Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Gia Lâm, Hà Nội: Luận án Tiến sĩ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ

SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG TRỌT CÂY ĐAN SÂM (SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP CÔNG

NGHỆ SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG

NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG

TRỌT CÂY ĐAN SÂM (SALVIA MILTIORRHIZA

BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

Chuyên ngành: khoa học cây trồng

Mã số: 62.62.01.10

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

1. PGS.TS. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo

2. TS. Ninh Thị Phíp

HÀ NỘI - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn,

các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Lê Tiến Vinh

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới Ban Giám đốc Học Viện, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Cây công

nghiệp và cây thuốc đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu thực hiện luận án này.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị

Phƣơng Thảo, TS. Ninh Thị Phíp là những ngƣời hƣớng dẫn khoa học đã tận tâm giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện luận án này.

Cảm ơn Lãnh đạo Cục An toàn thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn

thành chƣơng trình học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thành viên trong gia đình, bạn bè, đồng

nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Tác giả luận án

Lê Tiến Vinh

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

iii

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục các bảng

vii

Danh mục các hình

Trích yếu luận án tiến sĩ

Thesis abstract

xiii

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

1.1

Mục tiêu

1.2

1.3

Những đóng góp mới của luận án

1.4

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1

Giới thiệu về cây Đan sâm

2.1.1 Nguồn gốc

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

2.1.3

Phân bố

2.1.4 Yêu cầu điều kiện sinh thái của cây Đan sâm

2.1.5 Giá trị dƣợc liệu

2.2

Tình hình sản xuất và tiêu thụ dƣợc liệu Đan sâm

2.2.1

Trên thế giới

2.2.2

Tại Việt Nam

2.3

Cơ sở xác định các biện pháp kỹ thuật trồng

2.3.1 Cơ sở xác định thời vụ, mật độ và phân bón cho cây trồng

2.3.2

Phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm

2.3.3 Mật độ trồng

2.3.4

Phân bón

2.4

Kỹ thuật nhân giống in vitro

iii

2.4.1 Khái niệm và cơ sở của khoa học của phƣơng pháp nhân giống in vitro

2.4.2

Tổng quan tài liệu về nghiên cứu nhân giống in vitro

2.4.3 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm

2.5

Tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp

2.5.1 Cơ chế tạo rễ tơ

2.5.2 Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng cảm ứng tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes

2.5.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt

chất thứ cấp của rễ tơ

2.5.3 Các nghiên cứu tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ thu nhận hợp chất thứ

cấp ở cây Đan sâm

2.5.4 Những nghiên cứu về cây Đan sâm ở Việt Nam

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1

Vật liệu nghiên cứu

3.2

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

3.2.2

Thời gian nghiên cứu

3.3

Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung nghiên cứu

3.3.2

Phƣơng pháp nghiên cứu

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1

Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm

4.1.1

Tạo vật liệu khởi đầu

4.1.2 Nhân nhanh chồi

4.1.3

Tạo cây hoàn chỉnh

4.1.4

Thích nghi cây ngoài vƣờn ƣơm

4.1.5 Quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm

4.2

Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm

4.2.1 Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm

4.2.2 Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

mô lá Đan sâm

4.2.3 Xác định dòng rễ tơ chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR

4.2.4 Ảnh hƣởng của thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

dòng A5.14

4.2.5 Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14

4.2.6 Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14

4.2.7 Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy

hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14

4.2.8

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm

4.2.9 Ảnh hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng đến sự tăng trƣởng và

sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

4.2.10 Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu

của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

4.2.11 Quy trình cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm

4.3

Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trồng cây Đan sâm từ cây giống in vitro

4.3.1 Ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất, chất

lƣợng dƣợc liệu cây Đan sâm

4.3.2 Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến sinh trƣởng, phát triển và chất lƣợng

dƣợc liệu Đan sâm

4.3.3 Ảnh hƣởng của phân bón đến sinh trƣởng, phát triển và chất lƣợng dƣợc

liệu Đan sâm

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

102

5.1

Kết luận

102

5.2

Đề nghị

102

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án

104

Tài liệu tham khảo

105

Phụ lục

116

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

α - NAA Axít alpha-naphtyl acetic Axít Abscisic ABA Atmosphere atm Đô - la c AUD Gamborg‟s B5 B5 B. cereus exopolysaccharide - Polysaccharide của vi khuẩn nốt sần Bacillus cereus BPS Complementary and Alternative Medicine - Thuốc bổ sung và thay thế CAM Chinese Herbal Medicine - Thuốc thảo dƣợc Trung Quốc CHM Công thức CT Coefficient of variation – hệ số biến động CV% l-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase DXS Điều tiết sinh trƣởng ĐTST Đối chứng Đ/c Gibberellic acid - Axít gibberellic GA3 Hecta ha 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase HMGR Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Indole-3-acetic acid - axít Β - indol acetic IAA Indole-3-butyric acid - Axít β - indol butyric IBA LAB Lithospermic axit B LSD0,05 Mức sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa 5% MS PA PEG Put RA ROS rpm SM Spd Spe STS TAE TCM USD YE YM

Murashige and Skoog Polyamine Polyethylene glycol Putrescine Rosmarinic axit Reactive oxygen species Rounds per minute Salvia miltiorriza Spermidine Spermine Sodium tanshinone IIA sulfonate Tris-acetate-EDTA Y học cổ truyền Trung Quốc Đô - la Mỹ Dịch chiết nấm men Yeast medium

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

Trang

TT

2.1

Một số thực phẩm chức năng chứa dƣợc liệu Đan sâm tại Việt Nam

2.2

Các phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm

3.1

Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

3.2

Thành phần phản ứng PCR

4.1

Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm sau 2 tuần

nuôi cấy

4.2

Ảnh hƣởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần

nuôi cấy

4.3

Ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần

nuôi cấy

4.4

Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan

sâm sau 4 tuần nuôi cấy

4.5

Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan

sâm sau 4 tuần nuôi cấy

4.6

Ảnh hƣởng của α-NAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần

nuôi cấy

4.7

Ảnh hƣởng của IBA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

4.8

Ảnh hƣởng của IAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

4.9

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy cây in vitro trên môi trƣờng ra rễ đến

tỷ lệ sống của cây con ngoài vƣờn ƣơm trên giá thể xơ dừa: cát (1:1) sau

4 tuần

4.10

Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây Đan

sâm 30 ngày tuổi

4.11

Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ Đan sâm sau 4 tuần

4.12

Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

mô lá Đan sâm

4.13

Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy

vii

4.14

Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy

4.15

Ảnh hƣởng của các loại bình nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ dòng A5.14

sau 10 tuần nuôi cấy

4.16

Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau

8 tuần nuôi cấy

4.17

Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tích lũy các hoạt chất mục

tiêu của dòng rễ tơ A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy

4.18

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan

sâm dòng A5.14

4.19

Ảnh hƣởng của tổ hợp của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng sinh

khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

4.20

Ảnh hƣởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tích lũy các hoạt chất

mục tiêu dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy

4.21

Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan

sâm dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy

4.22

Ảnh hƣởng của các elicitor đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng

A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy

4.23

Ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm tại thời

điểm 10 tháng sau trồng

4.24

Ảnh hƣởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

dƣợc liệu Đan sâm

4.25

Ảnh hƣởng của thời vụ đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan

sâm (sau 10 tháng trồng)

Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm

4.26

Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm

4.27

Ảnh hƣởng của phân bón đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm

4.28

Ảnh hƣởng của phân bón đến mức độ nhiếm sâu bệnh trên cây Đan sâm

4.29

Ảnh hƣởng của phân bón đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm

4.30

Ảnh hƣởng của phân bón đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây

4.31

Đan sâm sau trồng 10 tháng

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Trang

TT

2.1

Cây và rễ cây Đan sâm

2.2

Cấu trúc Ri – plasmid

2.3

Con đƣờng sinh tổng hợp tanshinones trong rễ Đan sâm

3.1

Hạt Đan sâm sử dụng trong nghiên cứu

3.2

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA

3.3

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen virD

4.1

Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm

4.2

Ảnh hƣởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm

4.3

Ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm

4.4

Một số hình thái chồi Đan sâm trong quá trình nhân nhanh: (A): Chồi

Đan sâm sinh trƣởng, phát triển bình thƣờng; (B): Chồi biến dị, chồi mọc

thành cụm, không tăng trƣởng về chiều cao; (C): chồi biến dị, chồi mọc

thành cụm, thấp, lá xoăn; (D): chồi biến dị, chồi thấp, thân và lá mọng

nƣớc; (E): chồi biến dị, chồi bạch tạng.

4.5

Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

4.6

Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

4.7

Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

4.8

Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng thích nghi cây Đan sâm ngoài vƣờn ƣơm

4.9

Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm:

A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân.

4.10

Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

mô lá Đan sâm

4.11

Ảnh điện di kết quả tách chiết DNA tổng số từ rễ Đan sâm

4.12

Kết quả khuếch đại gen rolA (A) và gen virD (B) bằng phƣơng pháp

PCR: L: GeneRuler 1kb DNA Ladder; ( ): Đối chứng dƣơng, sản phẩm

PCR của Ri plasmid 15834; (-): Đối chứng âm, sản phẩm PCR của DNA

genome rễ bất định Đan sâm; H2O: Đối chứng âm, nƣớc; Giếng 1-10 (A):

Sản phẩm PCR của DNA genome 10 dòng rễ tơ Đan sâm; Giếng 1, 3, 4,

6, 9, 10 (B): sản phẩm PCR với cặp mồi virDF và virDR của 6 dòng rễ tơ

có mang gen rolA.

4.13

Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14

Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

4.14

Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

4.15

Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

4.16

Rễ tơ Đan sâm ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau trên môi trƣờng B5

4.17

Ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm:

4.18

(A): B5; (B): B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA; (C): B5 + 0,5 mg/l TDZ

+ 0,5 mg/l ABA.

Củ Đan sâm thu hoạch ở các thời vụ khác nhau

4.19

Ảnh hƣởng của phân bón đến sinh trƣởng, phát triển của cây Đan sâm

4.20

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1. Tên nghiên cứu sinh: Lê Tiến Vinh 2. Tên luận án: Nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Gia Lâm Hà Nội. 3. Chuyên ngành: Khoa học cây trồng; Mã số: 62.62.01.10 4. Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 5. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm có hệ số nhân cao, chất lƣợng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật phù hợp trồng cây Đan sâm ngoài đồng ruộng. Tạo các dòng tế bào rễ tơ và xác định đƣợc một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến việc nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm in vitro. 6. Các phƣơng pháp nghiên cứu

Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô hiện hành để xây dựng quy trình nhân giống in

vitro cây Đan sâm.

Cảm ứng rễ tơ cây Đan sâm bằng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong rễ tơ bằng phƣơng pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Rễ tơ chuyển gen đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS/B5 với các trạng thái môi trƣờng khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng và phân lớp) để khảo sát khả năng tăng trƣởng của rễ tơ Đan sâm. Khối lƣợng rễ tƣơi đƣợc xác định bằng cách cân sau khi đã loại bỏ hoàn toàn môi trƣờng. Rễ tƣơi sau khi thu đƣợc sấy ở nhiệt độ 450C đến khối lƣợng không đổi để xác khối lƣợng rễ khô (Ge et al., 2005). Ba hoạt chất mục tiêu gồm tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone, trong rễ tơ Đan sâm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Các thí nghiệm nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trồng ở ngoài đồng ruộng đƣợc bố trí theo phƣơng pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, diện tích mỗi ô thí nghiệm 5 m2. Đo đếm các chỉ tiêu sinh trƣởng, phát triển, năng suất củ Đan sâm. Phân tích hoạt chất trong rễ củ Đan sâm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 7. Kết quả đạt chính và kết luận

- Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm với các thông số nhƣ sau: Môi trƣờng gieo hạt Đan sâm là MS 1,0 mg/l GA; Môi trƣờng nhân nhanh chồi: MS 0,5 mg/l BA; Môi trƣờng tạo cây hoàn chỉnh: ½ MS + 0,75 mg/l IAA; Giá thể tiếp nhận cây Đan sâm ngoài vƣờn ƣơm: xơ dừa: cát (1:1).

- Xác định đƣợc vật liệu và điều kiện thích hợp để cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm: Mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ cây Đan sâm; Nồng độ dịch khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất tƣơng ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2; Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm thích hợp là B5 100 mg/l YE 0,1 mM Methyl Jasmonate, trong điều kiện 16h sáng/8h tối,

cho tốc độ tăng trƣởng rễ mạnh, khối lƣợng rễ tƣơi tăng 13,96 lần sau 8 tuần nuôi cấy, đồng thời cho hoạt chất mục tiêu tích lũy cao nhất.

- Xác định đƣợc một số các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển, năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm khi trồng trên đồng ruộng tại Hà Nội sử dụng cây giống có nguồn gốc nuôi cấy mô. Trồng cây Đan sâm vào tháng 3 với khoảng cách 30 cm x 35 cm, liều lƣợng phân bón là 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha cho cây sinh trƣởng, phát triển tốt, năng suất dƣợc liệu cao.

xii

THESIS ABSTRACT

1. Name of PhD student: Le Tien Vinh 2. Title of thesis: Application of biotechnology and traditional breeding methods on in vitro propagation, root production and field cultivation of Salvia miltiorrhiza Bunge in Gia Lam - Ha Noi. 3. Specialization: Plant Science;

Code: 62.62.01.10

4. Training institution: Vietnam National University of Agriculture 5. Research Objectives Establish the procedure for in vitro propagation of Salvia miltiorrhiza Bunge which shows high multiplication rate, good quality seedlings as well as determine optimal techniques to cultivate Danshen on the field. Induce in vitro hairy roots of Danshen and identify some cultural factors affecting hairy root culture.

The in vitro propagation of Salvia miltiorrhiza Bunge was carried out based on plant tissue culture techniques. Putative hairy root lines were detected by PCR technique using specific primers. Transgenic hairy roots were cultured on MS/B5 medium with different medium states (solid, liquid, semi-liquid and layered) to examine the growth and development of Danshen hairy roots. Fresh weight was determined after completely removing the medium and then kept in an oven at 45°C until constant weight to determine dry weigh (Ge et al., 2005). Three secondary metabolites including tanshinone I, tanshinone IIA and cryptotanshinone were quantitative using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods.

Randomized Complete Block Design (RCBD) was applied in field experiments, three replications (three 5 m2 plots). Data reflect plant growth and development as well as root yield were collected and analyzed.

6. Materials and Methods

- A simple and reliable in vitro regeneration procedure for Salvia miltiorrhiza Bunge was established as follows: The optimal medium for seed germination was MS + 1.0 mg/l GA; the most suitable medium for shoot multiplication was MS + 0.5 mg/l BA; The optimal medium for in vitro rooting was ½ MS + 0.75 mg/l IAA; The best substrate to acclimatize in vitro plantlets was 50% of coconut fiber and 50% of sand.

- Some factors affecting in vitro hairy root induction and culture of Salvia miltiorrhiza Bunge were identified: Leaf was found to be the most efficient explant for transforming and inducing hairy roots; Concentration of bacteria at optical density of 600nm (OD600 = 0.2 indicated maximum percentage of root induction; The optimal cultural medium and conditions for hairy root growth were B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM Methyl Jasmonate with a 16h photoperiod which shows maximum root biomass (13.96- fold higher) after 8 weeks of culture.

- Some optimal techniques to plant Danshen using in vitro plantlets on the field in

7. Main results and conclusions

xiii

Hanoi were determined: The best season to plant Danshen was in March (2014); A planting distance of 30 cm x 35 cm was suitable for Danshen cultivation; Two tons of biofertilizers + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha was found to be the most efficient fertilizers for good growth and development of Danshen, high yield as well as good accumulation of secondary metabolites.

xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) cây thuốc quý trong y học cổ truyền. Ngƣời xƣa có câu “Nhất vị Đan sâm, cộng đồng tứ vật thang”, nghĩa là một vị Đan sâm công dụng bằng bốn vị: đƣơng quy, địa hoàng, xuyên khung, bạch thƣợc - vốn là bài thuốc bổ huyết kinh điển của Đông y. Các nghiên cứu y học hiện đại cho thấy Đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm giãn mạch và tăng lƣu động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành các mảng xơ vữa động mạch và nhiều bệnh khác (Du and Zhang, 2015). Ngày nay, con ngƣời đang hƣớng tới sử dụng các hợp chất thiên nhiên có trong cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh và nâng cao sức khỏe. Chính vì vậy, nhu cầu sử dụng dƣợc liệu nói chung và cây Đan sâm nói riêng trong hai thập kỷ gần đây gia tăng nhanh chóng. Nếu nhƣ năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì nay con số đã lên tới 15.000 tấn/năm (Qin, 2006).

Mặc dù giá trị và nhu cầu Đan sâm tăng cao nhƣ vậy nhƣng nguồn Đan sâm sử dụng làm thuốc ở Việt Nam chủ yếu nhập khẩu từ Trung Quốc. Việc nghiên cứu và trồng trọt cây Đan sâm ở Việt Nam còn rất hạn chế. Theo báo cáo tại Hội nghị Dƣợc liệu toàn quốc năm 2003 về Phát triển dƣợc liệu bền vững trong thế kỷ 21, trên thị trƣờng dƣợc liệu Việt Nam, nguyên liệu cây thuốc Đan sâm phải nhập khẩu 100% từ Trung Quốc. Trong danh mục dƣợc liệu nhập khẩu những năm gần đây, chỉ riêng chi nhánh công ty Nam Hà tỉnh Lạng Sơn đã nhập khẩu lên tới trên 50 tấn dƣợc liệu Đan sâm mỗi năm. Nếu nhƣ trong nƣớc tự sản xuất đƣợc loại dƣợc liệu quý này, thì ngành dƣợc liệu không những sẽ chủ động đƣợc nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc, mà còn tiết kiệm đƣợc một khoản ngoại tệ đáng kể, đồng thời góp phần làm tăng thu nhập cho ngƣời nông dân.

Để đáp ứng và chủ động về dƣợc liệu Đan sâm trong nƣớc, nghiên cứu để đẩy mạnh nhân nuôi là con đƣờng tất yếu. Cây Đan sâm có thể nhân giống theo phƣơng pháp truyền thống bằng hạt hoặc vô tính từ củ mẹ. Tuy nhiên, phƣơng pháp nhân giống bằng hạt cây Đan sâm gặp nhiều khó khăn nhƣ khả năng thụ phấn, tỷ lệ kết hạt thấp, hạt chín rải rác nên khó thu hái và đặc biệt là cây Đan sâm trồng từ hạt mất tới 2 năm mới cho dƣợc liệu. Đào Văn Núi và cs. (2014) đã thử nghiệm phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm từ củ. Tuy nhiên, tỷ lệ củ Đan

sâm nảy mầm chƣa thực sự khả quan khi chỉ đạt cao nhất 61,11% với hệ số nhân 1,0 chồi/củ. Một nhƣợc điểm khác của phƣơng pháp nhân giống truyền thống là rất khó khăn trong việc phòng trừ các loại dịch bệnh, xử lý tồn dƣ của thuốc bảo vệ thực vật hoặc kim loại nặng. Hơn nữa, năng suất dƣợc liệu và hàm lƣợng sản phẩm mục tiêu là các chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái và kỹ thuật trồng trọt.

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật cảm ứng và nuôi

cấy rễ tơ in vitro và tối ƣu kỹ thuật trồng trọt cây Đan sâm trên đồng ruộng là

những giải pháp hiệu quả nhằm khắc phục khó khăn trong việc cung cấp dƣợc liệu

Đan sâm hiện nay. Phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro có nhiều ƣu điểm nhƣ hệ nhân giống cao, cây giống giữ nguyên đƣợc các đặc tính của cây mẹ, đồng đều,

sạch bệnh, sức sống cao khi đƣa ra trồng trên đất… đã và đang đƣợc ứng dụng

rộng rãi vào sản xuất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây dƣợc liệu. Trong khi đó,

nuôi cấy rễ tơ cảm ứng nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để thu nhận các

hợp chất mục tiêu có những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ rễ phát triển nhanh, không

hƣớng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trƣởng ngoại sinh, bền vững về

mặt di truyền và tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lƣợng cao hơn hoặc bằng với

cây mẹ giúp giảm thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm… hứa hẹn là một

hƣớng đi đầy triển vọng (Zhao et al., 2010; Gupta et al., 2010; Kai et al., 2011).

Việc áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất, thu nhận các hợp

chất có hoạt tính sinh học cao đã và đang đƣợc nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi

trên thế giới nhƣ một trong những giải pháp tiềm năng để đáp ứng nhu cầu thảo

dƣợc. Tuy nhiên, tại Việt Nam chƣa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào áp dụng

các kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất cây giống và nhân nuôi sinh khối rễ

Đan sâm nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp. Do vậy, đề tài này đƣợc tiến hành

có ý nghĩa lớn về mặt khoa học và thực tiễn.

1.2. MỤC TIÊU

1.2.1. Mục tiêu chung

Góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây Đan sâm

có hệ số nhân cao, chất lƣợng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật phù hợp

trồng cây Đan sâm ngoài đồng ruộng. Đồng thời, tạo đƣợc các dòng tế bào rễ tơ

Đan sâm và xác định đƣợc một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến việc nhân

nuôi rễ tơ in vitro làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất các hợp chất

thứ cấp phục vụ công nghiệp dƣợc liệu ở Việt Nam.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

(1) Xác định đƣợc các thông số kỹ thuật trong quy trình nhân giống in

vitro cây Đan sâm.

(2) Xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm tạo đƣợc các dòng rễ tơ cây Đan sâm và

một số thông số của quá trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ Đan sâm.

(3) Xác định đƣợc các biện pháp kỹ thuật trồng cây Đan sâm (thời vụ, mật

độ trồng, dinh dƣỡng) thích hợp cho sinh trƣởng, phát triển, năng suất và chất

lƣợng dƣợc liệu rễ cây Đan sâm.

1.3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã xác định đƣợc các yếu tổ ảnh hƣởng đến quá trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm, từ đó xây dựng đƣợc quy trình vi nhân giống cây Đan sâm có hệ số nhân giống cao, chất lƣợng cây giống tốt, đáp ứng nhu cầu cây giống Đan sâm hiện nay trên thị trƣờng. Đồng thời, nghiên cứu đã thiết lập đƣợc quá trình tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro, góp phần chủ động tạo ra nguồn dƣợc liệu Đan sâm sạch làm tiền đề cho quy trình sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây Đan sâm. Đề tài cũng cũng đã xác định đƣợc một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm, góp phần xây dựng quy trình trồng trọt cây Đan sâm cho hiệu quả kinh tế cao. Do vậy, có thể nói, đây là công trình nghiên cứu một cách có hệ thống và công phu về nhân giống in vitro, in vivo cây Đan sâm, cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm.

1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về nghiên cứu cây Đan sâm và xây dựng cơ sở lý luận cho việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối cây Đan sâm bằng công nghệ sinh học và công nghệ truyền thống. Từ đó, góp phần giúp cho các nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu và nghiên cứu các loại cây này trong tƣơng lai.

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cho phép hình thành đƣợc: (1) Quy trình nhân giống

in vitro cây Đan sâm ; (2) Quy trình tạo, nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm

và (3) Một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt cây Đan sâm. Các quy trình, kỹ thuật trên có khả năng ứng dụng thực tiễn cao, góp phần chủ động di thực, bảo tồn,

phát triển đƣợc nguồn giống cây dƣợc liệu quý Đan sâm tại Việt Nam. Bên cạnh đó, các sản phẩm do đề tài tạo ra bao gồm nguồn cây giống chất lƣợng cao và

lƣợng sinh khối rễ lớn. Nhƣ vậy, đây là những đóng góp thiết thực, góp phần

quan trọng trong việc phát triển dƣợc liệu Đan sâm một cách chủ động, bền vững

ở nƣớc ta. Chính vì vậy, đề tài có ý nghĩa thực tiễn to lớn.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐAN SÂM

2.1.1. Nguồn gốc Cây Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc ngành Hạt

kín – Angiospermae, lớp 2 lá mầm - Dicotyledones, phân lớp Cúc - Asteridae, bộ

Hoa môi – Lamiales, họ Hoa môi – Lamiaceae, chi Salvia (Hình 2.1).

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn đƣợc biết đến với tên gọi là

Radix Salviae Miltiorrhizae, huyết sâm, huyết căn, xôn đỏ… là một loài thực vật

sống lâu năm, loài bản địa của cả Trung Quốc và Nhật Bản. Đan sâm sinh sống

tại các khu vực có độ cao từ 90 tới 1.200 m trên mực nƣớc biển, ƣa các môi

trƣờng nhiều cỏ trong rừng, sƣờn núi, dọc các bờ suối. Từ Salvia có nguồn gốc từ

tiếng Latinh, "salveo" có nghĩa là "để chữa lành”. Tính năng phòng bệnh "ma

thuật" của nó là có thể chữa nhiều loại bệnh và phổ biến trong y học cổ truyền

(Kasimu et al., 1998). Phần tên gọi cho loài miltiorrhiza có nghĩa là “nƣớc màu

đỏ chiết ra từ rễ”.

Nguồn dẫn theo Lê Phƣợng dịch (2015)

Hình 2.1. Cây và rễ cây Đan sâm

2.1.2. Đặc điểm thực vật học Đan sâm là cây thảo, lâu năm, cao khoảng 30 - 70 cm. Thân phát triển thẳng đứng và vuông cạnh, phía trên thân cây phân nhánh. Toàn thân đƣợc bao phủ bởi lớp lông mềm màu vàng và lông tuyến. Lá kép lông chim lẻ mọc đối, 3-

5 lá chét, lá chét giữa thƣờng lớn hơn. Xung quanh cuống lá thƣờng có 5 lá nhỏ, ít khi 3 lá, lá ở đỉnh thƣờng lớn hơn các lá bên. Phiến lá hình trứng, chiều dài 2

- 7 cm, chiều rộng 0,8 - 5 cm; phần đỉnh nhọn, mép lá có nhiều răng cƣa. Mặt

phải phiến lá màu xanh lục, mặt trái màu nhạt hơn, trên mặt phiến lá phủ một

lớp lông mịn. Chùm hoa ô tròn, mọc ở đầu cành hoặc trên nách lá, gồm nhiều vòng chỗ dày, chỗ thƣa xếp thành tầng dọc, dài 10 - 15 cm. Cụm hoa mọc vòng,

với 6 vòng hoa, mỗi vòng 3 - 10 hoa, thông thƣờng là 5. Các bẹ hoa dạng mác ngƣợc và bao phủ bởi lông tuyến. Đài hoa màu tím, hình chuông và một phần

ống của nó đƣợc bao phủ dày đặc với những sợi lông mềm màu trắng. Tràng

hoa chẻ đôi, dài 2 - 2,7 cm và có màu xanh tím. Môi trên phát triển và có hình

dạng liềm, đầu có một vết nứt nhỏ. Môi dƣới ngắn hơn so với môi trên, đầu có

ba vết nứt, đoạn giữa dài hơn và lớn hơn so với hoa bên. Ống tràng hoa có một vòng lông. Hoa nở có hai nhị phát triển ở giữa của môi dƣới và mở rộng ra từ

các tràng hoa. Hai nhị hình dạng tuyến tính và phát triển với các bên của môi

trên ống. Bao phấn bị suy thoái thành hình cánh hoa. Bầu nhụy với bốn vết nứt

lớn, dài hơn nhị hoa. Mỗi hoa nở phát triển thành bốn quả hạch có hình elip với

màu nâu sẫm. Quả nhỏ xíu, dài, thuôn, dài 3 mm, rộng 1,5 mm. Cây ra hoa vào

tháng 4 - 6, hình thành quả tháng 7 - 9.

Đan sâm có 13 - 21 rễ đỏ, đƣợc phát triển từ thân rễ chính. Rễ Đan sâm

nhỏ dài hình trụ, dài 10 - 20 cm, đƣờng kính 0,5 - 1,5 cm, ăn sâu xuống đất, cong

queo, có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nhỏ. Rễ có màu đỏ tƣơi, mặt ngoài

nhăn nheo tạo thành rãnh nhỏ song song xuôi theo chiều dài của rễ.

Về mặt vi phẫu rễ, lớp bần gồm nhiều lớp tế bào có thành dày. Mô mềm

vỏ dày cấu tạo bởi tế bào hình tròn hay bầu dục, thành mỏng, xếp đều đặn theo

hƣớng tiếp tuyến. Libe cấp 2 gồm những tế bào nhỏ, thành mỏng, xếp đều đặn và

liên tục thành vòng tròn và tập trung dày hơn ở những chỗ tƣơng ứng với các

nhánh gỗ. Tia ruột rộng, mỗi tia gồm 6 – 35 dãy tế bào có thành mỏng, xếp theo

hƣớng xuyên tâm từ gần trung tâm xuyên qua gỗ đến libe cấp 2.

2.1.3. Phân bố

Cây Đan sâm Salvia miltiorrhiza (SM, Danshen) là cây thuốc có nguồn gốc ở Trung Quốc đƣợc trồng hàng trăm năm để điều trị các bệnh về tim mạch (Gao et al., 2014; Long et al., 2014). Tại Trung Quốc, Đan sâm đƣợc trồng ở tỉnh

Tứ Xuyên khoảng 100 năm về trƣớc (Wang et al., 2004) và đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà Bắc, Liêu Ninh, Giang Tô, Chiết Giang,

Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Quý Châu, Quảng Đông, Sơn Tây. Các tỉnh Hà Bắc, Hà Nam, Sơn Đông, Tứ Xuyên, Sơn Tây đƣợc coi là nơi sản xuất Đan sâm

với chất lƣợng cao, tốt nhất là ở Tứ Xuyên. Đan sâm cũng đƣợc trồng ở Nhật

Bản, Triều Tiên và Đức (Võ Văn Chi, 2004). Đan sâm phân bố chủ yếu ở vùng

ôn đới ẩm, cận nhiệt đới và nhiệt đới, là cây ƣa ẩm, thích hợp trồng trên đất phù sa, nhiều mùn. Đan sâm đƣợc di thực vào Việt Nam khoảng những năm 1960,

đƣợc trồng ở Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Văn Điển (Hà Nội), Bắc Hà (Lào Cai) và một số vƣờn thuốc khác. Hiện nay, Đan sâm đƣợc chú ý phát triển để nhân rộng

tại Tam Đảo, Sapa và Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến cây thuốc Hà Nội. Rễ

Đan sâm đƣợc thu hoạch vào mùa đông, rễ đƣợc đào về sau đó rửa sạch, cắt bỏ

cây và rễ con, đem đi phơi hoặc sấy khô.

2.1.4. Yêu cầu điều kiện sinh thái của cây Đan sâm 2.1.4.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm là 15 - 25oC, cây sinh trƣởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 20 - 26oC kết hợp với độ ẩm 80%. Cây ngừng sinh trƣởng khi nhiệt độ không khí dƣới 10oC (Shu et al., 2004). Cây bắt đầu phát triển khi nhệt độ đất đạt 10oC trong mùa xuân. Trong mùa thu, khi nhiệt độ xuống dƣới 10oC, các phần trên mặt đất se bị héo. Tuy nhiên rễ Đan sâm có thể qua đông an toàn ngay cả khi nhiệt độ đất dƣới - 15 oC. Hạt nảy mầm tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 18 - 22 oC, thời gian kéo dày 15 ngày. Mầm bất định bắt đầu hình thành khi nhiệt độ đất đạt 15 - 17oC. Trong điều kiện thiếu nắng và nhiệt độ thấp làm chậm quá trình sinh trƣởng và gây ra phát triển dị dạng (Huang et al., 2015)

2.1.4.2. Ánh sáng

Giống với cây thuộc họ hoa môi, Đan sâm là cây ƣa sáng thích hợp trồng

có ánh nắng chiếu trực tiếp. Cây Đan sâm sinh trƣởng tốt trong điều kiện đầy đủ

ánh sáng (Huang et al., 2015)

2.1.4.3. Nước

Nƣớc đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây Đan sâm, ảnh hƣởng đến sự hấp thu và sử dụng các chất dinh dƣỡng đất và điều chỉnh sự phát triển rễ. Đan sâm có nhu cầu nƣớc khác biệt (Gao et al., 2004). Nói chung, Đan sâm ƣa môi trƣờng ẩm ƣớt vừa phải, khả năng chống chịu lũ lụt và ngập úng kém. Khả năng chống chịu hạn kém (Huang et al., 2015). Những đặc điểm này làm cơ sở để lựa chọn vùng sinh thái thích hợp cho cây. Vì vậy, địa hình trũng

thấp với hệ thống thoát nƣớc kém không thích hợp cho phát triển Đan sâm. Mặt khác, điều kiện thời tiết và đất quá khô không thích hợp cho sự phát triển của

Đan sâm, đặc biệt là ở giai đoạn nảy mầm vào mùa Xuân và giai đoạn tăng

trƣởng nhanh về gốc vào mùa Thu (Jiang and Wei, 2004).

Các đặc tính nhu cầu nƣớc và hiệu quả sử dụng nƣớc của cây Đan sâm

trong điều kiện đất đai khác nhau đã đƣợc nghiên cứu. Nƣớc cần thiết trong toàn

bộ chu kỳ tăng trƣởng của cây, nhu cầu nhiều nhất thƣờng xảy ra từ tháng sáu

đến tháng tám và độ ẩm đất nên đƣợc duy trì mức tối đa khoảng 70% ở các giai

đoạn (Gao et al., 2004).

