Nghiên cứu thu nhận giao tử và phôi cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) một tế bào - Trần Quốc Dung

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ<br /> VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO<br /> Trần Quốc Dung<br /> Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> Cá chạch là loài cá nước ngọt. Không như các loài cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ<br /> mùa xuân cho đến mùa thu. Vì vậy, cá chạch được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển<br /> gen trong các phòng thí nghiệm. Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển<br /> thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm. Cá chạch đực và cái được<br /> phân biệt bằng cách dựa vào sự khác biệt hình thái của vây ngực. Sau khi gây kích thích bằng<br /> hormone qua đêm, trứng thành thục và tinh dịch được thu nhận từ cá bố mẹ. Thụ tinh nhân tạo<br /> được tiến hành trong đĩa Petri với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy<br /> kích thích sinh sản nhân tạo bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần vào xoang thân và thụ<br /> tinh nhân tạo bằng phương pháp thứ ba (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu quả tốt hơn.<br /> Từ khoá: Misgurnus anguillicaudatus, não thùy thể cá chép, thụ tinh nhân tạo, vi tiêm.<br /> <br /> I. Mở đầu<br /> Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) thuộc lớp Cá chạch, là cá nước ngọt. Ở<br /> nước ta, cá chạch là loài cá rất thường gặp ở các ao, hồ, kênh mương, đồng ruộng...<br /> Khác với các loài cá khác, cá chạch đẻ trứng suốt từ mùa xuân đến mùa thu. Do vậy,<br /> chúng được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để nghiên cứu chuyển gen [7, 9]. Với<br /> mục đích làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo<br /> là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm [10]. Để góp phần vào việc hoàn thiện<br /> phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào cá chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận<br /> giao tử và phôi một tế bào chuNn bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá chạch.<br /> II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> - Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) (Hình 1) sử dụng trong các thí nghiệm<br /> nghiên cứu được thu thập ở Nghĩa Ðô, Cầu Giấy, Hà Nội.<br /> - Não thùy thể cá chép do Công ty Dịch vụ và Nuôi trồng thuỷ sản trung ương<br /> (Ngọc Khánh, Ba Đình, Hà Nội) cung cấp.<br /> - Phương pháp thu nhận giao tử và thụ tinh nhân tạo được tiến hành theo Chung<br /> Lân và cs (1969):<br /> <br /> 29<br />  + Phân biệt đực, cái: Dựa vào vây ngực (Hình 2).<br /> + Chọn cá bố mẹ: chọn cá khỏe mạnh đang ở độ tuổi thành thục sinh dục.<br /> + Liều lượng tuyến yên cá chép dùng để tiêm cho cá chạch là 0,5 cái cho mỗi<br /> con cái, lượng tiêm cho cá đực bằng nửa cá cái.<br /> + Phương pháp tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm bắp thịt<br /> + Số lần tiêm: tiêm một lần và tiêm hai lần. Với cách tiêm hai lần thì lần đầu<br /> được tiêm vào buổi trưa, lần thứ hai vào hai giờ sáng để điều khiển cá đẻ lúc rạng đông.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus)<br /> + Thụ tinh nhân tạo: thụ tinh khô với 4 phương pháp khác nhau.<br /> Phương pháp 1: sau khi lấy trứng, cho tinh dịch đã lấy sẵn vào cốc nhỏ có nước<br /> muối sinh lý (lượng nước muối sinh lý gấp 10 lần tinh dịch) lắc đều, rồi tưới đều lên<br /> trứng.<br /> Phương pháp 2: đổ tinh dịch đã hòa với nước muối sinh lý vào khay thụ tinh sau<br /> đó cho trứng vào, lắc nhẹ khay thụ tinh làm cho trứng và tinh trùng sớm tiếp xúc với<br /> nhau.