbagin bị phân mảnh và phân tán trong tế bào chất. Quá trình phân

mảnh của nhân tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ Plumbagin cảm

ứng càng tăng (Hình 3.26).

Hình 3.26. Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2.

A: HepG2 không xử lý Plumbagin - nhân nguyên vẹn, không phân mảnh.

B, C, D, E: HepG2 xử lý Plumbagin ở nồng độ tương ứng - 2,5, 5, 10, 20 µM.

Quá trình phân mảnh của tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ

Plumbagin xử lý càng cao (mũi tên trắng).

Phương pháp điện di tế bào đơn được sử dụng để đánh giá mức độ đứt gãy

DNA nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin. Phương pháp này

được đánh giá qua hai thông số là phần trăm DNA trong đuôi comet và tỉ lệ

chiều dài đuôi comet/chiều dài comet. Phần trăm DNA trong đuôi comet thể hiện

lượng DNA đứt gãy và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet thể hiện mức

độ đứt gãy của DNA nhân tế bào. Kết quả cho thấy, khi nồng độ càng cao, lượng

DNA đứt gãy trong nhân tế bào HepG2 càng lớn (Bảng 3.17). Nồng độ

Plumbagin 20 µM gây đứt gãy DNA mạnh nhất. Ở nồng độ Plumbagin 5 µM và

104

10 µM lượng DNA trong tế bào HepG2 bị đứt gãy như nhau. Kết quả đánh giá tỉ

lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet cho thấy, khi nồng độ Plumbagin cảm

ứng tăng thì tỉ lệ này càng tăng ở tế bào HepG2 (Bảng 3.17). Tỉ lệ này cao nhất ở

tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin nồng độ 20 µM. Trong khi đó ở

nồng độ 5 µM và 10 µM, tỉ lệ này là tương đương nhau. Kết quả này cho thấy

khi nồng độ Plumbagin cảm ứng càng tăng, thì quá trình phân mảnh DNA thành

các đoạn nhỏ diễn ra càng mạnh. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá sự

phân mảnh của nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin (Hình

3.27). Đây là những đặc điểm quan trọng liên quan tới sự chết theo chương trình

của tế bào HepG2.

Bảng 3.17. Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài

comet.

Nồng độ Plumbagin (µM)

Đối chứng 2,5 5 10 20

Phần trăm

12,46±0,72a 32,96±1,47b 46,99±3,64c 48,66±3,12c 65,32±2,56d DNA trong

đuôi comet

Tỉ lệ chiều

dài đuôi 0,19±0,01a 0,41±0,03b 0,55±0,03c 0,63±0,02c 0,76±0,04d comet/chiều

dài comet

105

Hình 3.27. Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin

A, B, C, D, E: Ảnh huỳnh quang của tế bào HepG2 được nhuộm với Acridine

Orange. A1, B1, C1, D1, E1: Ảnh comet của tế bào HepG2 trong phân tích DNA

đứt gãy.

Phương pháp RT-PCR được áp dụng để đánh giá sự biểu hiện một số gene

liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2 [276]. Họ protein Bcl-2

gồm các protein BAX và protein BCL-2 được mã hóa bởi các gene họ bcl-2. Sự

cân bằng giữa các protein tiền apoptosis và protein kháng apoptosis quyết định tế

bào sẽ sống hay chết. Các thành viên trong họ Bcl-2 có chức năng như là các

điểm kiểm soát quyết định các trạng thái của tế bào [248].

Kết quả phân tích sự biểu hiện của gene kháng apoptosis bcl-2 và gene

tiền apoptosis bax ở mức phiên mã cho thấy sản phẩm phiên mã mRNA của gene

bax biểu hiện tăng theo nồng độ xử lý Plumbagin trong khi đó sự biểu hiện

mRNA của gene bcl-2 gần như không thay đổi ở các nồng độ Plumbagin (Hình

3.28). Ở nhóm đối chứng, sự biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax được cân

bằng, điều đó giúp tế bào không đi vào quá trình apoptosis. Trong khi đó ở các

nhóm tế bào được cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau, sự cân bằng

trong quá trình biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax bị thay đổi theo khuynh

hướng tăng sự biểu hiện của gene bax ở mức phiên mã khi tăng nồng độ

Plumbagin. Sự thay đổi trên dẫn tới cảm ứng các tế bào này đi vào quá trình

apoptosis và biểu hiện một số đặc điểm của quá trình apoptosis.

106

Kết quả phân tích RT-PCR trên phù hợp với các kết quả đánh giá mức độ

phân mảnh của tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân.

Hình 3.28. Sự biểu hiện của gene Bcl-2 và Bax ở mức phiên mã của tế bào

HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ khác nhau.

Quá trình giảm biểu hiện các sản phẩm phiên mã của gene kháng

apoptosis bcl-2 và tăng biểu hiện của gene tiền apoptosis bax diễn ra tương ứng

với việc một số đặc điểm biến đổi hình thái của quá trình apoptosis như sự phân

mảnh tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân diễn ra

càng mạnh.

107

Chương 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

- Chồi in vitro cây Bạch hoa xà phát triển tối ưu ở điều kiện môi trường MS

bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA; sự phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi ở

môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA; Lá là nguồn nguyên liệu cho khả năng

tạo rễ bất định cao với môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA.

- Tạo được 4 dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2

gen rolB và rolC. Qua mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM

và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325

cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%).

- Elicitor và dinh dưỡng là các yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng và

tích lũy hoạt chất ở rễ tơ cây Bạch hoa xà (nước dừa: 14,30%, chitosan 100

mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả trọng

lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135

mg).

- Plumbagin cảm ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi

sự cân bằng trong biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào

HepG2, thông qua mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm ở nồng độ

Plumbagin 5 µM (58x104 tế bào/ml) và 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm

mạnh ở nồng độ 20 µM (23,33x104 tế bào/ml); sự phân mảnh của nhân và sự

biểu hiện của gene liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2.

108

4.2 Đề nghị

- Khảo sát một số yếu tố tác động đến quá trình chuyển gen (chủng vi

khuẩn, nhiệt độ, pH, các chất phenol,..) nhằm tăng hiệu quả chuyển gen.

- Nghiên cứu một số elicitor khác (ion kim loại, vi sinh vật,..) đến khả năng

sinh trưởng và tích lũy Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà.

- Kiểm tra độc tính của Plumbagin để có cơ sở khoa học cho việc ứng dụng

hoạt chất này vào thực tế.

109

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Xác định được điều kiện khử trùng, môi trường tạo chồi, tạo cây và ra rễ

của cây Bạch hoa xà in vitro. Tạo rễ tơ cây bạch hoa xà trong điều kiện in

vitro nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 11325.

- Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh trưởng và tích lũy

hợp chất Plumbagin trong rễ tơ.

110

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Bùi Đình Thạch, Nguyễn Minh Hiếu, Nguyễn Phương Uyên, Ngô Kế

Sương, Nguyễn Hữu Hổ. (2012): Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu

khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà- Plumbago zeylanica L., Tạp

chí sinh học, 34(3SE): 161-169.

2. Bùi Đình Thạch, Hoàng Nghĩa Sơn, Đoàn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê

Thành Long, Nguyễn Hữu Hổ, Ngô Kế Sương. (2014): Plumbagin cảm

ứng một số đặc điểm apoptosis của tế bào HepG2, Tạp chí sinh học,

36(2): 247-252.

3. Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi

Ben, Nguyen Pham Ai Uyen, Ngo Ke Suong & Nguyen Huu Ho (2014):

Investigation on the accumulation of plumbagin in Plumbago zeylanica L.

hairy roots, European Journal of Advanced Research in Biological and

Life Sciences, 2(2): 14-21.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

1. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam: tr. 89 – 90.

NXB Y học.

2. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi

Văn Lệ. (2010), Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Bèo đất

Drosera burmanni Vahl. Cho mục tiêu thu nhận quinone. Tạp chí phát triển

KH&CN, 13 (T2): 53-61.

3. Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007). Nhân giống in vitro cây bắt

ruồi Drosera burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone có hoạt tính sinh

học. Tạp chí phát triển KH&CN, 10: 59- 66.

Tài liệu nước ngoài

4. Abbasi B.H., Tian C.L., Murch S.J., Saxena P.K., Liu C.Z. (2007), Light-

enhanced caffeic acid derivatives biosynthesis in hairy root cultures of

Echinacea purpurea. Plant Cell Rep 26:1367– 1372.

5. Abdul K.M., Ramchender R.P. (1995), Modulatory effect of plumbagin (5-

hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinone) on macrophage functions in

BALB/c mice. I. Potentiation of macrophage bactericidal activity.

Immunopharmacology; 30:231–236.

6. Abebe D., Ayehu A. (1993), Medicinal plants and enigmatic health

practices of northern Ethiopia. BSPE, Addis Ababa. Ethiopia. pp. 419-431.

7. Aditi G., Anjali G., Singh J. (1999), New naphtoquinones from Plumbago

zeylanica. Pharm. Biol. 37: 321 - 323.

8. Aggarwal B.B. (2004), Nuclear factor-kappaB: the enemy within, Cancer

Cell; 6: 203-208.

9. Ahmad A., Banerjee S., Wang Z., Kong D. and Sarkar H.F. (2008),

Plumbagin-induced apoptosis of human breast cancer cells is mediated by

inactivation of NF-kappaB and Bcl-2. J. Cell Biochem; 105:1461–1471.

10. Ahmad A., Farhan A.S., Singh S., Hadi S.M. (2000). DNA breakage by

resveratrol and Cu(II): Reaction mechanism and bacteriophage inactivation.

Cancer Lett; 154:29–37.

11. Ahmad A., Syed F.A., Singh S., Hadi S.M. (2005), Prooxidant activity of

resveratrol in the presence of copper ions: Mutagenicity in plasmid DNA.

Toxicol Lett; 159:1–12.

12. Alexander P.D., Alloway B.J., Dourado A.M. (2006), Genotypic variations

in the accumulation of Cd, Cu, Pb and Zn exhibited by six common grown

vegetables. Environmental Pollution, 144: 736–745.

13. Aoki S. (2004), Resurrection of an ancestral gene: functional and

evolutionary analyses of the Ng rol genes transferred from Agrobacterium

to Nicotiana. J Plant Res; 117:329-37.

14. Aoki S., Syono K. (1999), Synergistic function of rolB, rolC, ORF13 and

ORF14 of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes in hairy root induction in

Nicotiana tabacum. Plant Cell Physiol; 40:252-256.

15. Aziz M.H., Dreckschmidt N.E., Verma A.K. (2008), Plumbagin, a

medicinal plant-derived naphthoquinone, is a novel inhibitor of the growth

and invasion of hormone-refractory prostate cancer. Cancer Research 68,

9024–9032.

16. Azlan G.J., Marziah M., Radzali M., Johari R. (2002), Establishment of

Physalis minima hairy roots culture for the production of physalins. Plant

Cell Tiss Org Cult. 69:271-278.

17. Babulaa P., Mikelováb R., Potěšilb D., Adamb V., Kizekb R., Haveld L.,

Sladký Z. (2005), Simultaneous determination of 1,4- naphtoquinone,

lawsone, juglone and plumbagin by liquid chromatography with UV

detection. Biomed. Papers 149: 25-28.

18. Bakkali, A.T., Jaziri M., Foriers A., Vander Heyden Y., Vanhaelen M.,

Home`s J. (1997), Lawsone accumulation in normal and transformed

cultures of henna, Lawsonia inermis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 51:83–87.

19. Balandrin M.F., Klocke J.A, Wurtele E.S. and Bollinger W.H. (1985),

Natural plant chemicals: sources of industrial and medicinal materials.

Science 228, 1154-1160.

20. Banerjee S., Rahman L., Uniyal G.C., Ahuja P.S. (1998), Enhanced

production of valepotriates by Agrobacterium rhizogenes induced hairy root

cultures of Valeriana wallichii DC. Plant Sci 131:203–208.

21. Bauer N., Kiseljak D., Jelaska S. (2009), The effect of yeast extract and

methyl jasmonate on rosmarinic acid accumulation in Coleus blumei hairy

roots. Biol Plant 53:650–656.

22. Benhamou N. (1996), Elicitor-induced plant defence pathways, Trends in

Plant Sci. 1: 233-240.

23. Berlin J., Beier H., Fecker L., Forche E., Noe´ W., Sasse F., Schiel O.,

Wray V. (1985), Conventional and new approaches to increase the alkaloid

production of plant cell cultures. In: Neumann, K. H., Barz, W., Reinhard,

E., eds. Primary and secondary metabolism of plant cell cultures. Berlin:

Springer-Verlag: 272–280.

24. Bhagwath S.G. (1997), Optimization and Scale-Up of Thiarubrine A

Production from Hairy Root Cultures of Ambrosia artemisiifolia.

Dissertation, Louisiana State University.

25. Bhargava S.K. (1994), Effects of plumbagin on reproductive function of

male dog. Ind J. Exp. Biol. 22: 153-156.

26. Bloem E.M., Riemenschneider A., Volker J., Papenbrock J., Schmidt A.,

Salac I., Haneklaus S., Schnug E. (2004), Sulfur supply and infection with

Pyrenopeziza brassicae influence l-cysteine desulphydrase activity in

Brassica napus L. J. Exp Bot 55 (406): 2305-2312.

27. Boitel- Conti M., Laberche J.C., Lanoue A., Ducrocq C., and Sangwan-

Norreel B.S. (2000), Influence of feeding precursors on tropane alkaloid

production during an abiotic stress in Datura innoxia transformed roots.

Plant Cell Tissue and Organ Culture 60: 131–137.

28. Bonhomme V., Matta D.L., Fliniaux M.A. (2000), Effects of the rolC gene

on hairy root: induction development and tropane alkaloid production by

Atropa belladonna. J Nat Prod; 63:1249-52.

29. Borgesargaez R., Canche-Chay C.I., Pena-Rodriguez L.M., Said-Fernandez

S., Molina-Salinas G.M. (2007), Antimicrobial activity of Diospyros

anisandra. Fitoterapia; 78:370–372.

30. Bulatovic V.M., Wengenack N.L., Uhl J.R., Hall L., Roberts G.D.,

Cockerill III F.R., Rusnak F. (2002), Oxidative stress increases

susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid. Antimicrob

Agents Chemother; 46:2765–2771.

31. Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Mischenko N.P. (2002), Effects of Ca+2

channel blockers and protein kinase/ phosphatase inhibitors on growth and

anthraquinone production in Rubia cordifolia callus cultures transformed by

the rolB and rolC genes. Planta; 217:349-55.

32. Bulgakov V.P., Veselova M.V., Tchernoded G.K. (2003), Inhibitory effect

of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene on rabdosiin and RA production

in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon transformed cell

cultures. Planta; 221:471-78.

33. Capone I., Spano L., Cardarelli M. (1989), Upstream noncoding region

which confers polar expression to Ri plasmid root inducing gene rolB. Plant

Mol Biol; 13:43-52.

34. Cardarelli M., Mariotti D., Pomponi M. (1987), Agrobacterium rhizogenes

T-DNA genes capable of inducing hairy root phenotype. Mol Gen Genet;

209:475-80.

35. Casanova E., Trillasa M.I., Moysseta L.R. (2005), Influence of rol genes in

floriculture. Biotech Adv; 23:3-39.

36. Chanprame S., Tatreerod S., Saralamp P. and Chanprame S. (2003), High

efficiency system for micropropagation of Plumbago indica L. pp. 263 In

The 3 rd World Congress on Medicinal and Aromatic plants for Human

Welfare. Ching Mai, Thailand.

37. Charlwood B.V., Charlwood K.A. (1991), Terpenoid production in plant

cell culture. In: Harborne, J.B., Tomas-Barberan F.A., eds. Ecological

chemistry and biochemistry of plant terpenoids. Oxford: Clarendon Press:

95–132.

38. Checker R., Sharma D., Sandur S.K., Khanam S., Poduval T.B. (2009),

Antiinflammatory effects of plumbagin are mediated by inhibition of

NFkappaB activation in lymphocytes. Int. Immunopharmacol; 9(7-8): 949-

958.

39. Chen C.A., Chang H.H., Kao C.Y., Tsai T.H., Chen Y.J. (2009),

Plumbagin, isolated from Plumbago zeylanica, induces cell death through

apoptosis in human pancreatic cancer cells. Pancreatology, 9(6): 797-809.

40. Chilton M.D., Tepfer D.A., Petit A., David C. and Cassedelbart F. (1982),

Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host

plant root cells. Nature 295: 432-434.

41. Chinou I. (2008), Primary and Secondary Metabolites and their Biological

Activity. In: Thin Layer Chromatography in Phytochemistry,

Waksmundzka-Hajnos, M., J. Sherma and T. Kowalska, (Eds.). CRC Press,

Boca Raton.

42. Choosakul O. (2000), Plumbagin Production in Cell Suspension Cultures of

Plumbago zeylanica L. M.S. Thesis. Chulalongkorn University, Thailand.

43. Condori J., Sivakumar G., Hubstenberger J., Dolan M.C., Sobolev V.S.,

Medina-Bolivar F. (2010), Induced biosynthesis of resveratrol and the

prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 in hairy root cultures of

peanut: Effects of culture medium and growth stage. Plant Physiol

Biochem. 48 310-318.

44. Croteau R., Kutcahn T.M. and Lewis N.G. (2000), Natural products. In

Biochemistry and Molecular Biology of Plants (Buchanan, B., Gruissem,

W. and Jones, R., eds). Rockville, MD: American Society of Plant

Physiologists, pp. 1250–1318.

45. Curreli N., Sollai F., Massa L., Comandini O., Rufo A., Sanjust E., Rinaldi

A., Rinaldi A.C. (2001), Effects of plant-derived naphthoquinones on the

growth of Pleurotus sajor-caju and degradation of the compounds by fungal

cultures. J Basic Microbiol; 41:253–259.

46. Curtin M.E. (1983), Harvesting profitable products from plant tissue

culture. Bio/Technology 1:649–657.

47. Darvill A.G. and Albersheim P. (1984), Phytoalexins and their elicitors-

defense against microbial infection in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. 35:

243-275.

48. Das G. and Rout G.R. (2002), Direct plant regeneration from leaf explants

of Plumbago species. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 68: 311-314.

49. Dehio C., Grossmann K., Schell J. (1993), Phenotype and hormonal status

of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium

rhizogenes T-DNA. Plant Mol Biol; 23:1199-10.

50. Demma J., Hallberg K., Hellman B. (2009), Genotoxicity of plumbagin and

its effects on catechol and NQNO-induced DNA damage in mouse

lymphoma cells. Toxicol. In Vitro, 23(2): 266-271.

51. Devi U.P., Rao S.S.B., Solomon E.F. (1998), Effect of plumbagin on the

radiation induced cytogenetic and cell cycle changes in mouse Ehrlich

Ascitic Carcinoma in vivo. Indian Journal of Experimental Biology, 36:

891–895.

52. Dey P.M. and Harborne J.B. (1997), Plant Biochemistry. Academic Press,

San Diego.

53. Dicosmo F. and Misawa M. (1995), Plant cell and tissue culture alternative

for metabolite production. Biotechnology Advances, 13 (3): 425-453.

54. Didery N., Dubrevil L., Pinkas M. (1994), Activity of anthraquinonic and

naphtoquinonic compounds on oral bacteria. Die Pharm. 49: 681-683.

55. Ding Y., Chen Z.J., Liu S., Che D., Vetter M. & Chang C.H. (2005), J.

Pharm. Pharmacol. 57: 111-116.

56. Durand R. and Zenk H.M. (1971), Biosynthesis of plumbagin (5-hydroxy-2-

methyl-1,-4- naphthoquinone) via the acetate pathway in higher plants.

Tetrahedron Lett.

57. Dzoyem J.P., Tangmouo J.G., Lontsi D., Etoa F.X., Lohoue P.J. (2007), In

vitro antifungal activity of extract and plumbagin from the stem bark of

Diospyros crassiflora Hiern (Ebenaceae). Phytother Res; 21:671–674.

58. Ercan G.A., Taskin M.K, Turgut K., Yuce S. (1999), Agrobacterium

rhizogenes-mediated Hairy root Formation in Some Rubia tinctorum L.

Populations Grown in Turkey. Tr. J. of Botany 23: 373-377.

59. Estruch J.J., Schell J., Spena A. (1991), The protein encoded by rolB plant

oncogene hydrolyses indole glucosides. EMBO J; 10:3125-8.

60. Faria J.M.S., Nunes I.S., Figueiredo A.C., Pedro L.G., Trindade H., Barroso

J.G. (2009), Biotransformation of menthol and geraniol by hairy root

cultures of Anethum graveolens: effect on growth and volatile components.

