Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme Luciferase

Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ<br /> TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LUCIFERASE<br /> Trần Thị Thanh Quỳnh1, Tô Văn Thiệp1, Nguyễn Văn Hoàng1,<br /> Trần Thị Thu Hường1, Lê Duy Khánh1, Nguyễn Đình Hưng1, Phạm Kiên Cường1*<br /> Tóm tắt: Đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase từ đom đóm ở Việt Nam đã<br /> được nhân dòng thành công vào vector pGEMT bằng phương pháp RT-PCR<br /> (Reverse transcription-Polymerase chain reaction) và ứng dụng các kỹ thuật sinh<br /> học phân tử khác. Sau đó, plasmid mang đoạn gen này (pGEM-luciferase) đã được<br /> biến nạp vào tế bào E.coli và giải trình tự. Kết quả cho thấy: đoạn gen có kích<br /> thước khoảng 1,6 kb, có trình tự tương đồng 100% so với trình tự đã công bố trên<br /> ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Trên trình tự gen này không có vị trí cắt của<br /> các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...., do đó chúng tôi đã thiết kế<br /> thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và HindIII vào đầu 3' của<br /> gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này<br /> bằng phương pháp tái tổ hợp.<br /> Từ khóa: Enzyme luciferase, Đom đóm, Nhân dòng luciferase.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Luciferase là nhóm enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học,<br /> thuộc họ protein dạng aldelynate, có một nhóm oxy-4-oxidoreductase để thực hiện hoạt<br /> động khử carboxyl hóa và thủy phân ATP. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khác<br /> nhau đã được xác định dựa vào nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó,<br /> luciferase của đom đóm được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [1,2,3].<br /> Một trong những ứng dụng quan trọng của luciferase là để phát hiện tổng số vi sinh vật<br /> và kiểm tra mức độ an toàn của lương thực, thực phẩm và phát hiện sớm mức độ nhiễm<br /> khuẩn của bề mặt vật thể trong chế biến cũng như bảo quản lương thực, thực phẩm và y<br /> dược, với hệ thống enzym-cơ chất cực nhạy của đom đóm. So với phương pháp truyền<br /> thống đòi hỏi tốn nhiều thời gian để xử lý mẫu và nuôi cấy đếm khuẩn lạc, thì phương<br /> pháp phát quang sinh học vượt trội hơn hẳn về mặt thời gian và độ chính xác. Nhiều hãng<br /> sản xuất kít trên thế giới đã phát triển thành công kít phát hiện tổng số vi sinh vật bằng<br /> phương pháp quang sinh học (Clean-Trace, Kikoman, Bio Thema...)[3,7]. Trên thế giới, đã<br /> có nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa cho<br /> enzyme luciferase của đom đóm [4,8,9] và hệ thống enzym luciferase đã trở thành một<br /> công cụ đa năng với các ứng dụng khác nhau [5,6,7] bao gồm: thử nghiệm gen chỉ thị<br /> trong cả vi khuẩn và các dòng tế bào có nhân điển hình; phát hiện sự có mặt của các vi<br /> sinh vật và các hợp chất độc hại, tương tác của vi khuẩn/virut với tế bào chủ thông qua<br /> hình ảnh bên trong cơ thể, phân tích biểu hiện gen ở các cơ thể động vật sống và hình ảnh<br /> khối u...Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về enzyme luciferase [1,2,3], tuy<br /> nhiên các công bố về ứng dụng của phương pháp phát quang sinh học nói chung và<br /> luciferase nói riêng còn hạn chế và chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này.<br /> Đặc biệt là việc ứng dụng enzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội như<br /> trong trinh sát phát hiện chất độc hóa học, quan trắc, kiểm soát các chất độc trong lương<br /> thực, thực phẩm và môi trường đối với lực lượng tác chiến trong điều kiện đặc biệt... còn<br /> chưa được quan tâm nghiên cứu.