2.1.4.4. Điều kiện thổ nhưỡng

Các nguyên tố vô cơ trong rễ Đan sâm, đƣợc thu thập từ khu vực sản xuất

khác nhau, và các tính chất hóa lý của đất ở các vùng đã đƣợc phân tích. Các

thuộc tính chính của đất trồng Đan sâm trong khu vực sản xuất khác nhau là thịt

pha cát và sét, và độ pH của đất trong khoảng 6,0 - 8,7. Không có thành phần

chính rõ ràng cho sự phát triển của Đan sâm đã đƣợc tìm thấy trong đất. Do đó,

Đan sâm có khả năng thích ứng tốt trong môi trƣờng sinh thái đất khác nhau

(Zhao et al., 2004).

Nghiên cứu của Zhao et al.,(2004) cũng chỉ ra rằng thành phần dinh dƣỡng

trong các loại đất khác nhau là không cao và thậm chí rất thấp trong một số khu vực

sản xuất nhất định. Ví dụ, các chất hữu cơ của đất ở tỉnh Sơn Đông là dƣới 1%, và

tổng nitơ chỉ là 0,04%. Bên cạnh đó, một vài địa phƣơng trồng Đan sâm ở tỉnh Tứ

Xuyên và tỉnh Hà Nam nơi mà có phốt pho hữu hiệu trong đất nhiều hơn 15ppm,

các địa phƣơng trồng khác ở mức thấp (5-10 ppm). Liên quan đến nguyên tố vi

lƣợng, có sự tƣơng quan có thể đƣợc tìm thấy giữa các khu vực sản xuất và số lƣợng

nguyên tố vi lƣợng.

Theo Huang et al.,(2015) Đan sâm phát triển tốt trên đất cát pha giàu dinh

dƣỡng và thích nghi rộng với điều kiện pH từ hơi a xít đến hơi kiềm. Đất trồng

Đan sâm thƣờng đƣợc chọn là đất có tầng canh tác dày và thoát nƣớc tốt.

2.1.5. Giá trị dƣợc liệu

Những nghiên cứu về thành phần hóa học trên Đan sâm bắt đầu từ năm 1930 (Zhou et al., 2005). Ban đầu, ngƣời ta quan tâm hơn tới các thành phần hòa tan trong lipid (Chang et al., 1990). Kể từ khi danshensu đƣợc phân lập từ nƣớc sắc thuốc Đan sâm trong những năm đầu của thập niên 1980, các nghiên cứu

đƣợc mở rộng thêm trên các thành phần hòa tan trong nƣớc. Ngoài ra, Đan sâm cũng có một số flavonoids, triterpenoids và sterols. Một số các hợp chất này đã

đƣợc biết tới là các chất hoạt tính sinh học có thuộc tính dƣợc liệu (Lu and Foo,

2002; Jiang et al., 2005).

Dịch chiết Đan sâm khi đƣợc chiết xuất bằng rƣợu đặc biệt có nhiều các

sắc tố diterpene nhƣ phenanthrenequinones (Chang et al., 1990), trong khi đó khi

đƣợc chiết xuất bằng nƣớc thì dịch chiết thu đƣợc chứa nhiều các hợp chất

phenolic (Lu and Foo, 2002).

Các thành phần hóa học chính trong rễ cây Đan sâm gồm các chất hòa tan

trong lipid nhƣ tanshinone I, tanshinone II, tanshinone II, cryptotanshinone…

Đây là các hợp chất có hoạt tính dƣợc học có tác dụng chống thiếu máu cục bộ,

kháng khuẩn, chống oxy hóa và các đặc tính kháng u…. (Gordon and Weng,

1992; Sze et al., 2005; Wang et al., 2005). Các thành phần hòa tan trong nƣớc

trong rễ cây Đan sâm gồm axit caffeic, các dẫm xuất của axit caffeic, axit

salvianolic …. Các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, ức chế adenylate

cyclase … (Kohda et al., 1989; Petersen and Simmonds, 2003).

Trong những năm gần đây, các hoạt tính dƣợc lý của Đan sâm đã đƣợc

nghiên cứu rộng rãi (Zhou et al., 2005). Hoạt tính dƣợc lý chính của nó bao gồm

chống thiếu máu cục bộ (Ji et al., 2000), chống oxy hóa (Zhao et al., 2005),

chống khuẩn (Fang et al., 1976) và chống ung thƣ (Yang et al., 2005). Các tính

năng này chủ yếu đƣợc thực hiện thông qua hoạt tính sinh học của các thành

phần hòa tan trong lipid nhƣ tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone (Ji

et al., 2000) và các thành phần hòa tan trong nƣớc nhƣ axít salvianolic B (Lay et al., 2003). Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong hoạt tính dƣợc lý giữa các

thành phần hòa tan trong lipid và các thành phần hòa tan trong nƣớc. Trƣớc đây

chủ yếu ngƣời ta thấy tác dụng kháng khuẩn và điều chỉnh nội tiết, sau này hoạt tính chống oxy hóa mới đƣợc thấy rõ ràng hơn (Zhou et al., 2005). Thêm vào đó,

mỗi thành phần hoạt tính sinh học cụ thể lại có hoạt tính dƣợc lý độc đáo riêng của nó. Do đó, một số thành phần hoạt tính sinh học và dẫn xuất của nó nhƣ Sodium tanshinone IIA sulfonate (STS) đã phát triển thành các loại thuốc cụ thể

với hiệu quả điều trị nhất định (Wu et al., 1993).

Các hoạt tính chống vi khuẩn của Đan sâm đƣợc tìm thấy đầu tiên từ

cryptotanshinone và dihydrotanshinone I (Fang et al., 1976). Sau đó, các hoạt

tính dƣợc học khác nhƣ ảnh hƣởng trên hệ tim mạch và hệ thần kinh cũng đã đƣợc chứng minh với Sodium tanshinone IIA sulfonate (Li et al., 2004b; Wang

et al., 2005).

2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

2.2.1. Trên thế giới

Với nhiều thành phần hoạt chất có tác dụng dƣợc lý cao, Đan sâm đã có lịch

sử 2000 năm sử dụng. Ở Trung Quốc, cây Đan sâm có nguồn gốc tự nhiên và

trồng trọt đều đƣợc sử dụng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, An Huy, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Hồ Bắc, Tứ Xuyên, Quý Châu, Sơn Tây, Quảng

Đông… trong đó các tỉnh Sơn Tây, Tứ Xuyên, Hà Bắc, Hà Nam và Sơn Đông là

khu vực sản xuất Đan sâm chất lƣợng và sản lƣợng cao. Theo Minhui et al.

(2013) ở Trung Quốc có trên 40 loài thuộc chi Salvia đƣợc sử dụng làm thuốc

chữa các bệnh khác nhau hàng ngàn năm nay. Trong những năm gần đây, nhu

cầu sử dụng dƣợc liệu Đan sâm đã tăng nhanh do việc sử dụng rộng rãi các sản

phẩm hòa tan trong nƣớc của Đan sâm và do những ƣu điểm vƣợt trội của loại

dƣợc liệu này. Nếu nhƣ năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì năm 2002 là 10.000 tấn trên toàn thế giới, trong số đó, 8.000

tấn tiêu thụ ở Trung Quốc (Wei, 2002) và đã lên tới 80.000 tấn/năm trong thời

gian gần đây (Hu et al., 2005). Có tới 80% công ty dƣợc và bệnh viện y học

Trung Quốc có nhu cầu về dƣợc liệu Đan sâm (Qin, 2006).

Y học cổ truyền Trung Quốc sử dụng Đan sâm nhƣ một thành phần hoặc

thành phần chính trong các thang thuốc. Trong khi đó, từ Đan sâm, y học hiện đại

đã tạo ra hơn 100 chủng loại thuốc và thực phẩm chức năng trong điều trị các bệnh

nhƣ nhƣ viêm gan, viêm thận cấp và mạn tính, hen phế quản, viêm thần kinh

ngoại, đau dây thần kinh tam thoa, đau đầu do mạch máu, ù tai do nguyên nhân

thần kinh, mụn nhọt...và đặc biệt là các bệnh lý tim mạch nhƣ thiểu năng tuần hoàn não, tai biến mạch não, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, thiểu năng mạch vành, xuất

huyết võng mạc, viêm động tĩnh mạch... Ngoài ra, Đan sâm cũng đƣợc sử dụng

dƣới các hình thức nhƣ dịch tiêm truyền, viên nén, viên nang, trà tan... (Qin, 2006).

Một trong các sản phẩm sử dụng phổ biến nhất có chứa dƣợc liệu Đan sâm là Thiên Sứ Hộ Tâm Đan do các nhà khoa học Trung Quốc bào chế trên cơ sở kết hợp hai loại thảo dƣợc là Đan sâm và tam thất để phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch nhƣ đau thắt ngực, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tăng cholesterol máu… Đặc biệt, Thiên Sứ Hộ Tâm Đan là thuốc đông dƣợc đầu

tiên và duy nhất hiện nay đƣợc ơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ (Food and Drug Administration of USA – FDA) thông qua giai đoạn II. Nghiên cứu FDA

giai đoạn II mang của Thiên Sứ Hộ Tâm Đan đã đƣợc hoàn thành trong vòng 18

tháng tại 15 trung tâm nghiên cứu lâm sàng ở Mỹ. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau

4 tuần liên tục sử dụng thuốc thì khả năng gắng sức, số lần xuất hiện cơn đau thắt ngực mỗi tuần, lƣợng thuốc Nitroglycerin tác dụng nhanh cần dùng của bệnh nhân

đã giảm đi đáng kể. Sau 4 tuần sử dụng thuốc, sự khác biệt về khả năng gắng sức của bệnh nhân giữa nhóm dùng thuốc và nhóm không dùng thuốc là có ý nghĩa

thống kê về mặt khoa học. Số lần xuất hiện cơn đau thắt ngực mỗi tuần cũng đã

giảm tới hơn 75%. Kết quả nghiên cứu càng đƣợc cải thiện rõ rệt sau 8 tuần liên tục

sử dụng. Đặc biệt, Thiên Sứ Hộ Tâm Đan có thành phần hoàn toàn từ thảo dƣợc

thiên nhiên nên rất an toàn trong quá trình sử dụng. Từ đó FDA Mỹ khẳng định " Sử dụng Thiên Sứ Hộ Tâm Đan 10 viên 1 lần, 3 lần 1 ngày liên tục từ 4 đến 8 tuần giúp

điều trị và dự phòng hiệu quả, an toàn cơn đau thắt ngực ổn định mạn tính bệnh

mạch vành". Bên cạnh đó đã có nhiều bằng chứng chứng minh hiệu quả điều trị của

Thiên Sứ Hộ Tâm Đan đối với bệnh nhân gặp phải các vấn đề tim mạch nói chung,

đó là xơ vữa động mạch, huyết áp cao, mỡ máu cao…(Linh Doan, 2012).

Có mặt trên thị trƣờng từ năm 1993, tính đến nay có hơn 2 tỷ liều dùng

đƣợc kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị trong thời gian ngắn hoặc

kéo dài tại 34 Quốc gia trên toàn thế giới nhƣ Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam

Phi, Việt Nam... Tác dụng nhanh chóng và hiệu quả của Thiên Sứ Hộ Tâm Đan

đƣợc lý giải là nhờ ứng dụng khoa học công nghệ tiên tiến vào sản xuất. Đan sâm

và Tam Thất trong Thiên Sứ Hộ Tâm Đan đƣợc chiết xuất ra những thành phần

có tác dụng chọn lọc trên tim mạch, đƣợc bào chế dƣới dạng Viên hoàn giọt tác

dụng nhanh, hấp thu nhanh. Thiên Sứ Hộ Tâm Đan lần đầu tiên đƣợc FDA Mỹ

thông qua giai đoạn II là một điểm đáng tự hào, một niềm hi vọng mới trên con

đƣờng phát triển ngành Đông dƣợc hiện đại (Linh Doan, 2012).

2.2.2. Tại Việt Nam

Đan sâm đƣợc di thực và sử dụng từ những năm 1960 ở Việt Nam và hiện nay loại dƣợc liệu này đƣợc trồng ở Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Hà Nội (Văn Điển) và một số vƣờn thuốc khác (Ngô Quốc Luật và cs.,

2014). Theo báo cáo tại Hội nghị Dƣợc liệu toàn quốc năm 2003 về Phát triển dƣợc liệu bền vững trong thế kỷ 21, trên thị trƣờng dƣợc liệu Việt Nam, nguyên liệu cây thuốc Đan sâm phải nhập khẩu 100% từ Trung Quốc. Trong danh mục

dƣợc liệu nhập khẩu của năm 2001 và 2002, chỉ riêng chi nhánh Công ty Nam Hà, tỉnh Lạng Sơn đã nhập khẩu lên tới trên 50 tấn dƣợc liệu Đan sâm mỗi năm.

Hầu hết các đơn thuốc chữa bệnh từ dƣợc liệu đều có thành phần Đan sâm với

liều lƣợng trung bình 10g/ thang. Năng suất của cây trồng này ƣớc tính từ 1,16 –

2,65 tấn khô/ha, hàm lƣợng tanshinon IIA tích lũy đạt từ 0,21% - 0,87% (Ngô Quốc Luật và cs., 2014) và giá thành ở trong nƣớc là 250 – 300 nghìn đồng/kg

khô. Hiện nay, đã có rất nhiều các sản phẩm thuốc đông dƣợc có chứa thành phần dƣợc liệu Đan sâm đƣợc sản xuất và tiêu thụ trên thị trƣờng Việt Nam

(Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Một số thực phẩm chức năng chứa dƣợc liệu Đan sâm tại Việt Nam

Sản phẩm

Công dụng

Công ty sản xuất

Thành phần

Opcardio

Công ty OPC

Đan sâm, tam thất

Phòng và điều trị xơ vữa động mạch vành và đau thắt ngực

Đan sâm tam thất hoàn

Công ty CP Y dƣợc Phong

Đan sâm, tam thất

Đau thắt ngực do bệnh tim mach, thần kinh liên sƣờn, rối loạn thần kinh giao

Phú

cảm, giảm mỡ máu, tan huyết khối, huyết cục, co thắt mạch vành.

Đan sâm- Tam thất

Công ty TNHH Vạn Xuân

Đan sâm, tam thất

Phòng và điều trị chứng đau thắt ngực, thiểu năng tuần hoàn não

Hộ tâm đơn Vinapharm

Đan sâm,

Dự phòng và điều trị: chứng đau thắt

tam thất

ngực do suy vành và cảm giác ngột ngạt trong ngực, các bệnh mạch vành,

xơ cứng động mạch.

Hoạt huyết

Công ty cổ phần

Đan sâm Hoạt huyết, bổ huyết, lƣu thông tuần hoàn

Nam dƣợc

máu, phòng ngừa và điều trị thiểu năng tuần hoàn não, nhồi máu cơ tim….

2.3. CƠ SỞ XÁC ĐỊNH CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT TRỒNG

2.3.1. Cơ sở xác định thời vụ, mật độ và phân bón cho cây trồng

Mật độ, phân bón và thời vụ trồng đã đƣợc khẳng định là những yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất cây trồng nói chung và cây dƣợc liệu nói riêng

(Đào Văn Núi và cs., 2014; Adeniyan, 2014). Giải quyết tốt vấn đề về khoảng cách mật độ tức giải quyết tốt mối quan hệ giữa sinh trƣởng và phát triển của các cá thể làm cho quần thể cây khai thác tốt nhất khoảng không gian (không khí,

ánh sáng) và mặt đất (khai thác nƣớc, dinh dƣỡng trong đất) nhằm thu đƣợc sản

lƣợng cao nhất trên một đơn vị diện tích.

Mật độ trồng càng dày thì sự cạnh tranh diễn ra càng quyết liệt. Dƣới đất,

cạnh tranh về dinh dƣỡng, nguồn nƣớc, để phát triển bộ rễ để nâng đỡ cây và nuôi cây. Trên khoảng không gian, để có thể lấy đƣợc ánh sáng khi phải cạnh tranh với

các cây khác cây sẽ phải tăng trƣởng chiều cao một cách tối đa, chính vì vậy sẽ làm

cho thân nhỏ, cây yếu, số cành ít, nhỏ, số cặp lá trên cành giảm, sức chống chịu kém

trƣớc các điều kiện ngoại cảnh, khả năng chống đổ kém (Porter et al., 1997).

Khi trồng ở mật độ thƣa cây sẽ không phải cạnh tranh nhau nhiều do vậy

cây sẽ có điều kiện phát triển tốt cho năng suất cá thể cao nhƣng năng suất quần

thể lại giảm, bên cạnh đó cây sẽ bị ảnh hƣởng nhiều bởi điều kiện ngoại cảnh do

tính quần thể bị giảm, khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận

cũng bị ảnh hƣởng, cỏ dại tăng. Khoảng cách trồng thích hợp sẽ giúp cho cây sử

dụng đƣợc tối đa các điều kiện của đồng ruộng từ đó giúp cây sinh trƣởng phát

triển tốt, khả năng tích luỹ của cây tăng từ đó có thể tăng năng suất và tăng sản

lƣợng cũng nhƣ hiệu quả kinh tế (Johnson et al., 1998).

Tác giả Kumar et al., (2011) cho rằng bên cạnh kiểu gen tốt, điều kiện cần

và đủ để tạo cho cây trồng có năng suất cao, chất lƣợng tốt phải kể đến các yếu tố

thời vụ và phân bón. Thời vụ khác nhau chính là nhiệt độ, lƣợng mƣa snh sáng

khác nhau do đó ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng, phát triển, năng suất cây

trồng. Thời vụ trồng thích hợp cho phép cây trồng đƣợc sinh trƣởng phát triển

trong điều kiện tốt nhất về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, lƣợng mƣa … và cho năng

suất cao nhất và ngƣợc lại. Lƣợng phân bón thích hợp là chìa khóa quyết định

năng suất cây trồng (Tariq et al., 2007).

Chất lƣợng dƣợc liệu trong cây thuốc đƣợc quyết định bởi thành phần các

chất trong cây. Các chất này đƣợc tổng hợp chịu ảnh hƣởng của rất nhiều các yếu tố, trong đó kiểu gen, điều kiện ngoại cảnh (thời vụ) mật độ và đặc biệt là yếu tố

phân bón đƣợc nhiều tác giả khẳng định có ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng dƣợc liệu (Baranauskiene et al., 2003; Sifola and Barieri, 2006; Dordas, 2009; Babalar et al., 2010).

Điều đó khẳng định, muốn một loại cây trồng phát huy hết khả năng sinh trƣởng cho năng suất chất lƣợng dƣợc liệu cao trong sản xuất, việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật trồng phù hợp là

cần thiết.Trong đó mật độ, thời vụ và phân bón là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển của cây. Cây Đan sâm là cây trồng mới nhập nội vào

Việt Nam, là cây dƣợc liệu quý, nhiều triển vọng để phát triển. Tuy nhiên, những

nghiên cứu góp phần phát triển loài cây này trong sản xuất còn rất hạn chế. Đặc

biệt thiếu các nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật. Do vậy, thực hiện các nghiên cứu này là cần thiết.

2.3.2. Phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm Cây Đan sâm có thể nhân giống hữu tính bằng hạt hoặc vô tính từ rễ củ,

tách chồi và phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al.,

2002; Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Các phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm

Phƣơng pháp

Phƣơng pháp nhân giống

Phƣơng pháp nhân giống hữu tính

nhân giống bằng tách chồi

nhân giống từ rễ củ

Hạt

Chồi

Rễ củ

Vật liệu

Không có thông tin

1. Chuẩn bị cây con và chuyển cây ra đồng ruộng

Gieo hạt: tháng 7-8 hoặc tháng 2-3 Chuyển cây ra đồng

Giâm củ: tháng 2-3 Chuyển cây

Mùa vụ

đồng ruộng: khi cây đạt chiều cao

ruộng: cuối tháng 10 hoặc khi cây đạt chiều

6-10 cm

cao 6-10 cm

Tháng 2-3

2. Trồng cây trực tiếp

Tháng 8 hoặc tháng 3 Cuối tháng 10 đến đầu tháng 11

1. Chuẩn bị cây con và chuyển cây

Lƣợng hạt: 15,0-22,5 kg/ha

Không có thông tin

Mật độ trồng 33 x 23 cm

ra đồng ruộng

Mật độ gieo hạt: hàng cách hàng 12 - 15 cm

Mật độ trồng: 33 (30- 35 cm) x 23 (20)

Quy trình

2. Trồng cây trực tiếp

Lƣợng hạt: 7,5 kg/ha Gieo xạ: hàng cách

Mật độ trồng: 33x23 cm

Mật độ trồng: 33 x 23 cm

hàng 30-35 cm Mật độ cây: 30-35 x

20-25 cm

Nguồn: Sheng (2007)

2.3.2.1. Nhân giống bằng hạt

Phƣơng pháp nhân giống bằng hạt ở cây Đan sâm gặp nhiều khó khăn do

khả năng thụ phấn và tỷ lệ kết hạt thấp, đồng thời hạt chín rải rác nên rất khó thu

hạt. Hơn nữa, cây Đan sâm trồng từ hạt cần tới 2 năm để thu dƣợc liệu (Wang et al., 2002). Tuy nhiên theo nghiên cứu của An et al. (2004), nồng độ tanshinone

IIA trong cây gieo từ hạt cao hơn so với cây nhân giống vô tính.

2.3.2.2. Nhân giống từ rễ củ

Đây là phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm truyền thống đƣợc sử dụng

rộng rãi ở các vùng trồng Đan sâm hiện nay (Zhang and Zhang, 2004; Jiang et al.,

2004). Đây là phƣơng pháp sử dụng rễ củ tƣơi cây Đan sâm làm vật liệu nhân

giống. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là hệ số nhân giống thấp. Theo nghiên

cứu của Đào Văn Núi và cs. (2014), tỷ lệ tạo chồi từ rễ củ Đan sâm là 61,11% với

hệ số nhân 1,0 chồi/ mẫu.

2.3.2.3. Nhân giống bằng phương pháp tách chồi

Cây Đan sâm nhân bằng phƣơng pháp tách chồi có tốc độ sinh trƣởng

mạnh hơn so với cây nhân bằng các phƣơng pháp khác. Tuy nhiên hạn chế của

phƣơng pháp này là cây con tách ra phải có đủ rễ để phát triển và khả năng lây

nhiễm bệnh qua các thế hệ cao (Zhang and Zhang, 2004; Wang et al., 2002).

2.3.2.4. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Với ƣu điểm là hệ số nhân giống cao, cây giống có chất lƣợng đồng đều,

phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro đã và đang đƣợc áp dụng để nhân nhanh

rất nhiều cây dƣợc liệu (Gao et al., 1992; Canter et al., 2005; Debnath et al.,

2006; Sato et al., 2006). Đã có rất nhiều nghiên cứu nhân giống Đan sâm bằng

phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật sử dụng các vật liệu nuôi cấy khác

nhau (Wang et al., 2004; Xu and Sun, 2008; Tạ Nhƣ Thục Anh và cs., 2014).

2.3.3. Mật độ trồng Trong các yếu tố kỹ thuật để tăng năng suất cây trồng, ngoài phân bón và cách bón phân thì mật độ quần thể ảnh hƣởng lớn đến sự sinh trƣởng phát triển của cây trồng. Trong trƣờng hợp cây thuốc, mật độ trồng còn ảnh hƣởng đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu (Liu et al., 2006b; Yu et al., 2006). Mật độ trồng quá dày sẽ dẫn đến sự cạnh tranh dinh dƣỡng, ánh sáng quyết liệt, ảnh hƣởng đến

năng suất (Liu et al., 2006b; Yu et al., 2006). Ngƣợc lại, mật độ quá thƣa làm

lãng phí đất và nguồn nƣớc.

Liu et al. (2006) nghiên cứu ảnh hƣởng của khoảng cách trồng đến khả năng sinh trƣởng phát triển của cây Đan sâm trồng tại tỉnh Shanxi, Trung Quốc.

Bảy khoảng cách đƣợc khảo sát là 20 × 20 cm, 25 × 20 cm, 25 × 25 cm, 25 × 30

cm, 30 × 25 cm, 35 × 25 cm và 35 × 30 cm. Kết quả cho thấy tại khoảng cách 20

x 20 cm, tỷ lệ cây sống thấp nhất (47%) trong khi có đến 88% cây sống ở khoảng cách trồng 25 x 20 cm. Khoảng cách trồng gần hơn dẫn đến sự che lấp lẫn nhau

của các bộ phận trên mặt đất làm hạn chế sự quang hợp của các lá giữa và dƣới

dẫn đến sự kém phát triển của cây.

Ở chỉ tiêu năng suất rễ, khoảng cách 25 x 25 cm (mật độ 16 cây/m2) cho khối lƣợng rễ đạt cao nhất, cao hơn 20% so với khối lƣợng rễ thu đƣợc khi trồng

cây ở khoảng cách 35 x 30 cm và 60% so với khoảng cách 35 x 25 cm.

Bên cạnh việc ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của cây, mật độ trồng

còn ảnh hƣởng đến sự tích lũy hợp chất tanshinone IIA ở cây Đan sâm. Nhìn

chung, mật độ cao ảnh hƣởng đến sự phân bố của rễ trong đất, số lƣợng rễ nhánh

và chiều dài rễ, do vậy ảnh hƣởng đến diện tích bề mặt của lớp ngoại bì của rễ dẫn

đến làm tăng hoặc giảm hàm lƣợng tanshinone IIA trong cây Đan sâm. Hàm lƣợng

tanshione IIA đạt cao nhất khi trồng cây Đan sâm ở khoảng cách 25 x 20 cm (20 cây/m2). Ngƣợc lại, hàm lƣợng tanshinone IIA thấp hơn khi trồng cây ở mật độ cao hơn (khoảng cách 25 x 25 cm và 35 x 35 cm) (Liu et al., 2006).

Hiện nay, ở các quy trình trồng cây Đan sâm thƣờng sử dụng mật độ trồng

khá cao với khoảng cách hàng 25 cm hoặc 30 cm, khoảng cách cây 20 cm hoặc

25 cm. Mật độ trồng này kích thích sự tổng hợp hoạt chất tanshione IIA (Wang et

al., 2003; Jiang et al., 2004).

2.3.4. Phân bón Đối với cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng phân bón là nhu cầu

cần thiết để cây trồng sinh trƣởng phát triển. Đồng thời, bón phân còn quyết định cả năng suất và hoạt chất của cây. Chế độ phân bón hợp lý sẽ tạo điều kiện cho

cây sinh trƣởng phát triển thuận lợi, cho năng suất cao, chất lƣợng dƣợc liệu tốt. Chế độ phân bón quá cao cây sinh trƣởng mạnh tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển, dƣ lƣợng hóa chất tồn dƣ trong sản phẩm nhiều không kiểm soát đƣợc, có hại đến sức khỏe của ngƣời sử dụng. Chế độ phân bón quá thấp cây sinh trƣởng kém, còi cọc, năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu thấp. Do đó, xác định đƣợc lƣợng phân bón thích hợp cho năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu tốt có ý nghĩa lớn đối

với sản xuất dƣợc liệu.

Đối với cây Đan sâm đất trồng cần chọn đất phù sa, đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều màu, cao ráo, thoát hơi nƣớc. Sau khi cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 – 25

cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nƣớc. Dùng 15 – 20 tấn phân chuồng

ủ với 1,4 – 2,8 tấn tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho một heta. Tốt nhất, nên

bón theo hốc để tiết kiệm phân và hạn chế cỏ dại. Hốc đƣợc chuẩn bị với khoảng cách 30 x 30 cm. Sau đó đặt mầm giống, lấp đất và tƣới giữ ẩm. Đan sâm thƣờng

trồng trên đất tốt, đủ ẩm nên cỏ dại mọc nhiều. Vì vậy, cần thƣờng xuyên làm cỏ, xới xáo cho đất tơi xốp, thông thoáng. Chú ý về sau càng phải xới mạnh, cần bón

thúc 2 - 3 lần, mỗi lần dùng 80 - 100 kg ure pha loãng để tƣới cho mỗi heta,

khoảng cách giữa hai lần bón thúc là 25 - 30 ngày (Zhang and Cheng, 1999).

2.3.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của cây Đan sâm

Cây Đan sâm hấp thu rất đa dạng các chất dinh dƣỡng. Do có bộ rễ phát

triển nên khả năng hấp thụ dinh dƣỡng của cây Đan sâm rất mạnh, không chỉ từ

các chất ở lớp đất bề mặt, mà cả từ các chất ở các lớp đất sâu (Chen et al., 1991;

Chen et al., 1992) nghiên cứu nhu cầu dinh dƣỡng của cây Đan sâm thông qua

thí nghiệm trồng cây trên cát và cung cấp dinh dƣỡng calcium nitrate, ammonium

sulphate, potassium dihydrophosphate và magnesium sulfate ở các hàm lƣợng

khác nhau. Kết quả cho thấy sinh khối thân lá và rễ cây Đan sâm cao hơn khi

tăng lƣợng dinh dƣỡng bổ sung. Năng suất rễ cây Đan sâm khi trồng trong điều

kiện đủ dinh dƣỡng cao hơn 40,7% so với cây Đan sâm khi trồng trong điều kiện

thiếu dinh dƣỡng (Chen et al., 1992).

Chen et al. (1992) cũng đã xác định nồng độ N và P trong cây và sinh

khối rễ khô tại các liều lƣợng bón phân khác nhau và tại các thời điểm sinh

trƣởng khác nhau. Hai thời điểm hấp thụ N và P cao nhất của cây Đan sâm là 90 -

100 ngày và 150 - 170 ngày sau khi trồng. Ở giai đoạn đầu tiên, cây Đan sâm

phát triển mạnh các bộ phân sinh dƣỡng, sau đó mới bắt đầu chuyển sang giai

đoạn tích lũy hoạt chất thứ cấp, do vậy, bón phân kết hợp N và P ở các liều lƣợng

khác nhau làm tăng đáng kể sinh khối rễ khô so với đối chứng (không bón phân).

90 - 100 ngày sau khi trồng là thời điểm lan rộng của rễ cây Đan sâm, do vậy nhu

cầu N và P của cây cao hơn (Han et al., 2003). Giai đoạn thứ 2 (150 – 170 ngày

sau khi trồng) là thời điểm chuyển tiếp từ giai đoạn chín của hạt sang giai đoạn

lan rộng của nhóm rễ thứ 2 và cây hấp thụ nhiều dinh dƣỡng hơn. Mặt khác, kết

quả nghiên cứu cũng chỉ ra, nồng độ chlorophyll trong cây ở các công thức bón

phân cao hơn so với công thức đối chứng không bón phân. N kích thích quá trình

quang hợp của cây Đan sâm, kết quả làm nâng cao sự tích lũy chất khô trong cây

(Han and Liang, 2005). Theo Han et al. (2003), tăng lƣợng phân bón có chứa N

và P làm tăng khả năng hấp thu N và P từ đất của cây Đan sâm.

Bên cạnh các nguyên tố đa lƣợng, thì các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Bo, Mn

và Fe có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng, phát triển và sự tích lũy hợp chất

mục tiêu của cây Đan sâm (Han and Liang, 2005).

2.3.4.2. Ảnh hưởng của phân bón đến sự sinh trưởng, phát triển của cây Đan sâm

Chen et al. (1991) bón bổ sung N và P cho cây Đan sâm ở các hàm lƣợng khác nhau và nhận thấy khi bón bổ sung 225 kg/ha ammonium sulphate và 300

kg/ha super phosphate cho sinh khối rễ đạt cao nhất, tăng 26,66% so với đối

chứng (bón 29,985 kg/ha).

Yang and Teng (2005) nghiên cứu ảnh hƣởng của ba loại phân bón (phân

hỗn hợp, phân chuồng và phân vi sinh) đến sự sinh trƣởng của rễ cây Đan sâm.

Kết quả cho thấy, phân chuồng đóng vai trò lớn nhất đến năng suất rễ. Sinh khối

rễ tƣơi đạt đƣợc cao nhất (23.200 kg/ha) khi bón phân kết hợp 750 kg/ha phân

hỗn hợp, 11.244 kg/ha phân chuồng và 22,5 kg/ha phân vi lƣợng chứa Bo.

2.3.4.3. Ảnh hưởng của phân bón đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu

N và P đóng vai trò trái ngƣợc trong sự tích lũy tanshione IIA và

danshensu. Trong nghiên cứu của Han et al. (2005); Han and Liang (2005) hàm

lƣợng tanshione IIA và danshensu giảm khi tăng lƣợng phân N, trong khi đó hàm

lƣợng tanshinone IIA và danshensu tăng khi tăng lƣợng phân bón P. Khi bón

phân cân đối giữa N, P và K sẽ làm tăng tối đa sự tích lũy tanshione IIA.

Mặt khác, tăng lƣợng phân bón chứa nguyên tố vi lƣợng Fe, Bo, Zn, Mn

làm tăng khả năng tích lũy các hoạt chất mục tiêu trong rễ Đan sâm. So với công

thức đối chứng không bón phân vi lƣợng, khi bón bổ sung phân vi lƣợng có thể

làm tăng hàm lƣợng danshensu lên 60% (Han et al., 2005).

2.4. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO

2.4.1. Khái niệm và cơ sở của khoa học của phƣơng pháp nhân giống in vitro Nhân giống bằng nuôi cấy mô, hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ đƣợc tách khỏi cây đang đƣợc dùng phổ biến để nhân giống thực vật. Các bộ phận

đƣợc dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác nhƣ vỏ cây, lá non, thân mầm....(Ngô Xuân

Bình, 2009).

Ƣu điểm chính của nuôi cấy mô là cây mô đƣợc trẻ hoá cao độ và có rễ giống nhƣ cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây

mọc từ hạt. Một ƣu điểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số nhân

cao hơn nhân giống bằng hom, từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô liên

tục có thể sản xuất hàng triệu cây con. Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một trong những biện pháp làm sạch bệnh. Vì thế mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật

phức tạp, giá thành cao, song vẫn đƣợc nhiều nơi áp dụng.

Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật ngƣời Đức Haberlandt (1902) ông là ngƣời đầu tiên đƣa ra quan điểm rằng: Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Các tế bào cũng đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Ngô Xuân Bình, 2009).

Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất này trong môi trƣờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi trong môi trƣờng nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hƣớng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hƣớng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hƣớng tạo mô sẹo (callus) (Nguyễn Quang Thạch, 2000).

Ngày nay, một số phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đang đƣợc áp

dụng phổ biến bao gồm:

Nuôi cây đỉnh sinh trƣởng: Phƣơng pháp thuận lợi có thể đạt đƣợc mục tiêu trong nuôi cấy tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (bao gồm mô phân sinh

đỉnh và mô phân sinh bên). Từ một đỉnh sinh trƣởng, sau một thời gian nuôi cấy

nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó, chồi tiếp tục vƣơn dài

hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phƣơng thức nhân giống thông thƣờng khác.

Nuôi cấy bằng mô sẹo: trong điều kiện môi trƣờng nuôi cấy có chứa nhiều

auxin, mô sẹo đƣợc hình thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hƣớng, thƣờng có màu trắng. Trong môi trƣờng phù hợp, mô sẹo có khả

năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy tế bào đơn: Khối mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng

và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dƣới tác

dụng của cơ học và các chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn.

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trƣờng lỏng, tế bào đơn đƣợc tách

ra và trải trên môi trƣờng thạch, tế bào đơn đƣợc phát triển thành từng cụm tế bào

mô sẹo khi môi trƣờng có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên

môi trƣờng có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp.

Nuôi cấy tế bào trần: thực chất là tế bào đơn đƣợc tách lớp vỏ cellulose,

có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Khi mất thành tế bào, tế bào

trần, hai tế bào trần có thể dung hợp với nhau, tạo ra con lai. Có thể sử dụng để

cải thiện các đặc tính quý của cây trồng.

Nuôi cấy hạt phấn: Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chƣa chín nuôi

trong môi trƣờng dinh dƣỡng, nhằm tạo cây đơn bội (Ngô Xuân Bình, 2009).

2.4.2. Tổng quan tài liệu về nghiên cứu nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro đƣợc áp dụng thành công trên nhiều đối tƣợng

cây dƣợc liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lƣợng một cách chủ động cho sản xuất. Tuy nhiên để nhân giống thành công cây trồng trong in vitro, rất nhiều

tác giả đã khẳng định, quá trình nhân giống chịu ảnh hƣởng của rất nhiều yếu tố

môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy.

Môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn đến khả năng tái sinh cây từ các bộ phận khác nhau (Sharswat and Chand, 2004). Có rất nhiều môi trƣờng dùng để nuôi cấy in vitro, nhƣng hầu hết trong in vitro đều sử dụng môi trƣờng nuôi cấy là MS (Murashige and Shoog, 1962), bởi vì môi trƣờng MS là môi trƣờng cây thích

hợp nhất vì nó chứa đựng tất cả các nguyên tố cần thiết cho cây trồng sinh trƣởng trong môi trƣờng in vitro. Tác giả Diallo et al. (2008) cho rằng việc nghiên cứu tạo

môi trƣờng thích hợp là cần thiết giúp tế bào trần tái sinh tốt trong in vitro.

Cơ quan thực vật sử dụng nuôi cấy in vitro (lá, cuống lá, lá mầm, phôi, rễ.... cũng là một trong những nhân tố quan trọng quyết định thành công nuôi cấy

in vitro (Gubis et al., 2003; Kumar et al., 2011). Có sự khác biệt giữa các cơ quan

thực vật ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro đƣợc cho là do mức độ khác nhau về

hormon nội sinh trong cây khác nhau giữa các cơ quan trong cây. Lá đƣợc cho là bộ phận sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy vì diện tích bề mặt lớn (Tyagi et al.,

2001). Trong một số nghiên cứu khác, sử dụng bộ phận nuôi cấy là thân cây loài

Solanum trilobotam cho khả năng tái sinh cao nhất (Alagumanian et al., 2004).

Kiểu gen là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến khả

năng tái sinh tế bào nuôi cấy in vitro (Reddy et al., 2008; Kumar and Reddy,

2011). Các tác giả cho rằng, các loài khác nhau một phần do hormon nội sinh

khác nhau, đặc biệt là tác động của hormon cytokinins trong giai đoạn đầu, mặc

dù cơ chế chƣa đƣợc rõ.

Chất điều hòa sinh trƣởng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro là hợp chất hữu cơ tự nhiên đƣợc tổng hợp ở thực vật bậc cao, nó có ảnh hƣởng lớn đến sự

sinh trƣởng, phát triển của cây trong in vitro. Cân bằng giữa auxin và cytokinin là

một trong những quan trọng nhất cho quá trình hình thành rễ và mầm bật định

(Kumar and Reddy, 2011). Hầu hết trong nhân giống in vitro đều sử dụng

cytokinins là kinetin, BA và 2 ip. Auxin (IAA, IBA, NAA hoặc 2,4 D) cũng

thƣờng xuyên đƣợc sử dụng để bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy làm thúc đẩy sự

hình thành callus và điều hòa sự hình thành và phát triển. Đặc biệt chú trọng kết

hợp với cytokinin (dẫn theo Kumar and Reddy, 2011).

Điều kiện môi trƣờng vật lý cũng tác động đến in vitro. Phản ứng của cây

nuôi cấy mô với quá trình trao đổi khí và độ ẩm bên trong bình nuôi đƣợc ghi nhận bởi Read and Preece (2003). Trao đổi khí CO2 trong bình, ảnh hƣởng đến quá trình quang hợp, hô hấp của cây. Các tác giả khẳng định rằng độ ẩm tƣơng đối trong bình thích hợp từ 98 - 100% (Kumar and Reddy, 2011). Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố môi trƣờng điều khiển sự sinh trƣởng và phát triển của cây trong điều kiện in vitro, bởi vì liên quan đến hoạt động quang hợp, quang hô hấp và quá trình phát sinh hình thái (Read and Preece, 2003). Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình sinh trƣởng của rễ và

mầm, trong khi đó, trong điều kiện tối sẽ thích hợp cho quá trình hình thành rễ, quá trình này đƣợc điều khiển bởi hornmon nội sinh IAA. Khi nghiên cứu về yếu tố

nhiệt độ, hầu hết các tác giả đều cho rằng, nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy in vitro trong khoảng 20 - 270C tùy thuộc vào loài ( Read and Preece, 2003).

Nhân sâm là một loại thảo dƣợc lâu năm đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một vị thuốc bổ, một dƣợc phẩm quý giá. Furuya et al. (1973) đã nuôi cấy mô callus

nhân sâm để thu nhận hợp chất saponins và sapogenins. Các nghiên cứu trên cây

nhân sâm chủ yếu tập trung vào nhân sinh khối nhằm phục vụ cho công nghiệp dƣợc. Năm 1994, Choi nghiên cứu nhân nhanh in vitro nhân sâm thành công trên

quy mô công nghiệp. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) là một loài sâm đặc

hữu của Việt Nam đƣợc biết đến từ năm 1973, không chỉ là loài sâm quý của Việt Nam mà còn trên thế giới. Nhân giống vô tính in vitro trên đối tƣợng sâm

Ngọc Linh đã đƣợc thực hiện và hành công bởi Nhut et al. (2010). Sau đó, Nhut

et al. (2012) đã nghiên cứu thành công quy trình tạo phôi từ thân rễ của cây sâm

Ngọc Linh. Vũ Thị Hiền và cs. (2014) đã thành công trong việc cảm ứng tạo phôi

trực tiếp từ lá và cuống lá.

Đinh lăng là một loài thực vật chứa nhiều saponin, có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress. Sau 3 năm nghiên cứu (2008 - 2011), Salwa et al.

(2014) đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro từ đoạn thân non

mang mầm ngủ. Tại Việt Nam, Phạm Thị Tố Liên và cs. (2007) đã tạo thành

công phôi vô tính thông qua cảm ứng callus từ mô lá non in vitro cây đinh lăng.

Reddy et al. (1998) đã nhân giống in vitro thành công cây dây thìa canh

(Gymnema sylvestre), một cây thuốc quý cho bệnh nhân tiểu đƣờng, với hệ số nhân trên môi trƣờng MS+ 5 mg/l BA+ 0,2 mg/l α-NAA đạt 7 lần. Sau đó,

Komalavalli and Rao (2000); Arunakumara et al. (2013) cũng đã nhân giống

thành công dây thìa canh bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô in vitro cho hệ số nhân

giống cao, cây giữ nguyên đặc tính so với cây mẹ.

Chow et al. (1982) đã nghiên cứu thành công nhân loài lan kim tuyến Anoectochilus formosannus từ hạt với môi trƣờng nhân nhanh chồi là môi trƣờng ½ MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l α- NAA. Tsay et al. (2002) đã sử dụng các mắt đốt thân lấy từ cây lan kim tuyến Anoectochilus formosanus Hayata 2 năm tuổi làm vật liệu nhân nhanh in vitro trên

môi trƣờng MS lỏng dung tích 500 ml + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-NAA + 2% than

hoạt tính. Tại Việt Nam, Nguyễn Quang Thạch và cs. (2012) đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây lan kim tuyến Anoectochilus setaceus

Blume từ mắt đốt ngang thân cho hệ số nhân chồi cao (6,55 chồi/mẫu) và chất

lƣợng cây tốt. Trƣơng Thị Bích Phƣợng và cs. (2013), nghiên cứu nhân nhanh in

vitro cây lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl từ đỉnh sinh trƣởng và đoạn thân mang mắt ngủ với hệ số nhân chồi đạt 4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi

cấy trên môi trƣờng MS + 1,0 mg/l Kinetin+ 0,3 mg/l α-NAA.

Trên chi Hibiscus, Samanthi et al. (2004) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Hibiscus cannabinus từ vật liệu là

chồi non cùng đƣợc cắt ra từ hạt nảy mầm 10 ngày tuổi. Kết quả cho thấy hệ số

nhân chồi đạt cao nhất (11 lần) trên môi trƣờng MS có bổ sung 8,8 µM BA.

Đã có rất nhiều nghiên cứu nhân nhanh in vitro các loài lan thuộc có giá

trị dƣợc liệu cao thuộc chi Dendrobium nhƣ lan Phi Điệp vàng - Dendrobium

chrysanthum (Subarna et al., 2010); lan Dendrobium wangliangii (Dake et al.,

2013), lan Thạch hộc - Dendrobium nobile Lindl. (Vũ Ngọc Lan và cs., 2013);

lan Hoàng thảo long nhãn – Dendrobium fimbriatum Hook (Nguyễn Thị Sơn và

cs., 2012)…

Một đối tƣợng khác là cây ba kích (Morinda officinalis How) cũng đƣợc tái

sinh thành công với vật liệu ban đầu là đoạn thân mang chồi nách trên môi

trƣờng thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + 1 mg/l BA với tỷ lệ chồi tái sinh sau 4

tuần nuôi cấy là 96,6%. Môi trƣờng nhân nhanh thích hợp là MS + 3,0 mg/l BA

+ 0,2 mg/l IBA 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân là 10,13 lần

(Hoàng Thị Thế và cs., 2013).

2.4.3. Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm Nhiều công trình nhân giống vô tính cây Đan sâm với mục đích tạo ra

giống chất lƣợng cao đã đƣợc công bố. Cai et al. (1991) tiến hành nhân nhanh cây Đan sâm từ vật liệu mô lá. Tỷ lệ mô lá tái sinh tạo chồi đạt cao nhất trên môi

trƣờng MS + 0,5 – 1,0 mg/l BA. Môi trƣờng cảm ứng ra rễ tốt nhất cho chồi Đan

sâm là ½ MS + 0,2 – 1,0 mg/l IBA.

Theo nghiên cứu của Zhao et al. (2003), đoạn thân non cây Đan sâm là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo callus trên môi trƣờng MS + 0,5 mg/l BA + 0,5

mg/l 2,4D. Để tái sinh và nhân nhanh chồi, callus đƣợc chuyển sang môi trƣờng

MS + 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA. Bổ sung IBA ở nồng độ 0,5 mg/l vào môi

trƣờng ½ MS cho hiệu quả ra rễ cao hơn so với khi bổ sung IAA hoặc α-NAA.

Feng et al. (2004) sử dụng đoạn thân non, lá và cuống lá làm vật liệu nhân

nhanh cây Đan sâm thông qua con đƣờng hoạt hóa chồi nách và tạo chồi bất

định. 100% đoạn thân mang mắt ngủ cảm ứng tạo chồi trên môi trƣờng MS + 1,0 mg/l BA và hệ số nhân chồi đạt 15 lần khi chuyển chồi sang môi trƣờng nhân

nhanh MS + 1,0 mg/l BA + 0,01 mg/l α-NAA. Trên môi trƣờng MS + 0,5 (hoặc

2,0) mg/l BA, 100% lá và cuống lá cảm ứng tạo chồi bất định; hệ số nhân chồi

đạt 24 lần trên môi trƣờng MS 1,0 mg/l BA. Môi trƣờng cảm ứng chồi Đan sâm ra rễ tốt nhất là ½ MS 0,1 mg/l IBA. Để thu đƣợc tỷ lệ cây sống 100% khi

trồng trên giá thể đất, cây Đan sâm in vitro đƣợc trồng trong hệ thống thủy canh

vài ngày trƣớc khi chuyển ra trồng trên đất.

Xu and Sun (2008) khảo sát khả năng nhân nhanh in vitro cây Đan sâm từ

ba loại vật liệu là đoạn thân, cuống lá và lá của cây in vitro gieo từ hạt 1 tháng

tuổi và nhận thấy lá là nguồn vật liệu tốt nhất để cảm ứng tạo chồi bất định. Trên

môi trƣờng MS + 1,0 mg/l BA, 80% mô lá cảm ứng tạo chồi. Môi trƣờng MS +

1,0 mg/l cũng là môi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi với hệ số nhân đạt 25

chồi/mẫu. Để ra rễ cho chồi in vitro, các chồi đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS

+ 0,1 mg/l IBA + 10 g/l sucrose với tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 95%.

Tại Việt Nam, trƣớc nghiên cứu này, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu

liên quan đến nhân nhanh in vitro cây Đan sâm đƣợc thực hiện bởi Tạ Nhƣ Thục

Anh và cs. (2014). Tạ Nhƣ Thục Anh và cs. (2014) đã khảo sát ảnh hƣởng của

các chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng nhân in vitro cây Đan sâm sử dụng

vật liệu là chồi mầm từ củ giống. Nghiên cứu đã chỉ ra các chất điều tiết sinh trƣởng và nồng độ thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh

và kích thích ra rễ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro.

2.5. TẠO VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP

Sự hình thành rễ tơ nhờ chuyển các gen cảm ứng tạo rễ tơ của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật là một trong những con đƣờng rất thuận lợi nhằm làm tăng sinh khối rễ lớn, phục vụ sản xuất và thu nhận các hợp

chất tự nhiên với số lƣợng lớn.

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật gây ra bởi quá trình tƣơng tác giữa vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, một loại vi khuẩn đất gram âm, với tế bào vật chủ. Rễ

tơ đƣợc đặc trƣng bởi sự sinh trƣởng, phát triển nhanh, không hƣớng đất, không

phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trƣởng ngoại sinh và bền vững về mặt di truyền.

2.5.1. Cơ chế tạo rễ tơ Giống nhƣ vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid Ti, A. rhizogenes mang plasmid Ri (root-inducing) đƣợc xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế

bào thực vật bị xâm nhiễm. Khi bị tổn thƣơng, tế bào thực vật tiết ra các

polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây chúng chuyển một đoạn T-DNA

(transfer DNA) từ plasmid Ri vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế

quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế

bào vật chủ của hai vi khuẩn này đƣợc chứng minh là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin qui định, trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A.

rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật.

Plasmid Ri là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lƣợng phân tử

lớn từ 200 - 800 kb gồm 2 vùng chính là T-DNA và vir (virulence). T-DNA ở

plasmid Ri của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng bờ trái LB-DNA

và bờ phải RB-DNA. Hai vùng này đều có kích thƣớc khoảng 15 - 20 kb và đƣợc

xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn này không đƣợc chuyển vào hệ gen của tế bào vật

chủ. RB-DNA chỉ đƣợc tìm thấy ở plasmid Ri của các chủng thuộc nhóm

agropine, vùng này mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin và opine (aux1,

aux2, rolB TR, mas1, mas2 và ags) (Hình 2.2). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh

đƣợc các gen aux không giữ vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng sản sinh rễ

tơ mà chỉ đóng vai trò bổ trợ cho quá trình này. Các nghiên cứu cho thấy, sự biểu

hiện của các gen nằm trên T-DNA vùng bờ phải có khả năng cảm ứng hình thành

kiểu hình rễ tơ ở một số thực vật, tuy nhiên hình thái rễ tơ là không điển hình và tốc độ sinh trƣởng của rễ không mạnh nhƣ khi biểu hiện cả vùng bờ trái và vùng bờ phải. Điều này cho thấy, T-DNA vùng bờ trái là cần thiết để mở rộng đối tƣợng

vật chủ ở các chủng A. rhizogenes nhóm agropine.

Chuyển gen thông qua A. rhizogenes từ lâu đã đƣợc coi là phƣơng thức biến đổi hệ gen thực vật. Sự có mặt và hoạt động của các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn trong mô thực vật chuyển gen có khả năng cảm ứng hình thành rễ tơ ở nhiều

loài thực vật khác nhau. Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen nhờ A. rhizogenes chỉ áp dụng trên cây cảnh và chuyển gen tạo rễ tơ vào một số loài thực vật với mục đích sản xuất hợp chất thứ cấp, trong đó có một số cây dƣợc liệu quan trọng. Gần

đây, xu hƣớng sử dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ để sản xuất các dƣợc phẩm sinh

Gốc tái bản

Gen đồng hóa opines

Vùng gen vir

Bờ trái (LB, TL)

Bờ phải (RB, TR)

học tái tổ hợp bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng.

Nguồn: Lê Xuân Thao (2012)

Hình 2.2. Cấu trúc Ri – plasmid

2.5.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng cảm ứng tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy, vật liệu

chuyển gen, phƣơng pháp lây nhiễm, độ tuổi vật liệu lây nhiễm.

Ngoài hai chủng A. rhizogenes phổ biến là agropine (A4T, 15834, TR105), mannopine (TR7, 8196) còn có những chủng ít phổ biến hơn nhƣ mannopine (TR7, 8196), mikimopine (A5, A6) với cấu trúc Ri – plasmid khác nhau và có sự sai khác

trong hiệu quả chuyển gen tƣơng ứng của mỗi chủng đối với từng đối tƣợng thực vật

khác nhau. Các chủng vi khuẩn A. rhizogenes khác nhau đã đƣợc thử nghiệm để khảo sát khả năng tạo rễ tơ sản xuất hợp chất thứ cấp trên cây Rubi akane Nakai

(Lee el al., 2010). Năm chủng A. rhizogenes (13.333, 15.834, R1000, R1200 và

R1601) đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này và tất cả đều có thể cảm ứng tạo rễ

tơ. Tuy nhiên ở mỗi chủng khác nhau, khả năng cảm ứng đều có sự khác biệt. Trong đó chủng R1601 có tần số lây nhiễm cao nhất ứng cao nhất (85,6%) và chiều dài rễ

dài nhất (1,6 cm). Bên cạnh đó, chủng R1601 cũng cho tốc độ tăng trƣởng rễ cao nhất (11,1g/l khối lƣợng rễ khô) và sản xuất hàm lƣợng alizarin (4,3 mg/g khối

lƣợng rễ khô) và purpurin (4,9 mg/g khối lƣợng rễ khô) lớn nhất.

Zebarjadi el al. (2011) sử dụng hai chủng A. rhizogenes (AR15834 và LBA

9402) để khảo sát khả năng tạo rễ tơ của cây Valeriana officinalis L. Hai chủng A. rhizogenes đƣợc lây nhiễm trên các loại mô khác nhau (lá, phôi và rễ). Kết

quả là chủng LBA9402 cho khả năng cảm ứng tạo rễ (68,92%) cao hơn chủng

AR15834 và lá là loại mô thích hợp cho lây nhiễm.

Chai el al. (2012) đã đánh khả năng cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Solanum

mammosum bằng năm chủng A. rhizogenes (ATCC 31798, ATCC 43057, AR12,

A4 and A13). Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng có sự khác biệt đáng kể khả năng cảm ứng của các chủng khác nhau. Hai chủng AR12 và A13 có thể tạo rễ cảm

ứng sau 6 ngày đồng nuôi cấy, nhanh nhất so với các chủng còn lại. Tuy nhiên

khả năm tăng sinh khối của rễ tơ của dòng 31789 lại cho kết quả tốt nhất, sau 45

ngày nuôi cấy trong điều kiện 16h sáng/8h tối trên môi trƣờng MS.

Nồng độ dịch khuẩn cũng ảnh hƣởng tới khả năng cảm ứng rễ tơ của vi

khuẩn A. rhizogenes. Lili el al. (2011) đã tiến hành thí nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ trên bảy giống đậu tƣơng khác nhau (Luhua11, Huayu16,Huayu28, Baisha1016,

Yuanhua8, Xinhua1, and Xinhua5) bằng chủng vi khuẩn A. rhizogenes K559. Thí

nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách lây nhiễm vi khuẩn bằng lƣỡi dao ngâm trong dịch khuẩn ở các nồng độ khuẩn khác nhau (0,2; 0,8 ;3 ;5,5) trên lá, phôi và rễ. Kết

quả cho thấy giống đậu tƣơng Luhua11 cho khả năng tạo rễ tốt nhất, nồng độ dịch

khuẩn 0,2 cảm ứng đƣợc nhiều rễ nhất và thời gian cảm ứng tạo rễ nhanh nhất.

Theo Jun and Ling (2005) hiệu quả chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes còn chịu ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy, nếu thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn sự chuyển và gắn của T – DNA vào bộ gen của tế bào thực vật

không hoàn toàn, trong khi đó thời gian đồng nuôi cấy quá dài sẽ dẫn đến sự ức

chế cạnh tranh. Bên cạnh đó khả năng chuyển gen còn bị ảnh hƣởng bởi nồng độ acetosyringone, nồng độ dịch khuẩn, thời gian lây nhiễm. Jun and Ling đã tiến

hành lây nhiễm 4 chủng A. rhizogennes (A4, R1000, R1601 và R1205) trên cây

Torenia fournieri L. Kết quả cho thấy thời gian lây nhiễm càng dài thì hiệu quả

cảm ứng ra rễ càng cao (20 phút) nồng độ dịch khuẩn thích hợp nhất là 1, thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày và nồng độ acetosyringone thích hợp nhất là

30µmol/l. sẽ cho trên 80% khả năng cảm ứng tạo rễ.

Một yếu tố khác cũng ảnh hƣởng đến cảm ứng rễ tơ là phƣơng pháp lây nhiễm. Để xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu, 3 phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng:

tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô, mẫu đƣợc cắt và ngâm trong dung dịch vi

khuẩn một thời gian, mẫu đƣợc cắt và tạo vết thƣơng bởi dao cấy đã nhúng vào dung dịch vi khuẩn (Eibl el al., 2009). Trong đó mẫu đƣợc cắt và tạo vết

thƣơng và tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mẫu nhằm tạo ra hợp chất phenolic thu

hút vi khuẩn A. rhizogenes.gắn lên vị trí bị thƣơng của mẫu. Ngâm mẫu đã tạo

vết thƣơng vào dung dịch vi khuẩn tạo điều kiện để mẫu tiếp xúc với vi khuẩn

và những tín hiệu từ tế bào thực vật kích hoạt sự hoạt động của gen vir, dẫn

tới vi khuẩn bám lên vị trí bị thƣơng của mẫu. Từ đó, dẫn đến những biến đổi

trong tế bào vi khuẩn, sự hình thành cầu nối để chuyển phức hợp T-DNA vào

tế bào thực vật và sự sáp nhập T-DNA của Ri-plasmid vào bộ gen tế bào chủ.

Để tăng hiệu quả chuyển gen, đã có nhiều phƣơng pháp hóa lý khác nhau

đƣợc thực hiện. Có thể gián tiếp tăng hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A.

rhizogenes. Bằng cách sử dụng các phƣơng pháp xử lý siêu âm, nồng độ

acetosyringone, calcium và các dung dịch enzyme. Kết quả của quá trình chuyển

gen sau khi xử lý bằng siêu âm tăng 2,3 lần, kết hợp siêu âm với xử lý bằng canxi

tăng 2,5 lần và kết hợp siêu âm với acetosyringone tăng 4,1 lần. Tuy nhiên nếu

kết hợp siêu âm với xử lý enzyme lại làm giảm hiệu quả chuyển gen từ 1,5 đến

5,25 lần (Kumar el al., 2006).

2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt chất thứ cấp của rễ tơ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, việc chọn lựa tế bào phù hợp có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ƣu sẽ thu đƣợc sản phẩm ở mức độ cao hơn. Để thu đƣợc năng suất rễ tơ cao, đặc biệt là để thu các hoạt chất thứ cấp thì việc tối ƣu môi trƣờng là điều vô cùng quan trọng. Một số yếu tố vật lý và hóa

học đã đƣợc biết có thể ảnh hƣớng đến sự tăng trƣởng và năng suất của rễ tơ.

Các yếu tố nhƣ carbon, nồng độ ion của môi trƣờng, pH môi trƣờng, ánh sáng, các chất điều tiết sinh trƣởng, nhiệt độ, phƣơng thức nuôi cấy đều ảnh

hƣớng đến sự phát triển và sản xuất các hợp chất thứ cấp của rễ tơ.

Nuôi cấy rễ tơ cây Hyoscyamus albus cho thấy, sự phát triển và tổng hợp năm loại alkaloid tropane có sự khác biệt trong điều kiện môi trƣờng nuôi cấy khác nhau (Christen et al., 1992). Trong số bốn môi trƣờng thí nghiệm, môi trƣờng B5 cho tốc độ tăng trƣởng rễ tơ và sự tích lũy hàm lƣợng alkaloid tropane trong rễ tơ cao nhất. Nồng độ sucrose thích hợp nhất cho sản xuất tropane là 3%. Ngoài ra, việc bổ sung một số ion kim loại vào môi trƣờng có khả năng kích thích một cách tích cực tổng hợp alkaloid của rễ tơ. Đặc biệt, Cu2+ tăng đáng kể tốc độ phát triển cũng nhƣ lƣợng alkaloid tổng hợp.

pH cũng là yếu tố đáng kể ảnh hƣởng tới sự phát triển của rễ tơ. Morgan et al. (2000) đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy rễ tơ dòng LBE-6.1 cây Catharanthus roseus trên môi trƣờng bổ sung buffers 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) và 2-[(2-amino-2-oxoethyl) amino] ethanesulfonic acid (ACES). Quá trình theo dõi từ 14 đến 26 ngày, 3 ngày thu hoạch mẫu một lần, pH môi trƣờng đƣợc kiểm tra thƣờng xuyên. Kết quả cho thấy cả hai mẫu thí nghiệm sau hơn 20 ngày nuôi cấy đều cho khối lƣợng khô/tƣơi thấp hơn so với đối chứng nhƣng khi đem phân tích hàm lƣợng tabersonine trong mẫu cả hai mẫu

thí nghiệm đều cho nồng độ cao hơn đối chứng.

Martina et al. (1991) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu sáng và chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng tổng hợp 5 loại tropane alkaloid trên rễ tơ chuyển gen cây Hyoscyamus albus. Phân tích hàm lƣợng hyoscyamine trên các mẫu thí nghiệm cho thấy hàm lƣợng hyoscyamine cao nhất khi rễ tơ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l kinetin với 1,0 mg/l IAA đặt trong điều kiện tối. Thí nghiệm cũng cho thấy rằng sự tổng hợp các oxygenate alkaloid nhƣ 6β- hydroscyamine, 7β-hydroscyamine và scopolamine

đƣợc tăng cƣờng hơn so với rễ đƣợc nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ.

Alpizar et al. (2008) đã tiến hành nghiên cứu tạo rễ tơ cây Coffea arabica nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng A4RS. Phôi hữu tính Coffea arabica sau khi đƣợc lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy là MS bổ sung 30 g/l sucrose, 2,8 g/l phytagel trên đĩa petri, đặt trong tối trong 12 ngày ở 20oC. Sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng diệt khuẩn có bổ sung cefotaxime 500 mg/l bằng cách rửa 2 lần

trong 2 giờ. Rễ tơ xuất hiện tại vị trí vết thƣơng sau 8 - 10 tuần và thu đƣợc 5 dòng chuyển gen (X1, X6, X23, X25, X34). Các dòng rễ này đƣợc sử dụng để nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng, điều kiện chiếu sáng và nồng độ sucrose. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các nồng độ auxin khác nhau bao gồm IBA, α-NAA, IAA với các nồng độ 0,125; 0,25; 0,5 và 5,0 µM. Cƣờng độ chiếu sáng đƣợc thay đổi với ba điều kiện: tối hoàn toàn, 20 µmol m–2 s–1 và 50 µmol m– 2 s–1 chiều sáng 16 h/ngày. Kết quả cho thấy ít có sự phân nhánh khi thiếu auxin ngoại sinh, với IBA và α-NAA nồng độ tối ƣu là 0,5 và 0,25 mM. Nồng độ 5 mM ức chế phân nhánh và tăng trƣởng. Ngƣợc lại, với IAA nồng độ phát triển tốt nhất là 5 mM. Tuy nhiên với nồng độ 0,25 mM IBA cho số lƣợng nhánh hiệu quả và rễ ít bị thủy tinh hóa. Điều kiện ánh sáng cũng ảnh hƣởng đáng kể đến sự hình thành các nhánh và tốc độ tăng trƣởng của rễ tơ. Sự hình thành nhánh và tốc độ tăng trƣởng của rễ tơ trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ (50 µmol m–2 s–1) là yếu nhất. Trong khi đó ở điều kiện tối hoàn toàn cho hiệu quả phân nhánh tốt nhƣng ở điều kiện chiếu sáng 20 µmol m–2 s–1 cho tốc độ tăng trƣởng rễ tơ cao nhất. Nồng độ sucrose tối ƣu cho sự tăng trƣởng là 2%.

Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng tích lũy hợp

chất thứ cấp ở rễ tơ. Toivonen et al. (1992) đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu

ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự phát triển và tổng hợp alkaloid indol dòng rễ

chuyển gen No8 của cây Catharanthus roseus. Dòng rễ tơ No8 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng B5 lỏng bổ sung 40 g/l sucrose, 45 mg/l (NH4)2SO4, 0,5 g/l carbenicillin ở các nhiệt độ khác nhau (19,5; 24; 420C). Kết quả cho thấy khi hạ thấp nhiệt độ, rễ phản ứng bằng cách tăng hàm lƣợng lipid không bão hòa mà chủ

yếu là do sự tăng của axít inilenic. Cách thay đổi trong thành phần lipid làm cho

màng tế bào thích nghi với các nhiệt độ. Đồng thời ở nhiệt độ thấp, hàm lƣợng

alkaloid tích lũy có sự gia tăng rõ rệt.

Bên cạnh đó, ngoài các yếu tố vật lý và môi trƣờng nuôi cấy, elicitor là

một trong những yếu tố đã đƣợc sử dụng để nâng cao khả năng tổng hợp các hợp

chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Đã có nhiều elicitor có nguồn gốc sinh học

hoặc phi sinh học đã đƣợc sử dụng trong nuôi cấy rễ tơ làm tăng khả năng sản

xuất hợp chất thứ cấp (Buitelaar et al., 1993; Pitta-Álvarez et al., 2000). Dịch

chiết nấm men và sợi nấm viên của Streptomyces pactum Act12 (Act12) có thể

thúc đẩy sự tích tụ đƣờng hòa tan và tăng sự tích lũy tanshinone trong rễ tơ

Salvia miltiorrhiza đồng thời ức chế sự tích tụ của protein hòa tan trong rễ tơ

(Yang và et al., 2012). Kết quả cho thấy Act12 tăng cƣờng sự biểu hiện của

gen 3-hydroxy-3-methyglutary1-CoA reductase (HMGR), 1-deoxy-D-xylulose 5-

phosphate synthase (DXS), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase

(DXR), và geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS). Trong đó, gen HMGR

biểu hiện tăng gấp 33,66 lần so với đối chứng, điều này cho thấy Act12 có khả

năng ảnh hƣởng đáng kể làm tăng mức độ tích lũy tanshinone trong rễ tơ, nhất là

cryptotanshinone.

2.5.3. Các nghiên cứu tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp ở cây Đan sâm

Hu and Alfermann (1993) tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm thông qua lây nhiễm các cơ quan của cây in vitro với năm chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gồm LBA 9042, ATCC 15834, TR 105, R 1601 và A 4 1027. Kết quả cho thấy, khả năng thu đƣợc các dòng rễ tơ của các chủng vi khuẩn khác nhau là khác nhau, trong đó chủng vi khuẩn LBA 9402 có mang plasmid pRi 1855 cho phép thu đƣợc các dòng rễ tơ với tỷ lệ cao nhất. Trong quá trình nhân nuôi rễ tơ, nhóm tác giả đã tìm ra môi trƣờng bổ sung 3% đƣờng và ammonium nitrate có ảnh hƣởng tích cực đến sự

tăng sinh khối rễ tơ cũng nhƣ sự tích lũy hoạt chất diterpenes.