Biotechnol Lett 31:897–903.

61. Farr S.B., Natvig D.O., Kogoma T. (1985), Toxicity and mutagenicity of

plumbagin and the induction of a possible new DNA repair pathway in

Escherichia coli. J Bacteriol; 164:1309–1316.

62. Fernandez R.M.D., Moreno M.T., Cubero J.I. and Gil J. (1998), An efficient

in vitro method for chickpea. Int. Chickpea Pigeonpea. News Lett., 5: 18–9.

63. Figueiredo S.F.L., Simōes C., Albarello N. and Viana V.R.C. (2000),

Rollinia mucosa cell suspension culture: Establishment and growth

conditions. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 63:85-92.

64. Filippini F., Lo Schiavo F., Terzi M. (1994), The plant oncogene rolB alters

binding of auxin to plant cell membranes. Plant Cell Physiol; 35:767-71.

65. Filippini F., Rossi V., Marin O. (1996), A plant oncogene as a phosphatase.

Nature; 379:499-00.

66. Fits D.V.L. and Memelink J. (2000), ORCA3, a jasmonate-responsive

transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism.

Science 289, 295-297.

67. Flores H.E., Vivanco J.M., Loyola-Vargas V.M. (1999), Radicle

biochemistry: the biology of root-specific metabolism. Trends Plant Sci.

4:220–226.

68. Flores H.E., Yao-Rem D., Cuello J.L., Maldonado-Mendoza I.E., Loyola-

Vargas V.M. (1993), Green roots: photosynthesis and photoautotrophy in an

underground plant organ. Plant Physiol. 101:363–371.

69. Fraga B.M. (1988), Natural sesquiterpenoids. Natural Product Reports. 5:

497-521.

70. Frankfater C.R., Dowd M.K., Triplett B.A. (2009), Effect of elicitors on the

production of gossypol and methylated gossypol in cotton hairy roots. Plant

Cell Tissue Organ Cult 98:341–349.

71. Fruendt C., Meyer A.D., Ichikawa T. (1998), A tobacco homologue of the

Ri-plasmid orf13 gene causes cell proliferation in carrot root discs. Mol Gen

Genet; 259:559-68.

72. Furuya T., Yoshikawa T., Orihara Y., Oda H. (1984), Studies of the culture

conditions for Panax ginseng cells in jar fermentors. J. Nat. Prod. 47:70–75.

73. Gamborg O.L., Miller R.A and Ojima K. (1968), Nutrient requirements of

suspension cultures of soyabeen root cells. Exp. Cell. Res. 50: 151-158.

74. Ganasoundari A., Zare S.M., Devi U.P. (1997), Modification of bone

marrow radiosensitivity by medicinal plant extracts. British Journal of

Radiology; 70: 599-602.

75. Gangopadhyaya M., Dewanjee S., Chakraborty D., Bhattacharya S. (2011),

Role of exogenous phytohormones on growth and plumbagin accumulation

in Plumbago indica hairy roots and conservation of elite root clones via

synthetic seeds. Industrial Crops and Products; 33: 445–450.

76. Gaudin V., Vrain T., Jouanin L. (1994), Bacterial genes modifying

hormonal balances in plants. Plant Physiol Biochem; 32(1):11-29.

77. Gbadamosi T.I. and Egunyomi A. (2010), Micropropagation of Plumbago

zeylanica L. (Plumbaginaceae) in Ibadan, Southwestern, Nigeria. Journal of

Medicinal Plants Research, Vol. 4(4): 293 – 297.

78. Geier T., Eimert K., Scherer R., Nickel C. (2008), Production and rooting

behaviour of rolB-transgenic plants of grape rootstock ‘Richter 110’ (Vitis

berlandieri x V. rupestris). Plant Cell Tiss Org Cult; 94: 269–280.

79. Geissman T.A. and Crout D.H.G. (1967), Organic Chemistry of Secondary

Metabolism. San Francisgo, USA: Freeman, Cooper & Company.

80. George E.F. (1993), Plant propagation by tissue culture. Part I. The

Technology. Exegetics Ltd., Edington.

81. Georgiev B.B., Sánchez M.I., Vasileva G.P., Nikolov P.N., Green A.J.

(2007), Cestode parasitism in invasive and native brine shrimps (Artemia

spp.) as a possible factor promoting the rapid invasion of A. franciscana in

the Mediterranean region. Parasitology Research; 101: 1647–1655.

82. Georgiev M., Heinrich M., Kerns G., Bley T., Pavlov A. (2006), Production

of iridoids and phenolics by transformed Harpagophytum procumbens root

cultures. Eng Life Sci; 6(6):593–596.

83. Gershenzon J., Croteau R. (1991), Terpenoids. In Herbivores their

interaction with secondary plant metabolites, Vol I: The chemical

participants, 2nd ed., G.A. Rosenthal and M.R. Berenbaum, eds, Academic

press, San Diego; pp: 165-219.

84. Giovannini A., Secchioni N., Rabaglio M. (1997), Characterization of

ornamental Datura plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. In

vitro cellular and developmental Biology Plant; 33:101-106.

85. Giri A., Narasu L.M. (2000), Transgenic hairy roots: recent trends and

applications. Biotechnology Advances; 18: 1–22.

86. Giri A., Rafindra S.T., Dhingra V., Narasu M.L. (2001), Influence of

different strains of Agrobacterium rhizogenes on induction of hairy roots

and artemisinin production in Artemisia annua. Curr. Sci.; 81: 378-382.

87. Gomathinayagam R., Sowmyalakshmi S., Mardhatillah F. Kumar R.,

Akbarsha M.A., Damodaran C. (2008), Anticancer mechanism of

plumbagin, a natural compound, on non-small cell lung cancer cells.

Anticancer Res; 28:785–792.

88. Gopinath G., Muralidharan S., Rajan S.and Danaphal P.S. (2009),

Simultaneous Estimation of Plumbagin and Embelin by Reverse Phase-

High Performance Liquid chromatographic method. Der Pharmacia Lettre;

1(1): 135-142.

89. Grayer R.J., Harborne J.B. (1994), A survey of antifungal compounds from

higher plants 1982–1993. Phytochemistry; 37: 19-42.

90. Grayson D.H. (1998), Monoterpenoids. Natural Product Reports, 5: 497-

521.

91. Grubb C., Abel S. (2006), Glucosinolate metabolism and its control. Trends

in Plant Science, 11: 89–100.

92. Hadi S.M., Asad S.F., Singh S., Ahmad A.(2000), Putative mechanism for

anticancer and apoptosisinducing properties of plant-derived polyphenolic

compounds. IUBMB Life; 50:167–171.

93. Halkier B.A., Gershenzon J. (2006), Biology and biochemistry of

glucosinolates. Annual Review of Plant Biology, 57: 303-333.

94. Hansen G., Vaubert D., Heron J.N. (1993), Phenotypic effects of

overexpression of Agrobacterium rhizogenes T-DNA ORF13 in transgenic

tobacco plants are mediated by diffusible factors. Plant J; 4:581-85.

95. Hartmann T. (1991), Alkaloids. In herbivores; their interaction with

secondary plant metabolites, Vol. I, The chemical participants, 2nd ed.,

G.A. Rosenthal and M.R. Berenbaum, eds Academic press, San Diego, pp:

33-85.

96. Hasanloo T., Sepehrifar R., Rahnama H., Shams M.R. (2009), Evaluation of

the yeast-extract signaling pathway leading to silymarin biosynthesis in

milk thistle hairy root culture. World J Microbiol Biotechnol 25:1901–1909.

97. Hazra B., Sarkar R., Bhattacharyya S., Ghosh P. K., Chel G. and Dinda B.,

(2002), Synthesis of plumbagin derivatives and their inhibitory activities

against Ehrlich ascites carcinoma in vivo and Leishmania donovani

Promastigotes in vitro. Phytother Res, 16:133-137.

98. Hook I.L.I. (2001), Naphthoquinone contents of in vitro cultured plants and

cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species. Plant Cell,

Tiss. Org. Cult. 67: 281-285.

99. Hsieh Y.J., Lin L.C., Tsai T.H. (2006), Measurement and pharmacokinetic

study of plumbagin in a conscious freely moving rat using liquid

chromatography/tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 844: 1-5.

100. Hsu Y.L., Cho C.Y., Kuo P.L., Huang Y.T., Lin C.C. (2006), Plumbagin (5-

hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone) induces apoptosis and cell cycle

arrest in A549 cells through p53 accumulation via c-Jun NH2-terminal

kinase-mediated phosphorylation at serine 15 in vitro and in vivo. J

Pharmacol Exp Ther, 318:484–494.

101. Huang H.S., Vishwakarma K.R., Lee T.T., Chan S.H. and Tsay S.H. (2014).

Establishment of hairy root lines and analysis of iridoids and secoiridoids in

the medicinal plant Gentiana scabra. Botanical Studies, 55(17): 2-8.

102. Huffman G.A., White F.F., Gordon M.P. (1984), Hairy root inducing

plasmid: physical map and homology to tumor-inducing plasmids. J

Bacteriol; 157:269-76.

103. Islam A.M., Zubair H., Imtiaz N. and Chaudhary F.M. (2005), Effect of

Different Plant Growth Regulators for the Economical Production of in

vitro Root Cultures of Cicer arietinum L. Int. J. Agri. Biol., 7(4): 621-626.

104. J¨orgensen K., Rasmussen A.V., Morant M., Nielsen A.H., Bjanrholt N.,

Zagrobelny M., Bak S. and M¨oller B.L. (2005), Metabolon formation and

metabolic channeling in the biosynthesis of plant natural products. Curr.

Opin. Plant Biol., 8: 280–91.

105. Jackson K.J., Higo T., Hunter L. W and Burt M.H. (2008), Topoisomerase

inhibitors as anti-arthritic agents. Inflamm. res., 57: 126–134.

106. Jaiswal A.S., Bloom L.B. & Narayan S. (2002), Oncogene, 21: 5912-5922.

107. Jeyachandran R., A. Mahesh A., Cindrella L., Sudhakar S. and

Pazhanichamy K. (2009), Antibacterial activity of plumbagin and root

extracts of Plumbago zeylanica L. Acta Biologica Cracoviensia Series

Botanica, 51(1): 17–22.

108. John M., Tzafrir i., Aux G., Rogers R., Ashby C., Smith K., Thomas C.,

Schetter A., Zhou Q., Cushman A.M., Tossberg J., Nickle T., Levin Z.J.,

Law M., Meinke D. and Patton D. (2001), Insertional Mutagenesis of Genes

Required for Seed Development in Arabidopsis thaliana. Genetics, 159:

1751–1763.

109. Jouanin L. (1984), Restriction map of an agropine-type Ri plasmid and its

homologies with Ti plasmids. Plasmids; 12:91-102.

110. Karban R., Baldwin I.T. (1997), Induced responses to herbivory. Chicago:

University of Chicago Press.

111. Karthikeyan A., Palanivel S., Parvathy S. and Bhakyaraj R. (2007), Hairy

root induction from hypocotyl segments of groundnut (Arachis

hypogaeaL.). African J. Biotechnol., 6(15): 1817-1820.

112. Karuppusamy S. (2009), A review on trends in production of secondary

metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures. J.

Med. Plants Res., 3: 1222-1239.

113. Kawauchi M., Arima T., Shirota O., Sekita S., Nakane T., Takase Y.,

Kuroyanagi M. (2010), Production of sesquiterpene-type phytoalexins by

hairy roots of Hyoscyamus albus co-treated with copper sulfate and methyl

Jasmonate. Chem Pharm Bull; 58:934–938.

114. Kawiak A., Piosik J., Stasilojc G., Gwizdek-Wisniewska A., Marczak L.,

Stobiecki M., Bigda J., Lojkowska E. (2007), Induction of apoptosis by

plumbagin through reactive oxygen species-mediated inhibition of

topoisomerase II. Toxicol Appl Pharmacol; 223:267–276.

115. Khan N.S., Ahmad A., Hadi S.M. (2000), Anti-oxidant, pro-oxidant

properties of tannic acid and its binding to DNA. Chem Biol Interact;

125:177–189.

116. Kieran P., MacLoughlin P., Malone D. (1997), Plant cell suspension

cultures: some engineering considerations. J. Biotechnol. 59: 39–52.

117. Kim O.T., Bang K.H., Kim Y.C., Hyun D.Y., Kim M.Y., Cha S.W. (2009),

Upregulation of ginsenoside and gene expression related to triterpene

biosynthesis in ginseng hairy root cultures elicited by methyl jasmonate.

Plant Cell Tissue Organ Cult; 98:25–33.

118. Kim O.T., Bang K.H., Shin Y.S., Lee M.J., Jung S.J., Hyun D.Y., Kim

Y.C., Seong N.S., Cha S.W., Hwang B. (2007), Enhanced production of

asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) urban elicited

by methyl jasmonate. Plant Cell Rep; 26:1941–1949.

119. Kim Y.J., Weathers P.J., Wyslouzil B.E. (2002), The growth of Artemisia

annua hairy root in liquid and gas phase reactors. Biotechnol Bioeng; 80:

454-464.

120. Kini D.P., Pandey S., Shenoy B.D., Singh U.V., Udupa N., Umadevi P.,

Kamath R., Nagarajkumari, Ramanarayan K. (1997), Antitumor and

antifertility activities of plumbagin controlled release formulations. Indian J

Exp Biol; 35:374–379.

121. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V. (2007), The rolB

gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed

cells. J Biotech; 123:681-92.

122. Kittipongpatana N., Hock R.S., Porter J.R. (1998), Production of solasodine

by hairy root, callus, and cell suspension cultures of Solanum aviculare

Forst. Plant Cell Tiss. Organ Cult.; 52:133–143.

123. Kiyokawa S., Kikuchi Y., Kamada H. (1996), Genetic transformation of

Begonia tuberhybrida by Ri rol gene. Plant Cell Rep; 15:606-09.

124. Kolewe M.E., Gaurav V. and Roberts S.C. (2008), Pharmaceutically active

natural product synthesis and supply via plant cell culture technology. Mol.

Pharm., 5: 243-256.

125. Komaraiah P., Kavi Kishor P.B and Ramakrishna S.V. (2001), Production

of plumbagin from cell suspension cultures of Plumbago rosea L. Biotech.

Lett., 23: 1269-1272.

126. Krolicka A., Staniszewska I., Bielawski K., Malinski E., Szafranek J.,

Lojkowska E. (2001), Establishment of hairy root culture of Ammi majus.

Plant Sci. 160: 259-264.

127. Kubo I., Uchida M., Klocke J.K. (1983), An insect ecolysis inhibitor from

the African medicinal plant, Plumbago capsensis (Plumbaginaceae). Agric.

Biol. Chem., 47: 911-913.

128. Kuete V., Tangmouo J.G., Meyer J.J., Lall N. (2009), Diospyrone,

crassiflorone and plumbagin: Three antimycobacterial and antigonorrhoeal

naphthoquinones from two Diospyros spp. Int J Antimicrob Agents; 34:322–

325.

129. Kunte D.P., Dhakephalkar P.K., Mukerjee A., Patil A., Kumbhar A.,

Padhye S.B., Chopade B.A. (1993), Elimination of plasmid mediated

antibiotic and metal resistance in Acinetobacter baumannii C11 by naturally

occurring quinones and their metal complexes. J Inorg Biochem; 51:387.

130. Kuo Y.L.H. and Cho C.Y. (2006), Plumbagin induces G2-M arrest and

autophagy by inhibiting the AKT/mammalian target of rapamycin pathway

in breast cancer cells. Molecular Cancer Therapeutics, 5:3209–3221.

131. Kuzmaa L., Bruchajzer E., Wysokinska H. (2009), Methyl jasmonate effect

on diterpenoid accumulation in Salvia sclarea hairy root culture in shake

flasks and sprinkle bioreactor. Enzyme MicrobTechnol, 44:406–410.

132. Laloi C., Apel K., Danon A. (2004), Reactive oxygen signalling: the latest

news. Curr Opin Plant Biol; 7:323-328.

133. Lemcke K., Schmulling T. (1998), Gain of function assays identify nonrol

genes from Agrobacterium rhizogenes TL-DNA that alter plant

morphogenesis or hormone sensitivity. Plant J; 15:423-33.

134. Li L., Wang J., Lu Y., Wang Y., Zhou G., Kai G. (2008), Optimization of

induction and culture conditions and tropane alkaloid production in hairy

roots of Anisodus acutangulus. Biotech Bioprocess Eng, 13:606-612.

135. Lubaina A.S. (2011), Shoot multiplication and direct organogenesis of an

important medicinal plant Plumbago zeylanica L. (Plumbaginaceae).

Journal of Research in Biology, 6: 424-428.

136. Luczkiewicz M. and Glod D. (2003), Callus cultures of Genista plants-in

vitro material producing high amounts of isoflavones of phytoestrogenic

activity. Plant Sci., 165: 1101-1108.

137. Mahagamasekera M.G.P., Doran P.M. (1998), Intergeneric co-culture of

genetically transformed organs for the production of scopolamine.

Phytochemistry 47:17–25.

138. Mahoney N., Molyneux R.J., Campbell B.C. (2000), Regulation of aflatoxin

production by naphthoquinones of walnut (Juglans regia). J Agric Food

Chem; 48:4418–4421.

139. Malarz J., Stojakowska A., Kisiel W. (2007), Effect of methyl jasmonate

and salicylic acid on sesquiterpene lactone accumulation in hairy roots of

Cichorium intybus. Acta Physiol Plant, 29:127–132.

140. Mandala S.K., Aithal K., Anandam A., Shavi G., Nayanabhirama U.,

Arumugam K., Musmade P., Bhat K., Bola S. (2010), reparation, in vitro

characterization, pharmacokinetic, and pharmacodynamic evaluation of

chitosan-based plumbagin microspheres in mice bearing B16F1 melanoma.

Drug Deliv; 17:103–113.

141. Martintanguy J., Sun L.Y., Burtin D. (1996), Attenuation of the phenotype

caused by the root-inducing, left-hand, transferred DNA and its rolA gene.

Plant Physiol; 111:259-67.

142. Mauricio R. (1998), Costs of resistance to natural enemies in field

populations of the annual plant Arabidopsis thaliana. The American

Naturalist, 151(1): 20–28.

143. Mauriel C., Barbier-Brygoo H., Spena A. (1991), Single rol genes from the

Agrobacterium rhizogenes TL DNA alter some of the cellular responses to

auxin in Nicotiana tabacum. Plant Physiol, 97:212-16.

144. Mauro M.L., Trovato M., De Paolis A. (1996), The plant oncogene rolD

stimulates flowering in transgenic tobacco plants. Dev Biol; 180:693-00.

145. Mazid M., Khan T., Mohammad F. (2011), Effect of abiotic stress on

synthesis of secondary plant products: A Critical Review. Agric. Rev.,

32:172-182.

146. McDonald K.A. and Jackman A.P. (1989), Bioreactor studies of growth and

nutrient utilization in Alfalfa suspenion cultures. Plant Cell Rep. 8: 455-

458.

147. Memelink J. (2005), The use of genetics to dissect plant secondary

pathways. Curr. Opin. Plant Biol., 8: 230–35.

148. Memelink J., Verpoorte R. and Kijne J.W. (2001), ORCAnization of

jasmonate-responsive gene expression in alkaloid metabolism. Trends Plant

Sci. 6, 212-219.

149. Meyer A., Tempe' J., Costantino P. (2000), Hairy root; a molecular

overview. Functional analysis of Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes.

In: Stacey G, Keen NT, eds. Plant Microbe Interactions. St. Paul: APS

Press: 93-139.

150. Mohana K., Purushothoman K.K. (1980), Plumbagin: a study of its

anticancer, antimicrobial and antifungal properties. Indian J. Exp.Biol. 18:

876-8880.

151. Montoya J., Varela-Ramirez A., Estrada A., Martinez L.E., Garza K.,

Aguilera R.J. (2004), A fluorescence-based rapid screening assay for

cytotoxic compounds. Biochem Biophys Res Commun; 325:1517–1523.

152. Montserrat S., Bergonon S., Viladomat F., Bastida J. and Codina C. (1997),

Effect of sucrose on growth and galanthamine production in shoot– clump

cultures of Narcissus confusus in liquid–shake medium. Pl. Cell Tissue Org.

Cul., 49: 129–36.

153. Morgan J.A., Bamey C.S., Penn A.H. & Shnks J.V. 2000. Effects of

buffered media upon growth and alkaloid production of Catharanthus roseus

hairy roots. Appl. Microbiol. Biotechnol.; 53:205–210.

154. Moriuchi H., Okamoto C., Nishihama R. (2004), Nuclear localization and

interaction of rolB with plant 14-3-3 proteins correlates with induction of

adventitious roots by the oncogene rolB. Plant J; 38:260-75.