<br /> Mặt khác enzyme luciferase thông thường được thu nhận từ các sinh vật có khả năng<br /> phát sáng trong tự nhiên như đom đóm, sứa... Tuy nhiên, việc tách chiết và thu nhận<br /> enzyme từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên là rất khó khăn do không chủ động nguồn<br /> <br /> <br /> 140 T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, …, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ… enzyme luciferase.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> nguyên liệu và đạt hiệu quả thu hồi thấp. Vì vậy, tổng hợp được gen mã hóa cho enzyme<br /> luciferase, từ đó hướng tới việc ứng dụng và phát triển sản xuất enzyme luciferase bằng<br /> công nghệ tái tổ hợp là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Chính vì thế, trong<br /> nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho<br /> enzyme luciferase để tạo tiền đề, phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất enyme luciferase<br /> theo con đường tái tổ hợp<br /> 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Nguyên liệu và hóa chất<br /> - Đom đóm thu được ở Việt Nam (Nghệ An, 19/2/2015)<br /> - Hóa chất: Các hóa chất thường dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng<br /> Sigma, Mecrk, Thermo Scientific...<br /> 2.2. Thiết bị<br /> Máy PCR và thiết bị điện di ngang của hãng Bio-rad (Mỹ), hệ thống chụp ảnh điện di<br /> Mega bio print của hãng Fisher biotech (Úc), máy ly tâm lạnh của hãng Orto alresa (Tây<br /> Ban Nha).<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số<br /> RNA tổng số được tách chiết từ đom đóm theo bộ kit của hãng ANABIO. Nghiền 30<br /> mg phần đuôi của đom đóm trong nitơ lỏng. Sau đó, bổ sung 400 µl Lysis buffer và 4 µl β-<br /> mecaptoethanol bằng máy vortex trong 10 giây và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Tiếp đến, bổ<br /> sung 200 µl isopropanol và đảo ngược 5-6 lần. Dịch nổi có chứa RNA tổng số sẽ được thu<br /> nhận bằng cách ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, ở nhiệt độ phòng và được<br /> chuyển sang cột lọc SCO1 (Anapure filter spin column). Qua 2 bước rửa cột bằng đệm<br /> Washing buffer, ARN tổng số được rửa chiết bằng 50 µl Elution buffer.<br /> 2.3.2. Phương pháp tổng hợp cDNA<br /> RNA tổng số tiếp tục được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược<br /> M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomic và mồi hexamer.<br /> 2.3.3. Phương pháp PCR nhân bản gen luciferase<br /> Sau khi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ đom đóm và tổng hợp được cDNA,<br /> đoạn gen luciferase được chúng tôi nhân bản dựa trên cDNA tổng hợp được bằng phương<br /> pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen luciferase của đom đóm<br /> đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Cặp mồi có trình tự như sau:<br /> Mồi Luciferase Fw: 5’ AACATATGGAAAACATGGAGAACGA 3’<br /> Mồi Luciferase Rv: 5’ CCAAGCTTTACATCTTAGCAACTG 3’<br /> Chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và<br /> HindIII vào đầu 3' của gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản<br /> xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp.<br /> Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng mồi luciferase như sau:<br /> <br /> 94oC : 30 giây<br /> 54oC : 45 giây x 35 chu kỳ<br /> 72oC : 2 phút 30 giây<br /> <br /> 2.3.4. Phương pháp nhân dòng gen: Sản phẩm PCR được nhân dòng trực tiếp vào vector<br /> pGEM-T dạng mạch thẳng có đầu dính T (theo kit pGEM T easy của Promega). Sản phẩm<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 141<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> nhân dòng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5, được chọn lọc xanh trắng<br /> trên môi trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG và ampicillin. Plasmid tái tổ hợp được tách ra<br /> từ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra sự có mặt của gen luciferase bằng PCR với các cặp mồi<br /> của vector và mồi đặc hiệu của gen mã hóa.<br /> 2.3.5. Phương pháp tách chiết plasmid: Plasmid tái tổ hợp pGEM-luciferase được tách<br /> chiết từ các tế bào E. coli bằng bộ kit của hãng Qiagen.