<br /> Phương pháp 3: vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch. Trong khi lấy trứng thì đồng<br /> thời có một số người khác lấy tinh dịch và tưới nhanh vào trứng.<br /> Phương pháp 4: lấy trứng trước, lấy tinh dịch sau. Sau khi lấy trứng, trực tiếp<br /> vuốt ngay tinh dịch của cá đực vào trứng.<br /> Bất kỳ áp dụng phương pháp nào, sau khi đã trộn lẫn tinh dịch với trứng cũng<br /> cần dùng lông gà khuấy nhẹ để thúc đNy quá trình thụ tinh.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Vây ngực cá đực Vây ngực cá cái<br /> Hình 2: Vây ngực cá chạch đực và cá chạch cái<br /> <br /> 30<br /> III. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Số lần tiêm não thùy thể cá chép<br /> Ðể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch và thụ tinh nhân tạo, cá chạch được kích<br /> thích sinh sản bằng cách tiêm não thùy thể cá chép (bảo quản trong dịch thể). Hiện nay,<br /> trong phương pháp kích thích sinh sản cá nuôi người ta có thể tiêm một lần hoặc hai lần.<br /> Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả kích thích sinh sản bằng cách tiêm<br /> một lần và tiêm hai lần để chọn ra phương pháp cho kết quả tốt, phù hợp với các điều<br /> kiện nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.<br /> Bảng 1: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng số lần tiêm não thùy thể cá chép<br /> Tiêm 1 lần Tiêm 2 lần<br /> Số cá Số cá Tỉ lệ Tỉ lệ Số cá Số cá Tỉ lệ cá Tỉ lệ<br /> Đợt thí<br /> kích cho cá cho trứng kích cho cho trứng<br /> nghiệm<br /> thích trứng trứng nở thích trứng trứng nở<br /> (con) (con) (%) (%) (con) (con) (%) (%)<br /> 1 13 5 38,46 67,00 13 7 53,84 69,00<br /> 2 8 5 62,50 65,00 8 6 75,00 72,00<br /> 3 9 6 66,66 68,00 9 9 100,00 78,00<br /> 4 16 10 62,50 72,00 16 14 87,50 85,00<br /> 5 14 7 50,00 76,00 14 10 71,42 89,00<br /> 6 12 6 50,00 80,00 12 10 83,33 91,00<br /> Trung<br /> 72 39 55,02 71,33 72 56 78,52 80,67<br /> bình<br /> Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỉ lệ đẻ trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm một<br /> lần trung bình đạt 55,02% (từ 38,46 - 66,66%) và 71,33% (từ 65,00 - 80,00%); tiêm hai<br /> lần là 78,52% (từ 53,84 - 100%) và 80,67% (từ 69,00 - 91,00%). Như vậy, tỉ lệ cho<br /> trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm hai lần đạt 142,71% và 113,09% so với tỉ lệ<br /> cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch tiêm một lần. Kết quả này cho thấy hiệu quả kích<br /> thích sinh sản cá chạch bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần cao hơn cách tiêm<br /> một lần. Như chúng ta đã biết, quá trình thành thục của trứng từ cuối giai đoạn IV<br /> chuyển sang giai đoạn V cần có một thời kỳ quá độ. Do đó, trong trường hợp sử dụng<br /> cách tiêm một lần toàn bộ lượng thuốc, nhìn chung, nhất định sẽ có ảnh hưởng không<br /> tốt, tạo nên những phản ứng sinh lý vội gấp, cơ năng sinh dục không được điều hòa, như<br /> có hiện tượng bụng cá phình lên quá nhanh, quá to làm giảm tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở.<br /> Hơn nữa, dùng cách tiêm hai lần còn có thể coi lần tiêm thứ nhất là lần sát hạch cuối<br /> cùng để lựa chọn cá bố mẹ thành thục.<br /> <br /> <br /> <br /> 31<br />  3.2. Vị trí tiêm não thùy thể cá chép<br /> Về phương pháp tiêm cá thì hiện nay có hai cách tiêm: tiêm vào xoang thân và<br /> tiêm vào bắp thịt. Kết quả kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch bằng hai phương pháp<br /> tiêm khác nhau được trình bày ở bảng 2.