155. Mossa J.S., El-Feraly F.S., Muhammad I. (2004), Antimycobacterial

constituents from Juniperus procera, Ferula communis and Plumbago

zeylanica and their in vitro synergistic activity with isonicotinic acid

hydrazide. Phytother Res; 18:934–937.

156. Mukherjee P.K., Rai S., Kumar V., Mukherjee K., Hylands P.J. and Hider

R.C. (2007), Plants of Indian origin in drug discovery. Expert Opin. Drug

Discovery, 2: 633-657.

157. Mukundan U., Hjortsø M. (1991), Effect of light on growth and thiophene

accumulation in transformed roots of Tagetes patula. J. Plant Physiol.,

138:252–255.

158. Murashige M. and Skoog F. (1962), A revised medium for rapid growth and

bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15:473-497.

159. Naha´lka J., Naha´lkova´ J., Gemeiner P. and Blana´rik P. (1998),

Elicitation of plumbagin by chitin and its release into the medium in

Drosophyllumlusitanicum Link. suspension cultures. Biotechnology Letters,

20(9):841–845.

160. Nahálka J., Blanárik P., Gemeiner P., Matúšová E. and Partlová I. (1996),

Production of plumbagin by cell suspension cultures of Drosophyllum

lusitanicum Link. J. Biotech. 49:153-161.

161. Nair S., Nair R.R., Srinivas P., Srinivas G., Pillai M.R. (2008),

Radiosensitizing effects of plumbagin in cervical cancer cells is through

modulation of apoptotic pathway. Mol Carcinog; 47:22–33.

162. Naresh R.A., Udupa N., Devi P.U. (1996), Niosomal plumbagin with

reduced toxicity and improved anticancer activity in BALB/C mice. J

Pharm Phar-macol; 48:1128–1132.

163. Nilsson O., Crozier A., Schmuelling T. (1993), Indole-3-acetic acid

homeostasis in transgenic tobacco plants expressing the Agrobacterium

rhizogenes rolB gene. Plant J; 3:681-89.

164. Nilsson O., Olsson O. (1997), Getting to the root: the role of the

Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiol

Plantarum; 100:463–473.

165. Ohyama K. and Nitsch J. P. (1972), Flowering haploid plants obtained from

protoplasts of tobacco leaves. Plant Cell Physiol., 13, 229-236.

166. Padhye S., Dandawate P., Yusufi M., Ahmad A. and Sarkar H.F, (2010),

Perspectives on Medicinal Properties of Plumbagin and Its Analogs,

Medicinal Research Reviews, 9:1–28.

167. Palazon J., Cusido R.M., Bonfill M. (2003), Elicitation of different Panax

ginseng transformed root phenotypes for an improved ginsenoside

production. Plant Physiol Biochem; 41:1019-25.

168. Pan Q.F., Chen Y., Wang Q., Yuan F., Xing S.H., Tian Y.S., Zhao J.Y., Sun

X.F., Tang K.X. (2010), Effect of plant growth regulators on the

biosynthesis of vinblastine, vindoline and catharanthine in Catharanthus

roseus. Plant Growth Regul 60:133–141.

169. Panichayupakaranant P., Tewtrakul S. (2002), Plumbagin production by

root cultures of Plumbago rosea. Electronic Journal of Biotechnology,

Vol.5 No.3, 0717-3458.

170. Parimala R., Sachdanandam P. (1993), Effect of plumbagin on some

glucose Metabolizing. J. Ethnopharmacol. 37: 85-91.

171. Park B.S., Lee H.K., Lee S.E., Piao X.L., Takeoka G.R., Wong R.Y., Ahn

Y.J., Kim J.H. (2006), Antibacterial activity of Tabebuia impetiginosa

Martius ex DC (Taheebo) against Helicobacter pylori. J Ethnopharmacol;

105:255–262.

172. Park S.U., Kim Y.K., Jang H.G., Kim J.N., Ryu H.W. (2008), Auxin

treatment improves indigo biosynthesis in hairy root cultures of Polygonum

tinctorium. Chem Nat Compd 44:213–214.

173. Parr A.J. (1988), Secondary products from plant cell culture. In: Mizrahi,

A., ed. Advances in biotechnology progress, vol. 9. Biotechnology in

agriculture. New York: Alan R. Liss;1–34.

174. Payne J., Hamill J.D., Robins R.J., Rhodes M.J.C. (1987), Production of

hyoscyamine by “hairy root” cultures of Datura stramonium. Planta Med,

53:474-478.

175. Petcharut Chuntaratin (2006), Production of plumbagin by hairy root, callus

and cell suspension cultures of Plumbago indica L. Ph. D. Thesis, Graduate

school, Kasetsart University.

176. Petersen M. (2007), Current status of metabolic phytochemistry.

Phytochemistry, 68, 2847–60.

177. Pezzuto J.M. (1995), Natural Product Cancer Chemoprotective Agents. In:

Recent Advances in Phytochemistry. Phytochemistry of Medicinal Plants.

29:19-45.

178. Pillai B.D., Jose B., Satheeshkumar K. and Krishnan N.P. (2015),

Optimization of inoculum density in hairy root culture of Plumbago rosea

L. for enhanced growth and plumbagin production towards scaling-up in

bioreactor. Indian Journal of Biotechnology; 14: 264-269.

179. Pistelli L., Giovannini A., Ruffoni B., ABertoli A. and Pistelli L. (2010),

Hairy Root Cultures for Secondary Metabolites Production. Adv Exp Med

Biol.698:167-184.

180. Pittaalvarez S.I. and Guilietti A.M. (1999), Influence of chitosan, acetic acid

and citric acid on growth and tropane alkaloid production in transformed

roots of Brugmansia candida: Effect of medium pH and growth phase.

Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 59: 31-38.

181. Plackett R.L., Burman J.P. (1946), The design of optimum multifactorial

experiments. Biometrika 37: 305-325.

182. Powolny A.A., Singh S.V. (2008), Plumbagin-induced Apoptosis in Human

Prostate Cancer Cells is Associated with Modulation of Cellular Redox

Status and Generation of Reactive Oxygen Species. Pharm Res, 25:2171–

2180.

183. Prasad V.S., Devi P.U., Rao B.S., Kamath R. (1996). Radiosensitizing

effect of plumbagin on mouse melanoma cells grown in vitro. Indian J. Exp.

Biol.; 34: 857-858.

184. Putalun W., Luealon W., De-Eknamkul W., Tanaka H., Shoyama Y. (2007),

Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of

Artemisia annua L. Biotechnol Lett; 29:1143–1146.

185. Putalun W., Udomsin O., Yusakul G., Juengwatanatrakul T., Sakamoto S.,

Hiroyuki Tanaka H. (2010), Enhanced plumbagin production from in vitro

cultures of Drosera burmanii using elicitation. BiotechnolLett, 32:721–724.

186. Rahman U.S., Ismail M., Muhammad N. , Ali F. , Chishti A.K. and Imran

M. (2011), Evaluation of the stem bark of Pistacia integerrima Stew ex

Brandis for its antimicrobial and phytotoxic activities. African Journal of

Pharmacy and Pharmacology, 5(8):1170-1174.

187. Ram A. (1996), Effect of Plumbago Zeylanica in hyperlipidaemic rabbits

and its modification by vitamin E. Indian J. Pharmacol. 28:161-166.

188. Ramachandra R.S. and Ravishankar G.A. (2002), Plant cell cultures:

Chemical factories of secondary metabolites. Bio-technology Advances, 20:

101-153.

189. Rang D.D., Dung N.X. (1996), Chemical constituents of Plumbago

zeylanica Tap. Chin. Hoc. 34: 67-70.

190. Raskin I., Ripoll C. (2004), Can an apple a day keep the doctor away? Curr.

Pharm. Des.; 10(27): 3419- 3429.

191. Ravindra K.C., Selvi B.R., Arif M., Reddy B.A., Thanuja G.R., Agrawal S.,

Pradhan S.K. Nagashayana N., Dasgupta D. Kundu T.K. (2009), Inhibition

of lysine acetyltransferase KAT3B/p300 activity by a naturally occurring

hydroxynaphthoquinone, plumbagin. J Biol Chem; 284:24453–24464.

192. Razdan M.K. (2003), Introduction to Plant Tissue. 2nd Edition. Qxford &

IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi. 27p.

193. Rijhwani S., Shanks J.V. (1998), Effect of elicitor dosage and exposure time

on biosynthesis of indole alkaloids by Catharanthus roseus hairy root

cultures. Biotechnol Prog, 14:442.

194. Roberts M.F. (1981), Enzymic synthesis of coniceine in Conium maculatum

chloroplasts and mitochondria. Plant Cell Rep., 1, 10–13.

195. Robins R.J., Parr A.J., Bent E.G., Rhodes M.J.C. (1991), Studies on the

biosynthesis of tropane alkaloids in Datura stramonium L. transformed root

cultures 1. The kinetics of alkaloid production and the influence of feeding

intermediate metabolites. Planta 183:185–195.

196. Rokem J.S., Goldberg I. (1985), Secondary metabolites from plant cell

suspension cultures: methods for yield improvement. Advances in

biotechnological processes; 4: 241–274.

197. Romero F.R., Delate K., Kraus G.A., Solco A.K., Murphy P.A., Hannapel

D.J. (2009), Alkamide production from hairy root cultures of Echinacea. In

Vitro Cell Dev Biol Plant; 45:599–609.

198. Rout G.R., Saxena C., Samantaray S. and Das P. (1999a), Rapid plant

regeneration from callus cultures of Plumbago zeylanica. Plant Cell, Tiss.

Org. Cult. 56: 47-51.

199. Rout G.R., Saxena C., Samantaray S. and Das P. (1999b), Rapid clonal

regeneration of Plumbago zeylanica Linn. Plant Growth Regul. 28:1-4.

200. Ryad A., Lakhdar K., Majda K.S. (2010), Optimization of the culture

medium composition to improve the production of hyoscyamine in elicited

Datura stramonium L. hairy roots using the Response Surface Methodology

(RSM). Int J Mol Sci; 11(11):4726-40.

201. Saito K. (2004), Sulfur assimilatory metabolism. The long and smelling

road. Plant Physiology, 136: 2443–2450.

202. Saklani A. and Kutty S.K. (2008), Plant-derived compounds in clinical

trials. Drug Discov.;13:161-171.

203. Sandur K.S, Pandey K.M., Sung B. and Aggarwal B.B. (2010), 5-Hydroxy-

2-Methyl-1,4-Naphthoquinone, a Vitamin K3 Analogue, Suppresses STAT3

Activation Pathway through Induction of Protein Tyrosine Phosphatase,

SHP-1: Potential Role in Chemosensitization. Mol Cancer Res; 8(1):107–

118.

204. Sankar R., Devamanohanran P., Raghupathi G. (1987), Lipid peroxidation

in plumbagin administered rats. J Biosci; 12:267-271.

205. Santhakumari G., Saralamma P.G., Radhakrishnan N. (1980), Effect of

plumbagin on cell growth & mitosis. Indian J Exp Biol; 18:215–218.

206. Satdive R.K., Fulzele D.P. and Eapen S. (2007), Enhanced production of

azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss by

elicitation and media optimization. J. Biotechnol.; 128 (2):281-289.

207. Satheesh Kumar K. and Bhavanandan K.V. (1988), Micropropagation of

Plumbago rosea Linn. Plant Cell, Tiss. Org. Cult.; 15:275-278.

208. Satheeshkumar K., Jose B., Soniya V.E. and Seeni S. (2009), Isolation of

morphovariants through plant regeneration in Agrobacterium rhizogenes

induced hairy root cultures of Plumbago rosea L. Indian Journal of

Biotechnology; 8: 435-441.

209. Sch¨afer H. and Wink M. (2009), Medicinally important secondary

metabolites in recombinant microorganisms or plants: Progress in alkaloid

biosynthesis. Biotechnological Journal; 4:1684–1703.

210. Schmulling T., Schell J., Spena A. (1988), Single genes from

Agrobacterium rhizogenes influence plant development. EMBO J;

7:2621-29.

211. Seigler D.S. (1998), Plant Secondary Metabolism. Kluwer, Norwell.

212. Selvakumar V., Anbudurai P.R. and Balakumar T. (2001), In vitro

propagation of the medicinal plant Plumbago zeylanica L. through nodal

explants. In Vitro Cell Develop Biol. 37: 280-285.

213. Sevon N, Oksman-Caldentey KM. (2002). Agrobacterium rhizogenes

mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids. Planta Med

68:859–868.

214. Shanks J., Morgan J. (1999), Plant ‘‘hairy root’’ culture. Curr Opin

Biotechnol 10:151–155.

215. Shih Y.W., Lee Y.C., Wu P.F., Lee Y.B. (2009), Chiang TA. Plumbagin

inhibits invasion and migration of liver cancer HepG2 cells by decreasing

productions of matrix metalloproteinase-2 and urokinaseplasminogen

activator. Hepatol Res; 39: 998–1009.

216. Shin K.S, Lee S., Cha B. (2007), Antifungal activity of plumbagin purified

from leaves of Nepenthes ventricosa 3 maxima against phytopathogenic

fungi. Plant Pathology Journal; 23:113–115.

217. Shinde A.N., Malpathak N., Fulzele D.P. (2009), Enhanced production of

phytoestrogenic isoflavones from hairy root cultures of Psoralea corylifolia

L. using elicitation and precursor feeding. Biotechnol Bioprocess Eng;

14:288–294.

218. Shinde A.N., Malpathak N., Fulzele D.P. (2010), Impact of nutrient

components on production of the phytoestrogens daidzein and genistein by

hairy roots of Psoralea corylifolia. J Nat Med; 64:346- 353.

219. Shukla S., Wu C.P., Nandigama K., Ambudkar S.V. (2007), The

naphthoquinones, vitamin K3 and its structural analogue plumbagin, are

substrates of the multidrug resistance linked ATP binding cassette drug

transporter ABCG2. Mol Cancer Ther; 6:3279–3286.

220. Simms E.L. (1992), Costs of plant resistance to herbivory. In Plant

resistance to herbivores and pathogens. eds. Ecology, evolution and

genetics, Fritz RS and Simms EL, Chicago: University of Chicago

Press,44:392-425.

221. Singh G., Gavrieli J., Oakley J.S., Curtis W.R. (1998), Interaction of methyl

jasmonate , wounding and gungal elicitation during sesquiterpene induction

in Hyoscyamus mutucus in root cultures. Plant Cell Rep, 17:391-395.

222. Singh S., Asad S.F., Ahmad A., Khan N.U., Hadi S.M. (2001), Oxidative

DNA damage by capsaicin and dihydrocapsaicin in the presence of Cu(II).

Cancer Lett; 169:139–146.

223. Singh U.V., Udupa N. (1997), Reduced toxicity and enhanced antitumor

efficacy of betacyclodextrin plumbagin inclusion complex in mice bearing

Ehrlich ascites carcinoma. Indian J Physiol Pharmacol; 41:171–175.

224. Sinkar V.P., Pythoud F., White F.F. (1988), RolA locus of the Ri plasmid

directs developmental abnormalities in transgenic tobacco plants. Genes

Dev; 2:688-97.

225. Sivanesan I. and Jeong B.R. (2009), Induction and establishment of

adventitious and hairy root cultures of Plumbago zeylanica L. African

Journal of Biotechnology; 8 (20):5294-5300.

226. Smith A.G., John K.E., Gardner N. (2006), Dwarfing ornamentally crops

with the rolC gene. In: Texixeira da Siva JA, ed. Floriculture, Ornamental

and Plant Biotechnology; 2:54-59.

227. Spena A., Schmulling T., Koncz C. (1987), Independent and synergistic

activity of rolA, B and C loci in stimulating abnormal growth in plants.

EMBO J; 6:3891-3899.

228. Srinivas P., Gopinath G., Banerji A., Dinakar A., Srinivas G. (2004),

Plumbagin induces reactive oxygen species, which mediate apoptosis in

human cervical cancer cells. Mol Carcinog; 40:201–211.

229. Srivastava S. and Srivastava A.K. (2007), Hairy root culture for mass-

production of high-value secondary metabolites. Crit. Rev. Biotec. 27:29-

43.

230. Steinbeck C. (2004), Recent development in automated structure elucidation

of natural products. Nat. Prod. Rep., 21:512-518.

231. Steve M.N., Christopher J.L., Leonard A.L. (2006), Simultaneous labeling

of projecting neurons and apoptotic state, J Neurosci Methods, 161(2):281-

284.

232. Stieger P.A., Meyer A.D., Kathmann P. (2004), The orf13 T-DNA Gene of

Agrobacterium rhizogenes Confers Meristematic Competence to

Differentiated Cells. Plant Physiol; 135:1798-08.

233. Subroto S.E., Kwok K.H., Hamill J.D., Doran P.M. (1996), Co-culture of

genetically transformed roots and shoots for synthesis, translocation, and

biotransformation of secondary metabolites. Biotechnol. Bioeng. 49:481–

494.

234. Sugie O.K., Rahman K.M., Tanaka T., Kawai K., Yamahara J. and Mori H.

(1998), Inhibitory effects of plumbagin and juglone on azoxymethane-

induced intestinal carcinogenesis in rats. Cancer Lett; 127:177–183.

235. Sun L.Y., Monneuse M.O., Martin-Tanguy J. (1991), Changes in flowering

and the accumulation of polyamines and hydroxycinnamic acid-polyamine

conjugates in tobacco plants transformed by the rolA locus from the Ri

TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes. Plant Sci; 80:145-56.

236. Syklowska-Baranek K., Pietrosiuk A., Kokoszka A., Furmanowa M. (2009),

Enhancement of taxane production in hairy root culture of Taxus media var.

Hicksii. J Plant Physiol; 166:1950–1954.

237. Tanaka N., Fujikawa Y., Aly M.A.M. (2001), Proliferation and rol gene

expression in hairy root lines of Egyptian clover (Trifolium alexandrinum

L.). Plant Cell Tiss Org Cult; 66:175-82.

238. Tanaka N., Yamakawa M., Yamashita I. (1988), Characterization of

transcription of genes involved in hairy root induction on pRi1724

core-T-DNA in two Ajuga reptans hairy root lines. Plant Sci; 137:95-105.

239. Tatreerod S., Saralamp P. and Chanprame S. (2003), Hairy root induction

and culture of Plumbago indica L. In The 3 rd World Congress on

Medicinal and Aromatic plants for Human Welfare. Ching Mai, Thailand.

pp.306.

240. Taya M., Sato H., Masahiro K., Tone S. (1994), Characterization of pak-

bung green hairy roots cultivated under light irradiation. J. Ferment.

Bioeng.78:42–48.

241. Thasni K.A., Rakesh S., Rojini G., Ratheeshkumar T., Srinivas G., Priya S.

(2008), Estrogen-dependent cell signaling and apoptosis in BRCA1-

blocked BG1 ovarian cancer cells in response to plumbagin and other

chemotherapeutic agents. Ann Oncol; 19:696–705.

242. Thaweesak J., Seiichi S., Hiroyuki T. and Putalun W. (2011), Elicitation

effect on production of plumbagin in in vitro culture of Drosera indica L.

Journal of Medicinal Plants Research; 5(19): 4949-4953.

243. Tilak J.C., Adhikari S., Devasagayam T.P. (2004), Antioxidant properties

of Plumbago zeylanica, an Indian medicinal plant and its active ingredient,

plumbagin. Redox Rep; 9:219–227.

244. Tiwari S.B., Pai R.M., Udupa N. (2002), Temperature sensitive liposomes

of plumbagin: Characterization and in vivo evaluation in mice bearing

melanoma B16F1. J Drug Target; 10:585–591.

245. Trigiano R.N., Gray D.J. (2000), Plant tissue culture: Concepts and

laboratory exercises. 2nd Edn: CRC Press, Boca Raton. pp: 454.

246. Trovato M., Maras B., Linhares F. (2001), The plant oncogene rolD

encodes a functional ornithine cyclodeaminase. PNAS; 698(23):13449-53.

247. Udomsuk L., Jarukamjorn K., Tanaka H., Putalun W. (2011), Improved

isoflavonoid production in Pueraria candollei hairy root cultures using

elicitation. Biotechnol Lett; 33:369–374.

248. Van Delft M.F., Wei A.H., Mason K.D., Vandenberg C.J., Chen

L., Czabotar P.E., Willis S.N., Scott C.L., Day C.L., Cory S., Adams J.M.,

Roberts A.W., Huang D.C., 2006. The BH3 mimetic ABT-737 targets

selective Bcl-2 proteins and efficiently induces apoptosis via Bak/Bax if

Mcl-1 is neutralized. Cancer Cell., 10: 389-99.

