Nghiên cứu tổng hợp L-Dopa làm thuốc điều trị Parkinson

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

L-dopa (3,4 -dihydrophenyl-L-alanin) là thuốc chủ yếu được dùng trong điều trị bệnh Parkinson. Nhu cầu sử dụng L-dopa trong nước hiện nay khá cao. Tuy nhiên, L-dopa vẫn nằm trong nhóm thuốc chưa được nghiên cứu tổng hợp, sản xuất trong nước. Đề tài tổng hợp Lđopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo Dược điển Anh 2009.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tổng hợp L-Dopa làm thuốc điều trị Parkinson

NGHIÊN CỨU TỎNG HỢP L-DOPA LÀM THUỐC ĐĨÈU TRỊ PARKINSON Đ S . Vũ B ứ c H oàn*; ThS. Phạm T h ị Hiền* H ư ớng dẫn: PGS. TS. T hái N guyễn H ùn g T hu* T Ó M TẲ T Ldopa (3,4dihyđrophenylLalanin) là thuốc chủ yếu được dùng trong điều trị bệnh Parkinson. Nhu cầu sử dụng Ldopa trong nước hiện nay khá cao. Tuy nhiên, Ldopa vẫn nằm trong nhóm thuốc chưa được nghiên cứu tổng hợp, sản xuât trong nước. Mục tiêu nghiên cứu: tổng hợp Lđopa từ Ltyrosin đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo Dược điển Anh 2009. Nguyên liệu và phưong pháp nghiên cứu: Nguyên liệu: Ltyrosin là sản phẩm của quá tr nh thủy phân các nguồn keratin khác nhau (lông, sừng, tóc, móng.. Phư ng pháp nghiên cứu: Từ Ltyrosin quá trinh tổng hợp Lđopa bao gồm 4 bước: Ester hóa Ltyrosin (2) thu được Ltyrosin methyỉ ester (9), acyl hóa (9) trong pyridin thu được 0,NdiacylLtyrosin methyl ester (10), thực hiện phản ứng chuyền vị (10) với xúc tác AIC13 trong nitrobenzen thu được (3acetyl4hydroxyphenyl)Nacety Lalanin (11), thực hiện phản ứng oxy hóa và thủy phân (11) thu được Ldopa. Độ tinh khiết và cẩu trúc sản phẩm được kiểm tra bằng nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp đo phổ (IR, MS, 1H NMR). Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp thành công Ldopa từ Ltyrosin có hàm lượng đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 (99,4% trong khoàng giới hạn hàm lượng từ 99 đến 101% của BP 2009). cấu tĩY.c và độ tinh khiết của các đẫn chất trung gian và sản phẩm đã được chứng minh bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ IR, ‘HNMR, MS. Kết luận: Ldopa đã được tổng hợp thành công từ Ltyrosin. Các phản ứng tổng hợp sử đụng những hóa chất ỉhông đụng, điều kiện thực hiện phản ứng không quá phức tạp, phù hợp với điều kiện Việt Nam. V vậy, việc ứng dụng vào sản xuất của nghiên cửu này có tính khả thi ở Việt Nam. * Từ khóa: 3,4dihyđroxyphenylLalanin; Ldopa; levođopa; Ltyrosin; Parkinson. Reearch on preparation o f L -d o p a fo r treatm ent o f P arkison’s disease Summary LDOPA (3,4dihydroxyphenylLalanine) is an effective therapeutic agent in the treatment of Parkinson’s disease. The requirement of LDOPA is very high. But there is neither Vietnamese pharmaceutical factory nor other studies on synthesizing it in Vietnam.. Objective The aim of this study is to synthesize LDOPA which product’s content is within the recommended range of BP 2009 from Ltyrosine. Materials and methods: Material synthesizing of LĐOPA is Ltyrosine, a product obtained from hydrolysis of different sources of keratin (nail, hair, horn...). Process for synthesizing LDOPA from Ltyrosine involves 4 steps: (i) Esterification of Ltyrosine to produce L tyrosine methyl ester (2); (ii) Acylation of 2 in pyridin gave 0,NdiacetylL“tyrosine methyl ester (3); (iii) Arrangement reaction of 3, catalysts AỈCI3 to produce B(3acetyl4hydroxyphenyl)NacetylLalanine (4); (iv) Oxidation and hydrolysis 4 afforded LDOPA. The structure of the intermediate derivatives and LDOPA were confirmed by IR, lH NMR, MS spectroscopy. Results: In this study, LDOPA has been successfully synthesized from Ltyrosine, the product’s content is 99.4% (within the requirement range of BP 2009 from 99.0 to 101.0%). The structure of the intermediate derivatives and LDOPA were confirmed by IR, ‘HNMR, MS. * Đại học Dược H à Nội 745
Conclusion: LDOPA have been synthesized from Llyrosine. These reactions used the common chemical substance. The condition of reaction was not complex, which is suitable for reality in Vietnam. Thus, the application this study on manufacturing in Vietnam is very feasible. * Key words: 3,4dihydroxyphenylLaIanin; Ldopa; levodopa; Ltyrosin; Parkinson’s disease. ỉ. Đ Ặ T VẨN ĐẺ Bệnh Parkinson là bệnh lý thoái hóa thần kinh trung ương thường gặp ở bệnh nhân > 60 tuổi. Bệnh gây ra do sự mất các nơron trong chất đen ở thân não, các nơron này chứa các chất dẫn truyền thần kinh là dopamin. Nguyên nhân: độc chất, môi trường... Lđopa là tiền chất được chuyển hóa thành dopamin nhờ enzym dopadecarboxylase. Ở Việt Nam, Lđopa vẫn được coi là thuốc chủ chốt trong điều trị Parkinson. Do đó, nhu cầu sử dụng Ldopa rất cao. Tuy nhiên, các doanh nghiệp trong nước vẫn chưa thể sản xuất được L dopa. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp Ldopa từ Ltyrosin (một sản phẩm thu được từ quá tr nh thủy phân các nguồn keratin khác nhau: sừng, tóc, m óng.. .)• Đó ỉà nguồn nguyên liệu có sin ở Việt Nam. II. NGUYÊN L IỆ U VÀ PH Ư Ơ N G PH Á P NG H IÊN c ứ u 2.1. Nguyên liệu Ltyrosin ỉà sản phẩm của quá tr nh thủy phân các nguồn keratin khác nhau (lông, sừng, tóc, m óng...). H a chất: Aceton, acid hydrocloric, acid sunfuric, ethanol tuyệt đối, ether dầu hỏa, ethyl acetat, methanol, natri hydroxiđ, ninhyđrin, pyridin (tinh khiết hóa học Trung Quốc), anhydriđ acetic, hydro peroxiđ, natri carbonat khan, nhôm clorid khan, nitrobenzen (MerckĐức), giấy chi thị màu, nước cất (Tiêu chuẩn cơ sở 'Việt Nam). 2.2. P h ươ ng p h á p nghiên cứu Tổng hợp Ldopa từ Ltyrorin qua 4 giai đoạn như sơ đồ sau [1 ,2, 5]: .C O O H COOMe COOMe A cjO / pyridin NH2 * NH Ac l(MOcCMh AcO (ỈO) AiCIj/nitrobenzen 100 125cC/46h COOH COOH COOH H ,0 ,/N a 0 H HCi/CHjCOOH NHAc HO COM e Sử đụng các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tinh chế và thu lấy các chất trung gian và sản phẩm. Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi nbutanol: acid acetic: nước ss 9:2:2,5). Xác định cấu ưúc các chất trung gian và sản phẩm bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) đượe ghi trên máy Perkin Elm er (Mỹ). Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy máy A gilent 6310 Ion Trap (Đức). Phổ khối lượng phân giải cao được ghi trên máy FTICRMSVarian 910M S (Đức). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1HNMR) được ghi trên máy được ghi ứên máy Bruker AV500 (Mỹ). Kiểm tra hàm lượng Ldopa theo tiêu chuẩn D ư ợ c điển Anh 2009. III. K Ế T Q UẢ Tổng hợp L-dopa từL rtyrosỉn Tổng hợp L-tyrosin m ethyl ester (9) Thực hiện phản ứng ester hóa với 15g (0,083mol) Ltyrosin với 400ml methanol, xúc tác acid H 2S 04 đặc. Hỗn hợp phản ứng được hồi lưu trong 12h. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Phản ứng két thóc, hôn họp phản ửng được làm m át ở nhiệt độ phòng, c ấ t thu hồi dung môi. Phần còn lại được hòa tan 746
trong nước, điều chỉnh pH về 8 9 bằng dung dịch N a2C 03 bão hòa, xuất hiện tủa. Lọc thu được tủa thô 9. Tinh chế tủa thô 9: hòa tan trong dung dịch HC1 IM , làm lạnh và điều chỉnh pH=89 bằng dung dịch N a2C 03 bão hòa, xuấỉ hiện tủa. Lọc, rửa sản phẩm thu được 10,86g (2) H 67,2% . Sản phẩm: Nhiệt độ nóng chảy 134"136oC, Rf=0,45, IR (KBr, cm1): 3208 (NH2), 31003010 (~CH thơm), 2833 (H3C), 1731 (C = 0 ester). Tổng hợp ỡ , N -diac tyl-L-tyrosin m thyl ester (10) Lấy 18,0ml pyridin cho vào b nh cầu 2 cổ dung tích lOOml. Nghiền nhỏ 5,85g 9 (30,0 mmol) cho vào dung môi đã chuẩn bị ở trên. Sau đó nhỏ từ từ 8,5ml anhydrid acetic (90,0 mmol) vào hỗn hợp trên cho đến khi nguyên liệu 9 tan hết sao cho nhiệt độ không quá 25oC. Khuấy tiếp khối phản ứng ở nhiệt độ này trong 5 giờ. Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn họp phản ứng 100,Oml ethyl acetat. Khuấy rồi chiết vói dung dịch HC1 IM (3 lần, mỗi lần 70,0ml) để loại pyr din. Cuối cùng, rửa bằng nước thu được pha hữu cơ chứa sản phẩm. Làm khan bằng 10,Og natri sulfat khan. Sau đó, cất thu hồi đung môi đến khi thu được dạng siro. Thêm lOml ethylacetat và khuấy cho tan hoàn toàn, sau đó thêm ÍOml ether dầu hỏa, khuấy thu được kết tủa. Lọc, sấy thu được 6,2g tủa thô 10. Tủa thô 10 được tinh chế như sau: Hòa tan hoàn toàn 6,2g tủa thô 10 trong 50ml ethanol 50% sôi, khuấy 15 phứt, sau đó làm lạnh. Để kết tinh lạnh qua đêm, xuất hiện tinh thể màu trắng. Lọc, sấy tới khối lượng không đổi thu được 4,2g 10 tinh khiết. Sản phẩm 10: Nhiệt độ nóng chày 105107oC, R f = 0,88, IR (KBr, cm1): 3256 (~ NH amid), 1745 (0 = 0 ester), 1633 ( 0 0 amidx 1558 ( O C thơm), ESI MS (m/z): 301,6 C[M+Na]+). Tồng hợpjì-(3-acetyl~4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin Cho vào b nh cầu 1 cổ, dung tích 100ml: 3,0g (10,75 mmol) nguyên liệu 10 và 36,0ml nitrobenzen. Khuấy cho tan hết. Sau đó, thêm vào b nh cầu 3,6g (26,96 mmol) A1CỈ3 khan, hỗn hợp được đun trong khoảng 4h ở nhiệt độ 100I30oC. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh, thêm 60,0ml nước đá. Khuấy trong 15 phút tạo hỗn dịch. Thêm tiếp 6,0mỉ HC1 đặc. Khuấy trong 30 phút. Chiết hỗn hợp 2 lần bằng ethy acetat (lần 1 với 100,0ml, lần 2 với 70,0mỊ). Thu lấy dịch chiết pha hữu cơ. Chiết pha hữu cơ b ằ n g NaOH 2N hai lần (lần 1 ll,O m l, lần 2 3,0ml). Thu lấy dịch chiết pha nước. Loại nitrobenzen còn lẫn trong pha nước bằng 30,0 ethyl acetat. Sau đó pha nước được làm lạnh về 5oC và được điều chỉnh về pH 1 bằng HCI đậc. Đê lạnh 2h, 11 bắt đầu kết tinh. Lọc, rửa với nước lạnh thu được tủa ỉ 1. sấ y khô tủa thu được l,25 g họp chất 1i. Hiệu suất 43,87%. Sản phẩm 11: nhiệt độ nóng chảy 146148oC, Rf = 0.61; ĨR (KBr, cm1): 3355 (~NHamid), 1726 (~c= 0 ester), 1641 (~c = 0 amid), 1554 (C=C thơm), ESIMS (m/z): 263,9 ([MH]). 