Sử dụng chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 lây nhiễm với cây Đan sâm in vitro, Chen et al. (1999) đã thu đƣợc các dòng rễ tơ chuyển gen. Nhóm tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nền MS, MS-NH4 (môi trƣờng MS không chứa ammonium nitrate) B5, WPM và 6,7-V đến tốc độ tăng trƣởng của rễ tơ cũng nhƣ khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp. Kết quả cho thấy, tốc độ tăng trƣởng rễ tơ và hoạt chất thứ cấp tích lũy ở rễ tơ khi nuôi cấy trên môi trƣờng MS-NH4 và 6,7-V cao hơn so với khi nuôi cấy trên môi

trƣờng MS, B5 và WPM.

trong khi hàm

Để tạo các dòng rễ tơ Đan sâm, Gupta et al. (2011) lây nhiễm lá cây in vitro với vi khuẩn A. rhizogenes chủng BCRC 15010. Tỷ lệ mô lá tái sinh tạo rễ tơ thu đƣợc là 75-80%. Tốc độ tăng sinh khối rễ tơ đạt cao nhất khi nuôi cấy trên môi trƣờng B5 lỏng trong điều kiện tối. Để tăng hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu, rễ tơ đƣợc chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung các chất điều tiết sinh trƣởng nhƣ ABA, TDZ, BA, IAA, IBA, kinetin, α-NAA. Hàm lƣợng tanshinone I trong rễ tơ khi nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l ABA cao hơn 5 lần so lƣợng trồng ngoài đồng ruộng với rễ cây Đan sâm cryptotanshinone cao hơn 7,5 lần trên môi trƣờng chứa 1,0 mg/l GA3.

Nhằm nâng cao sự tổng hợp tanshinone và các sản phẩm thứ cấp, Yan et

al. (2005) đã sử dụng cao nấm men (yeast extract – YE), hydrophobic polymeric

serin – X-5 (chất hấp thụ tanshiones tại chỗ) và hệ thống nuôi cấy bán liên tục.

Kết quả cho thấy, YE kích thích quá trình sinh tổng hợp tanshinone, làm tăng

hàm lƣợng tanshinone tổng số (gồm 3 loại tanshinone chính là cryptotanshinone,

tanshinone I và tanshinone IIA) trong rễ lên gấp 2,97 lần, từ 0,46 lên 1,37 mg/g

rễ khô. Bổ sung X-5 resins vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng hàm lƣợng

tanshinone không đáng kể. Phƣơng pháp nuôi cấy bán liên tục với môi trƣờng

đƣợc thay mới, bổ sung YE và thay thế resin, bắt đầu ở giai đoạn muộn của pha

sinh trƣởng theo cấp số mũ, sinh khối rễ tăng lên đến 30,5g khối lƣợng khô/l (so

với 8 - 10 g khối lƣợng khô/l trong phƣơng pháp nuôi cấy mẻ), đồng thời hàm

lƣợng tanshinone tăng lên tới 87,5 mg/l (gấp khoảng 15 lần). Nhƣ vậy, kết quả

nghiên cứu đã cho thấy việc phối hợp các yếu tố elicitor, sự hấp thụ tại chỗ và

chế độ nuôi cấy bán liên tục có thể làm tăng cƣờng sự sản xuất tanshinone trong

nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm.

Theo kết quả nghiên cứu của Ge and Wu (2005), hàm lƣợng tanshinone tổng số tích lũy trong rễ tơ Đan sâm tăng 1,2 lần khi bổ sung 30 μM Ag+ và 3,1 lần khi bổ sung 100 µg/ml YE vào môi trƣờng nuôi cấy so với công thức đối chứng không bổ sung Ag+ và YE.

Yang et al. (2005) đã tiến hành nghiên cứu tác động của polyethylene

glycol (PEG), axít abscisic (ABA) và methyl jasmonate (MJ) đến sự tổng hợp

tanshinone ở rễ từ cây Salvia miltiorrhiza. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm

lƣợng 4 loại tanshinone trong rễ tơ cây Salvia miltiorrhiza tăng lên rõ rệt khi bổ

sung 2% PEG và 200 µM ABA vào môi trƣờng nuôi cấy. Đồng thời, lƣợng

mRNA và hoạt động của 2 enzyme chính (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme

A reductase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) liên quan đến sự sinh

tổng hợp tanshinone cũng tăng lên.

Gần đây, Cheng et al. (2013) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp 3 yếu tố elicitor gồm Ag+, YE và MJ đến sự tích lũy hoạt chất tashinones. Kết quả cho thấy, bổ sung kết hợp YE + Ag+, Ag+ + MJ và YE + Ag+ MJ đã làm tăng hàm lƣợng tanshinones, đặc biệt bổ sung Ag+ + MJ và YE + Ag+ MJ làm tăng hàm lƣợng tanshinone lên 5 lần so với công thức đối chứng.

Bên cạnh các đƣờng hƣớng nghiên cứu sự tác động của các yếu tố môi

trƣờng, các nhân tố kích thích, đƣờng hƣớng chuyển gen liên quan đến sự tổng

hợp tanshinones cũng đã đƣợc tiếp cận. Kai et al. (2011) đã tiến hành chuyển gen

mã hóa 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase (HMGR), l-deoxy-d-

xylulose-5-phosphate synthase (DXS) và geranylgeranyl diphosphate synthase

(GGPPS) liên quan đến sự sinh tổng hợp tanshinone trong rễ tơ Salvia

miltiorrhiza bằng kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Sự biểu

hiện của các gen SmGGPPS, SmHMGR và SmDXS trong các dòng rễ chuyển

gen có thể làm tăng sự tổng hợp tanshinone so với đối chứng không chuyển

gen. SmDXS có hiệu quả thúc đẩy sự tổng hợp tasnhinone cao hơn so với

SmHMGR, trong khi đó SmGGPPS có vai trò quan trọng hơn trong kích thích

tích lũy tanshinone so với enzyme SmHMGR hay SmDXS trong Salvia

miltiorrhiza. Sự tổng hợp tanshinone đạt đƣợc cao nhất khi SmHMGR và

SmGGPPS đồng biểu hiện, hơn gấp 4,74 lần so với đối chứng. Nghiên cứu cũng

cho thấy, hoạt tính chống oxi hóa ở tất cả các dòng rễ chuyển gen đƣợc kiểm tra

đều cao hơn so với đối chứng.

Để giải thích vai trò của yếu tố elicitor trong quá trình sinh tổng hợp

tanshinone trong rễ tơ Đan sâm, Kai et al. (2012) đã nghiên cứu cơ chế phân tử của

các yếu tố elicitor cảm ứng sự tích lũy tanshinone trong nuôi cấy rễ tơ Đan sâm.

Quá trình sinh tổng tanshinone là rất phức tạp và đến nay chƣa đƣợc hiểu

biết rõ. Là một loại diterpene, các tanshinone đƣợc tổng hợp từ tiền chất trung

gian có 5 carbon là isopentenyl diphosphate (IPP). IPP đƣợc tạo ra từ con đƣờng

chuyển hóa mevalonate (MVA) trong tế bào chất và con đƣờng chuyển hóa 1-

deoxy-D-xylulose phosphate (DXP) trong plastid (Ge and Wu, 2005; Jiang et al.,

2006; Liao et al., 2009). Một số gen nhƣ SmAACT, SmCMK, SmIPPI, SmFPPS,

SmCPS, SmKSL tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone đã phân lập

bởi nhóm nghiên cứu do Luqi Huang đứng đầu (Gao et al., 2008, 2009; Wang et

al., 2009). Sau đó, một số gen khác nhƣ SmHMGS, SmHMGR, SmDXR,

SmDXS1, SmDXS2, SmGGPPS đã đƣợc phân lập (Liao et al., 2009; Yan et al.,

2009; Kai et al., 2010). Hình 2.3 thể hiện con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone và

các gen liên quan.

Nguồn: Xu et al. (2010)

Hình 2.3. Con đƣờng sinh tổng hợp tanshinones trong rễ Đan sâm

2.5.4. Những nghiên cứu về cây Đan sâm ở Việt Nam Nghiên cứu về cây Đan sâm trên thế giới là khá phong phú. Tuy nhiên,

tại Việt Nam các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ

truyền thống nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm, chủ động

cung cấp nguồn dƣợc liệu Đan sâm tại Việt Nam còn rất ít.

Theo Đỗ Tất Lợi (2004), cây Đan sâm không có trong hệ thực vật của

nƣớc ta, cây đƣợc di thực vào Việt Nam từ Trung Quốc. Sau khi di thực vào Việt

Nam, Đan sâm đƣợc trồng ở Tam Đảo và Sapa. Phƣơng Thiện Thƣơng và cs.

(2013) xác định đƣợc thành phần hoạt chất của cây Đan sâm trồng tại Phú Thọ

gồm tanshinone IIA, tanshinone I, và cryptotanshinone.

Theo nghiên cứu của Ngô Quốc Luật và cs.,(2014) bƣớc đầu thử nghiệm

trồng cây Đan sâm tại 5 địa điểm nghiên cứu là Hà Nội, Phú Thọ, Thanh Hóa,

Sapa và Tam Đảo. Kết quả cho thấy, cây Đan sâm di thực tại 5 vùng sinh trƣởng

và phát triển tốt, thời gian sinh trƣởng các điểm đồng bằng là 240 ngày, các điểm

miền núi là 330 ngày, cây ra hoa nhiều, có quả nhƣng tỷ lệ đậu hạt chƣa cao.

Đồng thời, kết quả cũng chỉ ra năng suất dƣợc liệu ở các điểm trồng tại đồng bằng đạt cao hơn các điểm trồng ở miền núi nhƣng về hàm lƣợng hoạt chất lại

thấp hơn. Cụ thể tại Sapa, năng suất Đan sâm đạt 1,94 tấn khô/ha, trong khi hoạt

chất tanshinon IIA đạt đƣợc cao nhất là 0,87%. Cây Đan sâm trồng tại Hà Nội

cho năng suất đạt 2,24 tấn khô/ha, hàm lƣợng tanshinon IIA là 0,21%. Năng suất

Đan sâm đạt thấp nhất khi trồng tại Thanh Hóa với 1,80 tấn khô/ha, đồng thời

hàm lƣợng hoạt chất tanshinone IIA cũng đạt thấp nhất (0,13%). Tác giả cũng

khuyến cáo cây Đan sâm có thể trồng ở các vùng miền núi cao nhƣ Sapa, Tam

Đảo hoặc ở các vùng miền núi khác trên đất màu mỡ, đất nhẹ tơi, xốp. Ở vùng

trung du (Phú Thọ), đồng bằng (ngoại thành Hà Nội) tuy cây Đan sâm có hàm

lƣợng hoạt chất không cao bằng khi trồng tại Sapa, Tam Đảo nhƣng cây sinh trƣởng và phát triển tốt trên đất màu mỡ, thoát nƣớc tốt và nếu trồng đúng thời vụ

thì cây Đan sâm cho năng suất cao. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu bƣớc đầu cũng đã mở ra hƣớng sản xuất dƣợc liệu Đan sâm và chỉ rõ những ƣu nhƣợc điểm của

từng vùng nguyên liệu.

Sau khi đƣợc di thực về Việt Nam, viện Dƣợc liệu bƣớc đầu đã nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật về ảnh hƣởng của thời vụ, mật độ và phân bón đến

sinh trƣởng của cây Đan sâm. Kết quả cho thấy tại Hà Nội cây Đan sâm đƣợc trồng vào tháng 10 với khoảng cách 30 x 30 cm và lƣợng phân bón: 15.000 kg

phân chuồng + 300N + 100P2O5 + 75 K2O cho 1 ha năng suất cao và hiệu quả kinh tế (Lê Khúc Hạo và cs., 2014).

Về nghiên cứu nhân giống cây Đan sâm từ in vitro, kết quả nghiên cứu

của Viện Dƣợc liệu cũng cho thấy bƣớc đầu xác định đƣợc tổ hợp các chất BAP, Kinetin và α - NAA (hoặc IBA) theo tỷ lệ 1,0 : 0,3 : 0,03 mg/l cho hệ số nhân

nhanh chồi Đan sâm cao. Bổ sung α -NAA hay IBA ở nồng độ thấp ≤ 0,1mg/l có

tác dụng kích thích ra rễ tốt nhất. Tuy nhiên, giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh và ra

vƣờn ƣơm còn vẫn tiếp tục nghiên cứu (Tạ Nhƣ Thục Anh và cs., 2014).

Nhƣ vậy, có thể thấy ở Việt Nam cụ thể hơn là viện Dƣợc liệu đã bắt đầu

quan tâm di thực và nghiên cứu về các biện pháp kỹ thuật trồng cây Đan sâm

phục vụ mục tiêu sản xuất dƣợc liệu cây Đan sâm trong nƣớc chủ động nguồn

dƣợc liệu. Tuy nhiên kết quả nghiên cứu theo hƣớng phát triển truyền thống và

công nghệ sinh học về cây Đan sâm ở Việt Nam mới chỉ là bƣớc đầu. Cần có

những nghiên cứu mang tính lặp lại và triển khai có hệ thống để có thể thu đƣợc

kết quả mang tính khẳng định góp phần xây dựng vùng nguyên liệu và tạo ra

đƣợc nguyên liệu dƣợc đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời tiêu dùng là hết sức

cần thiết.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Hạt Đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge nhập từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung

Quốc từ năm 2012 (Hình 3.1).

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC (American Type Culture Collection) 15834 chứa plasmid pRi mang các gen rol (root loci) nhƣ

rolA, rolB, rolC trên vùng T-DNA đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh

học Thành phố Hồ Chí Minh.

Hình 3.1. Hạt Đan sâm sử dụng trong nghiên cứu

3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.2.1. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm và khu thí nghiệm đồng

ruộng của Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học –

Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.2.2. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 06/2012 đến tháng 06/2015.

3.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1 - Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm

a) Giai đoạn 1: Tạo vật liệu khởi đầu

Sau khi rửa bằng nƣớc sạch, hạt Đan sâm đƣợc ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rồi rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần. Sau đó, hạt Đan sâm đƣợc

gieo trên môi trƣờng nền MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung GA3 để

kích thích hạt nảy mầm.

Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Đan

sâm

Công thức GA3 (mg/l)

CT1 0,0

CT2 0,5

CT3 1,0

CT4 2,0

CT5 3,0

b) Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi Đan sâm

Đoạn thân có kích thƣớc từ 2 cm mang một chồi nách cắt từ cây Đan sâm nảy mầm đƣợc chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh là môi trƣờng MS, bổ sung

BA, kinetin và α-NAA riêng rẽ hoặc kết hợp ở các nồng độ khác nhau. Các chồi

đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới 4 tuần 1 lần.

Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan

sâm

Công thức BA (mg/l)

CT1 0,0

CT2 0,5

CT3 1,0

CT4 1,5

CT5 2,0

Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi

Đan sâm

Công thức Kinetin (mg/l)

CT1 CT2 CT3 CT4 0,0 0,5 1,0 1,5

CT5 2,0

Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả

nhân nhanh chồi Đan sâm

BA (mg/l) Công thức Kinetin (mg/l)

0,0 0,1 0,2 CT1 CT2 CT3 0,5 0,3 CT4

0,4 CT5

Ghi chú: Nồng độ BA cho hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm tốt nhất từ thí nghiệm 2.

0,5 CT6

Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả

nhân nhanh chồi Đan sâm

0,000

Công thức BA (mg/l) α-NAA (mg/l)

0,010

CT1

0,025

CT2

0,050

0,075

CT3 0,5 CT4

0,100

CT5

Ghi chú: Nồng độ BA cho hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm tốt nhất từ thí nghiệm 2.

CT6

c) Giai đoạn 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi có chiều cao 2-3 cm, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng đƣợc

cấy chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung α-NAA, IAA, IBA để cảm ứng tạo rễ.

Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi

Đan sâm

Công thức α-NAA (mg/l)

CT1 0,00

CT2 0,10

CT3 0,25

CT4 0,50

CT5 0,75

CT6 1,00

Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi

Đan sâm

Công thức IBA (mg/l)

CT1 0,00

CT2 0,10

CT3 0,25

CT4 0,50

CT5 CT6 0,75 1,00

Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ của chồi

Đan sâm

Công thức IAA (mg/l)

CT1 0,00

CT2 0,10

CT3 0,25

CT4 0,50

CT5 0,75

CT6 1,00

d) Giai đoạn 4: Thích nghi cây in vitro ngoài vƣờn ƣơm

Cây in vitro hoàn chỉnh đƣợc chuyển ra vƣờn ƣơm, sử dụng giá thể cát,

đất/cát hoặc xơ dừa/cát ở các tỷ lệ khác nhau. Giá thể xơ dừa trƣớc khi sử dụng

đƣợc ủ trộn với phân chuồng trong 2 tháng.

Cây đƣợc đặt trong nhà lƣới, 2 tuần đầu tiên đƣợc che nắng bằng lƣới

nylon đen. Tƣới nƣớc giữ ẩm 2 lần/ngày.

Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây in vitro trên môi

trường ra rễ đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm

Công thức Thời gian nuôi cây trên môi trƣờng ra rễ (ngày)

CT1 CT2 CT3 20 30 40

Thí nghiệm 10. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới sự sinh trưởng và phát

triển của cây Đan sâm

Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Giá thể Cát Đất:cát (7:3) Đất:cát (1:1) Xơ dừa:cát (3:7) Xơ dừa:cát (1:1)

Nội dung 2 - Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm

Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo

rễ tơ cây Đan sâm

Mẫu cấy đƣợc lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes ở mật độ vi khuẩn

tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,2.

Công thức CT1 CT2 CT3 Vật liệu Mô lá Cuống lá Đoạn thân

Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dịch khuẩn A. rhizogenes đến

khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm

Sau khi xác định đƣợc loại vật liệu có khả năng tạo rễ tơ cao nhất từ thí

nghiệm 11, mẫu cấy đƣợc lây nhiễm với dịch khuẩn ở các mật độ tƣơng ứng với giá trị OD600 khác nhau.

Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 OD600 0,05 0,10 0,20 0,30

Từ kết quả các thí nghiệm 11 và 12, rễ tơ chuyển gen đƣợc nuôi cấy trong các trạng thái môi trƣờng, các điều kiện chiếu sáng, các dạng bình nuôi cấy khác nhau, có hoặc không bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng, yếu tố elicitor để khảo sát khả năng tăng sinh khối và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu (cryptotanshinone,

tanshinone I và tanshinone IIA). Sử dụng môi trƣờng MS hoặc B5 (phụ lục 1) bổ

sung 30 g/l sucrose làm môi trƣờng nền.

Thí nghiệm 13. Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự tăng

sinh khối rễ tơ

Nền môi trƣờng MS B5 Công thức CT1 CT2

Rễ tơ đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ

Trạng thái môi trƣờng Đặc Bán lỏng, tĩnh Lỏng, tĩnh Phân lớp Công thức CT1 CT2 CT3 CT4

Nền môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm là môi trƣờng B5. Môi trƣờng đặc là môi trƣờng chứa 0,7% agar, môi trƣờng bán lỏng chứa 0,35% agar. Môi trƣờng phân lớp là môi trƣờng có pha đặc (25 ml) ở dƣới và pha lỏng (25 ml) ở trên. Rễ tơ đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ

Loại bình nuôi cấy Bình trụ thể tích 250 ml Bình tam giác thể tích 500 ml Bình chữ nhật thể tích 750 ml Túi nilon kích thƣớc 13 x 25 cm Công thức CT1 CT2 CT3 CT4

Thí nghiệm sử dụng nền môi trƣờng B5, trạng thái môi trƣờng đặc, nuôi

cấy ở điều kiện 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 16. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối của rễ tơ Đan sâm

Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Thời gian 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần 10 tuần

Thí nghiệm sử dụng nền môi trƣờng B5, trạng thái môi trƣờng đặc. Rễ tơ

đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 17. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng sinh

khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

Công thức Điều kiện chiếu sáng

CT1 8 tuần tối hoàn toàn

CT2 8 tuần 16h sáng - 8 h tối

CT3 3 tuần CT2 - 5 tuần CT1

CT4 4 tuần CT2 - 4 tuần CT1

CT5 5 tuần CT2 - 3 tuần CT1

Thí nghiệm sử dụng nền môi trƣờng B5, trạng thái môi trƣờng đặc. Rễ tơ

đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 18. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng

sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

Công thức Chất điều tiết sinh trƣởng

CT1 Không bổ sung chất ĐTST

CT2 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA

CT3 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA

Thí nghiệm sử dụng nền môi trƣờng B5, trạng thái môi trƣờng đặc. Rễ tơ

đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Thí nghiệm 19. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh

khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

Công thức Elicitor

CT1 Không bổ sung elicitor

CT2 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol

CT3 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic acid

100 mg/l YE + 0,1 mM ABA

CT4 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate

CT5

Thí nghiệm sử dụng nền môi trƣờng B5, trạng thái môi trƣờng đặc. Rễ tơ

đƣợc nuôi cấy trong bình trụ, điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối.

Nội dung 3 - Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất nâng cao năng

suất chất lượng dược liệu Đan sâm từ nguồn cây giống in vitro

Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển,

năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

Cây Đan sâm đƣợc trồng ở 6 thời vụ khác nhau cụ thể

Công thức Thời vụ trồng cây

TV1 Trồng ngày 20/1/2014

TV2 TV3 Trồng ngày 20/2/2014 Trồng ngày 20/3/2014

TV4 Trồng ngày 20/4/2014

TV5 TV6 Trồng ngày 20/5/2014 Trồng ngày 20/6/2014

Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát

triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

Công thức Khoảng cách trồng

Mật độ (cây/m2) 13 30 x 25 cm CT1

11 30 x 30 cm CT2

9 30 x 35 cm CT3

8 30 x 40 cm CT4

7 30 x 45 cm CT5

Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số công thức bón phân đến sinh

trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

Lƣợng phân bón/ha Công thức

2 tấn phân vi sinh CT1

CT2

CT3

CT4

CT5 2 tấn phân vi sinh + 30 kg N + 60 kg P2O5 + 45 kg K2O 2 tấn phân vi sinh + 60 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O 2 tấn phân vi sinh + 120 kg N + 150 kg P2O5 + 120 kg K2O

Cây Đan sâm đƣợc trồng vào thời vụ tháng 2 năm 2014 (riêng thí nghiệm

thời vụ bố trí theo các công thức đã xây dựng), với khoảng cách trồng 30 x 30 cm, tƣơng đƣơng 11 cây/m2 (riêng thí nghiệm mật độ trồng, bố trí theo công thức đã xây dựng), 55 cây/1 ô thí nghiệm, 165 cây/công thức, sử dụng lƣợng phân bón

chung cho các thí nghiệm là 2 tấn phân vi sinh sông gianh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O (Riêng thí nghiệm phân bón, bón theo các công thức đã xây dựng). Bón lót toàn bộ phân vi sinh và phân lân. Phân đạm và kali đƣợc bón thúc

làm 3 đợt: Đợt 1 sau trồng 45 ngày bón 30% phân N 30% kali; Đợt 2: sau trồng

3 tháng bón 50% N 30% Kali, đợt cuối cùng sau trồng 6 tháng bón nốt lƣợng

phân N và Kali còn lại. Làm cỏ và quản lý nƣớc, kiểm tra sâu bệnh thƣờng xuyên

đảm bảo cây sinh trƣởng, phát triển tốt.

Cây giống đƣợc trồng trong 3 thí nghiệm này là đều là cây in vitro. Tiêu

chuẩn cây con khi trồng: Cây đƣợc giâm trên giá thể cát xơ dừa (tỷ lệ 1:1) trong

thời gian 30 ngày, cây có chiều cao >4 cm, có 9 lá/cây, cây sinh trƣởng khỏe.

3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

Các thí nghiệm sử dụng môi trƣờng nền MS hoặc B5 theo từng thí nghiệm

(phụ lục 1) 30 g/l đƣờng 7,0 g/l agar. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh pH = 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút. (khối lƣợng agar có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm)

Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16h sáng/8h tối, cƣờng độ ánh sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20 C. (thời gian chiếu sáng có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm)

3.3.2.2. Phương pháp chuyển gen và kiểm tra mẫu chuyển gen a) Chuẩn bị mẫu lây nhiễm

Hạt Đan sâm sau khi rửa sạch bằng nƣớc và khử trùng bằng cồn 70%

trong 30 giây đƣợc gieo trên môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l GA3 để kích thích

hạt nảy mầm. Lá, cuống lá và đoạn thân tách ra từ cây Đan sâm in vitro sau nuôi

cấy 2 tuần đƣợc sử dụng làm vật liệu lây nhiễm.

b) Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Vi khuẩn A.rhizogenes chủng ATCC 15834 bảo quản ở -800 C đƣợc hoạt hóa bằng cách nuôi trải trên môi trƣờng LB đặc trong 48h ở 280 C trong điều kiện tối. Sau đó, một khuẩn lạc đơn đƣợc chuyển sang nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng (phụ lục 2), lắc 200 vòng/phút ở 280 C trong 16h. Dịch khuẩn đƣợc ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 4000 vòng/phút ở 40 C trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn sau đó đƣợc hòa loãng trong môi trƣờng MS lỏng và xác định mật độ vi khuẩn dựa trên giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bƣớc sóng 600 nm (OD600).

c) Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn

Mẫu cấy (lá, cuống lá, đoạn thân) đƣợc cắt và tạo vết thƣơng bởi dao cấy

đã nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes và cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy là

môi trƣờng MS 30 g/l sucrose trong 5 ngày trong điều kiện tối.

d) Diệt khuẩn và tái sinh tạo rễ tơ

Kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy đƣợc chuyển sang môi trƣờng

diệt khuẩn và tái sinh là môi trƣờng MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim

trong điều kiện tối. Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 4 tuần.

e) Xác định rễ tơ chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

DNA tổng số của các mẫu rễ tơ đƣợc tách chiết theo Kit tách chiết của

Qiagen. Phƣơng pháp PCR đƣợc thực hiện để khuếch đại gen rolA và gen virD

bằng các cặp mồi đặc hiệu.

Bảng 3.1. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

Kích thƣớc

Gen mục

Tr nh tự cặp mồi 5’ – 3’)

sản phẩm

tiêu

Tm (oC)

(bp)

F CAGAATGGAATTAGCCGGACTA

RolA

307

R ΤΤΑΑΤCCCGTAGGTTTGTTTCG

F GAAGAAAGCCGAAATAAAGAG

VirD

560

TTGAACGTATAGTCGCCGATA

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Nồng độ

Thể tích μl)

14,5

Nƣớc vô trùng Dream Taq Buffer (Mg2+)

10X

Hỗn hợp dNTP

2 mM

Mồi xuôi

10 pM

0,2

Mồi ngƣợc

10 pM

0,2

Dream Taq polymerase

5u/μl

0,1

DNA

Tổng thể tích

20

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để nhân gen rolA và gen virD đƣợc thể

hiện ở hình 3.2 và hình 3.3.

Hình 3.2. Chu k nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA

Hình 3.3. Chu k nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen virD

- Kiểm tra sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agrose

1%, bổ sung ethidium bromide (7 µl/100ml đệm TAE), hiệu điện thế 60 V, thời

gian 60 phút. Gel agarose đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại.

3.3.2.3. Phương pháp xác định khối lượng rễ tươi Kết thúc quá trình nuôi cấy, rễ tơ đƣợc thu nhận, rửa sạch môi trƣờng và loại bỏ hoàn toàn nƣớc bằng giấy thấm. Sau đó cân rễ bằng cân phân tích để xác

định khối lƣợng rễ tƣơi.

3.3.2.4. Phương pháp xác định khối lượng rễ khô

Rễ tơ sau khi thu sinh khối đƣợc sấy ở nhiệt độ 400C đến khối lƣợng không đổi để xác định khối lƣợng rễ khô theo phƣơng pháp của Ge et al. (2005).

3.3.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất mục tiêu Ba hoạt chất mục tiêu gồm cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA

trong rễ tơ Đan sâm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

tại Phòng Thí nghiệm Trung tâm – Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông

nghiệp Việt Nam.

3.3.2.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) xác định hoạt chất mục tiêu Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu Mẫu rễ tơ và rễ củ Đan sâm sau khi sấy ở 400 C đến khối lƣợng không đổi đƣợc nghiền và rây qua rây 0,1 mm. Bột mẫu đƣợc bảo quản ở 40 C cho đến khi sử dụng để phân tích xác định hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu.

Bƣớc 2: Chiết mẫu Hòa tan 0,1 g bột mịn trong 1,0 ml dung môi methanol 80%. Hỗn hợp

đƣợc phá bằng sóng siêu âm trên máy S60H (Elma, Đức) trong 30 phút ở nhiệt

độ phòng. Sau đó, dịch chiết đƣợc thu hồi bằng phƣơng pháp ly tâm 10.000 vòng/p ở 40 C trong 5 phút. Dịch chiết đƣợc làm khô cho bay hết dung môi bằng máy làm khô chân không speedvac. Mẫu sau khi cô đƣợc hòa tan với 0,5 ml

methanol 80%.

Bƣớc 3: Phân tích hoạt chất Hoạt chất mục tiêu đƣợc phân tích trên máy HPLC của hãng Shimazu.

Chất chuẩn tanshinone I, tanshinone IIA, cryptotanshinone và dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích đƣợc mua từ các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức). Hòa tan

chất chuẩn (≥95%) bằng Methanol: Tetrahydrofuran: Nƣớc: Acid acetic

(20:35:44:1) ở các nồng độ từ 0,05 -0,3µg/mL để dựng đƣờng chuẩn. Lấy 20 µL

của dịch chiết đƣa vào máy HPLC bằng bơm LC-10Ai. Điều kiện chạy HPLC ở

nhiệt độ phòng, cột ODS-Aligent C18 (5 µm; 4,6×150 mm), tốc độ dòng 0,85

ml/phút, thời gian chạy 10 phút, detector UV-SPD 20A, pha tĩnh là silica gel và

pha động là acetic acid 2%: acetonitrile (10:90, v/v).

3.3.2.7. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm nhân nhanh in vitro: Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 30 mẫu. Các chỉ tiêu đƣợc theo dõi và đo đếm sau 2 tuần đối với thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu và 4 tuần đối với thí nghiệm nhân nhanh, ra rễ, thích nghi cây ngoài vƣờn ƣơm (thí nghiệm tiến hành tại phòng thí nghiệm công

nghệ sinh học thực vật - Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

Các thí nghiệm tạo rễ tơ và nhân sinh khối rễ tơ: Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 100 mẫu đối với thí nghiệm chuyển

gen và 9 mẫu đối với thí nghiệm nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm. Các chỉ tiêu

đƣợc theo dõi và đo đếm sau 4-10 tuần tùy từng thí nghiệm. (thí nghiệm tiến

hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật - Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam)

Các thí nghiệm về biện pháp kỹ thuật trong sản xuất: Đƣợc bố trí từ

tháng 1/2014 -4/2015 tại khu thí thực nghiệm của Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thí nghiệm bố trí theo phƣơng pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ

(RCBD), mỗi công thức nhắc lại 3 lần (3 ô thí nghiệm). Diện tích mỗi ô thí nghiệm 5 m2, tổng diện tích thí nghiệm của 1 công thức là 15 m2 chƣa kể dải bảo vệ. Các ô thí nghiệm đƣợc đánh luống cao 30 cm, mỗi ô thí nghiệm cách nhau 40 cm.

3.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi

Số hạt nảy mầm Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) = x 100 Tổng số hạt gieo

Tổng chiều cao chồi Chiều cao chồi (cm) = Tổng số chồi

Tổng số lá Số lá/chồi (lá) = Tổng số chồi

Tổng số chồi Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số mẫu

Số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng số rễ Số rễ/cây (rễ) = Tổng số chồi ra rễ

Tổng chiều dài rễ chính Chiều dài rễ (cm) = Tổng số rễ

Số cây sống Tỷ lệ cây sống (%) = x 100 Tổng số cây thí nghiệm

Số mẫu tạo rễ Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100

Tổng số mẫu lây nhiễm Tổng số rễ tạo thành Số rễ/mẫu (rễ) = Tổng số mẫu lây nhiễm

Tổng chiều cao chồi Chiều cao chồi (cm) = Tổng số chồi

Tổng khối lƣợng tƣơi Khối lƣợng rễ tăng (lần) =

Khối lƣợng rễ tƣơi (g) Tổng khối lƣợng rễ ban đầu

Khối lƣợng rễ khô (g)

Đối với các thí nghiệm đồng ruộng:

Đánh dấu cố định 10 cây cần theo dõi trong 1 ô thí nghiệm để theo dõi các

chỉ tiêu sau:

- Số nhánh cấp 1/cây: Đếm toàn bộ số nhánh cấp 1 trên cây. - Chiều cao cây (cm): chiều cao đƣợc tính từ gốc sát mặt đất đến điểm cao nhất của cây. Dụng cụ đo: thƣớc thẳng chia vạch đến mm. Cách đo: đo dựng

thẳng thƣớc song song với thân cây.

- Đƣờng kính tán lá (cm): Đo một chiều rộng tán lớn nhất và chiều rộng

tán nhỏ nhất rồi lấy trung bình.

- Mức độ nhiễm sâu bệnh hại: thực hiện theo QCVN 01 - 38/BNNPTNT

2010 về đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh hại.

- Khối lƣợng củ/cây (g/cây): mỗi ô thu hoạch riêng 10 cây theo phƣơng

pháp 5 điểm chéo góc, cân năng suất của 10 cây rồi tính giá trị trung bình.

- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) = Khối lƣợng củ/cây (kg/cây) x mật độ

trồng/m2 x 10.000 m2 x 10-3

- Năng suất thực thu (tấn/ha) = Năng suất ô/5 m2 x 10.000 m2 - Hàm lƣợng tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp HPLC.

3.3.2.9. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê theo chƣơng trình Excel và IRRISTAT 5.0.