249. Van Etten H.D., Mansfield J.W., Bailey J.A., Farmer E.E. (1994), Two

classes of plant antibiotics: Phytoalexins versus “phytoanticipins”. Plant

Cell, 6:1191-1192.

250. Vanhala L., Eeva M., Lapinjoki S., Hiltunen R., Oksman-Caldentey K.

(1998), Effect of growth regulators on transformed root cultures of

Hyoscyamus muticus. J Plant Physio,153:475- 481.

251. Varner J.E., Lin L.S. (1989), Plant cell wall architecture. Cell; 56:231-39.

252. Verma P.C., Singh D., Rahman L.U., Gupta M.M., Banerjee S. (2002), In

vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid micropropagation and

establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. J Plant

Physiol 159:547–552.

253. Verpoorte R., Heijden R.V.D., Ten-Hoopen H.J.G. and Memelink J.

(1999), Metabolic engineering of plant secondary metabolite pathways for

the production of fine chemicals. Biotechnol. Lett., 21:467-479.

254. Verslues P.E., Sharp R.E. (1999), Proline accumulation in maize (Zea mays

L.) primary roots at low water potentials. II. Metabolic source of increased

proline deposition in the elongation zone. Plant Physiol; 119:1349-60.

255. Vijver D.V. (1972), Distribution of plumbagin in the Plumbaginaceae.

Phytochemistry; 11:3247-3248.

256. Vijver L.M., Looter A.P. (1971), The constituents of the roots of Plumbago

auriculata and P. zeylanica responsible for antimicrobial activity. Plant.

Med. 20:8-13.

257. Villarreal F.M., Idrogo R.C., Ascencio M.N., Ferreira T.D., Pinto P.J. and

Paredes D.E.G. (2015), In vitro tissue culture, chemical composition and

biological activity of Plumbago scandens L. International Journal of

Applied Biology and Pharmaceutical Technology; 6(1): 199-209.

258. Vishnukanta (2010), Evaluation of anticonvulasant activity of Plumbago

zeylanica Linn leaf extract Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical

Research; 3(1): 76-78.

259. Wang C.C., Chiang Y.M., Sung S.C., Hsu Y.L., Chang J.K., Kuo P.L.

(2008), Plumbagin induces cell cycle arrest and apoptosis through reactive

oxygen species/c-Jun N-terminal kinase pathways in human melanoma

A375.S2 cells. Cancer Lett; 259:82–98.

260. Wang J.W., Tan R.X. (2002), Artemisinin production in Artemisia annua

hair root cultures with improved growth by altering the nitrogen source in

the medium. Biotechnol. Lett. 24:1153-1156.

261. Wang J.W., Zheng L.P., Zhang B., Zou T. (2009), Stimulation of

artemisinin synthesis by combined cerebroside and nitric oxide elicitation in

Artemisia annua hairy roots. Appl Microbiol Biotechnol; 85:285–292.

262. Wang J.Y., Burger R.M., Drlica K. (1998), Role of superoxide in catalase-

peroxidase-mediated isoniazid action against mycobacteria. Antimicrob

Agents Chemother; 42:709–711.

263. Wang Y.C., Huang T.L. (2005), High-performance liquid chromatography

for quantification of plumbagin, an anti- Helicobacter pylori compound of

Plumbago zeylanica L. Journal of Chromatography A; 1094:99–104.

264. Weathers P.J., Hemmavanh D.D., Walcerz D.B., Cheetham R.D., Smith

T.C. (1997), Interactive effects of nitrate and phosphate salts, sucrose, and

inoculum’s culture age on growth and sesquiterpene production in

Artemisia annua L. hairy root cultures in vitro. Cell Dev. Biol.-Plant.

33:306-312.

265. Wei X., Gou X., Yuan T. and Russell D.S. (2006), A highly efficient in

vitro plant regeneration system and Agrobacterium-mediated transformation

in Plumbago zeylanica. Plant Cell Rep; 25:513 – 521.

266. Weising K., Kahl G. (1996), Natural genetic engineering of plant cells: the

molecular biology of crown gall and hairy root disease. World J. Microbiol.

Biotechnol. 12:327-351.

267. Westjr F.R. and Mika E.S. (1957), Synthesis of atropine by isolated roots

and root-callus cultures of Belladonna. Bot. Gaz., 119:50-54.

268. White F.F., Taylor B.H., Huffmman G.A. (1985), Molecular and genetic

analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of

Agrobacterium rhizogenes. J Bacteriol; 164:33-44.

269. Wink C. and Hartmann T. (1981), Properties and subcellular localisation of

L-alanine: aldehyde aminotransferase. Concept of an ubiquitous plant

enzyme involved in secondary metabolism. Z. Naturforsch., 36:625–32.

270. Wink M. and Hartmann T. (1982), Localization of the enzymes of

quinolizidine alkaloid biosynthesis in leaf chloroplast of Lupinus

polyphyllus. Plant Physiol., 70:74–7.

271. Winkel B.S.J. (2004), Metabolic channelling in plants. Annu. Rev. Plant

Biol., 55:85–107.

272. Wu J.Y., Shi M. (2008), Ultrahigh diterpenoid tanshinone production

through repeated osmotic stress and elicitor stimulation in fedbatch fedbatch

culture of Salvia miltiorrhiza hairy roots. Appl Microbiol Biotechnol;

78:441–448.

273. Wuyts N., De waele D., Swennen R. (2006), Extraction and partial

characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa acuminate

grandr naine) roots. Plant Physiology and Biochemistry, 44:308-314.

274. Xu H., Park J.H., Kim Y.K., Park N.I., Lee S.Y., Park S.U. (2009),

Optimization of growth and pyranocoumarins production in hairy root

culture of Angelica gigas Nakai. Journal of Medicinal Plants Research;

3:978-981.

275. Xu M.J., Dong J.F. (2007), Enhancing terpeniod indole alkaloid production

by inducible expression of mammalian Bax in Catharanthus roseus cells.

Sci China C Life Sci; 50:234–241.

276. Yang H., Zhu Y.T., Cheng R., Shao M.Y., Fu Z.S., Cheng L., Wang F.M.

and Hu T. (2010), Lipopolysacchride-induced dental pulp cell apoptosis and

the expression of Bax and Bcl-2 in vitro. Brazilian Journal of Medical and

Biological Research, 43: 1027-1033.

277. Yazaki K., Matsioka H., Shimomura K., Bechthold A. and Sato F. (2001),

A novel dark-inducuble protein, LeDI-2, and its involvement in root-

specific secondary metabolism in Lithospermum erythrorhizon. Plant

Physiol. 125:1831-1841.

278. Yazaki K., Sugiyama A., Morita M. and Shitan N. (2008), Secondary

transport as an efficient membrane transport mechanism for plant secondary

metabolites. Phytochem. Rev, 7:513-524.

279. Yogananth N. and Basu J.M. (2009), TLC Method for the determination of

Plumbagin in Hairy Root Culture of Plumbago rosea L. Global Journal of

Biotechnology & Biochemistry; 4(1):66-69.

280. Zenk M.H. and Juenger M. (2007), Evolution and current status of the

phytochemistry of nitrogenous compounds. Phytochemistry; 68:2757–72.

281. Zhang Z.S., Yu Z.Y., Jin Z.X., Liu J., Li Y.F. (2013), Liquid culture of

adventitious roots is a potential alternative to field cultivation for

Psammosilene tunicoides, a rare and endangered endemic medicinal plant.

Adv. J. Food Sci. Tech; 52:127–131.

282. Zhao J., Davis L.C. and Verpoorte R. (2005), Elicitor signal transduction

leading to production of plant secondary metabolites. Biotech. Adv; 23: 283-

333.

283. Zhao J.L., Zhou L.G., Wu J.Y. (2010), Promotion of Salvia miltiorrhiza

hairy root growth and tanshinone production by polysaccharideprotein

fractions of plant growth-promoting rhizobacterium Bacillus cereus.

Process Biochem;45:1517–1522.

284. Zhao L.J., Zou L., Zhang Q.C., Li Y.Y, Peng X.L., Xiang B.D., and Zhao

G. (2014), Efficient production of flavonoids in Fagopyrum tataricum hairy

root cultures with yeast polysaccharide elicitation and medium renewal

process. Harmacogn Mag; 10(39): 234–240.

285. Zhou L., Wang J., Yang C. (1998), Progress on plant hairy root culture and

its chemistry. 1. Induction and culture of plant hairy roots. Nat Product Res

Dev; 10:87-95.

286. Zhou L.G., Cao X.D., Zhang R.F., Peng Y.L., Zhao S.J., Wu J.Y. (2007),

Stimulation of saponin production in Panax ginseng hairy roots by two

oligosaccharides from Paris polyphylla var. Yunnanensis. Biotechnol Lett;

29:631–634.

287. Zhou M.L., Zhu X.M., Shao J.R., Wu Y.M., Tang Y.X. (2010),

Transcriptional response of the catharanthine biosynthesis pathway to

methyl jasmonate/nitric oxide elicitation in Catharanthus roseus hairy root

culture. Appl Microbiol Biotechnol 88:737–750.

Tài liệu trên internet

288. http://plants.usda.gov.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen

1.1. Khử trùng mẫu

Nghiệm

Ký hiệu

Lần lặp

Nồng độ

Thời gian

Mẫu vô

Tỷ lệ mẫu

Tỷ lệ tạo

thức

lại

javel (%)

khử trùng

trùng (%)

sống (%)

chồi (%)

J2T10

100

J2T20

100

J2T30

100

J4T10

15.47

75.50

100

J4T20

45.5

62.2

100

J4T30

100

J6T10

20.5

65.5

100

J6T20

60.33

100

J6T30

45.5

100

J8T10

J10

100

58.67

J8T20

J11

53.33

J8T30

J12

20.67

89.67

J2T10

100

J2T20

100

J2T30

100

J4T10

72.00

100

J4T20

35.5

60.5

100

J4T30

47.33

100

J6T10

22.5

62.67

100

J6T20

50,20

58.75

100

J6T30

71.5

47.00

100

J8T10

J10

50.67

100

J8T20

J11

50.13

97.5

J8T30

J12

21.50

J2T10

100

J2T20

100

J2T30

100

J4T10

12.67

78.67

100

J4T20

50.33

65.00

100

J4T30

67.33

47.35

100

J6T10

24.5

66.5

100

J6T20

48.5

61.67

100

J6T30

42.25

100

J8T10

J10

57.5

61.50

100

J8T20

J11

57.00

J8T30

J12

79.5

18.67

82.33

- Phần trăm mẫu vô trùng

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

J 4 8 2 4 6

T 3 10 20 30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 34

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 30793.20822 2368.70832 140.30 <.0001

Error 20 337.66056 16.88303

Corrected Total 33 31130.86878

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.989154 9.930514 4.108896 41.37647

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 35.76624 17.88312 1.06 0.3654

J 3 20345.88225 6781.96075 401.70 <.0001

T 2 6653.88786 3326.94393 197.06 <.0001

J*T 6 2307.37285 384.56214 22.78 <.0001

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett-Hsu

H0:LSMean=

Control

J T Y LSMEAN Pr > |t|

8 10 61.7001242

8 20 72.3333333 0.0667

8 30 84.8333333 <.0001

2 10 1.6666667 <.0001

2 20 2.3333333 <.0001

2 30 10.0000000 <.0001

4 10 14.3800000 <.0001

4 20 43.7766667 0.0010

4 30 64.1100000 0.9931

6 10 22.5000000 <.0001

6 20 49.6606004 0.0599

6 30 78.8333333 0.0016

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

JT 12 J8T10 J8T20 J8T30 J2T10 J2T20 J2T30 J4T10 J4T20 J4T30 J6T10 J6T20

J6T30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 34

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 30793.20822 2368.70832 140.30 <.0001

Error 20 337.66056 16.88303

Corrected Total 33 31130.86878

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.989154 9.930514 4.108896 41.37647

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 18.34630 9.17315 0.54 0.5891

JT 11 30774.86191 2797.71472 165.71 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 35.76624 17.88312 1.06 0.3654

JT 11 30774.86191 2797.71472 165.71 <.0001

% VO TRUNG

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 20

Error Mean Square 16.88303

Harmonic Mean of Cell Sizes 2.769231

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

Critical Range 9.93 10.36 10.65 10.85 11.01 11.14 11.24 11.33 11.40

11.46 11.52

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N JT

A 84.833 3 J8T30

B A 78.833 3 J6T30

B C 72.333 3 J8T20

D C 64.110 3 J4T30

D 61.000 2 J8T10

E 50.250 2 J6T20

E 43.777 3 J4T20

F 22.500 3 J6T10

G F 14.380 3 J4T10

G H 10.000 3 J2T30

H 2.333 3 J2T20

H 1.667 3 J2T10

- Tỷ lệ mẫu sống

% MAU SONG

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

J 4 8 2 4 6

T 3 10 20 30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 36

% MAU SONG

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 20282.40863 1560.18528 290.62 <.0001

Error 22 118.10756 5.36853

Corrected Total 35 20400.51619

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.994211 3.540630 2.317008 65.44056

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 33.05651 16.52825 3.08 0.0662

J 3 15882.85846 5294.28615 986.17 <.0001

T 2 2977.29474 1488.64737 277.29 <.0001

J*T 6 1389.19893 231.53315 43.13 <.0001

% MAU SONG

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

J T N Mean Std Dev

8 10 3 56.946667 5.61690603

8 20 3 53.486667 3.43767848

8 30 3 20.280000 1.45475084

2 10 3 100.000000 0.00000000

2 20 3 100.000000 0.00000000

2 30 3 100.000000 0.00000000

4 10 3 75.390000 3.33636029

4 20 3 62.566667 2.27229693

4 30 3 46.560000 1.35103664

6 10 3 64.890000 1.98652964

6 20 3 60.250000 1.46164291

6 30 3 44.916667 2.42813371

% MAU SONG

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

J T Y LSMEAN Pr > |t|

8 10 56.946667

8 20 53.486667 0.4164

8 30 20.280000 <.0001

2 10 100.000000 <.0001

2 20 100.000000 <.0001

2 30 100.000000 <.0001

4 10 75.390000 <.0001

4 20 62.566667 0.0520

4 30 46.560000 0.0002

6 10 64.890000 0.0032

6 20 60.250000 0.4677

6 30 44.916667 <.0001

% MAU SONG

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

JT 12 J8T10 J8T20 J8T30 J2T10 J2T20 J2T30 J4T10 J4T20 J4T30 J6T10 J6T20

J6T30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 36

% MAU SONG

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 20282.40863 1560.18528 290.62 <.0001

Error 22 118.10756 5.36853

Corrected Total 35 20400.51619

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.994211 3.540630 2.317008 65.44056

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 33.05651 16.52825 3.08 0.0662

JT 11 20249.35212 1840.85019 342.90 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 33.05651 16.52825 3.08 0.0662

JT 11 20249.35212 1840.85019 342.90 <.0001

% MAU SONG

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 22

Error Mean Square 5.368526

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

Critical Range 5.333 5.562 5.714 5.825 5.911 5.980 6.037 6.084 6.125

6.159 6.190

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N JT

A 100.000 3 J2T20

A 100.000 3 J2T30

A 100.000 3 J2T10

B 75.390 3 J4T10

C 64.890 3 J6T10

C 62.567 3 J4T20

D C 60.250 3 J6T20

D E 56.947 3 J8T10

E 53.487 3 J8T20

F 46.560 3 J4T30

F 44.917 3 J6T30

G 20.280 3 J8T30

- Tỷ lệ tạo chồi

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

J 4 8 2 4 6

T 3 10 20 30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 36

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 574.7784278 44.2137252 32.53 <.0001

Error 22 29.9024278 1.3592013

Corrected Total 35 604.6808556

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.950548 1.183435 1.165848 98.51389

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 1.2020389 0.6010194 0.44 0.6482

J 3 238.5208333 79.5069444 58.50 <.0001

T 2 83.7638889 41.8819444 30.81 <.0001

J*T 6 251.2916667 41.8819444 30.81 <.0001

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

J T N Mean Std Dev

8 10 3 100.000000 0.00000000

8 20 3 96.500000 1.32287566

8 30 3 85.666667 3.71513571

2 10 3 100.000000 0.00000000

2 20 3 100.000000 0.00000000

2 30 3 100.000000 0.00000000

4 10 3 100.000000 0.00000000

4 20 3 100.000000 0.00000000

4 30 3 100.000000 0.00000000

6 10 3 100.000000 0.00000000

6 20 3 100.000000 0.00000000

6 30 3 100.000000 0.00000000

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

J T Y LSMEAN Pr > |t|

8 10 100.000000

8 20 96.500000 0.0109

8 30 85.666667 <.0001

2 10 100.000000 1.0000

2 20 100.000000 1.0000

2 30 100.000000 1.0000

4 10 100.000000 1.0000

4 20 100.000000 1.0000

4 30 100.000000 1.0000

6 10 100.000000 1.0000

6 20 100.000000 1.0000

6 30 100.000000 1.0000

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

JT 12 J8T10 J8T20 J8T30 J2T10 J2T20 J2T30 J4T10 J4T20 J4T30 J6T10 J6T20

J6T30

Number of Observations Read 36

Number of Observations Used 36

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 574.7784278 44.2137252 32.53 <.0001

Error 22 29.9024278 1.3592013

Corrected Total 35 604.6808556

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.950548 1.183435 1.165848 98.51389

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 1.2020389 0.6010194 0.44 0.6482

JT 11 573.5763889 52.1433081 38.36 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 1.2020389 0.6010194 0.44 0.6482

JT 11 573.5763889 52.1433081 38.36 <.0001

TY LE TAO CHOI

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 22

Error Mean Square 1.359201

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

Critical Range 2.683 2.799 2.875 2.931 2.974 3.009 3.037 3.061 3.082

3.099 3.114

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N JT

A 100.0000 3 J8T10

A 100.0000 3 J6T10

A 100.0000 3 J6T20

A 100.0000 3 J2T10

A 100.0000 3 J2T20

A 100.0000 3 J2T30

A 100.0000 3 J4T10

A 100.0000 3 J4T20

A 100.0000 3 J4T30

A 100.0000 3 J6T30

B 96.5000 3 J8T20

C 85.6667 3 J8T30

1.2. Môi trường tạo chồi

Chiều cao

Số chồi trung

Ký hiệu Mẫu tạo

Lần lặp

IBA

chồi

chồi TB

bình (chồi/mẫu

lại

(mg/L)

(%)

(cm)

cấy)

B1I1

88.89

1.56

4.45

1,0

0,1

B1I2

77.78

1.47

4.33

1,0

0,2

B1I3

83.33

1.59

2.67

1,0

0,3

B1I4

77.78

1.31

3.33

1,0

0,4

B1I5

55.56

1.12

3.75

1,0

0,5

B2I1

100

1.40

4.68

1,5

0,1

B2I2

88.89

1.45

4.33

1,5

0,2

B2I3

88.89

0.69

1.75

1,5

0,3

B2I4

100

0.73

2.33

1,5

0,4

B2I5

77.78

0.88

3.65

1,5

0,5

B3I1

100

1.33

2.45

2,0

0,1

B3I2

88.89

1.07

1.75

2,0

0,2

B3I3

77.78

0.84

1.37

2,0

0,3

B3I4

100

1.11

2.74

2,0

0,4

B3I5

77.78

1.27

3.58

2,0

0,5

B4I1

90.89

1.05

1.46

2,5

0,1

B4I2

86.89

0.69

1.15

2,5

0,2

B4I3

86.89

1.28

2.45

2,5

0,3

B4I4

65.67

0.52

1.56

2,5

0,4

B4I5

68.67

0.71

2.14

2,5

0,5

B1I1

90.00

1.59

4.58

1,0

0,1

B1I2

79.00

1.48

4.25

1,0

0,2

B1I3

85.00

1.61

2.63

1,0

0,3

B1I4

80.00

1.33

3.63

1,0

0,4

B1I5

57.60

1.15

3.81

1,0

0,5

B2I1

97.00

1.42

4.68

1,5

0,1

B2I2

86.89

1.47

4.36

1,5

0,2

B2I3

87.89

0.71

1.86

1,5

0,3

B2I4

96.50

0.75

2.43

1,5

0,4

B2I5

76.78

0.90

3.76

1,5

0,5

B3I1

100

1.35

2.42

2,0

0,1

B3I2

87.89

1.09

1.92

2,0

0,2

B3I3

75.78

0.86

1.37

2,0

0,3

B3I4

95.00

1.13

2.82

2,0

0,4

B3I5

78.78

1.29

3.60

2,0

0,5

B4I1

88.89

1.07

1.49

2,5

0,1

B4I2

88.89

0.71

1.26

2,5

0,2

B4I3

88.89

1.30

2.48

2,5

0,3

B4I4

66.67

0.54

1.83

2,5

0,4

B4I5

66.67

0.73

2.15

2,5

0,5

B1I1

86.56

1.55

4.45

1,0

0,1

B1I2

75.78

1.46

4.00

1,0

0,2

B1I3

81.33

1.58

2.67

1,0

0,3

B1I4

75.78

1.29

3.56

1,0

0,4

B1I5

54.56

1.10

3.78

1,0

0,5

B2I1

100

1.37

4.67

1,5

0,1

B2I2

90.90

1.41

4.33

1,5

0,2

B2I3

87.89

0.65

1.89

1,5

0,3

B2I4

98.00

0.70

2.44

1,5

0,4

B2I5

76.78

0.84

3.78

1,5

0,5

B3I1

95.00

1.31

2.44

2,0

0,1

B3I2

86.89

1.02

1.89

2,0

0,2

B3I3

79.78

0.80

1.33

2,0

0,3

B3I4

100

1.05

2.78

2,0

0,4

B3I5

79.78

1.22

3.56

2,0

0,5

B4I1

86.89

1.00

1.44

2,5

0,1

B4I2

89.89

0.63

1.22

2,5

0,2

B4I3

87.89

1.22

2.44

2,5

0,3

B4I4

62.67

0.48

1.78

2,5

0,4

B4I5

65.67

0.67

2.11

2,5

0,5

- Phần trăm mẫu tạo chồi

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

B 4 1,0 1,5 2,0 2,5

I 5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 7821.184800 372.437371 121.64 <.0001