<br /> Bảng 2: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng các phương pháp tiêm khác nhau<br /> Tiêm vào xoang thân Tiêm vào bắp thịt<br /> Số cá Số cá Tỉ lệ Tỉ lệ Số cá Số cá Tỉ lệ Tỉ lệ<br /> Đợt thí<br /> được cho cá cho trứng được cho cá cho trứng<br /> nghiệm<br /> tiêm trứng trứng nở tiêm trứng trứng nở<br /> (con) (con) (%) (%) (con) (con) (%) (%)<br /> 1 10 7 70,00 79,00 10 6 60,00 80,00<br /> 2 6 4 66,66 85,00 6 4 66,66 82,00<br /> 3 12 8 66,66 72,00 12 5 41,66 68,00<br /> 4 8 7 87,50 70,00 8 7 87,50 65,00<br /> 5 10 8 80,00 89.00 10 7 70,00 85,00<br /> 6 8 6 75,00 84,00 8 5 62,50 80,00<br /> Trung<br /> 54 40 74,30 79,83 54 34 64,72 76,67<br /> bình<br /> Bảng 2 cho thấy tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thùy<br /> thể cá chép bằng phương pháp tiêm vào xoang thân là 74,30% (từ 66,66 - 87,50%) và<br /> 79,83% (từ 70,00 - 89,00%); của cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép bằng phương<br /> pháp tiêm bắp thịt tương ứng là 64,72% (từ 41,66 - 87,50%) và 76,67% (từ 65,00 -<br /> 85,00%). Như vậy, tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thủy thể cá<br /> chép vào xoang thân đạt 117,64% và 104,13% so với cá chạch được tiêm não thùy thể<br /> cá chép vào bắp thịt. Kết quả này cho thấy kích thích sinh sản cá chạch bằng phương<br /> pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả tương đối chắc chắn hơn phương pháp tiêm vào<br /> bắp thịt.<br /> 3.3. Phương pháp thụ tinh nhân tạo<br /> Bảng 3: Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các phương pháp thụ tinh khác nhau<br /> Phương pháp Đợt Số trứng thụ Số trứng nở Tỉ lệ nở<br /> thụ tinh thí nghiệm tinh (cái) (cái) (%)<br /> 1 100 76 76,00<br /> 2 100 68 68,00<br /> Phương pháp 1 3 100 71 71,00<br /> 4 100 65 65,00<br /> 5 100 82 82,00<br /> ∑ = 500 ∑ = 362 x = 72,40<br /> <br /> 32<br />  1 100 69 69,00<br /> 2 100 72 72,00<br /> Phương pháp 2 3 100 78 78,00<br /> 4 100 64 64,00<br /> 5 100 75 75,00<br /> ∑ = 500 ∑ = 358 x = 71,60<br /> 1 100 86 86,00<br /> 2 100 92 92,00<br /> Phương pháp 3 3 100 72 72,00<br /> 4 100 80 80,00<br /> 5 100 78 78,00<br /> ∑ = 500 ∑ = 408 x = 81,60<br /> 1 100 83 83,00<br /> 2 100 69 69,00<br /> Phương pháp 4 3 100 74 74,00<br /> 4 100 78 78,00<br /> 5 100 75 75,00<br /> ∑ = 500 ∑ = 379 x = 75,80<br /> Trứng và tinh dịch được thu nhận vào đầu chu kỳ sáng để tiến hành thụ tinh<br /> nhân tạo với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các<br /> phương pháp khác nhau được trình bày ở bảng 3.<br /> Nhìn vào bảng 3 ta thấy các phương pháp thụ tinh nhân tạo 1, 2, 3 và 4 cho tỉ lệ nở<br /> lần lượt là 72,40%; 71,60%; 81,60% và 75,80%. Như vậy, phương pháp thụ tinh thứ 3<br /> cho tỉ lệ nở cao nhất. Trong hai phương pháp thụ tinh 1 và 2 đều lấy tinh trùng trước, thời<br /> gian tiến hành thụ tinh dài. Ở phương pháp thụ tinh 4 lấy trứng trước và vuốt ngay tinh<br /> dịch của cá đực vào trứng nên có thể giảm bớt thời gian lấy tinh dịch. Trong khi đó, đối<br /> với phương pháp thụ tinh 3, vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch, do đó, thời gian thụ tinh là<br /> ngắn nhất. Mặt khác, các thí nghiệm này được tiến hành vào mùa nóng (tháng 5, 6, 7) nên<br /> trứng sau khi ra khỏi cơ thể mẹ mất khả năng thụ tinh rất nhanh. Thời gian thụ tinh càng<br /> dài tỉ lệ trứng mất khả năng thụ tinh càng lớn do đó tỉ lệ nở càng giảm. Tóm lại, trong 4<br /> phương pháp thụ tinh nhân tạo nói trên, phương pháp thứ 3 cho hiệu suất cao nhất.<br /> IV. Kết kuận<br /> - Kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng<br /> phương pháp tiêm não thùy thể cá chép hai lần cho hiệu quả cao hơn tiêm một lần và<br /> phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả cao hơn tiêm vào bắp thịt.<br /> - Trong các phương pháp thụ tinh nhân tạo, phương pháp 3 (vừa lấy trứng vừa<br /> lấy tinh dịch) cho hiệu quả thu nhận phôi cá chạch một tế bào cao nhất.