<br /> 2.3.6. Phương pháp giải trình tự và phân tích kết quả: Các sản phẩm PCR mong muốn<br /> được đọc trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger trên máy giải trình tự tự động CEQ<br /> 8000 (Beckman Counter). Gen luciferase sau khi đọc trình tự sẽ được so sánh với trình tự<br /> gen tương ứng trên ngân hàng Gen quốc tế bằng phần mềm BLAST của NCBI.<br /> 2.3.7. Phương pháp phân tích vị trí cắt của enzyme giới hạn: Trình tự gen luciferase được<br /> phân tích bằng phần mềm ApE để xác định các vị trí cắt của enzyme giới hạn.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Tách chiết RNA tổng số từ đom đóm và tổng hợp cDNA<br /> RNA tổng số được tách chiết từ đom đóm bằng bộ kit của hãng ANABIO. Nồng độ<br /> RNA thu được được tính toán dựa trên kết quả đo quang phổ ở bước sóng 230 nm là 11,7<br /> ng/µl. Tiếp đến, RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã<br /> ngược M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomic và mồi hexamer.<br /> 3.2. Nhân bản gen mã hóa luciferase từ đom đóm<br /> Đoạn gen luciferase được chúng tôi nhân bản dựa trên cDNA tổng hợp được bằng<br /> phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen luciferase của<br /> đom đóm đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1).<br /> Sau khi PCR và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% , thu được 1 băng DNA có<br /> kích thước khoảng 1,6 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm (không có khuôn DNA) thì<br /> không xuất hiện băng nào (Hình 1). Kích thước đoạn gen thu được tương đương với kích<br /> thước của đoạn gen luciferase (X66919.1) đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới.<br /> Kết quả này cho phép bước đầu khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa<br /> cho luciferase từ đom đóm.<br /> 3.3. Nhân dòng gen mã hóa luciferase từ đom đóm vào vector pGEM T<br /> Sản phẩm PCR đoạn gen luciferase (1,6 kp) từ đom đóm được gắn trực tiếp vào vector<br /> nhân dòng pGEM-T, biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α và các tế bào biến nạp được<br /> nuôi cấy trên môi trường LB chứa ampicilin 50 g/ml với sự cảm ứng của IPTG (1 mM)<br /> và cơ chất X-gal. Tiếp theo, chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sự có mặt của<br /> đoạn gen nhân dòng bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi pGEM.Fw và pGEM.Rv<br /> được thiết kế đặc hiệu cho vector pGEMT. Theo tính toán lý thuyết, nếu nếu vector có<br /> mang đoạn gen luciferase thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước khoảng 1,9 kb, bao<br /> gồm kích thước của đoạn gen luciferase khoảng 1,6 kb cộng với kích thước đoạn DNA<br /> nằm giữa 2 mồi trên vector pGEMT là 0,3 kb.<br /> Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ 3 khuẩn lạc trắng<br /> làm khuôn cho thấy các sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng đều cho băng DNA có kích<br /> thước khoảng 1,9 kb (các đường chạy 1-3).<br /> Khi sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu Luciferase Fw/Rv (Hình 2) cho thấy, sản phẩm<br /> PCR từ khuẩn lạc trắng cho băng ADN kích thước khoảng 1,6 kb tương đương với kích<br /> thước luciferase (đường chạy 7-9). Như vậy, đã thu được các khuẩn lạc mang plasmid tái<br /> tổ hợp vector pGEM có chứa đoạn gen nhân bản có kích thước khoảng 1,6 kb đặc hiệu cho<br /> <br /> <br /> <br /> 142 T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, …, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ… enzyme luciferase.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> luciferase. Vì vậy, có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa luciferase<br /> vào vector pGEMT.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> nhân bản đoạn gen luciferase từ đom đóm. khuẩn lạc kiểm tra vector pGEM-luciferase.