Nghiên cứu trình tự một số gen độc lực của yersinia pestis và phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định Yersinia pestis gây bệnh ở Việt Nam

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA<br /> YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR<br /> XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM<br /> Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An**<br /> Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt***<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trên<br /> hai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập<br /> ở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y. pestis gây bệnh.<br /> Vật liệu và phương pháp: chủng Y. pestis Yp1 có đầy đủ độc lực được lưu giữ tại “Ngân hàng<br /> Chủng và Gen” của Học viện Quân y. Toàn bộ chiều dài gen ypo2088, pla và caf1 sau khi<br /> khuếch đại chính xác được tách dòng và phân tích trình tự. Từ kết quả phân tích trình tự kết<br /> hợp với trình tự các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen, 3 cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/R<br /> và caf1F/R đã thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng trong phản ứng PCR đa<br /> mồi xác định VK dịch hạch gây bệnh. Kết quả và kết luận: tách dòng và phân tích trình tự đầy<br /> đủ 3 gen là ypo2088, pla và caf1 của chủng VK Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam. Xác định<br /> được 1 đột biến sai nghĩa trên gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương đồng 100% khi so<br /> sánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900). Kết quả một lần nữa chứng minh, trình tự gen<br /> ypo2088, pla và caf1 rất ổn định, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y. pestis.<br /> Trình tự đầy đủ 3 gen này đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số lần lượt là<br /> KM880027, KM880025 và KM880026. Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếch<br /> đại đồng thời 3 gen đích xác định chính xác VK dịch hạch gây bệnh.<br /> *<br /> <br /> Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis.<br /> <br /> Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of Yersinia<br /> Pestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection of<br /> Pathogenic Yersinia Pestis in Vietnam<br /> Summary<br /> Objectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome),<br /> pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersinia<br /> pestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid and<br /> accurate detection of pathogenic Y. pestis. Materials and methods: Y. pestis strain Yp1 with full<br /> virulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University. Total DNA<br /> was extracted from culture media following autoclaved inactivation. Subsequently, full-length ypo2088,<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> *** Đại học Khoa học tự nhiên<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015<br /> <br /> 57<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR. The purified PCR products were<br /> cloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced from<br /> both ends. According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank,<br /> three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCR<br /> assay for detection of pathogenic Y. pestis. Results and conclusions: One missense mutation<br /> was identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence to<br /> the reference sequences of Y. pestis Angola (accession number KP000900). These results again<br /> demonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significant<br /> difference among Y. pestis strains. The complete sequences of these genes were submitted to<br /> Genbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively. A multiplex<br /> PCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid and<br /> accurate detection of pathogenic Y. pestis.