<br /> <br /> 33<br />  TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 1. Nguyễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Quyền<br /> Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người, Kỷ yếu<br /> Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9-10/12/1999. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà<br /> Nội, (1999), 1429-1437.<br /> 2. Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch<br /> (Misgurnus anguillicaudatus) bằng vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học<br /> Sư phạm Hà Nội, 2001.<br /> 3. Trần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng<br /> Hữu Lanh, Tinh sạch và đánh giá sơ bộ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào<br /> cá vàng và cá chạch, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, Số 2, (1999), 39-44.<br /> 4. Trần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu<br /> Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh<br /> trưởng người, Tạp chí Sinh học, 21(3) (1999), 24-28.<br /> 5. Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quốc Dung, Kết<br /> quả nghiên cứu khử màng chorion của phôi giai đoạn một tế bào chu#n bị cho kỹ thuật<br /> vi tiêm vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học,<br /> Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272.<br /> 6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some<br /> results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth<br /> hormone (MThGH) gene microinjection, Proceedings, third Asian Symposium of<br /> Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12/1997, (1997), 108-114.<br /> 7. Chung Lân, Lý Hữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương<br /> (Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh<br /> vật học và sinh sản nhân tạo các loài cá nuôi, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội,<br /> 1969.<br /> 8. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to<br /> Biotechnological Applications, Published by Singer, The Netherlandsm, 2007.<br /> 9. Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu<br /> nhận giao tử và phôi một tế bào chu#n bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá vàng<br /> Carassius auratus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ XXXII, 2 (1994), 6-11.<br /> 10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: Method and mechanism,<br /> Transgenic fish, World Scientific, (1993), 93-119.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 34<br />  THE COLLETION OF GAMETES AND MONOCELLULAR<br /> EMBRYOS OF LOACH (Misgurnus anguillicaudatus)<br /> Tran Quoc Dung<br /> College of Pedagogy, Hue University<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Loach is a fresh water fish species. Unlike other fish species, loach spawns from spring<br /> to fall. It has been used in the laboratory for the study of transgenesis. In order to control the<br /> time course of gene introduction into developing fish embryo, artificial fertilzation is required.<br /> Females and males are identified by the morphology of the pectoral fin. After an overnight<br /> hormonal induction, the mature eggs and milt were striped from parent fish. About one hundred<br /> eggs were collected in Pestri dish and mixed with 100 µl milt. The outcomes show that fish<br /> injected intraperitoneally two times by carp pituitary with the third artificial fertilization way<br /> (collect eggs and milt at the same time) are better.<br /> Keywords: Misgurnus anguillicaudatus, carp pituitary, artificial fertilization,<br /> microinjection.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 35<br />