1HNMR (500 MHz, DMSO) 5 (ppm): 11,82 (1H, s, HO), 8,19 (1H, d (J = 8,0), HN), 7,75 (1H, d (J = 2,0); HC2’), 7,39 (1H ; dd (J = 8,0, 2,0), HC6'), 6,87 (1H, d (J = 7, 5), HC5’), 4,39 (IH , m, HC COOH), 3,02 (1H, dd (J = 13,5, 4,5), HbC3), 2,82 (1H, m, Ha~C3), 2,62 (3H, s, H3CCOAr), 1,78 (3H, s, H3CCONH). Tổng họp L-dopa Hòa tan l,5g (5,66 mmol) nguyên liệu 11 írong 13,0ml đung dịch NaOH IN . Thêm từ tự đung dịch H 20 2 7,1%. Phản ứng được duy tr ờ nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Hỗn họp phản ứng được acid hóa bằng 2,16mỉ dđ HC1 IN , sau đó được cất đến kiệt. Chất rắn được hoà tan với aceton nóng, phần muối vô cơ không tan được lọc qua phễu lọc thủy tinh. Dịch lọc được cất đến kiệt một lần nữa thu được tủa thô 12. Hợp chất 12 được hòa tan trong 12,0ml hỗn hợp HC1 đặc và acid acetic băng với tỷ lệ thể tích CH3COOH băng/HCi đặc = 2/1. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở 118oC trong vòng 2 giờ. c ấ t loại bỏ bớt acid và thêm 10 phần nước sôi. Dung dịch được thêm 0 ,lg Na2S203 và 0,3g than hoạt để tẩy màu trong vòng 30 phút. Lọc loại bò than hoạt, dịch lọc được làm lạnh ở OoC và đưa về pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu được 1. Tủa thô 1 được iọc và rửa sạch với nước lạnh, sau đó với aceton. Sản phẩm được sấy khô trong chân không đến nhiệt độ không đổi. ^ Tinh chế sản phẩm: tủa thô được hòa tan trong acid HCI 32%, sau đó hỗn họp được làm nóng và tẩy màu băng lg than hoạt. Lọc nóng, ỉàm lạnh dịch lọc về 5oC rồi điều chỉnh pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu được 0,9g 1. Hiệu suất 80,6% 747
Ldopa: nhiệt độ nóng chảy 275276oC, R f = 0,45, IR (KBr, cm1): dải hấp thụ 36003000 (phenolOH và NH2), 3076 (CH thơm), 1730 (C = 0 aciđ), 1570 (C=C thơm), 1254 (CO phenol); ESIMS (m/z): 198 ([M+H]+); Công thức phân tử: C 9H Í1N 04 . Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton: 1HNMR (500MHz, D 20 + C F 3C 0 0 D ); 5 (ppm): 6,65 (1H, d (J = 8,0), HC5'), 6,57 (1H, d (J = 1,5), HC2'), 6,49 (1H, đd (J = 8,0, 1,5), HC6’), 4,04 (1H, dd (J = 7,0, 5,5), H C2), 3,00 (ỈH , dđ (J = 14,5, 5,0), HbC3), 2,87 (1H, dd (J = 14,5,11,5) HaC3). Giá ưị 5 (ppm) của đồng phân Ddopa trên phổ 1H NMR [3]: 6,99 (d, J = 8,0), 6,93 (s), 6,83 (d, J =5 8,0), 4,43 (đđ, J = 7,2, 5,6), 3,32 (dd, J = 14,4, 5,6) and 3,20 (đd, J = 1 4 ,4 , 7,2). T ừ các dữ liệu thu được sau khi phân tích phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể khẳng định sản phẩm thu được là LD hay (S)2amino3(3,4dihydroxyphenyỉ)propanoic. Kiểm tra L-dopa đạt tiêu chu ẩn D ược M n A n h 2009 Kết quả: hàm ỉượng Lđopa đạt 99,4% (đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 từ 99,0101,0%), IV . BÀN LUẬN Phản ứng tổng hợp điacyl từ Ltyrosin methyl ester: Khi tỷ lệ mol anhyđrid