Mô hình thống kê sử dụng cho thí nghiệm

Yij = µij + aij + eij Trong đó: i=1….I; j= 1……Ii

- Yij: Giá trị quan sát của chỉ tiêu theo dõi

- µij: Giá trị trung bình mẫu

- ai: Hiệu quả của công thức thí nghiệm i

- eij: Sai số ngẫu nhiên của các giá trị quan sát

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐAN SÂM

4.1.1. Tạo vật liệu khởi đầu Tạo nguồn vật liệu khởi đầu là bƣớc quan trọng có ý nghĩa quyết định đến

sự thành công của quy trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo tỷ lệ

mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh và sinh trƣởng cao. Trong nghiên cứu này, hạt Đan sâm có nguồn gốc từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung Quốc sau khi khử trùng đƣợc

nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa GA3 ở các nồng độ khác nhau để kích thích hạt

nảy mầm.

GA3 (mg/l)

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/chồi

14,33

1,95

5,43

0,0

28,33

4,61

7,35

0,5

40,43

4,75

6,20

1,0

20,00

6,91

6,00

2,0

18,33

7,40

6,09

3,0

2,3

1,9

CV%

0,21

LSD0,05

0 mg/l GA3

0,5 mg/l GA3

2,0 mg/l GA3

3,0 mg/l GA3

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm sau 2 tuần nuôi cấy

1,0 mg/l GA3

Hình 4.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm

Tỷ lệ hạt Đan sâm nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy khá thấp, dao động từ 14,33 – 40,33%. Trên môi trƣờng MS không bổ sung GA3, chỉ 14,33% hạt Đan

sâm nảy mầm với chiều cao chồi trung bình đạt 1,95 cm. Trong khi đó, bổ sung

GA3 vào môi trƣờng gieo hạt đã làm tăng đáng kể tỷ lệ hạt Đan sâm nảy mầm và

đặc biệt là chiều cao chồi. Tỷ lệ hạt nảy mầm đạt cao nhất (40,43%) trên môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l GA3, chồi sinh trƣởng phát triển tốt, thân mập, cao,

các lá to và có màu xanh đậm. Tỷ lệ hạt nảy mầm giảm dần khi nồng độ GA3 tăng dần và đạt thấp nhất (18,33%) trên môi trƣờng bổ sung 3,0 mg/l GA3. Trong

khi đó chiều cao chồi trung bình tăng tỷ lệ thuận với nồng độ GA3 bổ sung vào

môi trƣờng nuôi cấy (Bảng 4.1).

Bên cạnh GA3, một số chất điều tiết sinh trƣởng khác nhƣ BA, α-NAA, TDZ cũng đã đƣợc bổ sung vào môi trƣờng gieo hạt riêng rẽ hoặc kết hợp với

nhau. Tuy nhiên tỷ lệ hạt Đan sâm nảy mầm thấp hơn (đạt đƣợc cao nhất là

19,33% trên môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l BA, bên cạnh đó, các chồi có kích

thƣớc nhỏ (số liệu không đƣợc chỉ ra ở báo cáo này). Vì vật liệu sử dụng để nhân

nhanh là các đoạn thân có mang 1 cặp lá, do vậy bên cạnh tỷ lệ hạt nảy mầm,

chiều cao chồi là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá vật liệu khởi

đầu. Các chồi thấp gây khó khăn trong việc tách các đoạn thân và làm hạn chế

vật liệu nhân nhanh. Do đó, môi trƣờng thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm là

MS có bổ sung 1,0 mg/l GA3.

4.1.2. Nhân nhanh chồi

Trong nhân giống cây trồng in vitro, để có đƣợc hệ số nhân giống cao, số

lƣợng cây giống lớn, đồng nhất, cây có sức sinh trƣởng tốt thì việc xác định đƣợc

môi trƣờng nhân nhanh thích hợp có vai trò quyết định. Cytokinin là nhóm chất điều

tiết sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự tái sinh mẫu cấy

theo hƣớng tạo chồi làm tăng hệ số nhân. Tuy nhiên, với mỗi loại chất kích thích sinh trƣởng khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau ở mỗi loài cây và giai đoạn nuôi

cấy. Chính vì vậy, ở giai đoạn này trƣớc hết chúng tôi nghiên cứu ảnh hƣởng của BA và kinetin là hai chất điều tiết sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm. Vật liệu sử dụng để nhân nhanh là các đoạn thân

mang mắt ngủ từ chồi nảy mầm từ hạt Đan sâm.

4.1.2.1 Ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

BA là chất điều tiết sinh trƣởng có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trƣởng của mô phân sinh và làm hạn chế

sự già hoá của tế bào. Trong nhân giống in vitro, BA có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành chồi non, quyết định hệ số

nhân và chất lƣợng chồi hình thành.

Khả năng nhân nhanh của chồi Đan sâm trên môi trƣờng MS không bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng khá thấp với hệ số nhân đạt 1,08 lần và chiều cao

chồi đạt 3,13 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Bổ sung BA vào môi trƣờng nuôi cấy đã

làm tăng đáng kể hệ số nhân chồi và chiều cao chồi Đan sâm. Hệ số nhân chồi

Đan sâm đạt đƣợc cao nhất (5,05 lần) khi bổ sung 0,5 mg/l BA vào môi trƣờng nuôi cấy. Hệ số nhân giảm dần khi nồng độ BA bổ sung vào môi trƣờng tăng dần

và đạt thấp nhất trên môi trƣờng chứa 2,0 mg/l BA (Bảng 4.2).

BA (mg/l)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi (cm)

Chất lƣợng chồi

0,0

1,08

3,13

0,5 1,0

5,05 4,63

4,08 3,67

+++ +++

1,5 2,0

3,77 3,53

3,59 2,92

++ ++

4,3

2,6

0,32

0,31

CV% LSD0,05

Ghi chú:

(+): chồi thấp, lá nhỏ, không đẻ chồi mới

(++): chồi thấp, lá to trung bình, đẻ ít chồi mới

(+++): chồi cao, lá to, đẻ nhiều chồi mới

0 mg/l BA

0,5 mg/l BA

1,0 mg/l BA

1,5 mg/l BA

2,0 mg/l BA

Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Hình 4.2. Ảnh hƣởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm

Quan sát về hình thái cho thấy, chồi Đan sâm trên môi trƣờng nền MS sinh trƣởng chậm, chồi thấp trong khi đó chồi trên môi trƣờng có bổ sung BA

sinh trƣởng phát triển tốt, chồi cao, đẻ nhánh nhiều, chiều cao chồi đạt đƣợc cao

nhất ở nồng độ BA 0,5 mg/l (Hình 4.2).

4.1.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

Kinetin là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin có tác dụng làm tăng sự

phân chia tế bào, duy trì sự sống của mô, định hƣớng tế bào trong con đƣờng

phân hoá và tăng cƣờng tổng hợp chất diệp lục ở lá cây. Mục đích của thí nghiệm

này là làm rõ ảnh hƣởng của kinetin đến sự nhân nhanh chồi Đan sâm từ đoạn

thân mang chồi nách.

Bảng 4.3 thể hiện kết quả ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh

chồi Đan sâm. Bổ sung kinetin vào môi trƣờng nuôi cấy đã cải thiện hệ số nhân

và chất lƣợng chồi Đan sâm. Hệ số nhân chồi Đan sâm trên môi trƣờng bổ sung

kinetin dao động từ 2,58 đến 3,04 lần so với 1,08 lần trên môi trƣờng đối chứng.

Hệ số nhân chồi Đan sâm tăng dần khi nồng độ kinetin bổ sung vào môi trƣờng

tăng dần và đạt cao nhất (3,04 lần) khi 2,0 mg/l kinetin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Tƣơng tự nhƣ BA, chiều cao chồi đạt cao nhất (3,83 cm) khi

kinetin bổ sung vào môi trƣờng ở nồng độ thấp (0,5 mg/l). Tuy nhiên sự khác

biệt về chiều cao chồi Đan sâm giữa các công thức môi trƣờng có bổ sung kinetin

là không rõ rệt (Bảng 4.3).

Kinetin (mg/l)

Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm)

Chất lƣợng chồi

0,0

1,08

3,13

0,5 1,0 1,5 2,0

2,58 2,58 2,62 3,04

3,83 3,24 3,42 3,67

++ ++ ++ ++

4,1 0,3

5,1 0,3

CV% LSD0,05

Ghi chú:

(+): chồi thấp, lá nhỏ, không đẻ chồi mới

(++): chồi cao, lá to trung bình, đẻ ít chồi mới

Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Về mặt hình thái, chồi Đan sâm trên môi trƣờng có bổ sung kinetin sinh trƣởng phát triển mạnh hơn, chồi cao, đẻ nhiều chồi mới và có số lá cao hơn so

với chồi Đan sâm trên môi trƣờng MS không bổ sung kinetin. Tuy nhiên, không có sự sai khác rõ rệt về hình thái chồi Đan sâm giữa các công thức bổ sung

kinetin (Hình 4.3).

0,25 mg/l kinetin

0,5 mg/l kinetin

1,0 mg/l kinetin

2,0 mg/l kinetin

0 mg/l kinetin

Hình 4.3. Ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm

Qua hai thí nghiệm trên cho thấy việc bổ sung cytokinin (BA, kinetin) đều

cho hệ số nhân chồi cao hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, giữa hai cytokinin, BA

tỏ ra thích hợp hơn trong nhân nhanh chồi Đan sâm so với kinetin. Nồng độ BA

cho hiệu quả nhân nhanh chồi tốt nhất là 0,5 mg/l với hệ số nhân chồi đạt 5,05

lần sau 4 tuần nuôi cấy. Kết quả này cũng trùng với kết luận trong nghiên cứu

của Tạ Nhƣ Thục Anh và cs. (2014), hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm trên môi

trƣờng bổ sung BA cao hơn trên môi trƣờng bổ sung kinetin. Nhóm tác giả cũng

chỉ ra nồng độ BA thích hợp để tái sinh và nhân nhanh chồi là 1,0 mg/l, với hệ số

nhân chồi 2,62 chồi/mẫu. Theo kết quả nghiên cứu của Feng et al. (2004), nồng

độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi bất định cây Đan sâm là 1,0 mg/l. Xu

and Sun (2008) lựa chọn môi trƣờng MS bổ sung BA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l)

là môi trƣờng nhân nhanh chồi Đan sâm.

4.1.2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm Trong nhiều trƣờng hợp, bổ sung kết hợp BA và kinetin vào môi trƣờng nuôi cấy, cho hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro cao hơn so với bổ sung riêng rẽ (Asad et al., 2009). Do vậy, BA ở nồng độ 0,5 mg/l (nồng độ cho hiệu quả nhân nhanh chồi tốt nhất từ thí nghiệm trên) đã đƣợc sử dụng phối hợp với kinetin (0,1

– 0,5 mg/l) nhằm tăng hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm.

Bổ sung kết hợp kinetin và 0,5 mg/l BA không làm tăng hệ số nhân chồi cũng nhƣ chiều cao chồi Đan sâm so với môi trƣờng chỉ bổ sung 0,5 mg/l BA.

Trong các công thức bổ sung kết hợp giữa 0,5 mg/l BA và kinetin, công thức 0,5 mg/l BA và 0,1 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3,17 lần) sau 4

tuần nuôi cấy. Tuy nhiên hệ số này trên công thức đối chứng chỉ bổ sung 0,5

mg/l BA đạt 5,05 lần. Hệ số nhân giảm dần khi nồng độ kinetin tăng dần và đạt

thấp nhất (2,57 lần) khi kinetin bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy ở nồng độ 0,4- 0,5 mg/l. Với chỉ tiêu chiều cao chồi, xu hƣớng tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận.

Chiều cao chồi Đan sâm trên môi trƣờng chứa 0,5 mg/l BA (4,08 cm) cũng cao hơn so với chiều cao chồi Đan sâm trên môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp

với kinetin (Bảng 4.4).

BA (mg/l)

Kinetin (mg/l)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi (cm)

0,0

5,05

4,08

0,1

3,17

3,56

0,5

0,2 0,3

2,73 2,77

3,15 2,67

0,4 0,5

2,57 2,57

3,11 3,36

3,0 0,15

5,2 0,11

CV% LSD0,05

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Nhƣ vậy, bổ sung kinetin (từ 0,1 – 0,5 mg/l) vào môi trƣờng MS + 0,5

mg/l BA đã làm giảm hệ số nhân chồi cũng nhƣ chiều cao chồi cây Đan sâm.

4.1.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm Theo nguyên lý chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi sử dụng phối

hợp cytokinin và auxin với nồng độ và tỷ lệ thích hợp không những nâng cao hệ

số nhân chồi mà còn có tác dụng tốt đến chất lƣợng của chồi in vitro. Nhiều kết quả nghiên cứu cũng đã khẳng định hiệu quả phối hợp của auxin và cytokinin

đến hệ số nhân nhanh chồi trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau. Việc kết hợp BA và α-NAA ở nồng độ và tỷ lệ thích hợp có thể nâng cao hệ số nhân chồi và chất lƣợng chồi đối với một số cây trồng nhƣ cây địa liền (Paria et al., 2010), cây ba kích (Hoàng Thị Thế và cs., 2013). Trên cơ sở đó, BA ở nồng độ 0,5 mg/l (nồng độ tối ƣu cho nhân nhanh chồi Đan sâm từ thí nghiệm trên) đã đƣợc sử dụng phối hợp với α-NAA ở các nồng độ thay đổi từ 0,01 đến 0,1 mg/l nhằm

mục đích làm tăng hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro cây Đan sâm (Bảng 4.5).

BA (mg/l)

α-NAA (mg/l)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi (cm)

0,00 0,01

5,05 3,37

4,08 3,58

0,5

0,025 0,05

2,93 3,16

2,99 2,96

0,075 0,10

3,13 2,36

2,97 3,05

3,0 0,15

3,0 0,17

CV% LSD0,05

Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA và α-NAA ở nồng độ 0,01 – 0,1 mg/l đã làm giảm hệ số nhân chồi cũng nhƣ chất lƣợng chồi Đan sâm. Trong các công thức kết hợp giữa BA và α-NAA, hệ số nhân chồi đạt cao nhất là 3,37 lần ở công thức bổ

sung kết hợp 0,5 mg/l BA và 0,01 mg/l α-NAA, tuy nhiên, hệ số nhân này thấp hơn

công thức đối chứng chỉ bổ sung 0,5 mg/l BA (5,05 lần). Tƣơng tự nhƣ trong trƣờng

hợp bổ sung kết hợp BA và kinetin, bổ sung BA và α-NAA đã làm giảm chiều cao

chồi Đan sâm (Bảng 4.5).

Hình 4.4. Một số hình thái chồi Đan sâm trong quá trình nhân nhanh: (A): Chồi Đan sâm sinh trƣởng, phát triển b nh thƣờng; (B): Chồi biến dị, chồi mọc thành cụm, không tăng trƣởng về chiều cao; (C): chồi biến dị, chồi mọc thành cụm, thấp, lá xoăn; D): chồi biến dị, chồi thấp, thân và lá mọng nƣớc; (E): chồi biến dị, chồi bạch tạng.

Có thể thấy, bổ sung kết hợp BA và kinetin hoặc BA và α-NAA vào môi trƣờng nuôi cấy, không những không cải thiện hệ số nhân chồi mà các chồi trên môi trƣờng này thƣờng thấp, sinh trƣởng phát triển chậm, lá có màu xanh nhạt và

thƣờng bị biến dị nhƣ bạch tạng, thủy tinh thể, chồi mọc thành cụm, lá nhỏ, xoăn (Hình 4.4 B, C, D, E). Những chồi này không thể sử dụng làm vật liệu để nhân

nhanh tiếp tục hay chuyển sang môi trƣờng ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Trong

khi đó, chồi trên môi trƣờng bổ sung BA đơn lẻ sinh trƣởng phát triển tốt hơn,

cây cao, mập, lá thẳng, lá màu xanh đậm (Hình 4.4 A).

Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi Đan sâm là MS + 0,5

mg/l BA, cho hệ số nhân chồi đạt 5,05 lần, chiều cao chồi đạt 4,08 cm, các chồi

sinh trƣởng, phát triển tốt.

4.1.3. Tạo cây hoàn chỉnh

Trong giai đoạn nuôi cấy mô, cây con đƣợc cung cấp đầy đủ các chất dinh

dƣỡng đảm bảo cho quá trình sinh trƣởng và phát triển đƣợc diễn ra bình thƣờng.

Vì vậy, cây sẽ bị “sốc” mạnh khi chúng đƣợc chuyển qua giai đoạn nuôi trồng

ngoài vƣờn ƣơm. Chính vì vậy trƣớc khi ra ngoài vƣờn ƣơm, việc tạo cây có chất

lƣợng tốt và có khả năng thích nghi đƣợc với điều kiện tự nhiên là việc làm rất

quan trọng.

Trong quá trình nuôi cấy trong ống nghiệm, ngoài một số rất ít các chồi có

thể hình thành rễ, còn lại là hầu hết đều chƣa có rễ. Để cây thích nghi với điều

kiện tự nhiên bên ngoài đƣợc thuận lợi phải sử dụng các biện pháp kích thích cho

chồi ra rễ. Một số nghiên cứu cho thấy rằng đối với một số loài cây “khó” ra rễ in

vitro hoặc “chậm” hình thành rễ trên môi trƣờng MS thì nền môi trƣờng giảm đi

một nửa (½ MS) sẽ kích thích hình thành rễ nhanh hơn. Ngoài ra, bổ sung vào môi

trƣờng nuôi cấy chất điều tiết sinh trƣởng thuộc nhóm auxin hoặc than hoạt tính cũng giúp nâng cao hiệu quả ra rễ của chồi in vitro. Trong nghiên cứu này, các

chồi Đan sâm có chiều cao 2 - 3 cm, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng đƣợc cấy

chuyển sang môi trƣờng ½ MS bổ sung α-NAA, IAA, IBA để cảm ứng tạo rễ.

4.1.3.1 Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm in vitro

Hoạt chất -NAA là chất điều tiết sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm

auxin, có tác dụng tích cực trong việc tăng khả năng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính của các enzym và ảnh hƣởng mạnh mẽ đến trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng nguồn cacbon trong môi trƣờng.

Ngoài ra, -NAA còn có vai trò quan trọng trong việc kích thích sinh trƣởng,

phân chia tế bào và tạo rễ bất định.

Trong giai đoạn tạo rễ của nhiều loại cây trồng, thông thƣờng ngƣời ta bổ

sung một lƣợng -NAA nhất định vào môi trƣờng nhằm làm tăng hiệu quả việc tạo

rễ. Để tìm hiểu ảnh hƣởng của -NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm in

vitro, -NAA đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy ở nồng độ từ 0 – 1,0 mg/l.

α-NAA (mg/l)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ (rễ)

Chiều dài rễ (cm)

0,00

100,00

2,40

4,23

0,10

79,17

2,84

6,15

0,25

79,17

3,37

7,06

0,50

92,31

3,04

5,33

0,75

76,92

2,90

5,22

1,00

73,08

3,47

3,8

CV%

3,8

1,7

0,21

0,16

LSD0,05

Ghi chú: môi trường nền là ½ MS

0 mg/l α-NAA

0,1 mg/l α-NAA

0,25 mg/l α-NAA 0,5 mg/l α-NAA 0,75 mg/l α-NAA 1,0 mg/l α-NAA

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của α-NAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Hình 4.5. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

Chồi Đan sâm có thể tạo rễ trên môi trƣờng nền MS với tỷ lệ 100%. Tuy nhiên số rễ/cây thấp (2,4 rễ), rễ ngắn (4,23 cm). Bổ sung α-NAA vào môi trƣờng nuôi cấy đã làm tăng số rễ/cây và chiều dài rễ trung bình so với công thức đối chứng với số rễ/cây đạt dao động từ 2,84 (0,1 mg/l α-NAA) đến 3,47 rễ (1,0 mg/l α-NAA) và chiều dài rễ trung bình đạt từ 3,8 (1,0 mg/l α-NAA) đến 7,06 cm (0,25 mg/l α-NAA). Tuy nhiên, trên môi trƣờng bổ sung α-NAA, tỷ lệ chồi ra rễ lại thấp hơn so với môi trƣờng đối chứng ½ MS. Tỷ lệ chồi ra rễ đạt đƣợc cao nhất (92,31%) trên môi trƣờng chứa 0,5 mg/l α-NAA và chỉ đạt 73,08% trên môi trƣờng chứa 1,0 mg/l α-NAA trong khi tỷ lệ này trên môi trƣờng ½ MS là 100% sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.6). Qua kết quả thử nghiệm, chồi Đan sâm trên môi trƣờng tạo rễ phải đạt ít nhất 3-4 rễ/cây và chiều dài rễ phải đạt trên 3 cm thì sẽ thuận lợi cho cây phát triển ở giai đoạn vƣờn ƣơm.

Quan sát trong quá trình theo dõi thí nghiệm nhận thấy, thời gian rễ bắt đầu xuất hiện trên môi trƣờng chứa α-NAA rút ngắn hơn so với công thức đối chứng. Trên môi trƣờng chứa α-NAA ở nồng độ 0,25 - 1,0 mg/l α-NAA, thời điểm chồi Đan sâm bắt đầu xuất hiện rễ là 12 - 13 ngày sau khi cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ, sớm hơn 1-2 ngày so với thời điểm xuất hiện rễ của chồi Đan sâm trên môi trƣờng đối chứng ½ MS hay môi trƣờng ½ MS 0,1 mg/l α-NAA.

Xét về hình thái chồi Đan sâm, trên môi trƣờng đối chứng ½ MS, các chồi Đan sâm có thân mập hơn, cao hơn, lá to hơn, lá có màu xanh đậm hơn so với các chồi Đan sâm trên môi trƣờng ½ MS bổ sung α-NAA (Hình 4.5). Bổ sung α- NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hoặc cao (0,75; 1,0 mg/l), chồi Đan sâm có chiều cao thấp, lá nhỏ và có màu xanh nhạt hơn so với chồi Đan sâm trên môi trƣờng α-NAA ở nồng độ trung bình (0,25; 0,5 mg/l α-NAA) (Hình 4.5).

4.1.3.2 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm in vitro Mặc dù bổ sung α-NAA vào môi trƣờng nuôi cấy đã cải thiện đƣợc chất lƣợng bộ rễ Đan sâm so với đối chứng nhƣng tỷ lệ chồi ra rễ còn thấp, thời gian chồi bắt đầu hình thành rễ còn dài. Nhằm mục đích nâng cao tỷ lệ ra rễ, cải thiện chất lƣợng bộ rễ và rút ngắn thời gian ra rễ, IBA đã đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ra rễ cây Đan sâm. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy đƣợc trình bày ở bảng 4.7.

Bổ sung IBA vào môi trƣờng nuôi cấy đã cải thiện chất lƣợng bộ rễ cây Đan sâm. So với công thức đối chứng, số rễ trung bình/cây trên môi trƣờng bổ sung IBA đạt đƣợc cao hơn (3,10 - 3,88 rễ) và rễ dài hơn (4,16 - 7,24 cm). So với α-NAA, bổ sung IBA vào môi trƣờng nuôi cấy cho tỷ lệ chồi ra rễ cao hơn. Tỷ lệ chồi ra rễ đạt cao nhất (100%) trên môi trƣờng bổ sung 0,25 hoặc 0,5 mg/l IBA (Bảng 4.7).

IBA (mg/l)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ TB (rễ)

Chiều dài TB rễ (cm)

0,00

100,00

2,40

4,23

0,10

91,67

3,50

6,30

0,25

100,00

3,88

5,26

0,50

100,00

3,65

7,24

0,75

87,50

3,45

4,16

1,00

84,62

3,10

6,30

CV%

4,2

2,0

0,25

0,2

LSD0,05

Ghi chú: môi trƣờng nền là ½ MS

Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của IBA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Về mặt hình thái chồi, các chồi trên môi trƣờng bổ sung IBA ở nồng độ

thấp (0,1 và 0,25 mg/l) có thân cao, mập, lá to, màu xanh đâm, trong khi các chồi

trên môi trƣờng có chứa IBA ở nồng độ cao hơn (0,5; 0,75 và 1,0 mg/l) thấp hơn,

0 mg/l IBA

0,1 mg/l IBA

0,25 mg/l IBA

0,5 mg/l IBA

0,75 mg/l IBA

1,0 mg/l IBA

lá bé và nhỏ hơn (Hình 4.6).

Hình 4.6. Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

4.1.3.3 Ảnh hưởng của IAA tới khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm in vitro Trong trƣờng hợp sử dụng IAA để kích thích tạo rễ cho chồi Đan sâm in

vitro, chất lƣợng bộ rễ cũng đƣợc cải thiện so với môi trƣờng đối chứng và môi

trƣờng bổ sung α-NAA hoặc IBA. Cụ thể, trên môi trƣờng bổ sung IAA, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ TB đạt 3,69 – 6,19 rễ và chiều dài rễ dao động từ 8,63

đến 11,03 cm sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.8).

IAA (mg/l)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ TB (rễ)

Chiều dài TB rễ (cm)

0,0

100

2,40

4,23

0,1

100

3,71

8,63

0,25

100

3,69

9,65

0,5

100

4,25

11,03

0,75

100

6,19

9,29

1,0

100

5,62

9,02

CV%

2,8

1,2

0,22

0,19

LSD0,05

Ghi chú: môi trƣờng nền là ½ MS

0 mg/l IAA

0,1 mg/l IAA 0,25 mg/l IAA 0,5 mg/l IAA 0,75 mg/l IAA 1,0 mg/l IAA

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của IAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Hình 4.7. Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

Quan sát về hình thái cho thấy, chồi Đan sâm trên môi trƣờng bổ sung IAA có bộ lá phát triển, lá to, dày, màu xanh đậm, chồi cao, mập (Hình 4.7). Đây là những chồi có khả năng thích nghi cao khi chuyển ra ngoài điều kiện nhà lƣới.

Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp nhất để tạo rễ cho chồi là MS bổ sung 0,75

mg/l IAA cho 100% với số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 9,29 cm.

Trong nghiên cứu này, IAA tỏ ra thích hợp hơn trong việc kích thích chồi Đan sâm tạo rễ so với α-NAA và IBA. Tuy nhiên, môi trƣờng thích hợp nhất để chồi Đan sâm tạo rễ đƣợc kết luận ở các nghiên cứu khác nhau là rất khác nhau. Trong khi Zhao et al. (2003) chỉ ra môi trƣờng thích hợp nhất để tạo rễ cho chồi Đan sâm là ½ MS + 0,5 mg/l IBA thì Wang et al. (2004) lại cho rằng khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm tốt nhất trên môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l α-NAA. Theo kết quả nghiên cứu của Xu and Sun (2008) thì bổ sung kết hợp α-NAA (0,1 – 1,0 mg/l) và 0,1 mg/l IAA giúp chồi Đan sâm tạo rễ tốt hơn. Xu and Sun (2008) tìm ra môi trƣờng tốt nhất để chồi Đan sâm tạo cây hoàn chỉnh là ½ MS + 0,1 mg/l IBA 10 g/l sucrose và đạt tỷ lệ chồi ra rễ là 95%. Nhƣ vậy có thể thấy, phản ứng ra rễ của các giống Đan sâm khác nhau là hoàn toàn khác nhau.

4.1.4. Thích nghi cây ngoài vƣờn ƣơm

Giai đoạn vƣờn ƣơm là giai đoạn quyết định khả năng ứng dụng của đề tài nhân giống vô tính in vitro một cây trồng vào thực tiễn sản xuất. Trƣớc khi trồng trên đồng ruộng sản xuất, cây in vitro vốn sống trong môi trƣờng nhân tạo, thuận lợi về dinh dƣỡng, nhiệt độ, ánh sáng. Khi chuyển ra đất, với điều kiện nuôi trồng về dinh dƣỡng, ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ đều rất khác biệt so với điều kiện nuôi cấy in vitro do vậy cây con rễ bị stress, mất nƣớc. Vì vậy, việc xác định đƣợc các yếu tố để cây in vitro có thể tồn tại và sinh trƣởng tốt ở ngoài môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt là giai đoạn ra cây là rất quan trọng.

4.1.4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây Đan sâm in vitro trên môi trường ra rễ đến sự sinh trưởng và phát triển khi ra vườn ươm

Đối với việc thích nghi cây in vitro ngoài vƣờn ƣơm, chất lƣợng cây ra

ngôi có ảnh hƣởng rất lớn. Chất lƣợng cây ra ngôi đƣợc phản ánh qua các chỉ tiêu về chiều cao cây, số cặp lá/cây, chất lƣợng bộ rễ, mức độ thích nghi với điều kiện ngoại cảnh. Do vậy, để xác định đƣợc chất lƣợng cây in vitro phù hợp khi ra cây ngoài vƣờn ƣơm, đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian nuôi cây Đan sâm trên môi trƣờng ra rễ trƣớc khi chuyển ra thích nghi ngoài vƣờn ƣơm. Cây Đan sâm cấy mô đƣợc trồng trên giá thể xơ dừa: cát với tỷ lệ 1:1. Kết quả

sau 4 tuần ra cây đƣợc thể hiện ở bảng 4.9.

Số lá

Chất lƣợng cây

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Tỷ lệ cây sống (%)

Chiều cao cây (cm)

7,07

4,18

100

9,33

4,32

100

9,40

5,93

3,6 0,89

Cây và lá nhỏ, lá màu xanh nhạt Cây mập, lá to, lá màu xanh đậm Cây cao, mập, lá to, lá màu xanh đậm

3,4 0,38

CV% LSD0,05

Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy cây in vitro trên môi trƣờng ra rễ đến tỷ lệ sống của cây con ngoài vƣờn ƣơm trên giá thể xơ dừa: cát (1:1) sau 4 tuần

Thời gian nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ có ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của cây Đan sâm cấy mô khi ra cây ngoài vƣờn ƣơm. Cây in vitro nuôi cấy trên môi

trƣờng ra rễ 30 và 40 ngày có tỷ lệ sống 100%, trong khi đó cây non hơn (20

ngày nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ) có tỷ lệ sống thấp hơn (90%) (Bảng 4.9).

Sau 4 tuần chuyển cây ra thích nghi ngoài vƣờn ƣơm, cây in vitro đƣợc

nuôi cấy 40 ngày trên môi trƣờng ra rễ có chiều cao đạt 5,93 cm, cao hơn so với chiều cao và số lá của cây in vitro nuôi cấy 20 và 30 ngày trên môi trƣờng ra rễ.

Điều này có thể giải thích do cây in vitro 40 ngày tuổi có các chỉ tiêu về thân lá,

rễ, khối lƣợng tƣơi... cao hơn nên khả năng thích nghi tốt hơn.

Quan sát về hình thái cho thấy, cây in vitro nuôi cấy 30 ngày trên môi

trƣờng ra rễ tƣơng đƣơng với cây nuôi cấy 40 ngày, đồng thời cây sinh trƣởng,

phát triển mạnh, cây to, thân mập, bộ lá phát triển, bản lá to và có màu xanh đậm trong khi cây in vitro nuôi cấy 20 ngày trên môi trƣờng ra rễ sinh trƣởng, phát

triển kém hơn, thân và lá nhỏ, lá màu xanh nhạt.

Xét về hiệu quả kinh tế của quy trình nhân nhanh in vitro, cây nuôi cấy trên

môi trƣờng ra rễ 30 ngày tuổi là thích hợp để đƣa ra thích nghi ngoài vƣờn ƣơm.

4.1.4.2 Ảnh hưởng của giá thể trồng tới sự sinh trưởng và phát triển của cây Đan sâm

Cây Đan sâm in vitro đang sống trong môi trƣờng nuôi cấy đƣợc kiểm soát, vì vậy khi đƣa ra ngoài vƣờn cũng phải có điều kiện tƣơng đối thuận lợi để cây có thể thích nghi và sinh trƣởng, phát triển tốt. Giá thể có vai trò rất quan trọng trong quá trình đƣa cây từ môi trƣờng trong bình nuôi ra môi trƣờng bên ngoài. Việc lựa chọn giá thể thích hợp góp phần lớn vào thành công của quá trình chăm sóc cây ra

ngôi. Giá thể ảnh hƣởng trực tiếp đến tỷ lệ cây sống sót, đến sinh trƣởng của cây giai đoạn vƣờn ƣơm.

Trong thí nghiệm này, 5 loại giá thể đã đƣợc khảo sát bao gồm cát (100%), đất:cát (3:7), đất:cát (1:1), xơ dừa:cát (3:7), xơ dừa (1:1). Thí nghiệm sử dụng cây in vitro sau khi chuyển sang môi trƣờng ra rễ 30 ngày. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.10.

Tỷ lệ sống của cây Đan sâm dao động rất lớn giữa các giá thể khác nhau. Tỷ lệ cây sống đạt cao nhất (100%) trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát. Khi giảm lƣợng xơ dừa trong giá thể thì tỷ lệ cây sống cũng giảm theo, chỉ đạt 93,33% trên giá thể xơ dừa: cát (3:7) và 80% trên giá thể cát. Đặc biệt, tỷ lệ cây sống giảm rất mạnh khi trồng trên giá thể có chứa đất (36,67 – 46,67%), cây sinh trƣởng, phát triển chậm (Bảng 4.10, Hình 4.8). Điều này có thể lý giải do bộ rễ của cây in vitro còn yếu, giá thể đất khó thoát nƣớc, dễ bị bí chặt gây khó khăn trong việc đâm xuyên vào giá thể cũng nhƣ làm giảm khả năng trao đổi khí ở bộ rễ của bộ rễ cây Đan sâm cấy mô. Trong khi đó, giá thể cát và xơ dừa nhẹ, xốp, thoát nƣớc tốt giúp hệ rễ cây phát triển mạnh.