<br /> *<br /> <br /> Key words: Caf1 (capsule fraction 1 gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene);<br /> Yersinia pestis.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Y. pestis là VK Gram âm, không sinh bào<br /> tử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae.<br /> Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, chỉ có<br /> ba loài gây bệnh ở người là Y. pestis,<br /> Y. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica.<br /> Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh<br /> dịch hạch và viêm phổi cấp tính phân biệt<br /> với hai loài còn lại [8, 10]. Tiềm năng hủy<br /> diệt của dịch hạch đã được chứng minh<br /> qua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong trong<br /> lịch sử, dẫn đầu danh sách các bệnh<br /> truyền nhiễm nguy hiểm. Theo Tổ chức Y<br /> tế Thế giới, từ 1989 đến 2003, thế giới đã<br /> ghi nhận 38.310 ca nhiễm và 2.845 ca tử<br /> vong, tập trung chủ yếu ở châu Phi và<br /> châu Á - nơi thiếu hoặc chưa đáp ứng<br /> đầy đủ của hệ thống giám sát, các cơ sở<br /> chẩn đoán hay báo cáo dịch [5]. Đặc biệt,<br /> những năm gần đây, mối quan tâm đối<br /> với VK dịch hạch được đặt ở mức cao, do<br /> khả năng sử dụng Y. pestis như một loại<br /> vũ khí sinh học [8].<br /> Trên thế giới, toàn bộ hệ gen của<br /> một số chủng chuẩn như Y. pestis KIM5<br /> 58<br /> <br /> (thuộc về biovar Mediaevalis), CO92 (chủng<br /> biovar Orientalis) đã được giải trình tự,<br /> tạo thuận lợi cho nghiên cứu, xác định<br /> Y. pestis [9]. Genome của Y. pestis<br /> (chủng CO92) bao gồm một “NST” 4,65<br /> Mb và ba plasmid lần lượt là pLcr, pPCP1<br /> và pMT1. Ngoài các sản phẩm do hệ gen<br /> trên NST, yếu tố độc lực của Y. pestis là<br /> do gen trên các plasmid này đảm nhiệm.<br /> Trong đó, pPCP1 và pMT1 là 2 plasmid<br /> được xác định chỉ có riêng ở Y. pestis [8].<br /> pPCP1 (kích thước 9,6 kb), có gen quan<br /> trọng là pla mã hóa chất hoạt hóa<br /> plasminogen Pla, đóng vai trò quan trọng<br /> đối với khả năng xâm nhập của Y. pestis<br /> vào cơ thể qua da [4]. Plasmid còn lại<br /> là pMT1 có kích thước tương đối lớn<br /> (110 kb) tiêu biểu với các gen mã hóa<br /> cho kháng nguyên vỏ F1, gen biểu hiện<br /> phospholipase D (PID), cả hai đều có vai<br /> trò trong lây lan dịch hạch [8].<br /> Ở Việt Nam, bệnh dịch hạch còn xuất<br /> hiện rải rác ở khu vực Tây Nguyên như<br /> Gia Lai, ĐắK Lắk [5]. Nghiên cứu về<br /> Y. pestis cũng như bệnh dịch hạch chủ<br /> yếu tập trung về dịch tễ học, thống kê,<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> giám sát bệnh trên cơ sở các vùng sinh<br /> thái. Những kết quả nghiên cứu về phân<br /> tử VK dịch hạch còn hạn chế và đơn lẻ<br /> trên một số gen đích [1, 5]. Nghiên cứu<br /> này tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen<br /> đặc trưng trên NST - ypo2088 và gen độc<br /> lực trên plasmid pPCP1, pMT1 tương<br /> ứng là pla và caf1 của chủng Y. pestis<br /> Yp1 phân lập ở Việt Nam. Đồng thời,<br /> nhóm tác giả đã phát triển kỹ thuật PCR<br /> đa mồi (multiplex PCR - mPCR) sử dụng<br /> 3 gen đích này để xác định chính xác VK<br /> dịch hạch có độc lực trong tự nhiên.<br /> Nghiên cứu đã góp phần làm phong phú<br /> thêm những kết quả về đa dạng di truyền<br /> các gen độc lực của VK dịch hạch cũng<br /> như cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu<br /> cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác<br /> Y. pestis có độc lực.