<br /> 1: Thang chuẩn DNA 1 kb 1-3: Khuẩn lạc PCR với mồi pGEM Fw/Rv<br /> 2: Mẫu đối chứng (-), không có DNA 4: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv<br /> 3: Sản phẩm PCR của mẫu cDNA tổng hợp 5: Thang chuẩn DNA 1kb<br /> từ RNA tổng số tách từ đom đóm 6: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv<br /> 7-9: Khuẩn lạc PCR với mồi Luciferase<br /> Fw/Rv<br /> 3.4. Tách chiết plasmid pGEM- luciferase<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid (a)<br /> và PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE (b)<br /> 1’: Thang chuẩn DNA 1kb 1: Plasmid pGEM- luciferase với mồi pGEM Fw/Rv<br /> 2’: Plasmid pGEM- luciferase 2: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv<br /> 3: Thang chuẩn DNA 1kb<br /> 4: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv<br /> 5: Plasmid pGEM- luciferase với mồi Luciferase<br /> Fw/Rv<br /> Một khuẩn lạc trắng mang plasmid pGEM-luiciferase được nuôi lắc trong 5-10 ml LB<br /> lỏng, bổ sung kháng sinh ampicillin với nồng độ 50 µg/ml, ở 37oC từ 8-12 tiếng. Sau đó,<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 143<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> sinh khối tế bào sẽ được thu nhận và được dùng để tách plasmid bằng bộ kit của hãng<br /> Qiagen (Đức). Plasmid pGEM-luciferase tinh sạch (Hình 3.a) sẽ được sử dụng làm khuôn<br /> để tiến hành PCR bằng cặp 2 mồi đặc hiệu của vector pGEM T và của đoạn gen luciferase.<br /> Kết quả được thể hiện ở hình 3b.<br /> Như vậy, có thể khẳng định đã tách chiết thành công plasmid pGEM-luciferase.<br /> Plasmid ở dạng tinh sạch sạch này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> 3.5. Giải trình tự gen mã hóa luciferase từ đom đóm<br /> Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng được tiến hành xác định trình tự đoạn gen mã hóa<br /> luciferase. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen luciferase trong nghiên cứu được<br /> so sánh với trình tự gen này đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1) được<br /> thể hiện trên Hình 4.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Từ hình 4 cho thấy, trình tự luciferase thu được trong nghiên cứu có khung đọc mở<br /> (ORF) là 1647 bp, có sự tương đồng 100% so với trình tự luciferase của loài đom đóm<br /> Luciola lateralis đã được công bố trên thế giới. Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm<br /> ApE, cho thấy trên trình tự gen luciferase của đom đóm ở Việt Nam không có vị trí cắt của<br /> các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...<br /> <br /> <br /> <br /> 144 T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, …, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ… enzyme luciferase.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. So sánh trình tự gen luciferase trong nghiên cứu và trình tự gen luciferase của<br /> đom đóm đã được công bố trên thế giới (X66919.1).<br /> Luciola lateralis là một loài đom đóm phổ biến ở Nhật Bản, kết quả so sánh chỉ ra rằng<br /> trình tự acid amin suy diễn của enzyme luciferase của loài L. lateralis tương đồng 94% so<br /> với trình tự của loài Luciola cruciata (một loài đom đóm phổ biến khác ở Nhật Bản) và chỉ<br /> tương đồng 67% so với loài Photinus pyralis (loài đom đóm phổ biến ở Bắc Mỹ). Đoạn<br /> gen mã hóa enzyme luciferase của loài L. lateralis đã được nhân dòng và biểu hiện thành<br /> công ở E. coli, với trình tự của protein suy diễn gồm 548 acid amin và có khối lượng phân<br /> tử khoảng 60,312 kDa (Tatsumi, 1992). Chính vì vậy, trình tự gen thu được trong nghiên<br /> cứu này hoàn toàn phù hợp cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme luciferase bẳng phương<br /> pháp tái tổ hợp.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase, đoạn gen có kích<br /> thước khoảng 1,6 kb từ đom đóm ở Việt Nam bằng phương pháp RT-PCR. Đồng thời<br /> nhân dòng thành công đoạn gen này vào vector pGEM T.