Giá thể

Số lá

Nhận xét

Tỷ lệ cây sống (%)

Chiều cao cây (cm)

Cát

80,00

3,65

7,97

Đất: cát (3:7)

46,67

3,42

3,40

Đất: cát (1:1)

36,67

3,33

2,87

93,33

3,34

9,27

100

5,31

9,07

Xơ dừa: cát (3:7) Xơ dừa: cát (1:1)

3,0 0,16

4,0 0,5

Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm Cây và bộ lá phát triển trung bình, phiến lá to, màu xanh đậm Cây và bộ lá phát triển kém, phiến lá nhỏ, màu xanh nhạt Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm

CV% LSD0,05

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây Đan sâm 30 ngày tuổi

Để tăng tỷ lệ cây Đan sâm sống khi trồng trong vƣờn ƣơm, Xu and Sun (2008) chuyển cây Đan sâm in vitro sang giá thể chứa vemiculite: đất (1:1) đã hấp khử trùng và chống thoát nƣớc bằng cách che phủ túi nilon trong 3 tuần trƣớc khi đƣa cây ra trồng ngoài đồng ruộng. Để thu đƣợc tỷ lệ cây sống 100%

100% cát

Đất: Cát (1:1)

Cát: Xơ dừa (1:1)

Cát: Xơ dừa (7:3)

khi trồng trên giá thể đất, Feng et al. (2004) trồng cây Đan sâm in vitro trong hệ thống thủy canh vài ngày trƣớc khi chuyển ra trồng trên đất.

Đất: Cát (3:7) Hình 4.8. Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng thích nghi cây Đan sâm ngoài vƣờn ƣơm

Nhƣ vậy, cây in vitro cần nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ 30 ngày là thích hợp

để chuyển ra ngoài vƣờn ƣơm. Giá thể thích hợp để ƣơm cây in vitro là cát xơ dừa

(tỷ lệ 1:1), cho tỷ lệ cây sống đạt 100%, cây sinh trƣởng, phát triển khỏe mạnh.

Cây in vitro sau khi ra ngoài vƣờn ƣơm 30 ngày, các cây sinh trƣởng phát

triển khỏe mạnh, chiều cao từ 3 - 4 cm đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn ƣơm.

4.1.5. Quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm Dựa vào những kết quả đã thu nhận đƣợc, chúng tôi đề xuất quy trình

MS + 1,0 mg/l GA3

2 tuần

4 tuần

MS + 0,5 mg/l BA

Cát: xơ dừa (1:1)

30 ngày

½ MS + 0,75 mg/l IAA

nhân giống in vitro cây Đan sâm nhƣ sau:

Bƣớc 1: Tạo vật liệu khởi đầu

Hạt Đan sâm sau khi rửa bằng nƣớc sạch đƣợc khử trùng bằng cồn 70% trong 30 giây, tráng lại bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần. Tiếp theo, hạt Đan sâm đƣợc gieo trên môi trƣờng MS + 1,0 mg/l GA3 trong 2 tuần để kích thích hạt nảy mầm.

Bƣớc 2: Nhân nhanh chồi

Đoạn thân có kích thƣớc từ 1-1,5 cm mang chồi nách cắt từ cây Đan sâm in vitro đƣợc chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh là môi trƣờng MS + 0,5 mg/l BA trong 4 tuần.

Bƣớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi Đan sâm có chiều cao 2-3 cm, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng ½ MS 0,75 mg/l IAA trong 30 ngày để kích thích tạo rễ.

Bƣớc 4: Thích nghi cây ngoài điều kiện tự nhiên

Cây Đan sâm in vitro sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ 30 ngày

đƣợc chuyển ra vƣờn ƣơm, sử dụng giá thể 50% cát 50% xơ dừa.

4.2. TẠO DÒNG RỄ TƠ VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ IN VITRO CÂY ĐAN SÂM

Tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học là một giải pháp hiệu quả, có thể khắc phục đƣợc những hạn chế của phƣơng pháp nhân giống truyền thống, đồng thời có những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ nâng cao hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu, chủ động quá trình sản xuất, tối ƣu hóa quy trình chiết xuất hợp chất mục tiêu.

Nghiên cứu tạo rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm đã đƣợc tiến hành bởi một số nhà khoa học trên thế giới với kết quả khả quan. Gupta et al. (2011) tạo thành công các dòng rễ tơ cây Đan sâm nhờ vi khuẩn A. rhizogenes BCRC 15010 với tỷ lệ mô lá tạo rễ đạt 78%. Thông qua tối ƣu các thành phần môi trƣờng nuôi cấy, sinh khối rễ tơ Đan sâm và các hoạt chất tích lũy nhƣ tanshione, salvinolic acid tăng lên đáng kể (Yan et al., 2005). Tuy nhiên, tại Việt Nam, chƣa có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc tạo các dòng rễ tơ Đan sâm nhờ vi khuẩn A.rhizogenes hay thiết lập quá trình nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm. Do vậy, việc tạo thành công rễ tơ Đan sâm và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tăng sinh khối rễ trong quá trình nuôi cấy góp phần tạo tiền đề cho quá trình xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây Đan sâm phục vụ phát triển ngành công nghiệp dƣợc liệu tại Việt Nam.

4.2.1. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguồn vật liệu dùng cho lây nhiễm với vi

khuẩn có khả năng cảm ứng chuyển gen khác nhau (Lièvre et al., 2005; Diof et

al., 2006). Sau 4 tuần lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes tại nồng độ dịch khuẩn tƣơng ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2, đoạn thân và cuống lá Đan sâm hoàn toàn không tạo rễ, trong khi đó, mô lá cho tỷ lệ tái sinh tạo rễ tơ

với tỷ lệ 53,85%, số rễ trung bình đạt 8,54 rễ/mẫu (Bảng 4.11). Quan sát hình

thái cho thấy, mẫu mô lá cảm ứng tạo rễ tại vị trí gây vết thƣơng, mẫu cuống lá

và đoạn thân có hiện tƣợng hóa nâu và tạo callus tại vị trí cắt (Hình 4.9). Quan

sát hình dạng rễ tơ tạo ra từ mô lá Đan sâm nhận thấy các dòng rễ đƣợc tạo ra từ

mô lá có sức sinh trƣởng nhanh, khả năng phân nhánh tốt khi đƣợc cắt và chuyển

sang môi trƣờng tái sinh không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật.

Tỷ mẫu tạo rễ

Số rễ/mẫu

Vật liệ(cid:13)

(%)

(rễ)

Mô lá Cuống lá

53,85 0

8,54 0

Đoạn thân

Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ Đan sâm sau 4 tuần

B Hình 4.9. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm: A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân.

Sự hình thành rễ tơ từ mẫu lá cao hơn so với từ cuống lá và đoạn thân có

thể do quá trình chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào Đan sâm ở mô lá dễ xảy ra

hơn so với ở cuống lá và đoạn thân. Kim et al. (2008) đã chứng minh rằng chủng

A. rhizogenes 15834 cho tỷ lệ phần trăm số mẫu tạo rễ tơ trên lá đậu phộng là

36,8% và số rễ tơ tạo ra từ vị trí bị thƣơng là 2,3 rễ. Còn trên mẫu từ trụ hạ diệp

thì tỷ lệ tạo rễ tơ là 75,9% và 6,7 rễ. Shi and Kintzios (2003) cũng ghi nhận đối

với cây Pueraria phaseoloides có kết quả tạo rễ tơ từ mẫu cuống lá cao hơn từ

mẫu lá và lá mầm. Còn đối với cây Valeriana sisymbriifolium, Rahimi et al. (2008)

đã chỉ ra mẫu lá và cuống lá sau khi lây nhiễm với vi khuẩn A. rhizogenes cho tỷ lệ

mẫu tạo rễ tơ cao hơn so với mẫu trụ hạ diệp. Hoàng Thị Thanh Minh và cs.

(2011) cũng nhận thấy sự tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ tơ từ mô lá của cây đậu phộng cao

hơn so với trụ hạ diệp, trụ thƣợng diệp, cuống lá và lá mầm.

Nhƣ vậy, vật liệu thích hợp để thực hiện chuyển gen tạo rễ tơ cây Đan sâm

là mô lá của cây in vitro. Kết luận này cũng trùng với kết quả của một số nghiên cứu trƣớc đây. Hao et al. (2012) ghi nhận tỷ lệ mẫu lá Đan sâm Salvia miltiorrhiza

Bunge tạo rễ tơ (73%) cao hơn so với đoạn thân khi lây nhiễm 2 loại vật liệu này

với chủng vi khuẩn A.rhizogenes ACCC 10066. Gupta et al. (2011) sử dụng mô lá

làm vật liệu lây nhiễm với chủng vi khuẩn A.rhizogenes để tạo dòng rễ tơ Đan sâm với hiệu quả chuyển gen đạt 75 - 80%. Theo Pavar and Maheshvari (2004), có sự

khác nhau về kết quả tạo rễ tơ trên các loại vật liệu khác nhau là do phản ứng của các mô thực vật khác nhau với sự xâm nhiễm của vi khuẩn A.rhizogenes là khác

nhau và phụ thuộc rất lớn vào trạng thái sinh lý của mô.

4.2.2. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm

Mật độ vi khuẩn A.rhizogenes là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng rõ đến hiệu quả chuyển gen nhằm thu đƣợc các dòng rễ tơ của thực vật. Kiana et al.

(2012) khảo sát khả năng thu đƣợc các dòng rễ tơ từ mô lá cây Portulaca oleracea tại bốn mật độ vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 và nhận thấy mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,6 cho tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ đạt cao nhất (70%), trong khi mật độ vi khuẩn ở giá trị OD600 cao hoặc thấp hơn 0,6 cho tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ chỉ đạt 30-50%.

Có sự khác nhau về tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu khi lây nhiễm mô lá Đan sâm với vi khuẩn ở các mật độ khác nhau tƣơng ứng với các giá trị OD600 = 0,05; 0,1; 0,2 và 0,3. Tỷ lệ mô lá tạo rễ (53,85%) và số rễ/mẫu (8,54 rễ) đạt cao nhất khi mật độ vi khuẩn ở giá trị OD600 = 0,2. Ở mật độ vi khuẩn thấp hơn (OD600 = 0,05; 0,1) hay cao hơn (OD600 = 0,3) cho tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu thấp hơn (Bảng 4.12). Do vậy, mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,2 là thích hợp cho chuyển gen tạo rễ tơ Đan sâm.

Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

Số rễ/mẫu (rễ)

OD600 0,05

18,18

0,52

0,1

23,53

0,94

OD600 = 0,2

OD600 = 0,3

0,2 0,3

53,85 25,00

8,54 2,33

Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm

Hình 4.10. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm

4.2.3. Xác định dòng rễ tơ chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR 4 ách chiết DNA genome

Các mẫu rễ tơ thu đƣợc sau khi lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes với mô lá Đan sâm, sau khi đƣợc cấy chuyển nhiều lần trên môi trƣờng nuôi dƣỡng có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đƣợc tách chiết DNA tổng số theo Kit tách chiết DNA của Qiagen để kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển (rolA, rolB, rolC) thông qua kỹ thuật PCR. Sự hiện diện của đoạn gen chuyển trong bộ gen của rễ tơ sẽ chứng tỏ vi khuẩn A. rhizogenes đã chuyển gen thành công vào rễ tơ.

Ghi chú: Giếng 1: Ladder 1kb; giếng 2: DNA tổng số từ rễ cây bất định; giếng 3 - 14: DNA tổng số từ rễ tơ Đan sâm

Hình 4.11. Ảnh điện di kết quả tách chiết DNA tổng số từ rễ Đan sâm

DNA tổng số từ rễ tái sinh sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. rhizogenes và rễ bất định (không đồng nuôi cấy) in vitro đƣợc tách chiết và kiểm tra tính chất lƣợng bằng quan sát kết quả điện di trên gel agarose. Kết quả điện di ở hình 4.11 cho thấy, trong 13 mẫu rễ đem tách chiết, có 1 mẫu rễ bất định và 9 mẫu rễ tơ cho chất lƣợng DNA tổng số đạt yêu cầu với tiêu chuẩn dùng cho phản ứng PCR. Các mẫu rễ tơ tƣơng ứng với DNA ở các giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12.

4 Xác định các d ng rễ tơ chuyển gen

Nhƣ đã biết, tác nhân gây bệnh lông rễ là do sự có mặt của plasmid Ri (root-inducing). T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine A. rhizogenes bao gồm hai vùng chính là vùng bờ trái TL-DNA và bờ phải TR-DNA. Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa tổng hợp auxin, vùng TL-DNA gồm 18 khung đọc mở trong đó có bốn locus mã hóa cho 4 gen rolA, rolB, rolC và rolD. Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Khi lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes với mô tế bào thực vật, vùng TL-DNA và TR-DNA của Ri-plasmid đƣợc chuyển vào hệ gen của tế bào thực

vật. Do vậy, để xác định các dòng rễ tơ chuyển gen, gen rolA đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 4.12A cho thấy, trong 10 dòng rễ tơ có 6 dòng (giếng 1, 3, 4, 6, 9, 10 - Hình 4.12A) có sự xuất hiện vạch băng DNA kích thƣớc 307 bp trùng vị trí với đối chứng dƣơng trong khi đó vạch băng này không xuất hiện ở đối chứng âm là mẫu rễ bất định. Nhƣ vậy, 6 dòng rễ tơ này có thể là rễ tơ chuyển gen chứa gen rolA trong genome.

307 bp

250 bp

Để loại trừ khả năng gen rolA có mặt trong sáu dòng rễ tơ là do vi khuẩn A. rhizogenes còn tồn tại trong rễ, phản ứng PCR với cặp mồi virDF và virDR đƣợc thực hiện để khuếch đại gen virD - một gen gây độc có mặt ở vùng gen vir của Ri-plasmid và không đƣợc chuyển vào hệ genome thực vật trong quá trình lây nhiễm. Kết quả cho thấy, 2 dòng rễ tơ chứa gen rolA (giếng 9, 10 - Hình 4.12B) xuất hiện vạch băng DNA có kích thƣớc 560 bp giống đối chứng dƣơng và 4 dòng rễ (giếng 1, 3, 4, 6 - Hình 4.12B) không xuất hiện vạch băng tƣơng ứng với kích thƣớc của gen virD. Điều này chứng tỏ DNA của vi khuẩn A. rhizogenes có mặt trong 2 dòng rễ tơ (giếng 9, 10 – Hình 4.12). 6

560bp

500 bp

Hình 4.12. Kết quả khuếch đại gen rolA (A) và gen virD (B) bằng phƣơng pháp PCR: L: GeneRuler 1kb DNA Ladder; +): Đối chứng dƣơng, sản phẩm PCR của Ri plasmid 15834; (-): Đối chứng âm, sản phẩm PCR của DNA genome rễ bất định Đan sâm; H2O: Đối chứng âm, nƣớc; Giếng 1-1 A): Sản phẩm PCR của DNA genome 1 d ng rễ tơ Đan sâm; Giếng 1, 3, 4, 6, , 1 B): sản phẩm PCR với cặp mồi virD và virDR của 6 d ng rễ tơ c mang gen rolA.

Từ kết quả trên có thể kết luận gen rolA từ pRi plasmid của A. rhizogenes 15834 đã đƣợc chuyển vào rễ tơ cây Đan sâm. Sự vắng mặt của gen virD trong 4

dòng rễ tơ cũng khẳng định rằng vi khuẩn sau khi đem lây nhiễm với nguồn vật

liệu ban đầu đã đƣợc khử sạch hoàn toàn và không còn sót lại trên bề mặt tế bào

4 dòng rễ tơ chuyển gen này.

Nhƣ vậy, có thể kết luận nghiên cứu đã thu đƣợc 4 dòng rễ tơ chuyển gen.

Qua khảo sát nhận thấy, các dòng rễ tơ này tăng sinh khối nhanh, ổn định trong

môi trƣờng nuôi cấy không chứa chất điều tiết sinh trƣởng.

4.2.4. Ảnh hƣởng của thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Trong nuôi cấy rễ tơ, việc chọn lựa các dòng rễ tơ có khả năng phát mạnh

cũng nhƣ điều kiện nuôi cấy tối ƣu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy hoạt chất mục tiêu ở mức cao hơn. Dòng rễ tơ nuôi cấy tích lũy một lƣợng lớn hoạt chất sinh

học chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt nhƣ: thành phần môi trƣờng và điều kiện

nuôi cấy thích hợp, các dòng rễ tơ năng suất cao, bổ sung tiền chất nuôi cấy và

các chất kích kháng bảo vệ thực vật thích hợp.

Trong số các dòng rễ tơ Đan sâm thu đƣợc, dòng rễ tơ A5.14 có sự tăng

sinh khối nhanh, ổn định trong môi trƣờng nuôi cấy không bổ sung chất điều tiết

sinh trƣởng nên đƣợc sử dụng làm vật liệu nuôi cấy để khảo sát các yếu tố ảnh

hƣởng đến sự tăng sinh khối cũng nhƣ hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu của rễ tơ

Đan sâm.

Dòng rễ tơ A5.14 đƣợc sử dụng làm vật liệu trong thí nghiệm đánh giá

ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng đến sự tăng sinh khối của rễ tơ chuyển

gen. Nghiên cứu sử dụng 2 nền môi trƣờng là MS và B5.

Khối lƣợng rễ

Khối lƣợng rễ tƣơi

Khối lƣợng rễ

Môi trƣờng

ban đầu (g)

sau 4 tuần (g)

tăng (lần)

khô (g)

5,90

0,55

7,61

0,57

0,297 0,373 4,6 0,034

CV% LSD0,05

3,25 4,34 2,2 0,19

Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy

Từ 0,55 gram rễ nuôi cấy trên môi trƣờng B5, sau 4 tuần, khối lƣợng rễ tƣơi tăng 7,61 lần, đạt 4,34 gram và thu đƣợc 0,373 gram khối lƣợng rễ khô sau

khi sấy. Trong khi đó, khối lƣợng rễ tƣơi tăng trên môi trƣờng MS là 5,90 lần, đạt 3,25 gram từ 0,55 gram rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy và thu đƣợc 0,297

gram khối lƣợng rễ khô. Khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng B5, sinh khối rễ Đan

sâm tƣơi cao hơn 28,6%, sinh khối rễ khô tăng 25,5% so với khi nuôi cấy trên

môi trƣờng MS (Bảng 4.13).

Quan sát về hình thái cho thấy, rễ tơ Đan sâm trên môi trƣờng nền MS to

và ít phân nhánh hơn rễ tơ Đan sâm trên môi trƣờng nền B5 (Hình 4.13).

Hình 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Sự khác biệt về sự tăng sinh khối rễ tơ trên môi trƣờng MS và B5 có thể giải

thích là do sự khác nhau về thành phần dinh dƣỡng của hai loại môi trƣờng. Theo

kết quả nghiên cứu của Sivakumar và cs. (2005), dinh dƣỡng khoáng là một trong

những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và tăng sinh khối rễ tơ cây

nhân sâm. Bensaddek và cs. (2001) nhận thấy hàm lƣợng ammonium cao trong môi

trƣờng nuôi cấy rễ tơ cây A. belladonna làm giảm tốc độ tăng trƣởng của rễ tơ, trong

khi đó hàm lƣợng nitrate cao làm giảm sự sinh tổng hợp và tích lũy alkaloid. Trong

trƣờng hợp rễ tơ cây Đan sâm chúng tôi ghi nhận xu hƣớng tƣơng tự. Hàm lƣợng

ammomium trong môi trƣờng MS cao hơn 20,3 lần so với hàm lƣợng ammonium trong môi trƣờng B5, có thể vì lý do này mà sinh khối rễ thu đƣợc trên môi trƣờng

MS thấp hơn so với môi trƣờng B5. Trong năm môi trƣờng nền khảo sát gồm WPM, B5, N6, MS, ½ MS, Hsia và cs. (2007) nhận thấy môi trƣờng cho sinh khối rễ Đan sâm đạt cao nhất là môi trƣờng WPM, theo sau lần lƣợt là B5, MS, ½ MS và N6. Ở nghiên cứu này, trong hai môi trƣờng khảo sát là MS và B5, môi trƣờng B5 là thích hợp để nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm. Do vậy B5 đƣợc lựa chọn làm môi trƣờng nên

để nhân nuôi rễ tơ Đan sâm ở những thí nghiệm sau.

4.2.5. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Trong nuôi cấy rễ in vitro, trạng thái môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rõ

đến tốc độ tăng trƣởng của rễ. Trong nghiên cứu này, bốn trạng thái môi trƣờng thử nghiệm gồm rắn; bán lỏng; lỏng và nuôi cấy phân lớp với 25 ml môi trƣờng

đặc ở dƣới, 25 ml môi trƣờng lỏng ở trên. Tốc độ tăng trƣởng rễ tơ trên môi

trƣờng rắn cao nhất, theo sau là môi trƣờng bán lỏng; lỏng, tĩnh và kém nhất là

trạng thái môi trƣờng phân lớp với khối lƣợng rễ tăng lần lƣợt là 7,67; 3,67; 3,08

và 2,83 lần so với khối lƣợng rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.14).

Trạng thái môi

Khối lƣợng

Khối lƣợng rễ tƣơi

Khối lƣợng rễ

Khối lƣợng

rễ ban đầu (g)

sau 4 tuần (g)

tăng (lần)

trƣờng

Rắn

0,57

7,67

Bán lỏng Lỏng, tĩnh

0,69 0,73

4,34 2,53 2,25

3,67 3,08

Phân lớp

0,77

2,18

2,83

CV%

4,2

rễ khô (g) 0,37 0,14 0,11 0,11 3,7

LSD0,05

0,33

0,02

Bảng 4.14. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy

Về mặt hình thái, rễ tơ Đan sâm có màu vàng, trắng, phân nhánh nhiều trên môi trƣờng nuôi cấy rắn nhƣng lại có xu hƣớng hóa đen và ít phân nhánh

B5 rắn

B5 bán lỏng

B5 lỏng

B5 phân lớp

trên môi trƣờng bán lỏng, lỏng và phân lớp (Hình 4.14).

Hình 4.14. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

Hsia và cs. (2007) khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy rắn và lỏng, lắc 100 vòng/phút đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm và nhận thấy rễ tơ nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng, lắc cho khối lƣợng tƣơi cao gấp 3 lần và khối lƣợng khô cao gấp 6 lần so với rễ tơ nuôi cấy trên môi trƣờng đặc. Tuy nhiên trong nghiên cứu

này, môi trƣờng đặc cho hiệu quả nuôi cấy rễ tơ Đan sâm cao hơn so với ba phƣơng thức nuôi cấy còn lại có thể do nuôi cấy trong môi trƣờng bán lỏng; lỏng, tĩnh hay phân lớp; rễ tơ Đan sâm ngập chìm trong môi trƣờng do vậy rễ không đƣợc thoáng khí, giảm sự trao đổi khí. Có thể vì lý do này mà một số mẫu rễ xuất hiện hiện tƣợng trƣơng nƣớc, một số rễ bị chết. Nhƣ vậy, trong điều kiện không có máy lắc, cần sử dụng môi trƣờng đặc cho nhân nuôi thu sinh khối rễ tơ.

4.2.6. Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Với mục đích xác định đƣợc chủng loại bình nuôi cấy có giá thành hạ

nhƣng vẫn cho tốc độ tăng trƣởng rễ tơ cao, đề tài thử nghiệm 4 loại bình nuôi

cấy gồm bình trụ, bình tam giác, bình chữ nhật và túi nilon. Các loại bình nuôi

cấy khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến sự tăng sinh khối rễ tơ sau 10 tuần

nuôi cấy. Trong các loại bình nuôi cấy, khối lƣợng rễ tơ tăng đạt cao nhất (15,90

lần) khi nuôi cấy trong bình tam giác 500 ml, theo sau là túi nilon với khối lƣợng

rễ tăng 14,70 lần sau 10 tuần nuôi cấy, khối lƣợng rễ tơ tăng đạt thấp nhất (9,70

lần) khi nuôi cấy rễ trong bình chữ nhật 750 ml (Bảng 4.15).

Loại bình

Khối lƣợng rễ ban đầu

Khối lƣợng rễ tƣơi sau 10 tuần

Khối lƣợng rễ tăng

Khối lƣợng rễ khô

(g)

(lần)

(g)

Bình trụ 250 ml Bình tam giác 500 ml

0,84 0,83

11,97 13,12

14,25 15,90

0,703 0,837

Bình chữ nhật 750 ml Túi nilon 13 x 25 cm

0,85 0,85

8,25 12,95

9,70 14,70

0,547 0,757

CV% LSD0,05

1,5 0,38

4,3 0,06

Bình trụ

Túi nilon

Bình chữ nhật

Bình tam giác

Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của các loại b nh nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau 10 tuần nuôi cấy

Hình 4.15. Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

Tốc độ rễ tăng cao nhất khi nuôi cấy trong bình tam giác có thể giải thích là do diện tích bề mặt rễ tiếp xúc với môi trƣờng và khả năng thu nhận ánh sáng

của rễ là lớn nhất. Tuy nhiên, sử dụng túi nilon để nuôi cấy rễ tơ cho hiệu quả

kinh tế cao hơn do giá thành thấp cũng nhƣ tiết kiệm điện năng trong quá trình

chuẩn bị môi trƣờng. Do sự khác biệt không đáng kể về khối lƣợng rễ khi nuôi cấy trong túi nilon, bình tam giác cũng nhƣ bình trụ, có thể sử dụng túi nilon để

nuôi cấy rễ tơ Đan sâm để nâng cao hiệu quả kinh tế khi sản xuất ở quy mô lớn.

4.2.7. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14

Theo nghiên cứu của Fett-Neto và cs. (1993), ngoài tác động lên sự hình

thành và tăng sinh của tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy, ánh sáng còn ảnh

hƣởng đến sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp do liên quan đến hoạt động của

các enzyme nội bào. Theo nghiên cứu của Lê Thị Thủy Tiên và cs. (2010), sự tăng

trƣởng của mô sẹo và huyền phù tế bào từ thân non cây thông đỏ Lâm Đồng nuôi

cấy trong điều kiện chiếu sáng tăng trƣởng chậm hơn so với khi nuôi cấy trong điều

kiện tối. Tuy nhiên sự tích lũy hoạt chất mục tiêu taxol thì ngƣợc lại, điều kiện chiếu

sáng kích thích sự sinh tổng hợp taxol của tế bào hơn điều kiện tối. Để tìm hiểu ảnh

hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu

của rễ tơ Đan sâm, 5 điều kiện chiếu sáng khác nhau đã đƣợc áp dụng trong 8 tuần

nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm. Kết quả về sự tăng trƣởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu

đƣợc trình bày ở bảng 4.16 và 4.17.

Điều kiện chiếu sáng

Khối lƣợng rễ ban đầu (g)

Khối lƣợng rễ tƣơi (g)

Khối lƣợng rễ tăng (lần)

Khối lƣợng rễ khô (g)

8 tuần tối hoàn toàn (CT1) 8 tuần 16h sáng - 8 h tối (CT2) 3 tuần CT2 - 5 tuần CT1 (CT3) 4 tuần CT2 - 4 tuần CT1 (CT4) 5 tuần CT2 - 3 tuần CT1 (CT5)

0,73 0,72 0,71 0,73 0,72

8,61 10,67 7,55 9,62 8,61

11,80 14,82 10,63 13,19 11,96

0,573 0,643 0,530 0,660 0,580

3,6

2,8

0,58

0,03

CV% LSD0,05

Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy

Khi nuôi cấy rễ tơ Đan sâm trong 8 tuần ở 5 điều kiện chiếu sáng khác nhau,

gồm: 8 tuần nuôi cấy trong tối hoàn toàn (CT1), 8 tuần nuôi cấy ở điều kiện 16h

sáng/8h tối (CT2), 3 tuần nuôi cấy ở điều kiện 16h sáng/8h tối rồi chuyển vào nuôi

cấy trong tối hoàn toàn 5 tuần (CT3), 4 tuần nuôi cấy ở điều kiện 16h sáng/8h tối

sau đó 4 tuần nuôi cấy tối hoàn toàn (CT4), 5 tuần nuôi cấy ở điều kiện 16h

sáng/8h tối sau đó 3 tuần nuôi cấy tối hoàn toàn (CT5) thì khối lƣợng rễ tăng và

khối lƣợng rễ khô đạt cao nhất ở CT2 (8 tuần nuôi cấy ở điều kiện 16h sáng/8h

tối). Ở điều kiện nuôi cấy này, sau 8 tuần thu đƣợc 10,67 g rễ tƣơi từ 0,72 g rễ ban

đầu, tƣơng ứng với khối lƣợng rễ tăng đạt 14,82 lần. Trong khi đó, ở công thức 3

khi nuôi cấy rễ tơ 3 tuần ở điều kiện 16h sáng/8h tối trƣớc khi chuyển sang nuôi

cấy trong tối hoàn toàn 5 tuần cho khối lƣợng rễ tăng 10,63 lần và khối lƣợng khô

là 0,530 g, thấp nhất trong số các công thức thí nghiệm (Bảng 4.16).

Về mặt hình thái rễ, không quan sát thấy sự khác biệt lớn giữa các công thức

nuôi cấy ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Nhìn chung, các mẫu rễ sinh

trƣởng mạnh, có màu trắng, ăn sâu vào môi trƣờng và lan rộng trên bề mặt môi

8 tuần tối hoàn toàn (CT1)

8 tuần 16h sáng – 8h tối (CT2)

3 tuần CT2 – 5 tuần CT1 (CT3)

3 tuần CT2 – 5 tuần CT1 (CT5)

Rễ Đan sâm tƣơi

trƣờng nuôi cấy cũng nhƣ phát triển bám vào thành bình nuôi cấy (Hình 4.16).

4 tuần CT2 – 4 tuần CT1 (CT4) Hình 4.16. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

Mặc dù nuôi cấy rễ tơ ở điều kiện 16h sáng/8h tối trong 8 tuần (CT2) cho

sinh khối rễ tơ đạt cao nhất nhƣng hàm lƣợng hoạt chất cryptotanshinone và

tanshinone I tích lũy trong rễ sau 8 tuần nuôi cấy lại đạt thấp nhất trong tất cả các công thức, tƣơng ứng 0,061% và 0,056% chất khô. Ngƣợc lại, hàm lƣợng các

hoạt chất này tích lũy cao nhất khi nuôi cấy rễ ở điều kiện 3 tuần 16h sáng/8h tối

và 5 tuần tối hoàn toàn (CT3) với hàm lƣợng cryptotanshinone đạt 0,754% và

hàm lƣợng tanshinone I đạt 0,257% chất khô. Trong khi đó, hàm lƣợng tanshinone IIA đạt cao nhất (0,145% chất khô) khi nuôi cấy ở điều kiện 4 tuần

16h sáng/8h tối và 4 tuần tối hoàn toàn (CT4) và đạt thấp nhất (0,072% chất khô)

khi nuôi cấy rễ tơ 8 tuần trong tối hoàn toàn (CT1) (Bảng 4.17).

Công thức

Cryptotanshinone (% chất khô)

Tanshinone I (% chất khô)

Tanshinone IIA (% chất khô)

8 tuần tối hoàn toàn (CT1) 8 tuần 16h sáng - 8 h tối (CT2)

0,074 0,061

0,132 0,056

0,072 0,075

3 tuần CT2 - 5 tuần CT1 4 tuần CT2 - 4 tuần CT1

0,754 0,134

0,257 0,210

0,141 0,145

5 tuần CT2 - 3 tuần CT1

0,137

0,172

0,101

Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy

Nhƣ vậy nuôi cấy rễ tơ Đan sâm ở điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối trong

suốt 8 tuần nuôi cấy là thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối rễ. Tuy nhiên điều kiện

chiếu sáng cho hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu tích lũy cao nhất là 3 tuần nuôi cấy ở

điều kiện 16h sáng/8h tối sau đó chuyển sang nuôi cấy tối hoàn toàn trong 5 tuần.

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hsia và cs. (2007)

khi nhóm tác giả ghi nhận kết quả cryptotanshinone và tanshinone I tích lũy với

lƣợng rất nhỏ khi nuôi cấy rễ tơ Đan sâm trong điều điều kiện chiếu sáng và tích lũy

cao hơn gấp nhiều lần khi nuôi cấy rễ tơ trong điều kiện tối.

4.2.8. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm

Thí nghiệm này đƣợc tiến hành nhằm tìm hiểu mức độ tăng sinh khối

cũng nhƣ sự tích lũy hoạt chất mục tiêu trong rễ cây Đan sâm nhằm tìm đƣợc thời điểm rễ tơ vừa có sinh khối rễ cao vừa tích lũy nhiều hoạt chất mục tiêu. Rễ tơ Đan sâm đƣợc nuôi cấy sau 10 tuần, số liệu đƣợc theo dõi vào tuần thứ 2, 4, 6, 8 và 10 sau nuôi cấy. Khối lƣợng rễ tơ Đan sâm tăng tuyến tính từ tuần thứ 2 và đạt cực đại vào tuần thứ 8. Sau 8 tuần nuôi cấy, khối lƣợng rễ tƣơi tăng 13,96 lần. Tuy nhiên, sau 10 tuần nuôi cấy, sinh khối rễ tƣơi giảm so với tuần thứ 8, chỉ

còn 12,40 lần (Bảng 4.18).