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Chủng vi khuẩn.<br /> Chủng Y. pestis Yp1 có độc lực và<br /> chủng đối chứng âm E. coli ATCC 25922<br /> do Ngân hàng Chủng và Gen của Học<br /> viện Quân y cung cấp, xác định đặc điểm<br /> <br /> hình thể, tính chất sinh vật hóa học bằng<br /> card định danh GN46 (Vitek 2 - BioMérieux)<br /> và thử nghiệm độc lực trên chuột nhắt<br /> trắng để khảo sát khả năng gây chết<br /> hàng loạt.<br /> 2. Tách chiết ADN và PCR.<br /> Chủng VK được bất hoạt ở điều kiện<br /> 121oC/20 phút, sau đó tách ADN tổng số<br /> theo quy trình của nhà sản xuất (ADN<br /> genome QIAGen minikit). Thiết kế các<br /> cặp mồi tách dòng dựa trên trình tự gen<br /> ypo2088, pla và caf1 trên Ngân hàng Gen<br /> và được tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Sử dụng<br /> sinh phẩm Phusion High-Fidelity ADN<br /> polymerase (Thermo scientific) để phân<br /> lập gen đích với chu trình nhiệt, nhiệt độ<br /> gắn mồi TaoC và thời gian kéo dài chuỗi<br /> như sau: biến tính 98oC trong 30 giây,<br /> khuếch đại 30 - 32 chu kỳ (98oC, 8 giây;<br /> TaoC, 20 giây; 72oC, 30 - 35 giây), sau đó<br /> hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72º trong<br /> 6 phút. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi<br /> Ta oC và thời gian kéo dài chuỗi phụ<br /> thuộc vào trình tự mồi và kích thước<br /> sản phẩm.<br /> <br /> Bảng 1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu.<br /> TÊN MỒI<br /> <br /> MỤC ĐÍCH<br /> <br /> TRÌNH TỰ (5’-3’)<br /> <br /> NHIỆT ĐỘ GẮN<br /> KÍCH<br /> MỒI (Ta: oC) THƯỚC (bp)<br /> <br /> PCR/giải<br /> trình tự<br /> ypo2088F/BamHI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> GGGATCCGTGATGATTAAGTTCATGCT<br /> <br /> 52<br /> <br /> 719<br /> <br /> PCR/giải<br /> trình tự<br /> <br /> CCTCGAGGTCTGTATTGCTGAGAAAAG<br /> <br /> 52<br /> <br /> 719<br /> <br /> plaF/EcoRI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> CGAATTCGCAGAGAGATTAAGGGTGT<br /> <br /> 57<br /> <br /> 1019<br /> <br /> plaR/XhoI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> ACTCGAGTTCCACAGACATCCTCCC<br /> <br /> 57<br /> <br /> 1019<br /> <br /> caf1F/BamHI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> AGGATCCGGACACAAGCCCTCTCTAC<br /> <br /> 60<br /> <br /> 654<br /> <br /> ypo2088R/XhoI<br /> <br /> 59<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> caf1R/XhoI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> TCTCGAGCGAGGGTTAGGCTCAAAGT<br /> <br /> 60<br /> <br /> 654<br /> <br /> pJET1.2_F<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC<br /> <br /> 58<br /> <br /> -<br /> <br /> pJET1.2_R<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG<br /> <br /> 58<br /> <br /> -<br /> <br /> GGATGAGATAACGCGGGTGT-F<br /> <br /> 56<br /> <br /> 103<br /> <br /> 56<br /> <br /> 438<br /> <br /> 56<br /> <br /> 271<br /> <br /> mPCR<br /> ypoF1/R1<br /> <br /> mPCR<br /> <br /> AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R<br /> plaF1/R1<br /> <br /> mPCR<br /> <br /> CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F<br /> ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R<br /> <br /> cafF1/R1<br /> <br /> mPCR<br /> <br /> CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F<br /> GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R<br /> <br /> 3. Tách dòng và giải trình tự gen.<br /> <br /> 4. Multiplex PCR.