Nghiên cứu ứng dụng một số chế phẩm Enzyme thủy phân dịch bột sắn để cung cấp cho giai đoạn đường hóa và lên men đồng thời SSF (Simultaneous Saccharificatio)

Trần Thế Hiển và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 62(13): 71 - 77<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ENZYME THỦY PHÂN<br /> DỊCH BỘT SẮN ĐỂ CUNG CẤP CHO GIAI ĐOẠN ĐƯỜNG HÓA<br /> VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI SSF (SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION<br /> AND FERMENTATION)<br /> Trần Thế Hiển, Lương Hùng Tiến*, Nguyễn Viết Hưng, Nguyễn Thế Hùng<br /> Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu sản xuất bioethanol theo phƣơng pháp SSF (Simultaneous Saccharification and<br /> Fermentation) giữ một vai trò quan trọng, đặc biệt trong lĩnh vƣc chất đốt ở việt nam. Trong<br /> nghiên cứu này, các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên những dung dịch phù hợp, thích hợp để cung<br /> cấp cho giai đoạn đƣờng hóa và lên men đồng thời.<br /> Phần đầu tiên đề cập đến giai đoạn dịch hóa trong điểu kiện gia nhiệt hạn chế. Nghiên cứu đƣợc<br /> thực hiện trên các chế phẩm enzyme (Spezyme Extra, Stargen 001, Termamyl), nhiệt độ và thời<br /> gian dịch hóa đề chọn lựa những điều kiện công nghệ phù hợp. Những điều kiện tối ƣu là dịch hóa<br /> từ dung dịch sắn (bột sắn 100 g : 400 ml nƣớc) với Spezyme (0,3 kg/tấn chất khô), ở 70 oC trong<br /> 60 phút.<br /> Phần thứ 2 đề cập đến gíai đoạn đƣờng hóa. Ba yếu tố đƣợc lựa chọn nghiên cứu: nhiệt độ, thời<br /> gian và chế độ làm mát dịch đã đƣờng hóa tới nhiệt độ lên men. Các kết quả nhận đƣợc cho phép<br /> chúng tôi chọn lựa quá trình đƣờng hóa: sau dịch hóa, dịch đƣợc làm lanh tới 500 C, sau đó đƣợc<br /> điều chỉnh pH tới 4,2 và thêm Stargen 001 (2,0 kg/tấn chất khô). Sau đó dịch đƣợc làm lạnh lập<br /> tức tới nhiệt độ lên men (30oC) trong 45 phút.<br /> Với giai đoạn có các yếu tố công nghệ đã chọn lựa, nhóm nghiên cứu nhận đƣợc dịch đƣờng khử<br /> có DE đạt khoảng 14. Dịch này cho sự khởi động lên men tố từ 12-36h. Dịch đƣợc đánh giá là đáp<br /> ứng yêu cầu của giai đoạn SSF.<br /> Từ khóa : Đường hóa và lên men đồng thời (SSF); Khởi động lên men; gia nhiệt hạn chế; Mức độ<br /> thủy phân; cồn sinh học; Stargen; Tinh bột sắn.<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trong những năm qua, việc sản xuất cồn trên<br /> thế giới phát triển mạnh và theo dự tính trong<br /> tƣơng lai nhu cầu về cồn ngày càng tăng do<br /> xu hƣớng sử dụng cồn sinh học đƣợc sản xuất<br /> từ sinh khối tự nhiên nhƣ từ rỉ đƣờng, củ cải<br /> đƣờng, từ ngũ cốc (ngô, lúa mì) hay từ chất<br /> thải thực vật nhƣ mùn cƣa, rơm rạ nhƣ một<br /> nguồn nhiên liệu sạch, thân thiện với môi<br /> trƣờng, có thể tái tạo làm nhiên liệu để thay<br /> thế xăng sử dụng cho các phƣơng tiện vận<br /> chuyển để giảm hiện tƣợng nhà kính cũng<br /> nhƣ làm giảm sự phụ thuộc của thế giới vào<br /> các quốc gia dầu lửa [8,9,10,11]. Cùng với<br /> các nguồn năng lƣợng khác nhƣ năng lƣợng<br /> địa hóa học, năng lƣợng gió…năng lƣợng từ<br /> nhiên liệu sinh học đƣợc coi năng lƣợng của<br /> tƣơng lai, là một giải pháp tối ƣu phục vụ cho<br /> <br /> <br /> Tel: 0988 060 060<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> các phƣơng tiện vận chuyển khi mà các<br /> nguồn nguyên liệu hóa thạch nhƣ than, dầu<br /> lửa…đang ngày càng cạn kiệt.