Thời gian nuôi 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần 10 tuần CV% LSD0,05

Khối lƣợng rễ ban đầu (g) 0,71 0,72 0,71 0,72 0,72

Khối lƣợng rễ tƣơi (g) 1,69 3,73 7,38 10,05 8,93 1,3 0,14

Khối lƣợng rễ tăng (lần) 2,38 5,18 10,40 13,96 12,40

Khối lƣợng rễ khô (g) 0,107 0,327 0,490 0,617 0,593 3,4 0,026

Bảng 4.18. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

4 tuần

8 tuần

10 tuần

2 tuần

6 tuần

Quan sát trong quá trình nuôi cấy cho thấy, giai đoạn từ 2 đến 8 tuần là khoảng thời gian rễ có sự phát triển mạnh mẽ, phân nhiều nhánh và đâm sâu vào môi trƣờng nuôi cấy. Vào thời điểm 10 tuần sau nuôi cấy, phần rễ tiếp xúc với môi trƣờng bắt đầu hóa đen một phần (Hình 4.17).

Hình 4.17. Rễ tơ Đan sâm ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau trên môi trƣờng B5

Sự không tăng sinh khối rễ sau khi kéo dài thời gian nuôi cấy (sau 8 tuần) có thể là do sự giảm pH của môi trƣờng nuôi cấy thông qua việc hấp thu dinh dƣỡng khoáng của các tế bào rễ. Để hấp thu các chất dinh dƣỡng dƣới dạng cation, rễ cây phải tiết ra các ion H để trao đổi với môi trƣờng xung quanh. Ion H+ tích lũy dần trong vùng rễ, làm cho pH của môi trƣờng giảm dần. Mặt khác sự hấp thu tích cực cũng dẫn đến tiêu hao nhiều năng lƣợng của tế bào, vì vậy rễ hô hấp mạnh và thải ra nhiều khí CO2 vào môi trƣờng hệ rễ. Lƣợng khí CO2 này kết hợp với nƣớc tạo ra một lƣợng acid carbonic, tích lũy ngày càng nhiều dẫn đến việc làm giảm pH của môi trƣờng (Thorpe et al., 2008). Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh và cs. (2013), pH của môi trƣờng sau 35 ngày nuôi cấy rễ bất định cây Đƣơng quy Nhật Bản có bổ sung 0,2; 0,5 và 1,0 mg/g giảm tƣơng ứng còn 4,0; 3,9 và 3,8 từ 5,7. Bên cạnh đó, sau 8 tuần nuôi cấy, sự giảm thành phần môi trƣờng cũng có thể là nguyên nhân dẫn tới sự giảm sinh trƣởng của rễ Đan sâm.

4.2.9. Ảnh hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Rễ tơ phát triển nhanh, khả năng phân nhánh rất cao và có thể phát triển

trong môi trƣờng không có hormon sinh trƣởng. Hơn nữa, các cơ quan này không nhạy cảm với tính hƣớng đất. Chúng di truyền ổn định và có khả năng sinh tổng

hợp và tích lũy các hợp chất thứ cấp đặc trƣng. Sản xuất các hợp chất thứ cấp

nhờ rễ tơ có mức độ ổn định cao hơn so với các loại mô nuôi cấy khác. Theo

nghiên cứu của Gupta et al. (2011), hàm lƣợng tanshinone I và cryptotanshinone tích lũy trong rễ tơ Đan sâm khi nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l ABA

hoặc 1,0 mg/l TDZ cao hơn so với đối chứng tƣơng ứng là 5,0 và 7,5 lần. So với rễ

Đan sâm thƣơng mại, hàm lƣợng crytotanshinone trong rễ tơ cao hơn gấp 6,3; 5,0

và 3,75 lần khi nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung TDZ, ABA và BA. Tuy nhiên

Gupta et al. (2011) chƣa khảo sát ảnh hƣởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh

trƣởng này tới sự tích lũy hoạt chất mục tiêu trong rễ tơ Đan sâm. Do vậy, ảnh

hƣởng của tổ hợp TDZ BA, TDZ ABA với nồng độ tƣơng ứng 0,5 mg/l mỗi

chất đến sự tăng sinh khối rễ và sự tích hợp các hoạt chất mục tiêu đƣợc khảo sát

trong nghiên cứu này. Kết quả của thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 4.19 và 3.20.

Môi trƣờng

Khối lƣợng rễ ban đầu (g)

Khối lƣợng rễ tƣơi sau 8 tuần nuôi cấy (g)

Khối lƣợng rễ tăng (lần)

Khối lƣợng rễ khô (g)

B5 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA

0,75 0,74

7,33 6,94

9,77 9,38

0,51 0,50

B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA

0,74

4,37

5,90

0,41

4,4

3,9

0,31

0,033

CV% LSD0,05

Bảng 4.1 . Ảnh hƣởng của tổ hợp của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, tốc độ tăng trƣởng của rễ Đan sâm trên môi

trƣờng bổ sung phối hợp BA và TDZ/ABA thấp hơn so với tốc độ tăng trƣởng của rễ Đan sâm trên môi trƣờng đối chứng (B5). Cụ thể, trên môi trƣờng B5, sau 8 tuần nuôi cấy thu đƣợc 7,33 g rễ tƣơi từ 0,75 g rễ ban đầu, tƣơng ứng với khối lƣợng rễ tăng đạt 9,77 lần và khối lƣợng rễ khô đạt 0,51 g. Trong trƣờng hợp bổ sung 0,5 mg/l TDZ 0,5 mg/l BA vào môi trƣờng nuôi cấy B5, khối lƣợng rễ tăng đạt thấp hơn (9,38 lần) và khi bổ sung 0,5 mg/l TDZ 0,5 mg/l ABA vào môi trƣờng nuôi

cấy khối lƣợng rễ tăng chỉ đạt 5,90 lần sau 8 tuần nuôi cấy (Bảng 4.19).

Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận ở chỉ tiêu hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA tích lũy trong rễ tơ Đan

sâm khi nuôi cấy ở ba công thức khác nhau. Hàm lƣợng hoạt chất

cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA trong rễ tơ Đan sâm nuôi cấy

trên môi trƣờng có bố sung tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng đều thấp hơn so với công thức đối chứng không bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng. Hàm lƣợng

cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA tích lũy trong rễ tơ Đan sâm khi nuôi cấy trên môi trƣờng đối chứng sau 8 tuần đạt lần lƣợt 0,466; 0,153 và

0,203% chất khô. Hàm lƣợng 3 chất này tích lũy trong rễ tơ Đan sâm khi nuôi

cấy trên môi trƣờng B5 0,5 mg/l TDZ 0,5 mg/l BA đạt tƣơng ứng 0,039;

0,109 và 0,125% chất khô và khi nuôi cấy trên môi trƣờng B5 + 0,5 mg/l TDZ +

0,5 mg/l ABA là 0,072; 0,085 và 0,148% chất khô. Nhƣ vậy, có thể thấy cả ba hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ Đan sâm nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung

chất điều tiết sinh trƣởng đều thấp hơn so với nuôi cấy trên môi trƣờng không bổ

sung chất điều tiết sinh trƣởng. Đặc biệt, hàm lƣợng crytotanshinone tích lũy

trong rễ tơ trên môi trƣờng đối chứng cao hơn so với công thức bổ sung chất điều

tiết sinh trƣởng 11,9 và 6,47 lần (Bảng 4.20).

Môi trƣờng

Cryptotanshinone (% chất khô)

Tanshinone I (% chất khô)

Tanshinone IIA (% chất khô)

0,466

0,153

0,203

B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA

0,039

0,109

0,125

B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA

0,072

0,085

0,158

Bảng 4.20. Ảnh hƣởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy

B Hình 4.18. Ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm: (A): B5; (B): B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA; (C): B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA.

Nhƣ vậy, có thể thấy, bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng TDZ, BA và ABA vào môi trƣờng nuôi cấy đã làm giảm sinh khối cũng nhƣ sự tích lũy hoạt chất

mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14. Dòng rễ tơ Đan sâm sinh trƣởng, phát

triển mạnh và tích lũy nhiều hoạt chất mục tiêu cao ngay trên môi trƣờng không

bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc nhân sinh khối quy mô lớn rễ tơ Đan sâm trong môi trƣờng không bổ sung tác nhân

kích thích sinh trƣởng tổng hợp nhằm tạo sản phẩm “sạch” dƣ lƣợng chất điều

hòa sinh trƣởng.

4.2.10. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14

Thực vật sử dụng cơ quan cảm thụ (receptor) để nhận biết đƣợc sự có mặt

của các tác nhân gây hại (cũng nhƣ các tác nhân có lợi) từ môi trƣờng ví dụ tia UVB, vi sinh vật (VSV) gây bệnh, sâu hại... để từ đó kích hoạt hệ thống bảo vệ

hay kháng lại những tác nhân gây hại đó. Elicitor - chất có khả năng kích hoạt

một cách đặc hiệu các quá trình sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất sơ cấp, thứ

cấp) từ đó kích họat hệ thống bảo vệ của thực vật. Các elicitor ở sâu hại là các

gốc của amino acid béo fatty (FACs), của Ralstonia solanacearum là các

polysaccharide ngoại bào, Phytophthora infestans là các elicitins (Kamoun et al.,

1998; Halim et al., 2007; Kaschani et al., 2010; Eschen-Lippold et al., 2012;

Machinandiarena et al., 2012)... Sau khi phát hiện ra các elicitor, thực vật sẽ kích

hoạt quá trình sinh tổng hợp các chất điều tiết sinh trƣởng (phytohormone) và

thông qua các chất điều tiết sinh trƣởng điều hòa quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Trong các chất điều tiết sinh trƣởng thì sự sinh tổng hợp axít

jasmonic thƣờng gắn liền với sự kích hoạt quá trình sinh tổng hợp các hợp chất

thứ cấp có tác dụng kháng sâu hại và sự sinh tổng hợp axít salicylic gắn liền với

quá trình kích hoạt tính kháng lại sự xâm nhập, sinh trƣởng phát triển của vi sinh

vật. Đã có rất nhiều công bố trƣớc đó chỉ ra rằng axít jasmonic, axít abscisic (ABA) kích hoạt sự sinh tổng hợp các hợp chất terpenoid (Dinh và cs., 2013).

là các hợp chất

Điểm lƣu ý là các hoạt chất có hoạt tính dƣợc lý có trong Đan sâm là các tanshinones (tanshinone I, tanshinone IIA, tanshinone IIB, cryptotanshinone, terpenoid. Thêm vào đó, dihydrotanshinone) đều cryptotanshinone và dihydrotanshinone I đã đƣợc biết tới là có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ Bacillus subtilis KCTC 3069, B. subtilis ATCC 6633 (Xu et al., 2010). Chính vì vậy, ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành

xác định tác động của các chất điều tiết sinh trƣởng liên quan tới tính kháng của thực vật bao gồm axít jasmonic, axít abscisic (ABA) và axít salicylic tới sự sinh

tổng hợp các hoạt chất mục tiêu có trong Đan sâm.

Rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng B5 rắn trong 5

tuần ở điều kiện 16h sáng/8h tối. Các elicitor đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi

cấy 4 ngày trƣớc khi thu rễ. Sinh khối rễ tơ đạt đƣợc trên môi trƣờng bổ sung

elicitor cao hơn so với trên môi trƣờng đối chứng không bổ sung elicitor. Cụ thể,

sinh khối rễ tƣơi Đan sâm trên môi trƣờng chứa elicitor tăng từ 7,37 đến 8,66 lần,

trong khi đó sinh khối rễ Đan sâm trên môi trƣờng đối chứng tăng 7,13 lần. Sinh

khối rễ Đan sâm đạt cao nhất trong trƣờng hợp bổ sung 100 mg/l YE + 0,1 mM

ABA, tăng 8,66 lần sau 39 ngày nuôi cấy (Bảng 4.21).

Công thức

Khối lƣợng rễ ban đầu (g) 0,70

Khối lƣợng rễ tƣơi sau 39 nuôi cấy (g) 4,99

Khối lƣợng rễ tăng (lần) 7,13

Khối lƣợng rễ khô (g) 0,35

0,69

5,09

7,37

0,36

B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol

0,70

6,03

8,61

0,44

B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic

0,70

5,89

8,42

0,43

B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate

0,69

5,97

8,66

0,46

B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic

CV% LSD0,05

3,7 0,26

4,1 0,013

Bảng 4.21. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy

Kết quả phân tích hàm lƣợng hoạt chất cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA ở bảng 4.22 cho thấy, bổ sung các elicitor vào môi trƣờng nuôi cấy đã làm tăng hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ tơ Đan sâm so với

môi trƣờng đối chứng không bổ sung elicitor.

Hàm lƣợng cryptotanshinone, tanshinone I và tanshione IIA tích lũy trong rễ tơ Đan sâm khi nuôi cấy trên môi trƣờng B5 đạt tƣơng ứng là 0,126; 0,082 và 0,111%

chất khô.

Môi trƣờng

Cryptotanshinone (% chất khô) 0,126

Tanshinone I (% chất khô) 0,082

Tanshinone IIA (% chất khô) 0,113

0,227

0,106

0,141

0,161

0,098

0,108

0,549

0,230

0,213

0,221

0,094

0,103

B5 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l Sorbitol B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Salicylic acid B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM ABA

Bảng 4.22. Ảnh hƣởng của các elicitor đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy

Bổ sung kết hợp 100 mg/l YE và 50 g/l sorbitol làm tăng hàm lƣợng crytotanshinone cao hơn 1,8 lần so với đối chứng, đạt 0,227%; hàm lƣợng tanshinone I tăng 1,3 lần so với đối chứng, đạt 0,106%; hàm lƣợng tanshinone IIA đạt 1,141% chất khô.

Bổ sung kết hợp 100 mg/l YE và 0,1 mM salicylic acid làm tăng hàm lƣợng crytotanshinone 1,28 lần so với đối chứng, đạt 0,161% trong khi đó hàm lƣợng tanshinone I và tanshinone IIA có sự chênh lệch không đáng kể so với đối chứng.

Tƣơng tự, khi bổ sung kết hợp 100 mg/l YE và 0,1 mM ABA vào môi trƣờng nuôi cấy 4 ngày trƣớc khi thu rễ Đan sâm làm tăng hàm lƣợng cryptotanshinone 1,75 lần so với đối chứng, đạt 0,221%, tuy nhiên lại không làm tăng hàm lƣợng tanshinone I và tanshinone IIA.

Bổ sung 100 mg/l YE và 0,1 mM Methyl Jasmonate đã làm tăng hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ tơ Đan sâm ở cả ba chỉ tiêu: hàm lƣợng cryptotanshinone tăng 4,36 lần, đạt 0,549%; hàm lƣợng tanshinone I tăng 2,81 lần, đạt 0,230% ; hàm lƣợng tanshinone IIA tăng 1,88 lần, đạt 0,213% chất khô so với công thức đối chứng.

Có thể thấy, bổ sung elicitor vào môi trƣờng, trƣớc thời điểm thu rễ Đan sâm 4 ngày đã kích thích sự tích lũy hoạt chất mục tiêu, đặc biệt là cryptotanshinone.

Kai et al. (2012) nghiên cứu ảnh hƣởng của các elicitor gồm cao nấm men (YE), methyl jasmonate (MJ) và Ag+ đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu và sự biểu hiện của của các gen liên quan trong con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone. Theo đó, các yếu tố elicitor đƣợc bổ sung vào môi trƣờng sau 18 ngày nuôi cấy,

rễ Đan sâm đƣợc thu sau đó 3, 6 và 9 ngày để phân tích tanshinone và tách chiết RNA phục vụ cho phản ứng tổng hợp cDNA đồng thời sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các gen trong con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone. Kết quả cho thấy, hàm lƣợng tanshinone tích lũy trong rễ tơ Đan sâm nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung MJ, YE, Ag+ và YE + Ag+ cao hơn so với đối chứng, đạt tƣơng ứng 5,78; 3,99; 2,2 và 12,92 lần. Phân tích biểu hiện gen cho thấy, hàm lƣợng tanshinone tăng lên khi bổ sung elicitor vào môi trƣờng nuôi cấy là kết quả của sự biểu hiện hoặc biểu hiện mạnh hơn của các gen liên quan trong con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone. Cụ thể, bổ sung MJ vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng tới sự biểu hiện của các gen SmHMGR-M6, SmDXR- M9, SmIPPI-M9, SmCPS-M9, SmHMGR, SmDXR, SmIPPI và SmCPS. Sự biểu hiện của các gen SmHMGR, SmDXS2, SmIPPI, SmFPPS, SmGGPPS, SmCPS đƣợc gây ra bởi Ag+, sự biểu hiện của các gen SmAACT, SmHMGS, SmDXR, SmDXS2, SmCMK, SmIPPI, SmFPPS, SmGGPPS và SmCPS đƣợc kích thích bởi YE trong khi đó nếu bổ sung kết hợp YE – Ag+ kích hoạt đồng thời 8 gen SmAACT, SmHMGS, SmDXR, SmDXS2, SmCMK, SmFPPS, SmGGPPS, và SmCPS.

Nhƣ vậy có thể thấy, bổ sung các elicitor vào môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ

Đan sâm đã làm tăng khả năng tích lũy tanshinone trong rễ tơ. Kết quả của sự

tăng tanshinone có thể do hoạt động của các gen trong con đƣờng sinh tổng hợp

tanshinone đƣợc điều chỉnh bởi sự có mặt của elicitor. Tuy nhiên không phải tất

cả các gen tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp tanshinone đều đã đƣợc hiểu

biết rõ ràng về cơ chế phân tử và vai trò của chúng. Chính vì vậy vẫn cần tiếp tục

nghiên cứu để làm rõ chức năng của các gen tham gia tổng hợp tanshinone và vai

trò của các elicitor trong việc điều khiển sự biểu hiện của các gen này.

4.2.11. Quy trình cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm Dựa vào những kết quả đã thu nhận đƣợc, chúng tôi đề xuất quy trình cảm

ứng và nhân nuôi rễ tơ cây cây Đan sâm nhƣ sơ đồ sau:

Bƣớc 1: Cảm ứng tạo rễ tơ bằng cách lây nhiễm mẫu lá cây Đan sâm in

vitro với dịch khuẩn A.rhizogenes ở mật độ tƣơng ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2. Sau đó, mô lá Đan sâm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS + 30 g/l đƣờng trong tối trong 5 ngày trƣớc khi chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng MS 30 g/l đƣờng + 400 mg/l cefotaxim trong 4 tuần để cảm ứng rễ tơ.

Bƣớc 2: Kiểm tra các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR.

Bƣớc 4. Nhân nuôi các dòng rễ tơ chuyển gen có tốc độ tăng trƣởng cao

trên môi trƣờng B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate.

Có thể tóm tắt quá trình cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm nhƣ sơ

đồ sau:

Cảm ứng tạo rễ

Kiểm tra rễ chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR

Rễ tơ cảm ứng từ mô lá

Lá cây Đan sâm in vitro

Nhân nuôi rễ tơ trên môi trƣờng B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate

Chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834, OD600 = 0,2

4.3. NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT TRỒNG CÂY ĐAN SÂM TỪ CÂY GIỐNG IN VITRO

Đan sâm đƣợc di thực vào Việt Nam từ vài chục năm trƣớc và đƣợc Viện Dƣợc liệu trồng ở trại thuốc Sa Pa. Sau đó, cây Đan sâm đƣợc trồng thử nghiệm tại nhiều vùng có điều kiện sinh thái, khí hậu khác nhau nhƣ Phú Thọ, Thanh Hóa, Tam Đảo, Sapa, Hà Nội…sử dụng rễ củ làm vật liệu nhân giống (Ngô Quốc Luật và cs., 2014). Kết quả nghiên cứu của Ngô Quốc Luật và cs. (2014) cũng cho thấy, tại các điểm trồng ở vùng đồng bằng nhƣ Hà Nội, Đan sâm sinh trƣởng tốt, cho năng suất cao nhƣng hoạt chất lại thấp hơn so với ở Sapa và một số vùng khác, nhƣng cao hơn vùng Thanh Hóa. Nghiên cứu này tiến hành nhằm khảo sát ảnh hƣởng của một số biện pháp kỹ thuật nhƣ thời vụ trồng, mật độ trồng, phân bón, thời điểm thu hoạch đến sự sinh trƣởng, phát triển và năng suất cũng nhƣ chất lƣợng dƣợc liệu của cây Đan sâm sử dụng nguồn cây giống từ nuôi cấy mô. Các kết quả thu đƣợc sẽ là những kết quả bƣớc đầu góp phần xây dựng quy trình kĩ thuật trồng cây Đan sâm tại Hà Nội.

4.3.1. Ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu cây Đan sâm 4.3.1.1 Ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm

Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng cây Đan sâm in vitro sau khi chuyển ra thích nghi ngoài vƣờn ƣơm trên giá thể 50% cát + 50% xơ dừa sau 30 ngày đƣa

ra trồng ngoài đồng ruộng ở 6 thời vụ khác nhau gồm 20/1, 20/2, 20/3, 20/4, 20/5

và 20/6 năm 2014 tại vƣờn thực nghiệm của Khoa Công nghệ sinh học, Học viện

Nông nghiệp Việt Nam. Đất trồng có thành phần cơ giới nhẹ, thuộc đất phù sa

không đƣợc bồi hàng năm, pH từ 5,5 - 6. Cây đƣợc thu hoạch sau trồng 10 tháng. Kết quả ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển và các yếu tố cấu

thành năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu của cây Đan sâm đƣợc thể hiện ở bảng

4.23, 4.24 và 4.25.

Chiều cao cây

Số nhánh cấp 1

Đƣờng kính tán

Thời vụ

(cm)

(nhánh/cây)

(cm)

TV1

32,8

5,9

54,2

TV2

32,5

6,9

54,3

TV3

36,5

8,3

57,0

TV4

30,3

6,5

51,9

TV5

27,3

5,7

50,2

TV6

25,6

4,9

47,0

CV%

5,6

10,4

3,0

3,1

1,2

2,8

LSD0,05

Bảng 4.23. Ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm tại thời điểm 10 tháng sau trồng

Ghi chú: TV1: Trồng ngày 20/1/2014; TV2: Trồng ngày 20/2/2014

TV3: Trồng ngày 20/3/2014; TV4: Trồng ngày 20/4/2014

TV5: Trồng ngày 20/5/2014; TV6: Trồng ngày 20/6/2014

Thời vụ có ảnh hƣởng rõ rệt đến sự sinh trƣởng, phát triển và năng suất

dƣợc liệu Đan sâm. Có sự khác biệt ở chỉ tiêu chiều cao cây, số nhánh cấp 1 và

đƣờng kính tán cây sau 10 tháng trồng ở các thời vụ khác nhau. Chiều cao cây

Đan sâm dao động từ 25,6 cm (TV6) đến 36,5 cm (TV3). Cây Đan sâm trồng vào

tháng 3 có chiều cao trung bình đạt lớn nhất ở mức sai khác có ý nghĩa 95%.

Chiều cao cây Đan sâm thấp hơn khi trồng ở các tháng 2, tháng 1 và đạt thấp

nhất ở tháng 6 với 25,4 cm. Tƣơng tự, số nhánh cấp 1 đạt cao nhất khi trồng cây

vào tháng 3 với 8,3 nhánh và đạt thấp nhất khi trồng cây vào tháng 6 với 4,9

nhánh tƣơng đƣơng với TV5 và TV1 ở cùng mức sai khác có ý nghĩa. Các cây

Đan sâm trồng vào tháng 3 có đƣờng kính tán trung bình lớn nhất (57,0 cm)

trong khi các cây trồng vào tháng 6 có đƣờng kính tán thấp nhất (47,0 cm). Sự sai

khác ở độ tin cậy 95% (Bảng 4.23).

Đã có một số nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thời vụ trồng đến

sinh trƣởng, phát triển và năng suất dƣợc liệu Đan sâm tại Việt Nam. Sau khi khảo

sát 6 thời vụ trồng cây Đan sâm gồm tháng 2, tháng 3, tháng 4, tháng 10, tháng 11

và tháng 12. Đào Văn Núi và cs. (2014) kết luận, thời vụ trồng cây Đan sâm tại Phú

Thọ thích hợp nhất là tháng 10. thời vụ nhân giống Đan sâm cho kết quả tốt nhất là

15/3 - 28/4. Nhƣ vậy, có thể thấy, trồng Đan sâm ở thời điểm nắng nóng của tháng 5

và tháng 6 trong điều kiện Hà Nội, cây Đan sâm sinh trƣởng phát triển kém hơn hẳn

so với các thời vụ khác (TV1, TV2, TV3) trồng trong điều kiện nhiệt độ thấp hơn.

4.3.1.2 Ảnh hưởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cây Đan sâm

Để đánh giá thời vụ trồng cây dƣợc liệu thích hợp, không chỉ quan tâm đến các chỉ tiêu sinh trƣởng, phát triển của cây mà còn phải đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dƣợc liệu. Bảng 4.24 thể hiện ảnh hƣởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dƣợc liệu cây Đan sâm sau 10 tháng trồng.

Số củ/cây (củ

Chiều

Đƣờng

Khối lƣợng

Tỷ lệ

Năng suất

Thời vụ

có đƣờng

dài củ

kính củ

củ/cây

tƣơi/khô

thực thu

kính> 6 mm)

(cm)

(%)

(tấn/ha)

(g)

TV1

8,1

23,0

2,0

254,0

3,4

2,76

TV2

9,9

25,8

2,4

275,0

3,8

3,11

TV3

12,2

29,2

2,7

300,0

4,0

3,35

TV4

8,9

23,6

2,1

234,0

3,5

2,52

TV5

8,1

21,0

2,0

215,0

3,4

2,25

TV6

7,2

19,3

1,8

177,0

3,4

1,92

CV%

7,3

3,7

4,3

4,0

5,0

1,2

1,61

0,17

17,5

0,24

LSD0,05

Bảng 4.24. Ảnh hƣởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dƣợc liệu Đan sâm

TV1

TV2

TV3

TV4

TV5

TV6

Hình 4.19. Củ Đan sâm thu hoạch ở các thời vụ khác nhau

Có sự sai khác có ý nghĩa của các chỉ tiêu cấu thành năng suất nhƣ số củ/cây, chiều dài củ, đƣờng kính củ và khối lƣợng củ/cây giữa các thời vụ trồng cây Đan sâm thí nghiệm. Trong 6 thời vụ trồng, thời vụ tháng 3 cho số củ có đƣờng kính lớn hơn 6 mm /cây (12,2 củ), chiều dài củ (29,2 cm), đƣờng kính củ (2,7 cm) và khối lƣợng củ/cây (300 g) đạt cao nhất ở mức có ý nghĩa so với các công thức còn lại. Thời vụ tháng 3 cũng là thời vụ cho năng suất thực thu đạt cao nhất (3,35 tấn/ha). Theo sau là các thời vụ tháng 2, tháng 1, tháng 4, tháng 5 và thấp nhất ở mức sai khác có ý nghĩa về năng suất là tháng 6 chỉ đạt 1,92 tấn/ha. Đặc biệt khi trồng cây

vào tháng 6, tất cả các chỉ tiêu cấu thành năng suất đều đạt thấp nhất với 7,2 củ/cây, chiều dài củ 19,3 cm, đƣờng kính củ 1,8 cm, khối lƣợng lƣợng củ/cây 177 g nên tạo năng suất thực thu thấp nhất (Bảng 3.24). Về tỷ lệ tƣơi/khô, kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với cây Đan sâm tỷ lệ tƣơi/khô biến động từ 3,4 - 4. Ở TV3 cây sinh trƣởng tốt nhất nên cho tỷ lệ tƣơi/khô cao nhất đạt 4 lần.

Sự khác biệt trong sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây Đan sâm khi trồng ở các thời điểm khác nhau có thể giải thích là do điều kiện thời tiết ở các thời vụ trồng Đan sâm khác nhau, dẫn đến ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng, phát triển của cây. Theo Shu et al. (2004), cây Đan sâm sinh trƣởng phát triển tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ 20-260C, ở nhiệt độ cao hơn 260C và thấp hơn 200C, cây đều sinh trƣởng phát triển kém. Tháng 3 năm 2014 là thời điểm có điều kiện thời tiết lý tƣởng để chuyển cây con ra trồng ngoài đồng ruộng, cả nhiệt độ và độ ẩm đều thuận lợi, tạo điều kiện cho cây con bén rễ, sinh trƣởng, phát triển mạnh. Trong khi đó vào tháng 1 và tháng 2 năm 2014, nhiệt độ vẫn còn thấp, độ ẩm cao còn tháng 4, 5 và đặc biệt là tháng 6 năm 2014 có nhiệt độ cao, do vậy cây Đan sâm khi chuyển ra ngoài đồng ruộng khó thích nghi với điều kiện tự nhiên không thuận lợi, sinh trƣởng, phát triển kém.

4.3.1.3 Ảnh hưởng của thời vụ đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm

Sự tích lũy cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA trong rễ cây Đan sâm trồng tại các thời vụ khác nhau là rất khác nhau. Cả ba hoạt chất này đều tích lũy cao nhất khi trồng cây ở thời vụ tháng 3. Cụ thể, hàm lƣợng cryptotanshinone là 0,221%, hàm lƣợng tanshinone là 0,07% và hàm lƣợng tanshinone IIA là 0,247% chất khô. Hàm lƣợng các hoạt chất giảm dần và đạt thấp nhất khi trồng cây ở thời vụ tháng 6 tƣơng ứng với 0,033% cryptotanshinone; 0,023% tanshinone I và 0,092% tanshinone IIA (Bảng 4.25).

Thời vụ

Tháng trồng

TV1 TV2 TV3 TV4 TV5 TV6

1 2 3 4 5 6

Cryptotanshinone (% chất khô) 0,103 0,191 0,221 0,105 0,047 0,033

Tanshinone I (% chất khô) 0,050 0,065 0,070 0,044 0,029 0,023

Tanshinone IIA (% chất khô) 0,228 0,245 0,242 0,186 0,112 0,092

Bảng 4.25. Ảnh hƣởng của thời vụ đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm (sau 10 tháng trồng)

Nhƣ vậy, trong sáu thời vụ trồng khảo sát, thời vụ trồng tháng 2 đến tháng 3/2014 cho cây Đan sâm sinh trƣởng, phát triển, năng suất và tích lũy

hoạt chất mục tiêu cao nhất. Do vậy, đây là thời vụ trồng cây Đan sâm thích

hợp tại Hà Nội.

4.3.2. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến sinh trƣởng, phát triển và chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm 4.3.2.1 Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm

Mật độ trồng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng nói chung và cây Đan sâm nói riêng. Mật độ trồng quá dày sẽ có sự cạnh tranh về dinh dƣỡng lớn, làm cho cây không có khả năng phát triển hết tiềm năng năng suất giống. Đan sâm là cây có khả năng phát triển thân lá rất mạnh, nếu trồng ở mật độ dày cây sẽ không đủ dinh dƣỡng để phát triển, nhƣng nếu trồng ở mật độ quá thƣa, tiểu khí hậu tại vùng cây sinh trƣởng không đảm bảo, cây sẽ bị mất nƣớc nhiều, không đảm bảo đƣợc độ ẩm cho cây phát triển, đồng thời nhiệt độ sẽ tăng cao, không thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây Đan sâm. Không những thế, mật độ trồng quá thƣa sẽ gây lãng phí đất. Vì vậy, thí nghiệm này đƣợc thực hiện với mục đích tìm ra mật độ trồng cây Đan sâm thích hợp, vừa cho năng suất dƣợc liệu cao, vừa có hiệu quả về kinh tế. Kết quả ảnh hƣởng của mật độ trồng cây Đan sâm đến sinh trƣởng, phát triển của cây đƣợc thể hiện ở bảng 4.26.

Bảng 4.26. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm

Mật độ (cây/m2)

Chiều cao cây (cm)

Số nhánh cấp 1 (nhánh/cây)

Đƣờng kính tán (cm)

CT1 CT2

CT3 CT4

CT5

38,2 37,1 34,8 32,8 31,5 4,2 2,78 5,6 7,1 7,6 8,5 8,1 8,1 1,13 52,2 55,9 59,3 65,4 66,2 3,6 4,0 13 11 9 8 7 CV% LSD0,05

Có sự khác biệt lớn về chiều cao cây Đan sâm khi trồng ở các mật độ trồng khác nhau. Chiều cao cây Đan sâm và mật độ trồng quan hệ với nhau theo quy luật: mật độ càng thƣa, chiều cao cây Đan sâm càng thấp. Trồng cây Đan sâm ở mật độ thƣa (7 - 8 cây/m2), chiều cao cây Đan sâm đạt đƣợc thấp nhất (31,5 - 32,8

cm) ở cùng mức sai khác có ý nghĩa. Trong khi đó chiều cao cây Đan sâm lớn nhất đạt (37,1 cm - 38,2 cm) khi trồng ở mật độ 11 - 13 cây/m2 (Bảng 3.26). Sự sai khác thể hiện ở độ tin cậy 95%.

Về chỉ tiêu số nhánh cấp 1, các công thức thí nghiệm có sự sai khác ý nghĩa về mặt thống kê, trong đó công thức trồng thƣa với mật độ trồng 7 - 9 cây/m2 cây có khả năng phân nhánh mạnh (đạt 8,1 nhánh/cây - 8,5 nhánh/cây) cao hơn hẳn so với công thức trồng dày 13 cây/m2 chỉ đạt 5,6 nhánh/cây và ở CT2 trồng với mật độ là 11 cây/m2 số nhánh cấp 1 là 7,1 nhánh/cây.

Ngƣợc lại với chiều cao cây, đƣờng kính tán cây Đan sâm càng cao khi mật độ trồng cây càng thƣa. Đƣờng kính tán cây cao nhất (66,2 cm) khi trồng cây với mật độ 7 cây/m2 tƣơng đƣơng với CT4 đạt 65,4 cm. Đƣờng kính tán cây thấp nhất (52,2 cm) khi trồng cây với mật độ 13 cây/m2 (Bảng 4.26). Điều này đƣợc giải thích, khi trồng dày, cây phải tranh chấp ánh sáng mạnh, nên chiều cao cây tăng mạnh hơn, số nhánh giảm, ngƣợc lại khi trồng thƣa, cây có điều kiện phân cành tốt hơn do vậy đƣờng kính tán cây tăng lên.