<br /> <br /> Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm<br /> <br /> Tham khảo trình tự các gen ypo2088,<br /> <br /> PCR tinh sạch của 3 gen ypo2088, pla<br /> <br /> pla và caf1 của chủng VK dịch hạch trên<br /> <br /> và caf1 với vector tách dòng pJET1.2/blunt<br /> <br /> Ngân hàng Gen kết hợp với kết quả giải<br /> <br /> nhờ T4-ligase (Thermo scientific). Sản<br /> <br /> trình tự trong nghiên cứu này, 3 cặp mồi<br /> <br /> phẩm nối ghép được biến nạp vào tế<br /> <br /> tương ứng với các gen đích trên được<br /> <br /> bào khả biến E. coli DH5 (Invitrogen)<br /> <br /> thiết kế trong phản ứng PCR đa mồi xác<br /> <br /> bằng phương pháp sốc nhiệt. Tiến hành<br /> kiểm tra các thể tái tổ hợp bằng PCR<br /> khuẩn lạc (PCR colony), cắt bằng enzym<br /> hạn chế AvaI và XbaI (Thermo scientific).<br /> Xác đinh trình tự các gen đích theo cả<br /> hai chiều theo phương pháp Sanger<br /> với các mồi trên vector pJET1.2F/R và<br /> mồi khuếch đại (bảng 1). Sử dụng phần<br /> <br /> định Y. pestis có độc lực (bảng 1). Thành<br /> phần mPCR như sau: 1,2X Dream Taq<br /> Buffer; 0,25 mM dNTPs; MgCl2 0,6 mM;<br /> 0,25 μM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại;<br /> Dream Taq 0,8U; ~ 10 ng ADN khuôn,<br /> điều chỉnh H2O đủ thể tích 25 μl. Chu<br /> trình nhiệt: biến tính 94oC/4 phút, tiếp<br /> theo là 30 chu kỳ (94oC/30 giây; 56oC/30<br /> giây; 72oC/30 giây), sau đó hoàn thành<br /> <br /> mềm Bioedit và Genious R7 để xử lý,<br /> <br /> kéo dài chuỗi ở 72º trong 6 phút. Sản<br /> <br /> nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen<br /> <br /> phẩm mPCR được điện di kiểm tra trên<br /> <br /> ypo2088, pla, caf1, so sánh và phân tích<br /> <br /> gel agarose 1,5% TBE 0,5X; nhuộm ethidium<br /> <br /> trình tự đã xác định với trình tự trên<br /> <br /> bromide và quan sát bằng hệ thống soi<br /> <br /> Ngân hàng Gen.<br /> <br /> gel Dolphin-DOC.<br /> <br /> 60<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen ypo2088, pla và caf1.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích bằng Phusion ADN<br /> polymerase trên gel agrose 1,2%.<br /> a) M: Thang ADN chuẩn 100 bp (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088.<br /> b) M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1.<br /> <br /> ADN tổng số của chủng Y. pestis Yp1<br /> được dùng để phân lập gen ypo2088, pla<br /> và caf1 bằng PCR sử dụng Phusion HighFidelity ADN polymerase với các cặp mồi<br /> tách dòng tương ứng. Điện di kiểm tra<br /> sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%<br /> (hình 1) cho thấy, 3 sản phẩm khuếch đại<br /> rất đặc hiệu, thể hiện bằng các band đậm,<br /> rõ nét, không có band phụ, kích thước<br /> tương đương với tính toán lý thuyết.<br /> Theo như thiết kế, nếu khuếch đại<br /> thành công, các gen này sử dụng cặp mồi<br /> là ypo2088F/R, plaF/R và cafF/R sẽ cho<br /> sản phẩm có kích thước tương ứng là<br /> 645, 1019 và 654 bp, tương đương với<br /> kích thước sản phẩm PCR trên bản gel<br /> điện di. Việc lựa chọn gen đặc trưng<br /> của Y. pestis trên NST là ypo2088 và gen<br /> độc lực pla, caf1 trên plasmid được tham<br /> 61<br /> <br /> khảo từ một số nghiên cứu trên thế giới<br /> [4, 7, 10]. Nhóm nghiên cứu đã phân lập<br /> toàn bộ chiều dài của các gen này để<br /> phân tích trình tự của chủng VK dịch hạch<br /> có độc lực ở Việt Nam nhằm xác định có<br /> sự sai khác nào trong trình tự nucleotid<br /> với các chủng Y. pestis có độc lực trên<br /> thế giới.<br /> Như vậy, từ kết quả điện di kiểm tra<br /> sản phẩm PCR khuếch đại các gen đích<br /> và gen độc lực của Y. pestis như trên có<br /> thể kết luận, bước đầu đã khuếch đại<br /> thành công gen ypo2088, pla và caf1 của<br /> chủng Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam.<br /> Sau khi tinh sạch, các sản phẩm PCR<br /> này được gắn vào vector tách dòng<br /> pJET1.2/blunt. Plasmid tái tổ hợp chứa<br /> gen đích mong muốn, kiểm tra bằng PCR<br /> colony và enzym hạn chế AvaI và XbaI<br /> (hình 2).<br /> <br />