acetic: Ltyrosin methyl ester tăng th hiệu suất phản ứng tăng. Nguyên nhân có thể ià đo: phản ửng diacyl nên tỷ lệ mol tối thiểu là 2/1, khi tăng tỷ lệ mol lên 2,25/1 th hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống. Tăng tiếp tỷ lệ này, hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể. Phản ứng tổng hợp 11 từ nguyên liệu điacyl: Phản ứng được xúc tác bởi lượng thừa acid Lewis (AỈC13), do có sự h nh thành phức với cả nguyên liệu và sản phẩm. Một trong những điều kiện để acid Lewis phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dưới điều kiện khan nước. Sự hiện diện của một lượng nhỏ nước làm ngưng phản ứng do acid Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức VỚ nước và bị phân hủy. V vậy, phản ứng cần được thực hiện trong dung môi hữu cơ khan nước, dung môi sử đụng là nitrobenzen, xúc tác A1C13 khan, hóa chất và thiết bị cần được làm khô trước khi phản ứng [4]. Trong các nghiên cứu về phản ứng thủy phân 12 đến 1, các tác giả đều sử dụng tác nhân là HBr 48%. Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân này th phản ứng xảy ra mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gấy ra khó khăn khi tinh chế sản phâm. V vậy chúng tôi đã thay thế HBr bằng hỗn hợp acid với tỷ ỉệ thể tích HC1 đặc: acid acetic băng (1 :2 ) th phản ứng xảy ra tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế. V. K Ế T LUẬN Chúng tôi đã xây dựng được quy tr nh tổng hợp Ldopa từ Ltyrosin đạt tiêu chuẩn về định tính và định ượng theo Dược điển Anh 2009. Hiệu suất chung của cả quy tr nh đạt khoảng 18,37%, trong đó phản ứng chuyển vị Fries để tổng hợp 4 có hiệu suất thấp nhất (50,7%). Quá tr nh phản ứng không có sự racemic hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tội đã tổng hợp được Ldopa từ Ltyrosin. Quá tr nh tổng hợp Lđopa gồm các giai đoạn: Ester hóa Ltyrosin với methanol thu được Ltyrosin methyl ester (9); Acyl hóa 2 trong pyridin thu được 0,N diacetylLtyrosin methyl ester (10); Thực hiện phản ứng chuyển vị 10 với xúc tác AIC13 thu được (3acetyMhyđroxyphenyỊ)~NacetyIL~alanin ( ỉl ) ; oxy hóa và thủy phân 11 thu được Ldopa. c ẩ u trúc của sản phẩm và các chât trung gian được khẳng định bằng các phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng íừ hạt nhân 1HNMR. Ldopa tổng hộfp được có hàm lượng 99,4% (đạt tiêu chuẩn Dược điền Anh 2009). T À I L IỆU TH A M K H Ả O 1. Bernardi L., Golfredo o . (1973), Proccss for the preparation of Ldopa., The Unites States Patent and Trademark Office, US 3717673. 2. Brađy w . T. (1957), The synthesis of OmethylNacetylLtyrosine, California Institute of Technology. 3. Chen F. Y., Uang B. J. (2001), "Enantioselective Synthesis of (R)3(3, 4Dihydroxypheny ) alanine from tert Butyl Glycinate", The Journal of Organic Chemistry, 66(10), pp. 36503652. 4. Ogata Y. Tabuchi H. (1964), "A study on the mechanism of Fries reaction", Tetrahedron, 20(7), pp. 16611666. 5. Wolcke u ., Bretschneider H. HohenloheOehringen K„ Kaiser A., (1973), "Eine neue Synthese des 3[3,4~ Dihydroxyphenyl]Lalanins (LDOPA) aus LTyrosin”, Helvetica chimica acta, 56(8), pp. 28572860. 748