<br /> Trên thế giới, hai quá trình sản xuất cồn sinh<br /> học đi từ sinh khối là quá trình truyền thống<br /> và quá trình SSF. Quá trình truyền thống đã<br /> đƣợc nghiên cứu và ứng dụng sản xuất từ rất<br /> lâu với việc sử dụng 4 giai đoạn tách rời<br /> nhau : dịch hóa (90 – 100 0C, 80 phút), đƣờng<br /> hóa (60 0C, 30 phút), lên men (30 0C, 80 giờ)<br /> trong đó theo nghiên cứu của Duan Gang,<br /> năng lƣợng sử dụng cho quá trình dịch hóa<br /> chiếm 10-15 % năng lƣợng tổng của quá trình<br /> sản xuất [1,2]. Ngƣợc với quá trình truyền<br /> thống, trong quá trình sản xuất cồn theo<br /> phƣơng pháp SSF, giai đoạn dịch hóa đƣợc<br /> tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (70-75 0C), và<br /> đặc biệt giai đoạn đƣờng hóa và lên men đƣợc<br /> tiến hành đồng thời ở 30 0C [7,11]. Phƣơng<br /> pháp này giúp tiết kiệm năng lƣợng sử dụng<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> 71<br /> <br /> Trần Thế Hiển và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> trong giai đoạn dịch hóa và làm giảm thiểu<br /> các nguy cơ bị nhiễm tạp và đặc biệt có thể<br /> tránh đƣợc hiện tƣợng nấm men bị ức chế do<br /> hàm lƣợng đƣờng trong dịch lên men cao nhƣ<br /> trong quá trình truyền thống [7,11].<br /> Ở Việt Nam, việc sản xuất cồn hiện nay theo<br /> phƣơng pháp truyền thống chủ yếu đi từ<br /> nguyên liệu rỉ đƣờng, gạo và sắn. Phƣơng<br /> pháp SSF đang đƣợc nghiên cứu và dần hòan<br /> thiện để đƣa vào sản xuất. Với hàm lƣợng<br /> đƣờng sẵn có cao trong nguyên liệu rỉ đƣờng<br /> và do vấn đề an ninh lƣơng thực, nên rỉ đƣờng<br /> và gạo không phải là giải pháp tốt để sử dụng<br /> trong sản xuất cồn theo phƣơng pháp SSF.<br /> Với khả năng thích ứng cao, dễ trồng, có thể<br /> trồng trên cả đất bạc mầu, cho năng suất thu<br /> hoạch cao 15-30 (tấn/ ha), với giá một tấn sắn<br /> thấp chỉ khoảng từ 20-60 $/ tấn và đặc biệt<br /> với khả năng cho lƣợng sản lƣợng cồn lớn<br /> 160–180 lít/ tấn nên sắn là nguyên liệu thích<br /> hợp nhất để sản suất cồn theo phƣơng pháp<br /> SSF ở Việt Nam [2].<br /> Căn cứ vào các luận điểm trên, nhóm nghiên<br /> cứu đã quyết định tiến hành các nghiên cứu<br /> thực nghiệm trong phòng thí nghiệm với đề<br /> tài ”Nghiên cứu chuẩn bị dịch đủ để khởi<br /> động quá trình đƣờng hóa và lên men đồng<br /> thời” với mục tiêu chính là nghiên cứu một số<br /> điều kiện dịch hóa ở nhiệt độ hạn chế (loại<br /> chế phẩm enzyme dịch hóa sử dụng, nhiệt độ,<br /> thời gian) và đƣờng hóa (thời gian, nhiệt độ,<br /> chế độ làm mát) dựa trên nguyên liệu là bột<br /> sắn, trƣớc tiên nhằm tận dụng hơi nóng của<br /> giai đoạn chƣng cất, từ đó tiết kiệm năng<br /> lƣợng tiêu tốn cho giai đoạn dịch hóa, sau đó<br /> tạo ra dịch sử dụng cho giai đoạn đƣờng hóa<br /> và lên men đồng thời, đủ để khởi động sự lên<br /> men và lƣợng đƣờng trong dịch không tạo ra<br /> ảnh hƣởng ức chế tới nấm men.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> Nguyên liệu<br /> - Sắn có nguồn gốc từ vùng Hà Tây, ở dạng<br /> lát khô đƣợc nghiền nhỏ thành bột (hàm<br /> lƣợng tinh bột 72±2 %, độ ẩm: 12,7±0.2 % ).