<br /> Trình tự đoạn gen mã hóa cho luciferase từ đom đóm ở Việt Nam tương đồng 100%<br /> so với trình tự gen luciferase đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1),<br /> trình tự này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI,<br /> XhoI.... và đã được thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn NdeI vào<br /> đầu 5’ và XhoI vào đầu 3’.<br /> Nhân bản thành công đoạn gen mã hóa enzyme luciferase là cơ sở phục vụ cho mục<br /> đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 145<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài: "Nghiên cứu<br /> ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme luciferase".<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Trần Linh Phước và cộng sự, “Tạo dòng sản xuất luciferase tái tổ hợp dùng cho phản<br /> ứng phát sáng sinh học invitro”, Tạp chí Phát triển khoa học và công nghệ, Đại học<br /> Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh (2002), tập 5, số 7.<br /> [2]. Phạm Hồ Trương và cộng sự, “Nghiên cứu sản xuất bộ Kit vi sinh xác định Arsen bằng<br /> máy đo huỳnh quang ABOATOX 1253”, đề tài cấp Trung tâm KHKT&CNQS (2006).<br /> [3]. Ngô Ngọc Trung, “Nghiên cứu khả năng chế tạo thuốc thử phát hiện nhanh sự đột biến<br /> số lượng vi sinh vật độc hại trong mẫu thực phẩm”, để tài Viện Hóa học-Vật liệu (2012).<br /> [4]. Emamzadeh AR, Hosseinkhani S, Sadeghizadeh M, Nikkhah M, Chaichi<br /> MJ, Mortazavi M., “cDNA cloning, expression and homology modeling of a luciferase<br /> from the firefly Lampyroidea maculata”, J Biochem Mol Biol. (2006 Sep)<br /> 30;39(5):578-85.<br /> [5]. Frundzhyan V. & Ugarova N., “Bioluminescent assay of total bacterial contamination<br /> of drinking water”, Luminescence (2007), 22(3); 241-244.<br /> [6]. Lyons S.K., Meuwissen R., Krimpenfort P., Berns A., “The generation of a conditional<br /> reporter that enables bioluminescence imaging of Cre/loxP-dependent tumorigenesis in<br /> mice”, Cancer Res. (2003 Nov) 63 (21): 7042–6.<br /> [7]. Miller J. N., Nawawi, M. B. & Burgess C. , “Detection of bacterial ATP by reversed<br /> flow-injection analysis with luminescence detection”, Anal.Che. Acta (1992), 266, 339.<br /> [8]. Tasumi H., Kajiyama M., Nakano E., “Molecular cloning and expression in<br /> Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luiciola lateralis”,<br /> Biochim Biophys Acta. (1992 Jun) 15;1131(2):161-5.<br /> [9]. Tatsumi H1, Masuda T, Kajiyama N, Nakano E, “Luciferase cDNA from Japanese<br /> firefly Luciola cruciata: cloning, structure and expession in E.coli”, J Biolumin<br /> Chemilumin. (1989 Apr-Jun);3(2):75-8.<br /> ABSTRACT<br /> Research application of molecular biotechnology to<br /> clone the luciferase coding gene<br /> In this research, by RT-PCR method and molecular biology techniques, the<br /> luciferase complete coding sequence from firefly in Viet Nam was cloned and<br /> characterized. The cDNA was transformed into the E. coli and sequenced. The<br /> result showed: the gene fragment size about 1.6 kb and has a sequence shares 100%<br /> identity with the sequence that was published on GenBank (X66919.1). There is no<br /> recognition site of restriction enzymes as HinIII, Bam HI, NdeI, XhoI,... on this<br /> gene. So we designed additional recognition sites for NdeI at the 5' end and for<br /> HindIII at the 3' end of the luciferase coding sequence, that is important basic to<br /> express and produce recombinant luciferase protein.<br /> Keywords: Luciferase, Firefly, Cloned luciferase.<br /> Nhận bài ngày 22 tháng 10 năm 2015<br /> Hoàn thiện ngày 17 tháng 12 năm 2015<br /> Chấp nhận đăng ngày 22 tháng 02 năm 2016<br /> <br /> Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện KH-CNQS;<br /> *<br /> Email: phamkiencuong83@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> 146 T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, …, “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ… enzyme luciferase.”<br />