Error 38 116.344360 3.061694

Corrected Total 59 7937.529160

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.985342 2.091975 1.749770 83.64200

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 10.445440 5.222720 1.71 0.1952

B 3 1981.443627 660.481209 215.72 <.0001

I 4 3614.233443 903.558361 295.12 <.0001

B*I 12 2215.062290 184.588524 60.29 <.0001

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

B I N Mean Std Dev

1,0 0,1 3 88.4833333 1.75568600

1,0 0,2 3 77.5200000 1.62566909

1,0 0,3 3 83.2200000 1.83747109

1,0 0,4 3 77.8533333 2.11095555

1,0 0,5 3 55.9066667 1.54936546

1,5 0,1 3 99.0000000 1.73205081

1,5 0,2 3 88.8933333 2.00500208

1,5 0,3 3 88.2233333 0.57735027

1,5 0,4 3 98.1666667 1.75594229

1,5 0,5 3 77.1133333 0.57735027

2,0 0,1 3 98.3333333 2.88675135

2,0 0,2 3 87.8900000 1.00000000

2,0 0,3 3 77.7800000 2.00000000

2,0 0,4 3 98.3333333 2.88675135

2,0 0,5 3 78.7800000 1.00000000

2,5 0,1 3 88.8900000 2.00000000

2,5 0,2 3 88.5566667 1.52752523

2,5 0,3 3 87.8900000 1.00000000

2,5 0,4 3 65.0033333 2.08166600

2,5 0,5 3 67.0033333 1.52752523

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

B I Y LSMEAN Pr > |t|

1,0 0,1 88.4833333

1,0 0,2 77.5200000 <.0001

1,0 0,3 83.2200000 0.0099

1,0 0,4 77.8533333 <.0001

1,0 0,5 55.9066667 <.0001

1,5 0,1 99.0000000 <.0001

1,5 0,2 88.8933333 1.0000

1,5 0,3 88.2233333 1.0000

1,5 0,4 98.1666667 <.0001

1,5 0,5 77.1133333 <.0001

2,0 0,1 98.3333333 <.0001

2,0 0,2 87.8900000 1.0000

2,0 0,3 77.7800000 <.0001

2,0 0,4 98.3333333 <.0001

2,0 0,5 78.7800000 <.0001

2,5 0,1 88.8900000 1.0000

2,5 0,2 88.5566667 1.0000

2,5 0,3 87.8900000 1.0000

2,5 0,4 65.0033333 <.0001

2,5 0,5 67.0033333 <.0001

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

BI 20 B1I1 B1I2 B1I3 B1I4 B1I5 B2I1 B2I2 B2I3 B2I4 B2I5 B3I1 B3I2 B3I3

B3I4 B3I5 B4I1

B4I2 B4I3 B4I4 B4I5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 7821.184800 372.437371 121.64 <.0001

Error 38 116.344360 3.061694

Corrected Total 59 7937.529160

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.985342 2.091975 1.749770 83.64200

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 10.445440 5.222720 1.71 0.1952

BI 19 7810.739360 411.091545 134.27 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 10.445440 5.222720 1.71 0.1952

BI 19 7810.739360 411.091545 134.27 <.0001

% MAU TAO CHOI

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 38

Error Mean Square 3.061694

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

Critical Range 3.874 4.040 4.151 4.233 4.298 4.350 4.394 4.432

4.464 4.492

Number of Means 12 13 14 15 16 17 18

19 20

Critical Range 4.517 4.539 4.560 4.578 4.594 4.609 4.623

4.635 4.647

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N BI

A 99.000 3 B2I1

A 98.333 3 B3I1

A 98.333 3 B3I4

A 98.167 3 B2I4

B 88.893 3 B2I2

B 88.890 3 B4I1

B 88.557 3 B4I2

B 88.483 3 B1I1

B 88.223 3 B2I3

B 87.890 3 B4I3

B 87.890 3 B3I2

C 83.220 3 B1I3

D 78.780 3 B3I5

D 77.853 3 B1I4

D 77.780 3 B3I3

D 77.520 3 B1I2

D 77.113 3 B2I5

E 67.003 3 B4I5

E 65.003 3 B4I4

F 55.907 3 B1I5

Số chồi trung bình

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

B 4 1,0 1,5 2,0 2,5

I 5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 71.69047500 3.41383214 745.45 <.0001

Error 38 0.17402333 0.00457956

Corrected Total 59 71.86449833

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.997578 2.391112 0.067672 2.830167

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.04984333 0.02492167 5.44 0.0084

B 3 35.59991167 11.86663722 2591.22 <.0001

I 4 12.51757333 3.12939333 683.34 <.0001

B*I 12 23.52314667 1.96026222 428.05 <.0001

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

B I N Mean Std Dev

1,0 0,1 3 4.49333333 0.07505553

1,0 0,2 3 4.19333333 0.17214335

1,0 0,3 3 2.65666667 0.02309401

1,0 0,4 3 3.50666667 0.15695010

1,0 0,5 3 3.78000000 0.03000000

1,5 0,1 3 4.67666667 0.00577350

1,5 0,2 3 4.34000000 0.01732051

1,5 0,3 3 1.83333333 0.07371115

1,5 0,4 3 2.40000000 0.06082763

1,5 0,5 3 3.73000000 0.07000000

2,0 0,1 3 2.43666667 0.01527525

2,0 0,2 3 1.85333333 0.09073772

2,0 0,3 3 1.35666667 0.02309401

2,0 0,4 3 2.78000000 0.04000000

2,0 0,5 3 3.58000000 0.02000000

2,5 0,1 3 1.46333333 0.02516611

2,5 0,2 3 1.21000000 0.05567764

2,5 0,3 3 2.45666667 0.02081666

2,5 0,4 3 1.72333333 0.14364308

2,5 0,5 3 2.13333333 0.02081666

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

B I Y LSMEAN Pr > |t|

1,0 0,1 4.49333333

1,0 0,2 4.19333333 <.0001

1,0 0,3 2.65666667 <.0001

1,0 0,4 3.50666667 <.0001

1,0 0,5 3.78000000 <.0001

1,5 0,1 4.67666667 0.0258

1,5 0,2 4.34000000 0.0933

1,5 0,3 1.83333333 <.0001

1,5 0,4 2.40000000 <.0001

1,5 0,5 3.73000000 <.0001

2,0 0,1 2.43666667 <.0001

2,0 0,2 1.85333333 <.0001

2,0 0,3 1.35666667 <.0001

2,0 0,4 2.78000000 <.0001

2,0 0,5 3.58000000 <.0001

2,5 0,1 1.46333333 <.0001

2,5 0,2 1.21000000 <.0001

2,5 0,3 2.45666667 <.0001

2,5 0,4 1.72333333 <.0001

2,5 0,5 2.13333333 <.0001

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

BI 20 B1I1 B1I2 B1I3 B1I4 B1I5 B2I1 B2I2 B2I3 B2I4 B2I5 B3I1 B3I2 B3I3

B3I4 B3I5 B4I1

B4I2 B4I3 B4I4 B4I5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 71.69047500 3.41383214 745.45 <.0001

Error 38 0.17402333 0.00457956

Corrected Total 59 71.86449833

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.997578 2.391112 0.067672 2.830167

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.04984333 0.02492167 5.44 0.0084

BI 19 71.64063167 3.77055956 823.35 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.04984333 0.02492167 5.44 0.0084

BI 19 71.64063167 3.77055956 823.35 <.0001

SO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 38

Error Mean Square 0.00458

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

Critical Range .1498 .1562 .1605 .1637 .1662 .1683 .1699 .1714

.1726 .1737

Number of Means 12 13 14 15 16 17 18

19 20

Critical Range .1747 .1756 .1763 .1770 .1777 .1783 .1788

.1793 .1797

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N BI

A 4.67667 3 B2I1

B 4.49333 3 B1I1

C 4.34000 3 B2I2

C 4.19333 3 B1I2

D 3.78000 3 B1I5

D 3.73000 3 B2I5

E 3.58000 3 B3I5

E 3.50667 3 B1I4

F 2.78000 3 B3I4

F 2.65667 3 B1I3

G 2.45667 3 B4I3

G 2.43667 3 B3I1

G 2.40000 3 B2I4

H 2.13333 3 B4I5

I 1.85333 3 B3I2

I 1.83333 3 B2I3

I 1.72333 3 B4I4

J 1.46333 3 B4I1

K J 1.35667 3 B3I3

K 1.21000 3 B4I2

- Chiều cao chồi

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

B 4 1,0 1,5 2,0 2,5

I 5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 6.26142333 0.29816302 3138.56 <.0001

Error 38 0.00361000 0.00009500

Corrected Total 59 6.26503333

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.999424 0.887417 0.009747 1.098333

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.03272333 0.01636167 172.23 <.0001

B 3 2.56920667 0.85640222 9014.76 <.0001

I 4 1.27128333 0.31782083 3345.48 <.0001

B*I 12 2.38821000 0.19901750 2094.92 <.0001

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

B I N Mean Std Dev

1,0 0,1 3 1.56666667 0.02081666

1,0 0,2 3 1.47000000 0.01000000

1,0 0,3 3 1.59333333 0.01527525

1,0 0,4 3 1.31000000 0.02000000

1,0 0,5 3 1.12333333 0.02516611

1,5 0,1 3 1.39666667 0.02516611

1,5 0,2 3 1.44333333 0.03055050

1,5 0,3 3 0.68333333 0.03055050

1,5 0,4 3 0.72666667 0.02516611

1,5 0,5 3 0.87333333 0.03055050

2,0 0,1 3 1.33000000 0.02000000

2,0 0,2 3 1.06000000 0.03605551

2,0 0,3 3 0.83333333 0.03055050

2,0 0,4 3 1.09666667 0.04163332

2,0 0,5 3 1.26000000 0.03605551

2,5 0,1 3 1.04000000 0.03605551

2,5 0,2 3 0.67666667 0.04163332

2,5 0,3 3 1.26666667 0.04163332

2,5 0,4 3 0.51333333 0.03055050

2,5 0,5 3 0.70333333 0.03055050

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

B I Y LSMEAN Pr > |t|

1,0 0,1 1.56666667

1,0 0,2 1.47000000 <.0001

1,0 0,3 1.59333333 0.0238

1,0 0,4 1.31000000 <.0001

1,0 0,5 1.12333333 <.0001

1,5 0,1 1.39666667 <.0001

1,5 0,2 1.44333333 <.0001

1,5 0,3 0.68333333 <.0001

1,5 0,4 0.72666667 <.0001

1,5 0,5 0.87333333 <.0001

2,0 0,1 1.33000000 <.0001

2,0 0,2 1.06000000 <.0001

2,0 0,3 0.83333333 <.0001

2,0 0,4 1.09666667 <.0001

2,0 0,5 1.26000000 <.0001

2,5 0,1 1.04000000 <.0001

2,5 0,2 0.67666667 <.0001

2,5 0,3 1.26666667 <.0001

2,5 0,4 0.51333333 <.0001

2,5 0,5 0.70333333 <.0001

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

BI 20 B1I1 B1I2 B1I3 B1I4 B1I5 B2I1 B2I2 B2I3 B2I4 B2I5 B3I1 B3I2 B3I3

B3I4 B3I5 B4I1

B4I2 B4I3 B4I4 B4I5

Number of Observations Read 60

Number of Observations Used 60

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 21 6.26142333 0.29816302 3138.56 <.0001

Error 38 0.00361000 0.00009500

Corrected Total 59 6.26503333

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.999424 0.887417 0.009747 1.098333

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.03272333 0.01636167 172.23 <.0001

BI 19 6.22870000 0.32782632 3450.80 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.03272333 0.01636167 172.23 <.0001

BI 19 6.22870000 0.32782632 3450.80 <.0001

CHIEU CAO CHOI TRUNG BINH

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 38

Error Mean Square 0.000095

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

Critical Range .02158 .02250 .02312 .02358 .02394 .02423 .02448 .02469

.02487 .02502

Number of Means 12 13 14 15 16 17 18

19 20

Critical Range .02516 .02529 .02540 .02550 .02559 .02567 .02575

.02582 .02589

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N BI

A 1.593333 3 B1I3

B 1.566667 3 B1I1

C 1.470000 3 B1I2

D 1.443333 3 B2I2

E 1.396667 3 B2I1

F 1.330000 3 B3I1

F 1.310000 3 B1I4

G 1.266667 3 B4I3

G 1.260000 3 B3I5

H 1.123333 3 B1I5

I 1.096667 3 B3I4

J 1.060000 3 B3I2

J 1.040000 3 B4I1

K 0.873333 3 B2I5

L 0.833333 3 B3I3

M 0.726667 3 B2I4

N 0.703333 3 B4I5

O N 0.683333 3 B2I3

O 0.676667 3 B4I2

P 0.513333 3 B4I4

1.3. Phát triển cây từ chồi

Lần lặp

Số lá TB

Số rễ TB

Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

Chiều dài rễ (cm)

lại

2.93

4.00

4.33

100

2.27

6.67

11.33

100

1.30

6.33

13.00

100

1.13

5.33

9.00

100

1.07

5.00

10.33

100

0.97

5.67

12.67

100

0.67

4.67

5.67

100

2.85

4.15

100

2.25

6.65

11.25

100

1.37

6.38

13.12

100

1.15

5.25

9.31

100

1.15

5.12

10.37

100

0.94

5.56

12.81

100

0.63

4.69

5.63

100

2.97

3.95

4.45

100

2.32

6.54

11.37

100

1.25

6.28

12.84

100

1.21

5.54

9.06

100

1.25

4.85

10.27

100

0.98

5.60

12.52

100

0.68

4.71

5.46

- Số lá trung bình

SO LA TRUNG BINH(LA/MAU)

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

T 7 E0 E1 E2 E3 E4 E5 E6

Number of Observations Read 21

Number of Observations Used 21

SO LA TRUNG BINH(LA/MAU)

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 6 14.80419048 2.46736508 276.49 <.0001

Error 14 0.12493333 0.00892381

Corrected Total 20 14.92912381

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.991632 1.756494 0.094466 5.378095

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 6 14.80419048 2.46736508 276.49 <.0001

SO LA TRUNG BINH(LA/MAU)

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 14

Error Mean Square 0.008924

Number of Means 2 3 4 5 6 7

Critical Range .2296 .2395 .2458 .2504 .2538 .2565

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N T

A 6.62000 3 E1

B 6.33000 3 E2

C 5.61000 3 E5

D 5.37333 3 E3

E 4.99000 3 E4

F 4.69000 3 E6

G 4.03333 3 E0

SO LA TRUNG BINH(LA/MAU)

The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for Y

NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a

higher Type II

error rate than REGWQ.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 14

Error Mean Square 0.008924

Critical Value of Studentized Range 6.08472

Minimum Significant Difference 0.3319

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N T

A 6.62000 3 E1

A 6.33000 3 E2

B 5.61000 3 E5

B 5.37333 3 E3

C 4.99000 3 E4

C 4.69000 3 E6

D 4.03333 3 E0

- Số rễ trung bình

SO RE TRUNG BINH (RE/MAU)

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

T 7 E0 E1 E2 E3 E4 E5 E6

Number of Observations Read 21

Number of Observations Used 21

SO RE TRUNG BINH (RE/MAU)

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 6 205.6498667 34.2749778 2195.10 <.0001

Error 14 0.2186000 0.0156143

Corrected Total 20 205.8684667

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.998938 1.319041 0.124957 9.473333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 6 205.6498667 34.2749778 2195.10 <.0001

SO RE TRUNG BINH (RE/MAU)

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 14

Error Mean Square 0.015614

Number of Means 2 3 4 5 6 7

Critical Range .3037 .3167 .3252 .3312 .3358 .3393

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N T

A 12.9867 3 E2

B 12.6667 3 E5

C 11.3167 3 E1

D 10.3233 3 E4

E 9.1233 3 E3

F 5.5867 3 E6

G 4.3100 3 E0

- Chiều dài rễ

CHIEU DAI RE(cm)

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

T 7 E0 E1 E2 E3 E4 E5 E6

Number of Observations Read 21

Number of Observations Used 21

CHIEU DAI RE(cm)

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 6 11.63144762 1.93857460 690.00 <.0001

Error 14 0.03933333 0.00280952

Corrected Total 20 11.67078095

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.996630 3.551703 0.053005 1.492381

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 6 11.63144762 1.93857460 690.00 <.0001

CHIEU DAI RE(cm)

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 14

Error Mean Square 0.00281

Number of Means 2 3 4 5 6 7

Critical Range .1288 .1344 .1379 .1405 .1424 .1439

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N T

A 2.91667 3 E0

B 2.28000 3 E1

C 1.30667 3 E2

D 1.16333 3 E3

D 1.15667 3 E4

E 0.96333 3 E5

F 0.66000 3 E6

1.4. Khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro

IBA

NAA

Rễ TB từ đoạn thân

Ký hiệu

Rễ TB từ lá

Lần lặp

(mg/L)

(g TLT)

lại

(g TLT)

I0N0

0.43

1.21

0.1

I0N0,1

0.68

2.61

0.5

I0N0,5

0.82

2.50

1.0

I0N1,0

1.13

1.81

1.5

I0N1,5

1.22

1.70

0.1

I0,1N0

1.25

1.60

0.1

I0,1N0,1

1.78

2.00

0.1

0.5

I0,1N0,5

1.55

2.11

0.1

1.0

I0,1N1,0

0.85

2.19

0.1

1.5

I0,1N1,5

1.67

2.40

0.5

I0,5N0

1.45

1.72

0.5

0.1

I0,5N0,1

1.23

3.02

0.5

I0,5N0,5

0.77

1.71

0.5

1.0

I0,5N1,0

1.12

1.83

0.5

1.5

I0,5N1,5

1.25

1.83

1.0

I1,0N0

0.88

1.83

1.0

0.1

I1,0N0,1

0.77

2.12

1.0

0.5

I1,0N0,5

1.50

2.20

1.0

I1,0N1,0

1.17

2.40

1.0

1.5

I1,0N1,5

0.85

2.58

1.5

I1,5N0

0.77

1.87

1.5

0.1

I1,5N0,1

1.30

2.38

1.5

0.5

I1,5N0,5

1.22

1.75

1.5

1.0

I1,5N1,0

1.12

1.31

1.5

I1,5N1,5

1.18

1.24

I0N0

0.40

1.25

0.1

I0N0,1

0.65

2.62

0.5

I0N0,5

0.78

2.55

1.0

I0N1,0

1.12

1.83

1.5

I0N1,5

1.25

1.74

0.1

I0,1N0

1.17

1.65

0.1

I0,1N0,1

1.73

2.02

0.1

0.5

I0,1N0,5

1.52

2.12

0.1

1.0

I0,1N1,0

0.83

2.21

0.1

1.5

I0,1N1,5

1.64

2.43

0.5

I0,5N0

1.41

1.75

0.5

0.1

I0,5N0,1

1.20

3.06

0.5

I0,5N0,5

0.75

1.74

0.5

1.0

I0,5N1,0

1.17

1.83

0.5

1.5

I0,5N1,5

1.22

1.85

1.0

I1,0N0

0.85

1.82

1.0

0.1

I1,0N0,1

0.73

2.15

1.0

0.5

I1,0N0,5

1.46

2.26

1.0

I1,0N1,0

1.20

2.42

1.0

1.5

I1,0N1,5

0.81

2.55

1.5

I1,5N0

0.72

1.82

1.5

0.1

I1,5N0,1

1.32

2.34

1.5

0.5

I1,5N0,5

1.19

1.76

1.5

1.0

I1,5N1,0

1.15

1.33

1.5

I1,5N1,5

1.15

1.26

I0N0

0.46

1.17

0.1

I0N0,1

0.70

2.66

0.5

I0N0,5

0.85

2.55

1.0

I0N1,0

1.14

1.84

1.5

I0N1,5

1.23

1.65

0.1

I0,1N0

1.27

1.63

0.1

I0,1N0,1

1.74

2.14

0.1

0.5

I0,1N0,5

1.56

2.08

0.1

1.0

I0,1N1,0

0.88

2.14

0.1

1.5

I0,1N1,5

1.69

2.35

0.5

I0,5N0

1.47

1.70

0.5

0.1

I0,5N0,1

1.25

3.09

0.5

I0,5N0,5

0.79

1.64

0.5

1.0

I0,5N1,0

1.15

1.75

0.5

1.5

I0,5N1,5

1.30

1.73

1.0

I1,0N0

0.82

1.80

1.0

0.1

I1,0N0,1

0.75

2.15

1.0

0.5

I1,0N0,5

1.52

2.25

1.0

I1,0N1,0

1.19

2.35

1.0

1.5

I1,0N1,5

0.87

2.52

1.5

I1,5N0

0.79

1.85

1.5

0.1

I1,5N0,1

1.31

2.34

1.5

0.5

I1,5N0,5

1.25

1.70

1.5

1.0

I1,5N1,0

1.17

1.26

1.5

I1,5N1,5

1.19

1.27

- Rễ trung bình từ đoạn thân

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

I 5 0 0.1 0.5 1.0 1.5

N 5 0 0.1 0.5 1.0 1.5

Number of Observations Read 75

Number of Observations Used 75

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 26 7.82505333 0.30096359 671.88 <.0001