<br /> - Loại nấm men sử dụng: Men khô hãng<br /> Mauripan do công ty men thực phẩm Mauri<br /> La Ngà, Việt Nam sản xuất. Thành phần men<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 72<br /> <br /> 62(13): 71 - 77<br /> <br /> khô: Saccharomyces cerevisiae, Emulsifier<br /> (491), Vegetable gum (414), nƣớc.<br /> - Chế phẩm enzyme:<br /> + Spezyme Extra: chứa enzyme -amylase<br /> chịu nhiệt đƣợc sinh tổng hợp từ Bacillus<br /> lichenniformi; pH :5,0–6,7; nhiệt độ tối ƣu:<br /> 70 – 85 0C; chế phẩm dạng lỏng.<br /> + Stargen 001: chứa enzyme α – amylase<br /> giống với enzym α – amylaza từ Aspergillus<br /> kawachi nhƣng thu đƣợc trên Tricoderma<br /> reesei và glucoamylaza từ Aspergillus niger;<br /> pH tối ƣu khoảng 4,0 – 4,5; nhiệt độ tối ƣu:<br /> 20 – 40oC, chế phẩm dạng lỏng.<br /> + Termamyl : chứa enzyme α – amylase đƣợc<br /> sinh tổng hợp từ Bacillus licheniformis, chịu<br /> đƣợc nhiệt, ở 105 0C vẫn giữ hoạt tính; pH :<br /> 6,0 – 6,5; nhiệt độ tối ƣu : 90-950C.<br /> Phương pháp<br /> Phương pháp phân tích<br /> - Xác định hàm lƣợng tinh bột bởi HCL<br /> 2%[6];<br /> - Xác định đƣờng khử bởi phƣơng pháp DNS<br /> (Acide dinitro salicylique) [6];<br /> - Xác định độ nhớt bởi nhớt kế [6];<br /> - Xác định sự khởi động lên men bằng lƣợng<br /> CO2 thoát ra theo thời gian [6].<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Nghiên cứu giai đoạn dịch hóa<br /> Ba yếu tố đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu:<br /> loại chế phẩm enzyme (Termamyl, Spezyme<br /> Extra, Stargen 001), nhiệt độ ; thời gian dịch<br /> hóa. Các thực nghiệm đã đƣợc tiến hành 3 lần<br /> lặp lại theo các sơ đồ sau.<br /> <br /> Sơ đô 1. Nghiên cứu chế phẩm enzyme và nhiệt<br /> độ dịch hóa [1,2,3,4,5,6,11]<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Trần Thế Hiển và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Nhiệt độ và một chế phẩm enzyme đƣợc lựa<br /> chọn dựa vào DE lớn nhất<br /> Nghiên cứu thời gian dịch hóa<br /> <br /> 62(13): 71 - 77<br /> <br /> lƣợng: 2,0 kg/ tấn chất khô) theo 3 yếu tố:<br /> nhiệt độ, thời gian và chế độ làm nguội dịch<br /> tới nhiệt độ lên men theo các sơ đồ 3, 4.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Nghiên cứu giai đoạn dịch hóa<br /> Nghiên cứu chế phẩm enzyme dịch hóa và<br /> nhiệt độ dịch hóa<br /> <br /> Sơ đô 2. Nghiên cứu thời gian dịch hóa<br /> [1,3,4,6,11]<br /> <br /> Thời gian dịch hóa đƣợc chọn dựa vào sự chênh<br /> lệch lớn nhất giữa DE1 (DE của dịch sau dịch<br /> hóa) và DE2 (DE của dịch sau đƣờng hóa).<br /> Nghiên cứu giai đoạn đường hóa<br /> Nghiên cứu sự đƣờng hóa với chế phẩm<br /> enzyme glucoamylase Stargen 001 (liều<br /> <br /> Trong phần này với mục đích dịch hoá trong<br /> điều kiện gia nhiệt hạn chế, khoảng nhiệt độ<br /> nghiên cứu đƣợc lựa chọn: 50 oC – 70 oC,<br /> nghiên cứu thực nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ<br /> đồ 1,2 (phần phƣơng pháp). Kết quả nhận đƣợc<br /> về sự biến đổi nồng độ đƣờng khử trong quá<br /> trình thủy phân dƣới tác dụng của 3 enzyme<br /> đƣợc giới thiệu trong biểu đồ 1a-c và độ nhớt<br /> của dịch thủy phân ở 70 0C trên biểu đồ 2.<br /> <br /> Nghiên cứu nhiệt độ và thời gian đường hóa<br /> <br /> Sơ đồ 3. Nghiên cứu nhiệt độ và thời gian đƣờng hóa [2,3,4,8,11]<br /> <br /> Nghiên cứu chế độ làm mát<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> 73<br /> <br /> Trần Thế Hiển và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 62(13): 71 - 77<br /> <br /> Sơ đồ 4. Nghiên cứu chế độ làm mát [2,10,11,14,15]<br /> <br /> Biểu đồ 1. Sự biến đổi nồng độ đƣờng khử trong quá trình thủy phân ;<br /> (a) 700C (b) 600C (c) 500C ; Termamyl<br /> Stargen 001 Spezyme Extra<br /> <br /> Biểu đồ 2. Sự biến đổi độ nhớt trong quá trình thủy phân ở 70 0C;<br /> Termamyl<br /> <br /> Stargen 001<br /> <br /> Với các kết quả nhận đƣợc, có thể nhận thấy<br /> khi tăng nhiệt độ thủy phân, mức độ thủy<br /> phân tăng lên rõ rệt thể hiện qua hàm lƣợng<br /> đƣờng khử đƣợc tạo thành khi sử dụng chế<br /> phẩm Spezyme Extra và đạt cực đại ở nhiệt<br /> độ 70 oC (162,21 g/l). Trong khi đó với hai<br /> chế phẩm còn lại, lƣợng đƣờng khử tăng<br /> không đáng kể (từ 22,57 g/l tới 114,18 g/l với<br /> Stargen 001 và từ 21,27 g/l tới 89,39 g/l với<br /> Termamyl). Hàm lƣợng đƣờng khử lớn nhất<br /> nhận đƣợc với chế phẩm Spezyme Extra tao<br /> hơn 1,5- 2 lần so với 2 chế phẩm còn lại<br /> (162,21 g/l của Spezyme Extra so với 114,18<br /> g/l của Stargen 001 và so với 89,39 g/l của<br /> Termamyl). Kết quả này phù hợp với đặc tính<br /> của các chế phẩm enzyme, khoảng nhiệt độ<br /> nghiên cứu (50 – 70 oC) thấp hơn đáng kể so<br /> với nhiệt độ tối ƣu của chế phẩm Termamyl<br /> (95 – 100 oC) [5] ; cao hơn nhiệt độ tối ƣu của<br /> chế phẩm Stargen 001 (20 – 40 0C) [3]; và<br /> nằm gần khoảng nhiệt độ tối ƣu của Spezyme<br /> Extra (70 – 85 0C) [4].<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 74<br /> <br /> Spezyme Extra<br /> <br /> Những kết quả nhận đƣợc ở 70 oC cho thấy<br /> mức độ thuỷ phân tinh bột bởi enzyme đạt<br /> cao ngay từ 30 phút đầu, sau đó tăng chậm lại<br /> ở 90 phút tiếp theo (hàm lƣợng đƣờng khử :<br /> 162,21 g/l so với 118,4 g/l). Điều này chứng<br /> tỏ enzyme α-amilase có tính đặc hiệu với các<br /> polysacharit phân tử lƣợng lớn. Kết quả cho<br /> thấy việc kéo dài thời gian thuỷ phân chƣa<br /> hắn đã mang lại hiệu quả kinh tế, mặt khác<br /> mực độ thuỷ phân của tinh bột cũng có ảnh<br /> hƣởng đáng kể tới hiệu quả xúc tác của<br /> enzyme đƣờng hoá ở giai đoạn sau. Do vậy<br /> cần tiến hành tiếp các nghiên cứu lựa chọn<br /> thời gian dịch hoá thích hợp trong nghiên cứu<br /> quá trình dƣờng hoá [1,12,13].<br /> Về độ nhớt, dựa trên các kết quả thu nhận<br /> đƣợc, độ nhớt có xu hƣớng giảm theo thời<br /> gian thuỷ phân thể hiện mức độ thuỷ phân<br /> tăng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng đƣờng khử.<br /> Nhƣng sự biến đổi của hàm lƣợng đƣờng khử<br /> và độ nhớt giữa hai chế phẩm Stargen 001 và<br /> Termamyl không đồng nhất: Lƣợng đƣờng<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Trần Thế Hiển và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> khử của chế phẩm Stargen 001 nhận đƣợc cao<br /> hơn chế phẩm Termamyl, nhƣng độ nhớt của<br /> dịch thuỷ phân cũng cao hơn. Điều này có thể<br /> đƣợc giải thích chế phẩm Stargen chứa cả<br /> enzyme α-amilase và glucoamilase, do đó<br /> mức độ thuỷ phân nhận đƣợc ở đây không<br /> tuyến tính với lƣợng dextrine tạo thành (đƣợc<br /> biểu thị bằng sự giảm độ nhớt).