Error 48 0.02150133 0.00044794

Corrected Total 74 7.84655467

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.997260 1.896025 0.021165 1.116267

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01709867 0.00854933 19.09 <.0001

I 4 2.45570133 0.61392533 1370.54 <.0001

N 4 0.72232800 0.18058200 403.13 <.0001

I*N 16 4.62992533 0.28937033 646.00 <.0001

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

I N N Mean Std Dev

0 0 3 0.43000000 0.03000000

0 0.1 3 0.67666667 0.02516611

0 0.5 3 0.81666667 0.03511885

0 1.0 3 1.13000000 0.01000000

0 1.5 3 1.23333333 0.01527525

0.1 0 3 1.23000000 0.05291503

0.1 0.1 3 1.75000000 0.02645751

0.1 0.5 3 1.54333333 0.02081666

0.1 1.0 3 0.85333333 0.02516611

0.1 1.5 3 1.66666667 0.02516611

0.5 0 3 1.44333333 0.03055050

0.5 0.1 3 1.22666667 0.02516611

0.5 0.5 3 0.77000000 0.02000000

0.5 1.0 3 1.14666667 0.02516611

0.5 1.5 3 1.25666667 0.04041452

1.0 0 3 0.85000000 0.03000000

1.0 0.1 3 0.75000000 0.02000000

1.0 0.5 3 1.49333333 0.03055050

1.0 1.0 3 1.18666667 0.01527525

1.0 1.5 3 0.84333333 0.03055050

1.5 0 3 0.76000000 0.03605551

1.5 0.1 3 1.31000000 0.01000000

1.5 0.5 3 1.22000000 0.03000000

1.5 1.0 3 1.14666667 0.02516611

1.5 1.5 3 1.17333333 0.02081666

RE DOAN

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

I N Y LSMEAN Pr > |t|

0 0 0.43000000

0 0.1 0.67666667 <.0001

0 0.5 0.81666667 <.0001

0 1.0 1.13000000 <.0001

0 1.5 1.23333333 <.0001

0.1 0 1.23000000 <.0001

0.1 0.1 1.75000000 <.0001

0.1 0.5 1.54333333 <.0001

0.1 1.0 0.85333333 <.0001

0.1 1.5 1.66666667 <.0001

0.5 0 1.44333333 <.0001

0.5 0.1 1.22666667 <.0001

0.5 0.5 0.77000000 <.0001

0.5 1.0 1.14666667 <.0001

0.5 1.5 1.25666667 <.0001

1.0 0 0.85000000 <.0001

1.0 0.1 0.75000000 <.0001

1.0 0.5 1.49333333 <.0001

1.0 1.0 1.18666667 <.0001

1.0 1.5 0.84333333 <.0001

1.5 0 0.76000000 <.0001

1.5 0.1 1.31000000 <.0001

1.5 0.5 1.22000000 <.0001

1.5 1.0 1.14666667 <.0001

1.5 1.5 1.17333333 <.0001

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

IN 25 I0,1N0 I0,1N0,1 I0,1N0,5 I0,1N1,0 I0,1N1,5 I0,5N0 I0,5N0,1

I0,5N0,5 I0,5N1,0

I0,5N1,5 I0N0 I0N0,1 I0N0,5 I0N1,0 I0N1,5 I1,0N0 I1,0N0,1

I1,0N0,5 I1,0N1,0

I1,0N1,5 I1,5N0 I1,5N0,1 I1,5N0,5 I1,5N1,0 I1,5N1,5

Number of Observations Read 75

Number of Observations Used 75

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 26 7.82505333 0.30096359 671.88 <.0001

Error 48 0.02150133 0.00044794

Corrected Total 74 7.84655467

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.997260 1.896025 0.021165 1.116267

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01709867 0.00854933 19.09 <.0001

IN 24 7.80795467 0.32533144 726.28 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01709867 0.00854933 19.09 <.0001

IN 24 7.80795467 0.32533144 726.28 <.0001

RE DOAN THAN

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 48

Error Mean Square 0.000448

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13

Critical Range .04635 .04833 .04966 .05065 .05143 .05206 .05259 .05305 .05344

.05379 .05410 .05438

Number of Means 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23 24 25

Critical Range .05462 .05485 .05506 .05524 .05542 .05558 .05573 .05587 .05599

.05611 .05623 .05633

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N IN

A 1.75000 3 I0,1N0,1

B 1.66667 3 I0,1N1,5

C 1.54333 3 I0,1N0,5

D 1.49333 3 I1,0N0,5

E 1.44333 3 I0,5N0

F 1.31000 3 I1,5N0,1

G 1.25667 3 I0,5N1,5

H G 1.23333 3 I0N1,5

H G 1.23000 3 I0,1N0

H G 1.22667 3 I0,5N0,1

H G I 1.22000 3 I1,5N0,5

H J I 1.18667 3 I1,0N1,0

K J I 1.17333 3 I1,5N1,5

K J 1.14667 3 I1,5N1,0

K J 1.14667 3 I0,5N1,0

K 1.13000 3 I0N1,0

L 0.85333 3 I0,1N1,0

L 0.85000 3 I1,0N0

L 0.84333 3 I1,0N1,5

L 0.81667 3 I0N0,5

M 0.77000 3 I0,5N0,5

M 0.76000 3 I1,5N0

M 0.75000 3 I1,0N0,1

N 0.67667 3 I0N0,1

O 0.43000 3 I0N0

- Rễ trung bình từ lá

RE TU LA

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

I 5 0 0.1 0.5 1.0 1.5

N 5 0 0.1 0.5 1.0 1.5

Number of Observations Read 75

Number of Observations Used 75

RE TU LA

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 26 14.87330133 0.57205005 495.31 <.0001

Error 48 0.05543733 0.00115494

Corrected Total 74 14.92873867

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.996287 1.700471 0.033984 1.998533

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01136267 0.00568133 4.92 0.0114

I 4 2.21943200 0.55485800 480.42 <.0001

N 4 5.14685867 1.28671467 1114.09 <.0001

I*N 16 7.49564800 0.46847800 405.63 <.0001

RE TU LA

The GLM Procedure

Level of Level of --------------Y--------------

I N N Mean Std Dev

0 0 3 1.21000000 0.04000000

0 0.1 3 2.63000000 0.02645751

0 0.5 3 2.53333333 0.02886751

0 1.0 3 1.82666667 0.01527525

0 1.5 3 1.69666667 0.04509250

0.1 0 3 1.62666667 0.02516611

0.1 0.1 3 2.05333333 0.07571878

0.1 0.5 3 2.10333333 0.02081666

0.1 1.0 3 2.18000000 0.03605551

0.1 1.5 3 2.39333333 0.04041452

0.5 0 3 1.72333333 0.02516611

0.5 0.1 3 3.05666667 0.03511885

0.5 0.5 3 1.69666667 0.05131601

0.5 1.0 3 1.80333333 0.04618802

0.5 1.5 3 1.80333333 0.06429101

1.0 0 3 1.81666667 0.01527525

1.0 0.1 3 2.14000000 0.01732051

1.0 0.5 3 2.23666667 0.03214550

1.0 1.0 3 2.39000000 0.03605551

1.0 1.5 3 2.55000000 0.03000000

1.5 0 3 1.84666667 0.02516611

1.5 0.1 3 2.35333333 0.02309401

1.5 0.5 3 1.73666667 0.03214550

1.5 1.0 3 1.30000000 0.03605551

1.5 1.5 3 1.25666667 0.01527525

RE TU LA

The GLM Procedure

Least Squares Means

Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett

H0:LSMean=

Control

I N Y LSMEAN Pr > |t|

0 0 1.21000000

0 0.1 2.63000000 <.0001

0 0.5 2.53333333 <.0001

0 1.0 1.82666667 <.0001

0 1.5 1.69666667 <.0001

0.1 0 1.62666667 <.0001

0.1 0.1 2.05333333 <.0001

0.1 0.5 2.10333333 <.0001

0.1 1.0 2.18000000 <.0001

0.1 1.5 2.39333333 <.0001

0.5 0 1.72333333 <.0001

0.5 0.1 3.05666667 <.0001

0.5 0.5 1.69666667 <.0001

0.5 1.0 1.80333333 <.0001

0.5 1.5 1.80333333 <.0001

1.0 0 1.81666667 <.0001

1.0 0.1 2.14000000 <.0001

1.0 0.5 2.23666667 <.0001

1.0 1.0 2.39000000 <.0001

1.0 1.5 2.55000000 <.0001

1.5 0 1.84666667 <.0001

1.5 0.1 2.35333333 <.0001

1.5 0.5 1.73666667 <.0001

1.5 1.0 1.30000000 0.0332

1.5 1.5 1.25666667 0.6818

RE TU LA

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

K 3 1 2 3

IN 25 I0,1N0 I0,1N0,1 I0,1N0,5 I0,1N1,0 I0,1N1,5 I0,5N0 I0,5N0,1

I0,5N0,5 I0,5N1,0

I0,5N1,5 I0N0 I0N0,1 I0N0,5 I0N1,0 I0N1,5 I1,0N0 I1,0N0,1

I1,0N0,5 I1,0N1,0

I1,0N1,5 I1,5N0 I1,5N0,1 I1,5N0,5 I1,5N1,0 I1,5N1,5

Number of Observations Read 75

Number of Observations Used 75

RE TU LA

The GLM Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 26 14.87330133 0.57205005 495.31 <.0001

Error 48 0.05543733 0.00115494

Corrected Total 74 14.92873867

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.996287 1.700471 0.033984 1.998533

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01136267 0.00568133 4.92 0.0114

IN 24 14.86193867 0.61924744 536.17 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K 2 0.01136267 0.00568133 4.92 0.0114

IN 24 14.86193867 0.61924744 536.17 <.0001

RE TU LA

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 48

Error Mean Square 0.001155

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13

Critical Range .07443 .07760 .07974 .08133 .08258 .08360 .08445 .08518 .08582

.08637 .08687 .08731

Number of Means 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23 24 25

Critical Range .08771 .08807 .08840 .08871 .08899 .08924 .08948 .08970 .08991

.09010 .09028 .09045

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N IN

A 3.05667 3 I0,5N0,1

B 2.63000 3 I0N0,1

C 2.55000 3 I1,0N1,5

C 2.53333 3 I0N0,5

D 2.39333 3 I0,1N1,5

D 2.39000 3 I1,0N1,0

D 2.35333 3 I1,5N0,1

E 2.23667 3 I1,0N0,5

F E 2.18000 3 I0,1N1,0

F 2.14000 3 I1,0N0,1

F G 2.10333 3 I0,1N0,5

G 2.05333 3 I0,1N0,1

H 1.84667 3 I1,5N0

H 1.82667 3 I0N1,0

H 1.81667 3 I1,0N0

I H 1.80333 3 I0,5N1,0

I H 1.80333 3 I0,5N1,5

I J 1.73667 3 I1,5N0,5

J 1.72333 3 I0,5N0

K J 1.69667 3 I0N1,5

K J 1.69667 3 I0,5N0,5

K 1.62667 3 I0,1N0

L 1.30000 3 I1,5N1,0

M L 1.25667 3 I1,5N1,5

M 1.21000 3 I0N0

Phụ lục 2: Chuyển gen tạo rễ tơ

- Tỷ lệ mẫu chuyển gen

Thời gian ủ

Hàm lượng Acetocyringone (micromole)

Tỷ lệ mẫu chuyển gen (%)

100

150

100

150

0.001

0.002

100

150

The SAS System

The RSREG Procedure

Coding Coefficients for the Independent Variables

Factor Subtracted off Divided by

Thgian 4.000000 3.000000

acetosyringone 80.000000 70.000000

Response Surface for Variable TLChuyengen

Response Mean 0.000333

Root MSE 0.000634

R-Square 0.4834

Coefficient of Variation 190.1575

Type I Sum

Regression DF of Squares R-Square F Value Pr > F

Linear 2 0.000001242 0.2661 1.55 0.2875

Quadratic 2 5.336533E-9 0.0011 0.01 0.9934

Crossproduct 1 0.000001009 0.2162 2.51 0.1642

Total Model 5 0.000002256 0.4834 1.12 0.4380

Sum of

Residual DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Lack of Fit 6 0.000002411 0.000000402 . .

Pure Error 0 0 .

Total Error 6 0.000002411 0.000000402

Parameter

Estimate

Standard

from Coded

Parameter DF Estimate Error t Value Pr > |t| Data

Intercept 1 -0.000600 0.000846 -0.71 0.5051 0.000342

Thgian 1 0.000296 0.000430 0.69 0.5164 0.000358

acetosyringone 1 0.000005004 0.000015122 0.33 0.7520 -0.000157

Thgian*Thgian 1 0 0.000049410 0.00 1.0000 6.143367E-20

acetosyringone*Thgian 1 -0.000002209 0.000001394 -1.58 0.1642 -

0.000464

acetosyringone*acetosyringone 1 9.8915653E-9 8.582773E-8 0.12

0.9120 0.000048469

Sum of

Factor DF Squares Mean Square F Value Pr > F Label

Thgian 3 0.000002175 0.000000725 1.80 0.2464 Thoi gian u (ngay)

ham luong

acetosyringone 3 0.000001089 0.000000363 0.90 0.4925 acetosyringone

(micromol)

The SAS System

The RSREG Procedure

Canonical Analysis of Response Surface Based on Coded Data

Critical Value

Factor Coded Uncoded Label

Thgian -0.177912 3.466263 Thoi gian u (ngay)

ham luong

acetosyringone 0.772680 134.087591 acetosyringone (micromol)

Predicted value at stationary point: 0.000249

Eigenvectors

Eigenvalues Thgian acetosyringone

0.000257 -0.669358 0.742940

-0.000209 0.742940 0.669358

Stationary point is a saddle point.

The SAS System

The RSREG Procedure

Estimated Ridge of Maximum Response for Variable TLChuyengen

Coded Estimated Standard Uncoded Factor Values

Radius Response Error Thgian acetosyringone

0.0 0.000342 0.000438 4.000000 80.000000

0.1 0.000383 0.000439 4.264674 76.704493

0.2 0.000428 0.000435 4.512900 72.735348

0.3 0.000478 0.000427 4.749544 68.375792

0.4 0.000533 0.000415 4.978129 63.779334

0.5 0.000593 0.000401 5.201002 59.031209

0.6 0.000657 0.000386 5.419721 54.181129

0.7 0.000727 0.000371 5.635340 49.259599

0.8 0.000802 0.000359 5.848592 44.286219

0.9 0.000881 0.000355 6.059998 39.274092

1.0 0.000966 0.000360 6.269939 34.232288

- Tỷ lệ mẫu nhũn

Thời gian ủ

Hàm lượng Acetocyringone (micromole)

Tỷ lệ mẫu chuyển gen (%)

100

28.5

150

54.5

100

56.5

150

57.67

100

150

67.5

The SAS System

The RSREG Procedure

Coding Coefficients for the Independent Variables

Factor Subtracted off Divided by

Thgian 4.000000 3.000000

acetosyringone 80.000000 70.000000

Response Surface for Variable TLNHUN: Ti le mau nhun(%%)

Response Mean 49.472500

Root MSE 0.421407

R-Square 0.9996

Coefficient of Variation 0.8518

Type I Sum

Regression DF of Squares R-Square F Value Pr > F

Linear 2 2142.737903 0.7726 6033.03 <.0001

Quadratic 2 621.235380 0.2240 1749.13 <.0001

Crossproduct 1 8.451038 0.0030 47.59 0.0005

Total Model 5 2772.424321 0.9996 3122.38 <.0001

Sum of

Residual DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Lack of Fit 6 1.065504 0.177584 . .

Pure Error 0 0 .

Total Error 6 1.065504 0.177584

Parameter

Estimate

Standard

from Coded

Parameter DF Estimate Error t Value Pr >

|t| Data

Intercept 1 8.774754 0.562456 15.60

<.0001 63.725312

Thgian 1 20.921991 0.285691 73.23

<.0001 17.672952

acetosyringone 1 0.001180 0.010053 0.12

0.9104 2.235439

Thgian*Thgian 1 -1.942813 0.032849 -59.14

<.0001 -17.485313

acetosyringone*Thgian 1 0.006394 0.000927 6.90

0.0005 1.342669

acetosyringone*acetosyringone 1 0.000032374 0.000057061 0.57

0.5910 0.158632

Sum of

Factor DF Squares Mean Square F Value Pr > F Label

Thgian 3 2742.804188 914.268063 5148.37 <.0001 Thoi gian u (ngay)

ham luong

acetosyringone 3 38.071171 12.690390 71.46 <.0001 acetosyringone (micromol)

The SAS System

The RSREG Procedure

Canonical Analysis of Response Surface Based on Coded Data

Critical Value

Factor Coded Uncoded Label

Thgian 0.202017 4.606050 Thoi gian u (ngay)

ham luong

acetosyringone -7.900905 -473.063345 acetosyringone (micromol)

Predicted value at stationary point: 56.679433

Eigenvectors

Eigenvalues Thgian acetosyringone

0.184139 0.037967 0.999279

-17.510819 0.999279 -0.037967

Stationary point is a saddle point.

The SAS System

The RSREG Procedure

Estimated Ridge of Minimum Response for Variable TLNHUN: Ti le mau

nhun(%%

Coded Estimated Standard Uncoded Factor Values

Radius Response Error Thgian acetosyringone

0.0 63.725312 0.291204 4.000000 80.000000

0.1 61.772767 0.286559 3.701468 79.308456

0.2 59.475670 0.278582 3.401897 78.887609

0.3 56.831916 0.267738 3.101895 78.638039

0.4 53.840324 0.254884 2.801716 78.503181

0.5 50.500179 0.241433 2.501474 78.448732

0.6 46.811029 0.229566 2.201222 78.452763

0.7 42.772570 0.222380 1.900983 78.500625

0.8 38.384592 0.223633 1.600769 78.582175

0.9 33.646945 0.236753 1.300584 78.690169

1.0 28.559519 0.263547 1.000427 78.819297

Phụ lục 3: Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp hoạt chất

plumbagin

3.1. Đường chuẩn plumbagin:

Sự thay đổi hàm lượng plumbagin chuẩn được xác đinh bằng hệ thống HPLC.

Mức

Nồng độ pha (ppm)

Diện tích peak

Nồng độ xác định (ppm)

3,71

157321,19

7,97

289137,59

18,92

627406,87

30,30

979175,26

44,07

1404866,26

52,54

1666473,33

100

97,50

3055883,88

3.2. Trạng thái môi trường

Lần lặp lại

Điều kiện nuôi

Khối lượng rễ (g TLT)

2.54

long

2.25

ran

2.63

long

2.35

ran

2.53

long

2.37

ran

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

T 2 long ran

Number of Observations Read 6

Number of Observations Used 6

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 1 0.08881667 0.08881667 24.79 0.0076

Error 4 0.01433333 0.00358333

Corrected Total 5 0.10315000

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.861044 2.448301 0.059861 2.445000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 1 0.08881667 0.08881667 24.79 0.0076

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.003583

Critical Value of t 4.60409

Least Significant Difference 0.225

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 2.56667 3 long

B 2.32333 3 ran

3.3. Điều kiện chiếu sáng

Lần lặp lại

Điều kiện nuôi

Khối lượng rễ (g TLT)

sang

2.64

toi

2.75

sang

2.63

toi

2.81

sang

2.70

toi

2.77

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

T 2 sang toi

Number of Observations Read 6

Number of Observations Used 6

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Y

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 1 0.02160000 0.02160000 18.25 0.0129

Error 4 0.00473333 0.00118333

Corrected Total 5 0.02633333

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.820253 1.266243 0.034400 2.716667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 1 0.02160000 0.02160000 18.25 0.0129

KHOI LUONG RE(g)

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for Y

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.001183

Critical Value of t 4.60409

Least Significant Difference 0.1293

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 2.77667 3 toi

A 2.65667 3 sang

3.4. Ảnh hưởng loại môi trường:

Lần lặp lại

Môi trường

Khối lượng rễ (g TLT)

2.90

2.6

2.73

2.85

2.63

2.37

2.77

2.56

2.47

Khoi luong re

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

Moitruong 3 B5 MS N

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

khoi luong re

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: khoiluong

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 0.16486667 0.08243333 6.17 0.0350

Error 6 0.08013333 0.01335556

Corrected Total 8 0.24500000

R-Square Coeff Var Root MSE khoiluong Mean

0.672925 4.355512 0.115566 2.653333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

Moitruong 2 0.16486667 0.08243333 6.17 0.0350

khoi luong re

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for khoiluong

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 0.013356

Critical Value of t 3.70743

Least Significant Difference 0.3498

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Moitruong

A 2.84000 3 MS

A 2.59667 3 B5

A 2.52333 3 N

3.5. Khối lượng rễ ban đầu:

Lần lặp lại

Khối lượng rễ (g TLT)

Nghiệm thức

1.07619

0.447619

0.18543

0.361809

0.942308

0.545455

0.407895

0.359606

1.07619

0.446701

0.362126

0.540404

khoi luong re ban dau

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

nghiemthuc 4 1 2 3 4

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12

khoi luong re ban dau

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tyletangtruong

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 0.91954835 0.30651612 36.32 <.0001

Error 8 0.06752325 0.00844041

Corrected Total 11 0.98707160

R-Square Coeff Var Root MSE tyletangtruong Mean

0.931592 16.32855 0.091872 0.562644

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

nghiemthuc 3 0.91954835 0.30651612 36.32 <.0001

khoi luong re ban dau

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for tyletangtruong

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 0.00844

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 0.2517

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nghiemthuc

A 1.03156 3 1

B 0.47993 3 2

B 0.42061 3 4

B 0.31848 3 3

3.6. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ

- Sàng lọc yếu tố tác động:

Study

Type

Factorial

Initial

Design

Plackett Burman

No Blocks

Center

Points

Design

Model

Main effects

Std.

Low

High

Low

High

Dev.

Factor

Name

Units

Actual

Coded

Mean

nuoc dua %

-1

pepton

mg/L

100

500

-1

300

200

yeast

extract

mg/L

100

1000

-1

550

450

chitosan mg/L

100

300

-1

200

100

casein

mg/L

100

500

-1

300

200

100

-1

mg/L

-1

duong

g/L

-1

Std.

Dev.

Ratio

Response Name

Units

Analysis Minimum Maximum Mean

trong

luong

mg/70mL Factorial

3.34

5.32 4.398333 0.661864 1.592814

tuoi

trong

luong kho mg/70mL Factorial

0.253

0.585 0.459167 0.098257 2.312253

plumbagin mg

Factorial 0.008112 1.416564 0.661184 0.417177 174.6257

+ Trọng lượng tươi

Term

Effect

SumSqr

Contribtn

Intercept

A-nuoc dua

0.76

1.7328

32.96323

B-pepton

0.34

0.3468

6.597211

C-yeast

extract

0.276667 0.229633 4.368338

D-chitosan

-0.08

0.0192

0.365244

E-casein

0.01

0.0003

0.005707

F-SA

0.066667 0.013333 0.253641

G-duong

-0.41333 0.512533 9.749973

Lenth's ME

1.655366

Lenth's SME

3.545923

+ Trọng lượng khô

Term

Effect

SumSqr

Contribtn

Intercept

A-nuoc dua

0.108

0.034992 30.20362

B-pepton

-0.00467 6.53E-05 0.056393

C-yeast

extract

0.020333 0.00124 1.070603

D-chitosan

0.013333 0.000533 0.460351

E-casein

0.003333 3.33E-05 0.028772

F-SA

0.009333 0.000261 0.225572

G-duong

-0.08833 0.023408 20.20509

Lenth's ME

0.048941

Lenth's SME 0.104836

+ Hàm lượng plumbagin

Term

Effect

SumSqr

% Contribtn

Intercept

A-nuoc dua

-0.01401 0.000589

0.028183

B-pepton

0.56296 0.950772

45.52557

C-yeast extract

0.005491 9.05E-05

0.004331

D-chitosan

0.422368 0.535184

25.62609

E-casein

-0.11887 0.042392

2.029829

F-SA

0.106667 0.034134

1.634408

G-duong

-0.07184 0.015482

0.741325

Lenth's ME

0.548946

Lenth's SME

1.175885

- Ảnh hưởng của yếu tố được chọn lọc lên sự sinh trưởng của rễ tơ

+ Trọng lương tươi:

trong luong tuoi

Transform:

None

Sequential Model Sum of Squares [Type I]

Sum of

Mean

F

p-value

Source

Squares

df

Square

Value

Prob > F

226.80

Mean vs Total226.80

Suggested

0.24

Linear vs Mean0.97

0.95

0.4583

0.50

2FI vs Linear2.98

3.24

0.0329

Suggested

Quadratic vs 2FI

0.60

0.15

0.97

0.4672

Cubic vs Quadratic

1.27

0.25

4.59 0.0599 Aliased

0.055

Residual

0.28

9.32

Total

232.89

"Sequential Model Sum of Squares [Type I]": Select the highest order

polynomial where the

additional terms are significant and the model is not aliased.

Lack of Fit Tests

Sum of

Mean

F

p-value

Source Squares

df

Square

Value

Prob > F

Linear

4.85

0.32

5.83

0.0308

2FI

1.87

0.21

3.75

0.0797

Suggested

Quadratic 1.27

0.25

4.59

0.0599

Cubic

0.000

Aliased

Pure Error 0.28

0.055

"Lack of Fit Tests": Want the selected model to have insignificant lack-of-fit.

Model Summary Statistics

Std.

Adjusted

Predicted

Source

Dev.

R-Squared

PRESS

Linear

0.51

0.1590

-0.0092

-0.4846

9.04

2FI

0.39

0.6476

0.3960

-1.0544

12.52

Suggested

Quadratic 0.39

0.7459

0.3901

-2.7571

22.89

Cubic

0.24

0.9545

0.7818

Aliased

+ Case(s) with leverage of 1.0000: PRESS statistic not defined

"Model Summary Statistics": Focus on the model maximizing the "Adjusted R-Squared"

and the "Predicted R-Squared".

Use your mouse to right click on individual cells for definitions.

Response

1 trong luong tuoi

ANOVA for Response Surface Reduced Cubic Model

Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III]

Sum of

Mean

F

p-value

Source

Squares

df

Square

Value

Prob > F

0.0063

5.65

6.31

0.35

Model

0.0024

1.07

19.15

1.07

A-nuoc dua

0.0165

0.51

9.14

0.51

B-chitosan

0.27

0.0581

4.88

C-SA0.27

0.34

0.0392

6.06

AB0.34

1.38

0.0011

24.63

AC1.38

1.25

0.0015

22.27

AD1.25

1.74

0.0005

31.04

BC1.74

0.30

0.0478

5.45

CD0.30

0.48

0.0192

8.55

A20.48

0.79

0.0056

14.11

B20.79

0.88

0.0042

15.70

C20.88

1.13

0.0020

20.20

D21.13

0.68

0.0083

12.12

ABC0.68

0.36

0.0342

6.50

ABD0.36

1.07

0.0023

19.20

ACD1.07

0.48

0.0189

8.61

A2B0.48

0.45

0.056

Residual

0.17

0.057

1.030.4554 not significant

Lack of Fit

0.28

0.055

Pure Error

6.09

Cor Total

Std. Dev.

0.24

R-Squared

0.9266

Mean3.01

Adj R-Squared

0.7797

C.V. %

7.85

Pred R-Squared

-0.8387

PRESS

11.20

Adeq Precision

13.567

A negative "Pred R-Squared" implies that the overall mean is a better predictor of

your response than the current model.

"Adeq Precision" measures the signal to noise ratio. A ratio greater than 4 is

desirable. Your ratio of 13.567 indicates an adequate signal. This model can be

used to navigate the design space.

Coefficient

Standard

95% CI

Factor

Estimate

VIF

df

Error

Low

High

3.28

0.20

2.82

3.74

Intercept

-0.35

2.14

0.080

-0.54

-0.17

A-nuoc dua

-0.54

10.74

0.18

-0.94

-0.13

B-chitosan

-0.14

-0.30

6.297E-003

1.33

0.065

C-SA

0.17

0.027

0.83

7.75

AB0.43

0.088

0.24

0.64

1.93

AC0.44

0.21

-1.46

-0.50

10.29

AD-0.98

0.094

-0.74

-0.31

2.31

BC-0.53

0.48

0.10

2.993E-003

2.44

CD0.24

0.13

0.082

0.69

1.36

A20.39

0.35

-2.11

-0.51

8.47

B2-1.31

0.18

-1.13

-0.30

2.50

C2-0.71

0.28

0.62

1.91

6.35

D21.26

0.23

-1.35

-0.27

11.72

ABC-0.81

0.10

0.025

0.51

1.87

ABD0.27

0.26

0.55

1.76

13.03

ACD1.16

0.23

0.14

0.67

1.20

13.19

A2 B

Final Equation in Terms of Coded Factors:

trong luong tuoi

+3.28

-0.35

* A

-0.54

* B

-0.14

* C

+0.43

* A * B

+0.44

* A * C

-0.98

* A * D

-0.53

* B * C

+0.24

* C * D

+0.39

* A2

-1.31

* B2

-0.71

* C2

+1.26

* D2

-0.81

* A * B * C

+0.27

* A * B * D

+1.16

* A * C * D

+0.67

* A2 * B

1

Response

trong luong tuoi

Transform:

None

Diagnostics Case Statistics

InternallyExternallyInfluence on

Standard

Actual Predicted

Studentized

StudentizedFitted ValueCook's Run

Order

Value

Value Residual Leverage Residual Residual DFFITS Distance Order

2.92

3.00

-0.082 0.945-1.472-1.612 * -6.69

* 2.20

2.79

2.95

0.16 0.4970.9760.973

0.967

0.055

2.87

2.94

0.078 0.8850.9760.972

* 2.70

0.430

3.01

2.90

-0.12 0.444-0.663-0.638 -0.570

0.021

3.24

3.10

-0.14 0.844-1.538-1.715 * -3.99

0.753

4.89

4.97

0.076 0.9421.3351.417

* 5.73

* 1.72

2.69

2.75

-0.055 0.930-0.875-0.861 * -3.14

0.599

2.74

2.52

-0.22 0.698-1.685-1.962 * -2.99

0.387

2.58

2.66

0.077 0.6220.5290.504

0.646

0.027

3.10

3.12

-0.025 0.984-0.820-0.802 * -6.24

* 2.40

2.53

2.57

0.038 0.8430.4030.381

0.884

0.051

2.94

3.06

0.12 0.4970.7190.695

0.690

0.030

2.98

2.96

0.029 0.4610.1650.155

0.143

0.001

3.32

3.04

0.28 0.4381.5931.803

1.591

0.116

2.24

2.25-4.034E-003 0.717-0.032-0.030 -0.048

0.000

3.66

3.81

-0.14 0.819-1.432-1.553 * -3.30

0.545

3.29

3.31

-0.020 0.663-0.149-0.139 -0.195

0.003

2.98

2.97

0.011 0.9690.2750.259

1.450

0.140

2.85

2.94

-0.091 0.872-1.075-1.087 * -2.84

0.465

2.92

2.84

0.078 0.5940.5160.491

0.594

0.023

2.83

2.94

-0.11 0.497-0.662-0.637 -0.633

0.025

2.58

2.79

-0.21 0.497-1.232-1.281 -1.273

0.088

3.32

3.01

0.30 0.4441.7242.034

1.816

0.139

2.90

3.04

-0.14 0.438-0.802-0.783 -0.691

0.029

3.06

2.96

0.10 0.4610.5900.564

0.522

0.017

* Exceeds limits

+ Trọng lượng khô

2 trong luong kho

Transform:

None

Response

Sequential Model Sum of Squares [Type I]

Sum of

Mean

p-value

F

Source

Squares

df

Square

Value

Prob > F

Mean vs Total3.58

3.58

Suggested

Linear vs Mean3.492E-003

8.729E-004

0.28

0.8906

2FI vs Linear0.024

4.064E-003

1.46

0.2629

Quadratic vs 2FI

0.025

6.286E-003

0.0244

Suggested

4.51

Cubic vs Quadratic 7.715E-003

1.543E-003

0.4107

Aliased

1.24

Residual6.238E-003

1.248E-003

Total

3.64

0.15

"Sequential Model Sum of Squares [Type I]": Select the highest order polynomial

where the

additional terms are significant and the model is not aliased.

Lack of Fit Tests

Sum of

Mean

F

p-value

Source Squares

Square

df

Value

Prob > F

Linear

0.057

3.816E-003

0.1111

3.06

2FI

0.033

3.651E-003

0.1248

2.93

Quadratic7.715E-003

1.543E-003

1.24

0.4107

Suggested

Cubic

0.000

Aliased

Pure Error6.238E-003

1.248E-003

"Lack of Fit Tests": Want the selected model to have insignificant lack-of-fit.

Model Summary Statistics

Std.

Adjusted

Predicted

Source

Dev.

R-Squared

PRESS

Linear

0.056

0.0521

-0.1374

-0.5247

0.10

2FI

0.053

0.4162

-0.0008

-1.6394

0.18

Quadratic 0.037

0.7917

0.12

0.5000

-0.8101

Suggested

Cubic

0.035

0.9069

0.5529

Aliased

+ Case(s) with leverage of 1.0000: PRESS statistic not defined

"Model Summary Statistics": Focus on the model maximizing the "Adjusted R-Squared"

and the "Predicted R-Squared".

Use your mouse to right click on individual cells for definitions.

Response

2 trong luong kho

ANOVA for Response Surface Reduced Cubic Model

Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III]

Sum of

Mean

F

p-value

Source

Squares

df

Square

Value

Prob > F

Model

0.058

5.262E-003

7.53

0.0005

B-chitosan

2.256E-003

3.23

0.0956

AC0.013

0.013

18.86

0.0008

AD0.016

0.016

23.16

0.0003

BC0.013

0.013

18.21

0.0009

CD5.195E-003

5.195E-003

7.43

0.0173

C20.011

0.011

16.13

0.0015

D20.029

0.029

41.70

< 0.0001

ABC6.563E-003

6.563E-003

9.39

0.0090

ABD3.258E-003

3.258E-003

4.66

0.0501

ACD0.017

0.017

24.85

0.0002

A2B5.932E-003

5.932E-003

8.49

0.0121

Residual

9.086E-003

6.989E-004

Lack of Fit

2.848E-003

3.560E-004

0.29

0.9434

Pure Error

6.238E-003

1.248E-003

Cor Total

0.067

0.026

R-Squared

0.8643

Std. Dev.

Adj R-Squared

0.7495

Mean0.38

6.99

Pred R-Squared

0.5837

C.V. %

0.028

Adeq Precision

12.867

PRESS

The "Pred R-Squared" of 0.5837 is in reasonable agreement with the "Adj R-Squared"

of 0.7495.

"Adeq Precision" measures the signal to noise ratio. A ratio greater than 4 is

desirable. Your ratio of 12.867 indicates an adequate signal. This model can be

used to navigate the design space.

Coefficient

Standard

95% CI

Factor

Estimate

df

Error

Low

High

VIF

Intercept

0.35

0.014

0.32

0.38

B-chitosan

-0.031

0.017

-0.068

6.263E-003

8.12

AC0.036

8.240E-003

0.018

0.054

1.34

AD-0.044

9.115E-003

-0.064

-0.024

1.58

BC-0.038

8.989E-003

-0.058

-0.019

1.68

CD0.025

0.044

9.104E-003

5.153E-003

1.53

C2-0.068

0.017

-0.10

-0.032

1.77

D20.10

0.016

0.067

0.13

1.57

ABC-0.029

9.613E-003

-0.050

-8.689E-003

1.59

ABD0.023

0.011

-1.392E-005

0.046

1.55

ACD0.048

9.706E-003

0.027

0.069

1.41

A2 B

0.065

0.022

0.017

0.11

10.18

Final Equation in Terms of Coded Factors:

trong luong kho

+0.35

* B

-0.031

* A * C

+0.036

* A * D

-0.044

* B * C

-0.038

* C * D

+0.025

* C2

-0.068

* D2

+0.10

* A * B * C

-0.029

* A * B * D

+0.023

* A * C * D

+0.048

* A2 * B

+0.065

Response 2

trong luong kho

Transform:

None

Diagnostics Case Statistics

InternallyExternallyInfluence on

Standard

Actual Predicted

Studentized

StudentizedFitted ValueCook's Run

Order

Value

Value Residual Leverage Residual Residual DFFITS Distance Order

0.38

0.38-4.041E-003 0.650-0.258-0.249 -0.339

0.010

0.35

0.345.829E-003 0.3710.2780.268

0.206

0.004

0.37

0.37-2.920E-003 0.677-0.194-0.187 -0.270

0.007

0.39

0.36

0.023 0.4051.1291.142

0.942

0.072

0.36

0.355.619E-003 0.4870.2970.286

0.279

0.007

0.51

0.506.507E-003 0.7230.4680.453

0.732

0.048

0.43

0.43-6.554E-003 0.711-0.461-0.446 -0.699

0.043

0.34

0.35

-0.013 0.590-0.742-0.728 -0.873

0.066

0.38

0.35

0.021 0.3781.0001.000

0.780

0.051

0.29

0.31

-0.018 0.403-0.902-0.895 -0.735

0.046

0.34

0.35

-0.011 0.669-0.733-0.719 -1.022

0.090

0.45

0.43

0.019 0.3380.8780.870

0.621

0.033

0.34

0.39

-0.048 0.413-2.389-3.064 * -2.57

0.334

0.38

0.37

0.013 0.2850.5960.580

0.367

0.012

0.28

0.27

0.012 0.4330.5780.563

0.491

0.021

0.47

0.47-4.956E-003 0.783-0.403-0.389 -0.739

0.049

0.39

0.35

0.030 0.3031.3771.431

0.944

0.069

0.36

0.38

-0.019 0.391-0.934-0.929 -0.744

0.047

0.40

0.40-7.291E-003 0.726-0.527-0.512 -0.834

0.061

0.38

0.38-9.912E-004 0.454-0.051-0.049 -0.045

0.000

0.43

0.43-2.114E-003 0.338-0.098-0.094 -0.067

0.000

0.33

0.34-6.505E-003 0.371-0.310-0.299 -0.230

0.005

0.34

0.36

-0.022 0.405-1.094-1.103 -0.909

0.068

0.35

0.37

-0.015 0.285-0.672-0.657 -0.415

0.015

0.44

0.39

0.047 0.4132.3002.869

* 2.40

0.310

* Exceeds limits

+ Hàm lượng plumbagin

Response

3 plumbagin

Transform:

None

Sequential Model Sum of Squares [Type I]

Sum of

Mean

F

p-value

Source

Squares

df

Square

Value

Prob > F

Mean vs Total3319.63

3319.63

Suggested

Linear vs Mean396.45

99.11

1.54

0.2291

2FI vs Linear858.69

143.12

4.67

0.0083

Suggested

Quadratic vs 2FI

181.95

45.49

1.84

0.1980

Cubic vs Quadratic

240.86

48.17

37.17

0.0006

Residual

6.48

1.30

Total 5004.06

200.16

"Sequential Model Sum of Squares [Type I]": Select the highest order polynomial

where the

additional terms are significant and the model is not aliased.