<br /> Dựa trên các kết quả nghiên cứu, chế phẩm<br /> Spezyme Extra và nhiệt độ thuỷ phân 70oC<br /> đƣợc lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.<br /> Xác định thời gian dịch hóa<br /> Tiến hành dịch hoá dịch bột sắn ở 70oC với<br /> chế phẩm Spezyme Extra và kết thúc quá<br /> trình dịch hoá sau: 30; 60; 90 phút. Sau đó<br /> tiến hành quá trình đƣờng hoá tất cả các mẫu<br /> ở cùng điều kiện. Kết quả xác định mức độ<br /> thuỷ phân sau khi dịch hoá và sau đƣờng hoá<br /> đƣợc thể hiện trong biểu đồ 3.<br /> DE sau giai đoạn đường hóa<br /> <br /> 25<br /> <br /> 20<br /> <br /> 15<br /> <br /> 10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0<br /> 30<br /> <br /> 60<br /> <br /> 90<br /> <br /> thời gian dịch hóa (phút)<br /> <br /> Biểu đồ 3. Ảnh hƣởng của thời gian đƣờng hóa tới<br /> hoạt động của enzyme đƣờng hóa (DE sau giai<br /> đoạn dịch hóa)<br /> <br /> Kết quả nhận đƣợc cho thấy, mức độ thuỷ<br /> phân sau thời gian 60 phút dịch hoá cho ta<br /> mức độ thuỷ phân sau đƣờng hoá cao nhất.<br /> Nhận xét này đã đƣợc nhiều tác giả đề cập tới<br /> <br /> 62(13): 71 - 77<br /> <br /> về tính đặc hiệu cơ chất của glucoamylase<br /> [1,12,13]. Enzyme glucoamylase là enzyme<br /> ngoại mạch chúng cắt tuần tự từng gốc<br /> glucose ra khỏi đầu không khử của chuỗi<br /> mạch, do đó enzyme đặc hiệu với các đoạn<br /> oligosacchride có chiều dài nhất định.<br /> Với mục tiêu chỉ lựa chọn hiệu quả đƣờng<br /> hóa cao nhất, chúng tôi lựa chọn thời gian<br /> dịch hóa là 60 phút trong những nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> Tóm lại, qua 02 phần nghiên cứu, nhóm<br /> nghiên cứu chọn dịch hóa dịch bột sắn với<br /> chế độ gia nhiệt hạn chế nhƣ sau:<br /> - Chế phẩm enzyme sử dụng : Spezyme Extra<br /> - Nhiệt độ: 70 0C<br /> - Thời gian dịch hóa: 60 phút<br /> Nghiên cứu giai đoạn đường hóa<br /> Nghiên cứu nhiệt độ và thời gian đường hóa<br /> Tiến hành dịch hóa theo điều kiện đã lựa<br /> chọn, sau đó nghiên cứu giai đoạn đƣờng hóa<br /> dƣới tác dụng của enzyme Stargen 001 ở 3<br /> nhiệt độ 40 oC,50 oC, 60 oC theo sơ đồ 3.<br /> - Thời gian đƣờng hóa 0 phút: Sau khi bổ<br /> xung enzyme, dịch đƣợc làm nguội ngay lập<br /> tức tới nhiệt độ lên men (30 OC), thời gian làm<br /> mát 45 phút.<br /> - Thời gian đƣờng hóa 15 phút: Sau khi bổ<br /> xung enzyme, dịch đƣợc giữ ở nhiệt độ này<br /> trong 15 phút, sau đó đƣợc làm mát tới nhiệt<br /> độ lên men (30 0C), thời gian làm mát 45 phút<br /> Cuối cùng, các dịch đƣợc lên men trong cùng<br /> điều kiện. Sự khởi động lên men đƣợc theo<br /> dõi qua lƣợng CO2 thoát ra. Kết quả đƣợc thể<br /> hiện trên biểu đồ 4.<br /> <br /> M400<br /> M500<br /> M600<br /> M4015<br /> M5015<br /> M6015<br /> Biểu đồ 4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian đƣờng hóa tới sự khởi động lên men<br /> (a) thời gian đƣờng hóa: 0 phút (b) thời gian đƣờng hóa: 15 phút<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> 75<br /> <br />