Lack of Fit Tests

Sum of

Mean

F

p-value

df

Source Squares

Square

Prob > F

Value

Linear 1281.50

85.43

0.0001

65.92

2FI

422.81

46.98

36.25

0.0005

Suggested

Quadratic 240.86

48.17

0.0006

37.17

Cubic

0.000

Aliased

Pure Error 6.48

1.30

"Lack of Fit Tests": Want the selected model to have insignificant lack-of-fit.

Model Summary Statistics

Std.

Adjusted

Predicted

Source

Dev.

R-Squared

PRESS

Linear

8.02

0.2354

0.0824

-0.4185

2389.44

2FI

5.54

0.7451

0.5631

-0.8590

3131.39

Suggested

Quadratic 4.97

0.8532

0.6476

-1.5751

4337.50

Cubic

1.14

0.9962

0.9815

Aliased

+ Case(s) with leverage of 1.0000: PRESS statistic not defined

"Model Summary Statistics": Focus on the model maximizing the "Adjusted R-Squared"

and the "Predicted R-Squared".

Use your mouse to right click on individual cells for definitions.

Response

3 plumbagin

ANOVA for Response Surface Reduced Cubic Model

Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III]

Sum of

Mean

F

p-value

Source Squares

df

Square

Prob > F

Value

1674.17

98.48

67.15

< 0.0001

Model

126.27

86.10

< 0.0001

A-nuoc dua

15.47

10.55

0.0141

B-chitosan

190.61

129.96

< 0.0001

C-SA190.61

145.95

99.51

< 0.0001

D-pepton

12.44

8.48

0.0226

AB12.44

229.48

156.46

< 0.0001

AC229.48

48.99

0.0007

33.40

AD48.99

49.26

0.0007

33.59

BC49.26

13.00

0.0206

8.86

BD13.00

38.10

0.0014

25.98

CD38.10

23.97

0.0049

16.34

B223.97

10.30

7.02

0.0329

C210.30

60.96

0.0004

41.56

D260.96

24.84

0.0045

16.93

ABC24.84

47.68

0.0007

32.51

ACD47.68

51.29

0.0006

34.97

BCD51.29

5.85

0.0859

3.99

A2B5.85

1.47

10.27

Residual

1.89

1.46

0.3166

3.79

Lack of Fit

1.30

6.48

Pure Error

1684.43

Cor Total

R-Squared

0.9939

1.21

Std. Dev.

Adj R-Squared

0.9791

Mean11.52

Pred R-Squared

0.8155

10.51

C.V. %

Adeq Precision

42.717

310.79

PRESS

The "Pred R-Squared" of 0.8155 is in reasonable agreement with the "Adj R-Squared"

of 0.9791.

"Adeq Precision" measures the signal to noise ratio. A ratio greater than 4 is

desirable. Your

ratio of 42.717 indicates an adequate signal. This model can be used to navigate

the design space.

Coefficient

Standard

95% CI

Factor

Estimate

df

Error

Low

VIF

High

Intercept

7.03

0.79

5.32

8.75

A-nuoc dua

1.31

0.32

0.62

1.11

1.99

C-SA

-0.75

0.33

-1.47

1.14

-0.033

AB-0.97

0.39

-1.81

-0.12

1.32

AD1.21

0.47

0.19

2.23

1.75

BC0.95

0.37

0.16

1.75

1.17

BD-1.41

0.38

-2.23

-0.59

1.22

CD-0.90

0.40

-1.77

-0.024

1.25

B22.22

0.88

0.33

4.12

1.79

C21.48

0.69

-0.018

2.98

1.23

ACD-2.00

0.60

-3.29

-0.71

2.24

A2 B

0.40

-1.60

-0.73

0.14

1.36

Final Equation in Terms of Coded Factors:

plumbagin

+7.03

+1.31

* A

-0.75

* C

-0.97

* A * B

+1.21

* A * D

+0.95

* B * C

-1.41

* B * D

-0.90

* C * D

+2.22

* B2

+1.48

* C2

-2.00 * A * C * D

-0.73

* A2*B

Response

3 plumbagin Transform: None

Diagnostics Case Statistics

InternallyExternallyInfluence on

Standard

Actual Predicted

Studentized

StudentizedFitted ValueCook's Run

Order

Value

Value Residual Leverage Residual Residual DFFITS Distance Order

10.59

10.60-9.797E-003 0.957-0.039-0.036 -0.172

0.002

10.59

10.73

-0.14 0.497-0.167-0.155 -0.154

0.002

10.57

11.21

-0.64 0.889-1.598-1.856 * -5.25

* 1.14

7.61

8.19

-0.58 0.479-0.659-0.630 -0.604

0.022

10.92

11.38

-0.46 0.897-1.196-1.241 * -3.67

0.693

10.55

10.549.399E-003 0.9980.1660.154

* 3.30

0.702

6.71

7.27

-0.56 0.908-1.529-1.735 * -5.46

* 1.29

7.97

7.42

0.55 0.8831.3261.418

* 3.90

0.740

14.70

14.69

0.017 0.9890.1360.126

1.218

0.096

9.35

9.42

-0.078 0.927-0.238-0.221 -0.791

0.040

12.46

12.07

0.39 0.8770.9170.905

* 2.41

0.332

10.35

10.65

-0.30 0.464-0.343-0.321 -0.298

0.006

13.68

11.91

1.77 0.4712.0122.870

* 2.71

0.200

10.38

-0.45 0.493-0.527-0.497 -0.491

0.015

9.92

7.81

0.52 0.6720.7510.725

1.037

0.064

8.33

10.03

10.86

-0.83 0.708-1.271-1.342 * -2.09

0.218

7.53

-0.67 0.866-1.500-1.686 * -4.28

0.805

6.86

6.65

0.13 0.9860.9200.908

* 7.75

* 3.42

6.78

8.83

0.35 0.8630.7850.761

1.913

0.216

9.19

8.08

0.58 0.7690.9930.992

1.809

0.182

8.66

11.59

10.65

0.94 0.4641.0551.065

0.991

0.054

10.67

10.73

-0.061 0.497-0.071-0.065 -0.065

0.000

8.27

8.19

0.080 0.4790.0920.085

0.081

0.000

11.14

10.38

0.77 0.4930.8920.877

0.865

0.043

10.60

11.91

-1.31 0.471-1.486-1.662 -1.568

0.109

* Exceeds limits

- Tối ưu hóa

Constraints

Lower

Upper

Lower

Upper

Name

Goal

Limit

Weight

Importance

3

nuoc dua is in range

10

30

1

3

chitosan is in range

100

300

1

3 is in range

10

100

1

3

pepton

is in range

100

500

1

trong luong tuoi

maximize

2.24267 4.96833 1

3

1

trong luong kho

maximize

0.279667 0.510333 1

3

plumbagin maximize

5.05527 14.7033 1

1

Solutions

Number nuocdua

chitosan SA

pepton

trong luong tuoi

trong luong

kho

plumbagin Desirability

114.33 100.00

19.40

500.00 4.96838 0.454644 11.0107

0.777 Selected

214.17 100.00

19.73

500.00 5.02979 0.456746

10.914

0.775

314.20 100.00

14.53

500.00 4.96835 0.443537

11.382

0.775

414.30 106.05

10.00

500.00 4.98112 0.429588 11.4738

0.756

511.31 100.00

10.09

499.84 6.07102 0.45557 10.5237

0.756

614.55 110.94

10.00

500.00

4.9685 0.426858 11.2877

0.744

717.04 100.00

46.74

500.00 4.33765 0.485803 10.1144

0.711

829.58 300.00

43.85

100.01 4.96828 0.518957 8.50208

0.710

910.12 100.00

17.45

486.56

6.1658 0.456357 9.53605

0.709

1028.92 299.86

38.91

100.00 4.96831 0.515453 8.45698

0.706

1127.50 299.98

23.75

100.02 4.96832 0.502806 8.50789

0.702

1229.51 300.00

40.34

107.16 4.96832 0.514166

8.3781

0.701

1326.93 300.00

13.06

100.00 4.96922 0.490235 8.67769

0.700

1426.91 299.99

12.12

100.00 4.97349 0.489118 8.69264

0.700

1530.00 122.22

76.44

100.00 4.34857 0.475315 9.70261

0.681

1630.00 128.22

69.27

100.59 4.54834 0.480185 9.09705

0.675

1730.00 132.89

65.39

100.00 4.68813 0.482946 8.74981

0.671

1830.00 100.71

65.75

100.00

3.991 0.484303 9.97744

0.662

1930.00 180.12

74.09

100.00 4.96653 0.467661 8.37006

0.654

2030.00 210.82

72.87

100.00 4.96831 0.465062

8.2496

0.643

2123.74 300.00

10.00

100.00 3.91034 0.445263 9.86735

0.603

2216.31 177.84

10.00

499.99 4.90594 0.403374 9.06877

0.602

2330.00 178.98

89.74

500.00 4.45864 0.447108 8.21437

0.578

2430.00 184.80

99.82

500.00 4.61562 0.447107 7.76632

0.562

2510.00 279.61

65.73

100.00 3.53916 0.44175 9.47698

0.535

2610.04 264.56

47.02

100.00 3.61714 0.442436 9.19103

0.534

2730.00 223.05

63.48

500.00

3.9491 0.433015

8.3603

0.522

2810.00 300.00

73.60

500.00

3.772 0.463899 6.35718

0.393

28 Solutions found

Number of Starting Points: 30

nuoc duachitosan SA

pepton

10.838275.40017.443 199.320

13.114192.18031.906 483.880

22.934199.70050.140 447.880

29.510200.44097.075 180.920

26.090296.28036.100 491.920

13.198116.00083.071 106.560

11.458256.10087.661 498.040

29.594265.14060.382 110.440

23.248104.02057.709 341.440

10.290112.82013.204 242.200

18.142215.16057.619 301.360

28.816192.06025.480 271.880

17.280156.12041.320 206.200

28.782257.36073.081 460.160

10.694151.68075.646 229.040

24.628263.94052.291 378.680

14.278175.96036.901 132.720

14.806171.50044.587 180.440

19.220268.98083.818 165.480

27.492173.22097.561 320.160

13.970277.98016.516 406.000

18.772149.54062.119 124.200

18.696223.84041.995 158.480

23.374147.14026.056 411.480

12.216292.60065.629 198.840

17.836282.94083.719 163.120

11.484251.64029.062 269.040

16.246272.74071.947 443.520

23.512291.30034.309 222.840

18.416185.40082.378 369.760

Factor

Name

Level

Low Level

High Level Std. Dev.

Coding

nuoc dua

14.33

10.00

30.00 Actual

0.000 chitosan

100.00

300.00 Actual

0.000 SA

19.40

10.00

100.00 Actual

0.000 pepton

500.00

100.00

500.00 Actual

0.000

Response

Prediction

SE Mean 95% CI low 95% CI high

SE Pred 95% PI low

95% PI high

trong luong tuoi 4.96838

0.46

3.91

6.03

3.77

6.16

0.52

trong luong kho 0.45098

0.020

0.41

0.50

0.38

0.53

0.033

plumbagin

11.1352

0.98

8.89

13.13

7.50

14.52

1.62

Phụ lục 4: Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của plumbagin

4.1. Ảnh hưởng của plumbagin lên mật độ của tế bào HepG2

SAMPLE

CONTROL

2.5

CELL QUANTITY (CELLS/ml) x 104

141

115

135

113

137

118

Xử lý thống kê bằng Sigmaplot 11.0

Passed (P = 0.412)

Passed (P = 0.555)

137.667 115.333 58.000 57.333 23.333

3 3 3 3 3

0 0 0 0 0

Std Dev 3.055 2.517 1.732 2.082 1.528

SEM 1.764 1.453 1.000 1.202 0.882

MS 6576.667 5.067

DF 4 10 14

SS 26306.667 50.667 26357.333

F 1298.026

P <0.001

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean control 2.5 5 10 20 Source of Variation Between Groups Residual Total

Diff of Means 114.333 80.333 79.667 22.333 92.000 58.000 57.333 34.667 0.667 34.000

P<0.050 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes

q 87.978 61.815 61.302 17.185 70.793 44.630 44.117 26.675 0.513 26.162

p 5 4 3 2 4 3 2 3 2 2

P -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Duncan's Method) : Comparisons for factor: Comparison control vs. 20 control vs. 10 control vs. 5 control vs. 2.5 2.5 vs. 20 2.5 vs. 10 2.5 vs. 5 5 vs. 20 5 vs. 10 10 vs. 20 Note: The P values for Dunnett's and Duncan's tests are currently unavailable except for reporting that the P's are greater or less than the critical values of .05 and .01.

4.2. Phân tích comet assay

Control

Tail/comet

%DNA in Tail

Comet Area (px)

Tail Length (px)

Tail Area (px)

Comet Length (px) 183

Comet Height (px) 139

Head Diameter (px) 142

Tail Moment 5.174972

Olive Moment 9.697033

0.224043716

3552

12.621883

18625

185

135

17871

148

0.2

3228

12.275687

4.542004

9.190664

161

132

15051

130

0.192546584

2521

11.753238

3.643504

8.020113

146

108

11753

124

0.150684932

1507

9.571341

2.105695

6.035013

202

145

22295

160

0.207920792

4567

14.164382

5.94904

11.87435

219

166

26202

180

0.178082192

5688

14.374137

5.605913

12.79572

2.5

%DNA in Tail

Comet Area (px)

Tail Length (px)

Tail Area (px)

21300

Comet Length (px) 224

Comet Height (px) 133

Head Diameter (px) 150

0.330357143

6794

27.78044

Tail Moment 20.55753

Olive Moment 23.28434

288

142

28221

158

130

0.451388889

11583

31.96891

41.55958

36.31062

158

107

12116

0.392405063

5042

35.644895

22.09983

19.81921

296

149

26954

150

146

0.493243243

10927

35.662988

52.06796

39.22802

212

133

19628

128

0.396226415

7586

33.756274

28.35527

30.13016

%DNA in Tail

Comet Area (px)

Tail Length (px)

Tail Area (px)

Comet Length (px) 326

Comet Height (px) 133

27836

Head Diameter (px) 162

164

0.503067485

14533

47.921532

Tail Moment 78.59132

Olive Moment 56.10394

313

123

25009

114

199

0.635782748

16064

57.55198

114.5284

67.1161

337

127

30004

146

191

0.566765579

16865

46.699166

89.1954

65.91074

299

159

31379

178

121

0.404682274

10943

26.480308

32.04117

30.39669

366

113

31920

156

210

0.573770492

18490

50.26142

105.549

77.38334

328

129

29581

152

176

0.536585366

15729

43.542761

76.63526

60.92196

504

153

54562

180

324

0.642857143

37654

60.071391

194.6313

122.7381

400

183

46879

192

208

0.52

23621

43.362302

90.19359

66.12134

%DNA in Tail

Comet Area (px)

Tail Length (px)

Tail Area (px)

Comet Length (px) 658

Comet Height (px) 174

Head Diameter (px) 194

464

0.705167173

51897

59.167618

Tail Moment 274.5378

Olive Moment 145.5696

75017

665

216

107350

226

439

0.660150376

32791

33.793733

148.3545

88.55964

835

306

193376

390

445

0.532934132

102564

42.996955

191.3365

137.0312

491

140

43906

154

337

0.686354379

27125

50.311184

169.5487

97.7187

395

142

42802

156

239

0.605063291

27794

55.587417

132.8539

96.11745

486

181

63023

192

294

0.604938272

34200

47.928536

140.9099

91.11002

586

213

82899

242

344

0.587030717

51302

50.851917

174.9306

109.3099

%DNA in Tail

Comet Area (px)

Tail Length (px)

Tail Area (px)

109255

Comet Length (px) 797

Comet Height (px) 209

Head Diameter (px) 206

591

0.74153074

81515

66.275269

Tail Moment 391.6868

Olive Moment 191.2791

818

266

163389

274

544

0.665036675

111437

59.796578

325.2934

178.0461

799

189

102545

192

607

0.759699625

80104

71.981305

436.9265

202.9035

679

153

71346

154

525

0.773195876

56804

75.095475

394.2513

183.672

589

169

65965

212

377

0.640067912

39060

55.264753

208.3481

116.1007

514

165

75065

506

0.984435798

30839

63.73955

322.5221

132.6261

501

138

38308

120

381

0.760479042

27810

65.061301

247.8836

94.26042

4.3. Phần trăm DNA trong đuôi

Failed

(P < 0.050)

Passed (P = 0.205)

0 0 0 0 0

6 5 8 7 7

SEM 0.718 1.466 3.635 3.161 2.559

Std Dev 1.759 3.277 10.282 8.362 6.770

SS 9936.567 1493.023 11429.590

MS 2484.142 53.322

P <0.001

F 46.587

DF 4 28 32

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 12.460 Col 1 32.963 Col 2 46.986 Col 3 48.662 Col 4 65.316 Col 5 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Duncan's Method) :

p 5 4 3 2 4 3 2 3 2 2

Diff of Means 52.856 32.354 18.330 16.654 36.202 15.700 1.676 34.526 14.024 20.503

P<0.050 Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes

q 18.400 10.701 6.859 6.034 12.602 5.193 0.627 12.381 4.764 6.557

P -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

Comparisons for factor: Comparison Col 5 vs. Col 1 Col 5 vs. Col 2 Col 5 vs. Col 3 Col 5 vs. Col 4 Col 4 vs. Col 1 Col 4 vs. Col 2 Col 4 vs. Col 3 Col 3 vs. Col 1 Col 3 vs. Col 2 Col 2 vs. Col 1 Note: The P values for Dunnett's and Duncan's tests are currently unavailable except for reporting that the P's are greater or less than the critical values of .05 and .01.

Passed (P = 0.105)

Passed (P = 0.394)

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 0.192 control 0.413 0.5 0.548 5 0.626 10 0.761 20

6 5 8 7 7

0 0 0 0 0

Std Dev 0.0255 0.0621 0.0767 0.0607 0.111

SEM 0.0104 0.0278 0.0271 0.0230 0.0421

MS 0.298 0.00558

DF 4 28 32

SS 1.192 0.156 1.348

F 53.368

P <0.001

Diff of Means 0.568 0.348 0.213 0.135 0.434 0.213 0.0780 0.356 0.135 0.221

P<0.050 Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes

q 19.339 11.246 7.779 4.769 14.756 6.893 2.853 12.467 4.489 6.893

p 5 4 3 2 4 3 2 3 2 2

P -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Duncan's Method) : Comparisons for factor: Comparison 20 vs. control 20 vs. 0.5 20 vs. 5 20 vs. 10 10 vs. control 10 vs. 0.5 10 vs. 5 5 vs. control 5 vs. 0.5 0.5 vs. control Note: The P values for Dunnett's and Duncan's tests are currently unavailable except for reporting that the P's are greater or less than the critical values of .05 and .01.

Luận án Tiến sỹ Sinh học: Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

Chủ đề:

Luận văn cao học

Luận văn thạc sĩ khoa học cây trồng

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC.

Người hướng dẫn khoa học:

Hà Nội – 2016

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

Rễ

Hoa

Hình 1.1: Cây Bạch hoa xà: a. lá và thân; b. hoa; c. rễ

COOH

Reduction aldol condensatio

decarboxylation

Lưới nội chất (thực hiện bước thủy giải các hợp chất béo)

Dịch bào (hầu hết các chất phân cực)

nc

2

4 GS-SM

3 SM H+

5

1 SM

Vi thể (một vài alkaloid, protoberberine)

6

Hình 3.1. Mẫu Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy in vitro.

Hình 3.3. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA sau 4 tuần nuôi cấy.

b

a

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone theo mặt

Hình 3.15. Sắc ký đồ xác định

Hình 3.14. Sắc ký lớp mỏng

Phụ lục 1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen

1.1. Khử trùng mẫu

58.67

1.2. Môi trường tạo chồi

Số chồi trung bình

1.3. Phát triển cây từ chồi

1.4. Khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro

Phụ lục 2: Chuyển gen tạo rễ tơ

Phụ lục 3: Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp hoạt chất

plumbagin

3.1. Đường chuẩn plumbagin:

3.2. Trạng thái môi trường

3.3. Điều kiện chiếu sáng

3.4. Ảnh hưởng loại môi trường:

3.5. Khối lượng rễ ban đầu:

3.6. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ

+ Trọng lượng tươi

+ Trọng lượng khô

+ Hàm lượng plumbagin

+ Trọng lương tươi:

trong luong tuoi

Transform:

None

Sum of

Mean

F

p-value

Squares

df

Square

Value

Prob > F

Lack of Fit Tests

Sum of

Mean

F

p-value

df

Square

Value

Prob > F