4.3.2.2 Ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cây Đan sâm

Năng suất là một chỉ tiêu tổng hợp phản ánh các quá trình sinh trƣởng, phát triển các hoạt động sống diễn ra trong cây và thu đƣợc trên một đơn vị diện tích hay một đơn vị cá thể, đồng thời năng suất cũng là mục tiêu cuối cùng của ngƣời trồng cây. Ðối với Đan sâm, bộ phận sử dụng là rễ củ, năng suất do nhiều yếu tố cấu thành: số cây/m2, số củ/cây, chiều dài củ, đƣờng kính củ, khối lƣợng củ. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của mật độ trồng tới các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất củ Đan sâm đƣợc thể hiện qua bảng 4.27.

Mật độ (cây/m2)

Chiều dài củ (cm)

Năng suất (tấn/ha)

Số củ/cây (củ có đƣờng kính> 6 mm)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

8,1 9,4 10,9 12,0 11,5 5,3 1,0

20,5 24,2 27,6 32,2 31,5 4,9 2,5

Đƣờng kính củ (cm) 1,9 2,2 2,5 2,7 2,6 4,2 0,19

Khối lƣợng củ/cây (g) 231,7 279,3 315,7 327,3 337,6 4,8 26,9

2,65 2,90 3,00 2,71 2,58 5,0 0,16

13 11 9 8 7 CV% LSD0,05

Bảng 4.27. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm

Mật độ trồng ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu về số củ/cây, chiều dài củ, đƣờng

kính củ và khối lƣợng củ/cây. Các chỉ tiêu này đạt cao nhất khi trồng cây Đan sâm ở mật độ từ 7-9 cây/m2. Tăng thêm mật độ trồng (11 - 13 cây/m2) các chỉ tiêu về số củ, chiều dài, đƣờng kính và khối lƣợng củ càng giảm. Cụ thể, trồng Đan sâm ở mật độ 13 cây/m2 (30 x 25 cm), số củ có đƣờng kính > 6 mm chỉ đạt 8,1 củ, chiều dài củ đạt 20,5 cm, đƣờng kính củ đạt 1,9 cm và khối lƣợng củ/cây

đạt 231,7 g. Trong khi đó, các chỉ tiêu này đạt cao hơn ở các khoảng cách trồng

thƣa hơn và đạt cao nhất (tƣơng ứng số củ đạt 12,0 củ, chiều dài củ đạt 32,2 cm,

đƣờng kính củ đạt 2,7 cm và khối lƣợng củ/cây đạt 327,3 g) ghi nhận ở mật độ trồng 8 cây/m2 (Bảng 3.27). Các chỉ tiêu số củ/cây, đƣờng kính củ ở 3 mật độ 7 và 8 cây/m2 là sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Kết quả tính toán năng suất thực thu của các công thức thí nghiệm cho thấy: Năng suất củ của công thức trồng với mật độ trông 11 cây/m2 (30 x 30 cm), và 9 cây/m2 (30 x 35 cm) đạt cao nhất (2,90 tấn/ha và 3,00 tấn/ha), theo sau là công thức trồng với mật độ 8 cây/m2, đạt 2,71 tấn/ha tƣơng đƣơng với mật độ 13 cây/m2 và 7 cây/m2 ở cùng mức sai khác (Bảng 4.27). Nhƣ vậy mật độ cho năng suất dƣợc liệu Đan sâm đạt cao nhất là trồng cây với mật độ 9 - 11 cây/m2 tƣơng đƣơng với khoảng cách từ 30 x 30 cm và 30 x 35 cm.

Theo Liu et al. (2003), trồng cây Đan sâm ở mật độ dày sẽ gây ảnh hƣởng

đến sinh trƣởng, phát triển do sự cạnh tranh dinh dƣỡng, còn nếu trồng ở mật độ

quá thƣa lại gây lãng phí đất. Kết quả nghiên cứu của Sheng (2007) cho thấy,

trồng cây ở mật độ quá dày gây ảnh hƣởng đến sự phát triển của thân lá và bộ rễ

do các nguyên nhân chính sau: (1) Giảm quang hợp: các cây trồng ở mật độ cao thƣờng che bóng lên nhau, làm cản trở sự tiếp xúc với ánh sáng và sự hấp thụ CO2, do vậy, làm giảm cƣờng độ quang hợp. Mặt khác do bộ rễ khó phát triển sâu rộng

làm ảnh hƣởng đến sự hấp thu nƣớc và dinh dƣỡng, dẫn đến hậu quả là thân lá

kém phát triển (Liu et al., 2003); (2): Cạnh tranh về không gian: ở mật độ quá dày,

sẽ có ít không gian hơn cho mỗi cây, dẫn đến tiểu khí hậu tại vùng sinh trƣởng của

cây không đảm bảo. Điều này cũng sẽ ảnh hƣởng đến sự phát triển của thân lá và

bộ rễ cây Đan sâm (Liu et al., 2003); (3): Cạnh tranh về nguồn dinh dƣỡng dƣới

mặt đất: mật độ trồng cây dày sẽ hạn chế không gian dƣới đất của bộ rễ, hạn chế

nguồn dinh dƣỡng và nguồn nƣớc, do vậy gây khó khăn cho bộ rễ phát triển, đồng

thời ảnh hƣởng ngƣợc trở lại bộ phận thân lá ( Liu et al., 2003).

Trong thí nghiệm này, các chỉ tiêu về sinh trƣởng, phát triển, các yếu tố

cấu thành năng suất khi trồng cây Đan sâm ở mật độ dày cao hơn so với khi trồng

cây ở mật độ thƣa (Bảng 4.26, 3.27). Tuy nhiên, nếu trồng cây quá thƣa 7 -8 cây/m2 (30 x 45 cm) lại cho số củ/cây, chiều dài củ, đƣờng kính củ và khối lƣợng củ/cây thấp hơn so với mật độ 30 x 40 cm mặc dù các bộ phận thân lá phát

triển rất mạnh mẽ. Điều này có thể giải thích là do, khi thân lá phát triển quá

mạnh, dinh dƣỡng tập trung cho bộ rễ sẽ bị ảnh hƣởng, do vậy mà ảnh hƣởng đến

khối lƣợng rễ.

4.3.3. Ảnh hƣởng của phân b n đến sinh trƣởng, phát triển và chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm

Cây Đan sâm là cây thuốc, bộ phận thu hoạch làm dƣợc liệu là rễ củ. Do

vậy, bón phân có ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng, phát triển, năng suất và chất

lƣợng dƣợc liệu. Để xác định lƣợng phân bón thích hợp cho cây Đan sâm trồng

từ nguồn cây giống in vitro trong điều kiện Hà Nội, chúng tôi thực hiện đề tài với

mục đích là nhằm xác định đƣợc lƣợng phân bón hợp lí cho cây Đan sâm trồng

tại Hà Nội. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của liều lƣợng bón phân đến sinh

trƣởng, phát triển của cây Đan sâm đƣợc trình bày ở bảng 4.28.

4.3.3.1 Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm

Công thức đối chứng (CT1) chỉ bón 2 tấn phân vi sinh sông gianh, không

bón bổ sung N, P, K cho chiều cao cây, số nhánh cấp 1 và đƣờng kính tán thấp,

tƣơng ứng đạt 27,1 cm; 3,8 nhánh và 42,6 cm. So với công thức không bón phân

N, P, K, các công thức có bón phân N, P, K đã làm tăng chiều cao cây, số nhánh

và đƣờng kính tán cây Đan sâm (bảng 4.28). Công thức bón phân số 4 với 2 tấn

vi sinh, 90 kg N, 120 kg P2O5 và 90 kg K2O/ha cho các chỉ tiêu chiều cao cây (33,1 cm) tƣơng đƣơng với CT3 và CT5 nhƣng có số nhánh cấp 1 (7,8

nhánh/cây) cao nhất so với tất cả các công thức ở độ tin cậy 95%. Chỉ tiêu đƣờng

kính tán (53,4 cm) ở CT4 cũng đạt cao nhất tƣơng đƣơng với CT5. Bón phân với

lƣợng lớn hơn nhƣ CT5 gồm 2 tấn phân vi sinh + 120 kg N + 150 kg P2O5 + 120 kg K2O không làm tăng số nhánh/cây và đƣờng kính tán so với CT4 (Bảng 4.28). Có thể thấy, với mức độ bón phân cao chƣa hẳn chiều rộng tán tăng mà chỉ tăng

về chiều cao cây, khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi cây yếu, ảnh hƣởng đến năng

suất sau này.

Chiều cao cây

Số nhánh cấp 1

Đƣờng kính tán

(cm)

(nhánh/cây)

(cm)

27,1 29,3

3,8 5,5

42,6 47,6

CT1 CT2

33,0 33,1

6,6 7,8

50,6 53,4

CT3 CT4

35,5

6,6

52,2

CT5

3,8

5,7

4,6

2,3

0,65

2,4

CV% LSD0,05

Bảng 4.28. Ảnh hƣởng của phân b n đến sinh trƣởng, phát triển cây Đan sâm

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Hình 4.20. Ảnh hƣởng của phân bón đến sinh trƣởng, phát triển của cây Đan sâm

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, nitơ và photpho có tác dụng kích thích

sự phát triển của thân, lá cây Đan sâm (Chen et al., 1991; Jiang and Wei, 2004;

Li et al., 2004a). Nguyên nhân là do nitơ có khả năng thúc đẩy hoạt động của

nhiều enzyme và làm tăng khả năng quang hợp của lá, trong khi đó photpho thúc

đẩy khả năng tổng hợp dinh dƣỡng và sự vận chuyển các chất dinh dƣỡng này

trong cây (Yang et al., 2005). Trong nghiên cứu này, tất cả công thức có bón

phân đều có cho các chỉ tiêu sinh trƣởng cao hơn công thức đối chứng không bón

phân. Do đó, trong quá trình sản xuất dƣợc liệu Đan sâm ngƣời sản xuất phải bón lƣợng phân hợp lý để cung cấp vừa đủ lƣợng chất dinh dƣỡng cây cần vì nếu bón quá nhiều thì có thể làm cho cây bị lốp đổ, sâu bệnh gây hại, chất lƣợng dƣợc

liệu không cao. Ngƣợc lại, nếu bón quá ít phân cây sinh trƣởng kém, không phát

huy đƣợc hết tiềm năng năng suất của cây.

Tại Việt Nam, hiện chỉ có một số ít tài liệu công bố các kết quả nghiên cứu về kĩ thuật trồng và chăm sóc cây Đan sâm. Tác giả Đào Văn Núi và cs.

(2014) khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của liều lƣợng phân bón cho cây Đan sâm trồng tại Phú Thọ đã đƣa ra kết luận: Liều lƣợng bón phân khác nhau có ảnh

hƣởng đến chiều cao, số nhánh, đƣờng kính tán và các yếu tố cấu thành năng suất. Công thức bón phân 15.000 kg/ha phân chuồng, 300 kg N + 100 kg P2O5 + 75 kg K2O cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao.

4.3.3.2 Ảnh hưởng của phân bón đến mức độ nhiếm sâu bệnh hại trên cây Đan sâm Đối với cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng phân bón là nhu cầu

cần thiết để cây trồng sinh trƣởng phát triển. Chế độ phân bón hợp lý sẽ tạo điều

kiện cho cây sinh trƣởng phát triển thuận lợi, cho năng suất cao, chất lƣợng dƣợc liệu tốt. Tuy nhiên, chế độ bón phân cũng tạo điều kiện cho sâu bệnh hại phát

sinh, phát triển và gây hại làm ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu.

Cây Đan sâm thƣờng bị gây hại bởi sâu xám, bị bệnh khô đầu lá và bệnh héo rũ.

Do vậy, trong thí nghiệm này, mức độ nhiễm ba loại sâu bệnh hại trên đƣợc theo

dõi và trình bày ở bảng 4.29.

Sâu xám (%)

Bệnh khô đầu lá (%)

Bệnh héo rũ (%)

CT1

Bảng 4.29. Ảnh hƣởng của phân b n đến mức độ nhiếm sâu bệnh trên cây Đan sâm

CT2

2,42 1,82 1,82

CT3

3,03 2,42 3,03

CT4

3,64 2,42 3,64

CT5

3,64 3,03 4,24

4,24 3,64 4,24

Mức độ nhiễm sâu bệnh hại ở cây Đan sâm trong thí nghiệm là khá thấp,

dao động từ 2,42 – 4,24% đối với sâu xám, 1,82 – 4,24% đối với bệnh khô đầu lá

và 1,82 – 4,24% đối với bệnh héo rũ. Hơn nữa, mức độ gây hại của sâu bệnh tăng

tỷ lệ thuận với lƣợng phân bón cho cây Đan sâm. Ở công thức đối chứng với

lƣợng phân bón là 2 tấn phân vi sinh/ha, phần trăm số cây Đan sâm bị sâu xám,

bệnh khô đầu lá và bệnh héo rũ là là thấp hơn so với các công thức bón phân ở

mức ý nghĩa 5%, tƣơng ứng đạt 2,42; 1,82 và 1,82%. Bón phân cho cây Đan sâm ở lƣợng lớn nhất gồm 2 tấn phân vi sinh + 120 kg N + 150 kg P2O5 + 120 kg K2O/ha (CT5), tỷ lệ cây Đan sâm bị sâu bệnh hại là cao nhất với 4,24% cây bị sâu xám, 2,54% cây bị bệnh khô đầu lá và 4,24% cây bị bệnh héo rũ (Bảng 4.29).

Nhƣ vậy, các công thức bón phân nhiều có hàm lƣợng đạm trong thân lá cao là nguồn hấp dẫn cho các loài sâu bệnh hại. Vì vậy việc sử dụng liều lƣợng phân bón hợp lý là rất quan trọng nhằm đảm bảo an toàn lƣơng thực và môi trƣờng, là cơ sở

cho nền nông nghiệp bền vững, đặc biệt đối với cây dƣợc liệu làm thuốc chữa bệnh

cho cộng đồng.

4.3.3.3 Ảnh hưởng của phân bón đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cây Đan sâm

Bón phân cân đối là biện pháp hữu hiệu nâng cao hiệu quả của phân bón

và nâng cao năng suất cây trồng. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất củ

Đan sâm ở các công thức phân bón khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 4.30.

Số củ/cây (củ có

Chiều dài

Đƣờng

Khối lƣợng

Năng suất (tân/ha)

đƣờng kính > 6 mm)

kính củ (cm)

củ tƣơi/cây (g)

củ (cm)

1,91

CT1

Bảng 4.30. Ảnh hƣởng của phân b n đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm

2,30

CT2

6,7 18,6 1,7 180,3

2,75

CT3

3,13

CT4

8,4 21,0 2,0 212,0

2,77

CT5

9,6 11,4 23,5 25,4 2,2 2,3 242,3 282,7

3,5

CV%

0,17

9,8 23,6 2,1 242,0

LSD0,05

7,1 1,22 4,0 1,68 5,6 0,22 3,9 17,04

Các chỉ tiêu cấu thành năng suất củ cây Đan sâm nhƣ số củ có đƣờng kính

> 6mm, chiều dài, đƣờng kính và khối lƣợng củ ở các công thức bón phân N, P,

K đều cao hơn so với công thức đối chứng. Các chỉ tiêu này cũng tăng tỷ lệ thuận

với lƣợng phân bón cho cây. Số củ/cây (11,4 củ), chiều dài củ (25,4 cm), đƣờng

kính củ (2,3 cm) và khối lƣợng củ (282,7 g) đạt cao nhất khi bón 2 tấn phân vi sinh, 90 kg N, 120 kg P2O5 và 90 kg K2O/ha (CT4). Đây cũng là công thức bón phân cho năng suất cao nhất, đạt 3,13 tấn/ha. Trong khi đó, nếu chỉ bón phân vi sinh mà không bón bổ sung phân NPK, năng suất củ Đan sâm chỉ đạt 1,91 tấn/ha

(Bảng 4.30).

Từ kết quả trên có thể thấy, khi cây Đan sâm không đƣợc bón phân đầy đủ, cây không đƣợc cung cấp đủ chất dinh dƣỡng, cây sinh trƣởng, phát triển kém dẫn đến bộ rễ phát triển kém. Trong khi đó, nếu bón phân đầy đủ cho cây, cây phát triển cân đối, tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển và hình thành củ, củ lớn nhanh. Tuy nhiên, nếu bón phân quá nhiều sẽ thúc đẩy sự phát triển mạnh về thân lá, bộ rễ ăn nông, do vậy mà ảnh hƣởng đến năng suất củ.

Theo nghiên cứu của Chen et al. (1992), N, P, K đóng vai trò rất quan trọng sinh trƣởng, phát triển, năng suất và tích lũy hoạt chất mục tiêu của cây

Đan sâm. Hai thời điểm hấp thụ N và P cao nhất của cây Đan sâm là 90-100 ngày

và 150-170 ngày sau khi trồng. Thời điểm đầu cây Đan sâm phát triển mạnh các

bộ phận sinh dƣỡng, trong khi đó thời điểm thứ 2 là thời kỳ lan rộng của rễ cây Đan sâm. Theo Han et al. (2005) và Sheng (2007), Đan sâm là cây dƣợc liệu có

nhu cầu photpho cao, khối lƣợng củ Đan sâm tăng tỷ lệ thuận với lƣợng phân bón chứa photpho do hàm lƣợng photpho cao trong phân bón giúp hấp thu photpho từ

trong đất. Trong khi đó ảnh hƣởng của N đến các yếu tố cấu thành năng suất và

năng suất dƣợc liệu Đan sâm là do N có tác dụng kích thích quá trình quang hợp

của lá (Han and Liang, 2005) và kéo dài rễ (Sheng, 2007).

4.3.3.4. Ảnh hưởng của phân bón đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm

Hàm lƣợng cryptotanshinone ở các công thức bón phân dao động từ

0,080 đến 1,191% khối lƣợng khô, trong khi hàm lƣợng này ở công thức đối

chứng là 0,091%. Hàm lƣợng cryptotanshinone tăng dần khi hàm lƣợng N, P, K

tăng tƣơng ứng từ 30-90 kg, 60-120 kg và 45-90 kg. Tuy nhiên nếu tăng lƣợng N, P, K cao hơn, cụ thể 120 N +150 P2O5 + 120 K2O thì hàm lƣợng cryptotanshinone giảm còn 0,178%. Hàm lƣợng cryptotanshinone đạt cao nhất (0,191%) khi bón phân ở liều lƣợng 90 N, 120 P2O5 và 90 K2O cho cây Đan sâm (Bảng 4.31).

Cryptotanshinone (%)

Tanshinone I (%)

Tanshinone IIA (%)

CT1 CT2

0,091 0,080

0,045 0,027

0,199 0,183

CT3 CT4

0,098 0,191

0,033 0,065

0,191 0,245

CT5

0,178

0,050

0,218

Bảng 4.31. Ảnh hƣởng của phân b n đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm sau trồng 10 tháng

Tƣơng tự nhƣ cryptotanshinone, sự tích lũy của hai hoạt chất tanshinone I và tanshinone IIA cũng có xu hƣớng tƣơng tự. Hàm lƣợng tanshinone I (0,065%) và tanshinone IIA (0,245%) đạt đƣợc cao nhất ở công thức bón phân CT4. Hàm lƣợng hoạt chất tanshinone IIA theo quy định trong Dƣợc điển 4, 2010 trong cây

Đan sâm ít nhất là 0,25%, nhƣ vậy, cây Đan sâm trong thí nghiệm đảm bảo thành phần hoạt chất theo Dƣợc điển quy định. Kết quả phân tích về hoạt chất

tanshinone IIA trong thí nghiệm này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Đào

Văn Núi và cs, 2014 đã kết luận ở Hà Nội, hoạt chất tanoshinone IIA đạt 0,2%.

Cho đến nay vai trò của phân bón đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu trong rễ cây Đan sâm vẫn chƣa đƣợc hiểu biết rõ ràng. Theo Chen et al. (1992), hàm lƣợng cryptotanshione tích lũy trong rễ cây Đan sâm giảm khi tăng lƣợng phân bón, đặc biệt là phân đạm. Xu hƣớng tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận bởi Han et al. (2005) trong trƣờng hợp hoạt chất tanshinone IIA. Theo Han et al. (2005), hàm lƣợng tanshinone IIA tăng khi tăng lƣợng P và giảm lƣợng N bón cho cây. Tuy nhiên, trái với kết luận của Han et al. (2005), kết quả nghiên cứu của Sheng (2007) chỉ ra rằng, hàm lƣợng tanshinone IIA trong rễ cây Đan sâm giảm khi tăng lƣợng P bón cho cây. Nguyên nhân làm giảm hàm lƣợng tanshinone IIA trong trƣờng hợp này là do P kích thích sự tăng trƣởng của rễ Đan sâm, đặc biệt là làm tăng đƣờng kính rễ, do vậy hàm lƣợng tanshinone IIA giảm khi so sánh khối lƣợng củ Đan sâm. Do vậy, Sheng (2007) cho rằng, không có mối tƣơng quan thực sự giữa lƣợng phân bón và hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ củ Đan sâm. Các nghiên cứu xa hơn nữa cần phải đƣợc tiến hành nhằm tìm ra công thức bón phân cân đối giữa N, P và K để vừa cho năng suất dƣợc liệu cao vừa cho chất lƣợng dƣợc liệu tốt.

Trong nghiên cứu này, bón phân cho cây Đan sâm có tác dụng làm tăng sinh trƣởng, phát triển, năng suất và hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu. Sử dụng mức phân bón cao có tác dụng kích thích sự phát triển của thân lá cũng nhƣ năng suất củ Đan sâm. Tuy nhiên nếu bón phân quá mức giúp thân lá phát triển nhƣng lại không nâng cao năng suất dƣợc liệu Đan sâm. Tƣơng tự, hàm lƣợng ba hoạt chất mục tiêu đạt đƣợc cao nhất khi bón phân ở liều lƣợng và tỷ lệ phù hợp. Căn cứ vào tất cả các chỉ tiêu theo dõi, mức phân bón đề xuất cho quá trình trồng cây Đan sâm là 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha.

4.3.3.5. Ảnh hưởng của phân bón đến hiệu quả kinh tế dược liệu Đan sâm

Trên cơ sở tính toán tổng chi phí sử dụng bao gồm giống, phân bón, công lao động và các khoản chi khác, tổng thu nhập tính theo năng suất dƣợc liệu Đan sâm trên diện tích 1 ha, thu nhập thuần thu đƣợc từ các công thức bón phân khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 4.32. Có thể thấy, tổng chi phí giữa các công thức bón phân chênh lệch không nhiều, dao động từ 121.555.000 đến 138.495.000 đồng cho 1 ha.

Bảng 4.32. Ảnh hƣởng của liều lƣợng phân b n đến hiệu quả kinh tế trồng cây Đan sâm

Đơn vị: 1000 đồng

Phân bón

Năng suất thực thu

CT Giống

Tổng chi

Tổng thu Thu nhập thuần

Chi phí khác

Giá bán 1 kg khô

Vi sinh

(tấn/ha)

CT1

55.555

16.000

50.000 121.555

1,91

120

229.200

107.645

CT2

55.555

300

240

427.5

16.000

55.000 127.522

2,30

120

276.000

148.478

1 0 0

CT3

55.555

600

480

855

16.000

58.000 131.490

2,75

120

330.000

198.510

CT4

55.555

900

480

855

16.000

61.000 134.790

3,13

120

375.600

240.810

2,77

120

332.400

193.905

CT5

55.555

1.200

600

1.140

16.000

64.000 138.495

Ghi chú: Cây giống (cây nuôi cấy mô): 5.000 đồng/cây; Phân vi sinh Sông Gianh: 8.000 đồng/kg; Phân đạm Phú Mỹ: 10.000 đồng/kg; Phân lân

Phú Mỹ: 4.000 đồng/kg; Phân Kali Phú Mỹ: 9.500 đồng/kg; Giá một kg Đan sâm khô tƣơng đƣơng là 120.000 đ/kg

Kết quả tính toán cho thấy, tại các công thức bón phân N, P, K cho lãi thuần thu đƣợc sau 10 tháng trồng đều cao hơn công thức đối chứng. Cụ thể, ở công thức chỉ bón 2 tấn phân vi sinh, thu nhập thuần là 107,645 triệu đồng, ở các công thức bón phân N, P, K, thu nhập thuần dao động từ 148,478 triệu đồng (CT2) đến 240,810 triệu đồng (CT4). Từ đó cho thấy việc sử dụng phân bón trong quá trình sản xuất dƣợc liệu Đan sâm giúp nâng cao hiệu quả kinh tế một cách rõ rệt và liều lƣợng phân bón ảnh hƣởng nhiều đến hiệu quả kinh tế trồng cây Đan sâm. Trong các công thức bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha (CT4) cho thu nhập thuần đạt cao nhất (240,810 triệu đồng).

Nhƣ vậy, phân bón có ảnh hƣởng tích cực đến sinh trƣởng, phát triển và

năng suất dƣợc liệu Đan sâm. Xét về hiệu quả kinh tế, việc bón phân cũng giúp

làm tăng thu nhập thuần so với công thức không bón phân. Trong các công thức bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh 90 kg N 120 kg P 2O5 + 90 kg K2O/ha là phù hợp nhất cho cây Đan sâm trong điều kiện Hà Nội.

101

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm cho hệ số nhân cao, chất lƣợng tốt, có khả năng ứng dụng rộng rãi với

các thông số nhƣ sau:

Sử dụng môi trƣờng gieo hạt Đan sâm là MS 1,0 mg/l GA, sau đó nhân nhanh chồi Đan sâm trong môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA đạt hệ số nhân

chồi 5,05 lần. Tạo cây Đan sâm hoàn chỉnh thích hợp trong môi trƣờng ½ MS +

0,75 mg/l IAA. Giá thể thích hợp để tiếp nhận cây Đan sâm ngoài vƣờn ƣơm là

giá thể xơ dừa: cát (1:1) trong thời gian 30 ngày đạt tiêu chuẩn cây giống cao > 4

cm, có 9 lá sinh trƣởng phát triển tốt và tỷ lệ sống 100%.

2. Nghiên cứu đã xác định đƣợc các vật liệu và điều kiện thích hợp để tạo

và nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm:

Xác định đƣợc mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ cây Đan

sâm. Trong nồng độ dịch khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất tƣơng ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm thích hợp là B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl

Jasmonate, trong điều kiện 16h sáng/8h tối, cho tốc độ tăng trƣởng rễ trong thời

gian nuôi cấy 8 tuần khối lƣợng rễ tăng lên 13,96 lần so với khối lƣợng ban đầu,

tích lũy hoạt chất mục tiêu cao nhất.

3. Nghiên cứu đã xác định đƣợc một số các biện pháp kỹ thuật phù hợp

cho sự sinh trƣởng, phát triển, năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm khi

trồng trên đồng ruộng tại Hà Nội sử dụng cây giống có nguồn gốc nuôi cấy mô. Trồng cây Đan sâm vào tháng 3 với khoảng cách 30 cm x 35 cm, liều lƣợng phân bón là 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha cho cây sinh trƣởng, phát triển tốt, năng suất dƣợc liệu cao.

5.2. Đề nghị

1. Ứng dụng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm vào sản xuất cây giống Đan sâm chất lƣợng cao ở các cơ sở sản xuất giống góp phần chủ động nguồn giống dƣợc liệu Đan sâm trong nƣớc. Đồng thời, tiến hành trồng sản xuất thử

nghiệm cây Đan sâm có nguồn gốc nuôi cấy mô tại Hà Nội và các tỉnh lân cận.

102

2. Các dòng rễ tơ Đan sâm là nguồn vật liệu quý phục vụ nghiên cứu khoa học và sản xuất hợp chất thứ cấp. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn cơ chế phân tử

liên quan đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu, từ đó có phƣơng thức tác động để

nâng cao hoạt chất mục tiêu hiệu quả. Đồng thời, thiết lập quá trình nhân nuôi

sinh khối rễ Đan sâm ở quy mô lớn nhằm sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ Đan sâm phục vụ nền công nghiệp dƣợc liệu Việt Nam.

103

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Lê Tiến Vinh, Ninh Thị Thảo, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy và Nguyễn

Thị Phƣơng Thảo (2014). Quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia

miltiorrhiza Bunge), Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(5): 744-752.

2. Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy và Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2015). Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm (Salvia

miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, Tạp chí Khoa

học và Phát triển,13(2): 251-258.

104

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo tiếng Việt

Tạ Nhƣ Thục Anh, Nguyễn Trần Hy, Dƣơng Thị Phúc Hậu và Ngô Quốc Luật (2014). Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng trong nhân giống in vitro cây Đan sâm. Tạp chí Dƣợc liệu, 19 (1): 57-64.

2. Ngô Xuân Bình (2009). Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhà xuất bản Khoa học và

kỹ thuật.

3. Bộ Y tế (2010). Dƣợc điển Việt Nam IV. Nhà xuất bản Y học.

4. Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.

5. Lê Khúc Hạo, Ngô Quốc Luật, Đào Văn Núi và Trần Danh Việt (2014). Ảnh hƣởng của thời vụ, khoảng cách và liều lƣợng phân bón đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm nguồn gốc Tứ Xuyên - Trung Quốc tại Hà Nội. Tạp chí Dƣợc liệu 19 (1): 41 - 46

6. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn Thế Vinh, Thái Xuân Du và Dƣơng Tấn Nhựt (2014). Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống lá và thân rễ cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Tạp chí Sinh học, 36(1): 277-282.

7. Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11(7): 917-925.

Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007). Bƣớc đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 10(7): 11-16.

9. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa

học và Kỹ thuật.

10. Ngô Quốc Luật, Trần Danh Việt, Đào Văn Núi, Trần Thị Lan và Lê Tiến Vinh (2014). Nghiên cứu di thực cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Việt Nam. Tạp chí Dƣợc liệu, 458(6): 54.

11. Hoàng Thị Thanh Minh, Quách Ngô Diễm Phƣơng và Bùi Văn Lệ (2011). Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ in vitro cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm thu nhận Resveratrol. Tạp chí Công nghệ sinh học, 9(4A): 665-672.

12. Đào Văn Núi, Ngô Quốc Luật, Trần Danh Viêt, Nguyễn Trần Hy, Lê Khúc Hạo, Trịnh Văn Vƣợng và Lê Tiến Vinh (2014). Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời vụ đến nhân nhanh giống vô tính từ củ mẹ Đan sâm. Tạp chí Dƣợc liệu, 19(1): 52-56.

13. Trƣơng Thị Bích Phƣợng và Phan Ngọc Khoa (2013). Nhân giống in vitro cây lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (wall.) Lindl). Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 1: 79.

14. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung và Nguyễn Lê Anh Thƣ (2013). Sự hình thành và tăng trƣởng của rễ bất định từ nuôi cấy in vitro của cây Đƣơng quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa). Tạp chí Sinh học, 35(3): 165-173.

105

15. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan và Trần Thế Mai (2012). Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(2): 263-271.

16. Lê Xuân Thao (2012). Nghiên cứu tạo rễ tơ cây khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius). Luận văn thạc sĩ ngành Vi sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.

17. Nguyễn Quang Thạch (2000). Giáo trình sinh lý thực vật. Nhà xuất bản Nông

nghiệp Hà Nội.

18. Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện (2012). Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dƣợc liệu quý. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(4): 597-603.

19. Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Ninh Thị Thảo và Nguyễn Thị Thủy (2013). Quy trình nhân giống in vitro cây Ba kích (Morinda officenalis How). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11(3): 285-292.

20. Phƣơng Thiện Thƣơng, Nguyễn Thị Kim An, Nguyễn Minh Khởi và Fumiaki Ito (2013). Các tanshinon phân lập từ rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) di thực và trồng ở Việt Nam. Tạp chí Dƣợc học, 53(9).

21. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt và Nguyễn Đức Lƣợng (2010). Khảo sát vài yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào Taxus wallichiana Zucc. in vitro. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 11(T3): 67-77.

Tài liệu tham khảo tiếng nƣớc ngoài

22. Adeniyan O. (2014). Effect of different population densities and fertilizer rates on the performance of different maize varieties in two rain forest agro ecosystems of South West Nigeria. Academic Journals, 8(8): 410 - 415.

23. Alagumanian S., V. Saravanaperumal, R. Balachandar, K. Rameshkannan, and M.V. Rao (2004). Plant regeneration from leaf and stem explants of Solanum trilobatum L. Curr. Sci. 86: 1478-1480.

24. Alpizar E. E., F. Dechamp, C. Lapeyre-Montes, B. Guilhaumon, C. Bertrand, P. Jourdan, H. Lashermes and H. Etienne (2008). Agrobacterium rhizogenes- transformed Roots of Coffee (Coffea arabica): Conditions for Long-term Proliferation, and Morphological and Molecular Characterization. Annals of Botany, 101(7): 929–940.

25. An R., S. L. Wang, L. S. Zhou, Z. H. You, X. K. Wang, X. Hong and Y. Q. Wang (2004). Determination of fat-soluble component in Radix salviae from different sources. Chinese Traditional Patent Medicine, 26: 294-297.

26. Arunakumara K. K. I. U., B. C. Walpola and M. H. Yoo (2013). Mass Multiplication of an important medicinal plant Gymnema sylvestre R. Br.: A Review. International Journal of Medicinal Plants, 105: 250-259.

27. Asad S., H. Nosheen, A. Amir, B. Rukhsana (2009). Effect of different cultural conditions on micropropagation of rose (Rosa indica L.). Pakistan Journal of Botany, 41(6): 2877-2882.

28. Baranauskiene R., Venskutonis, P.R., Viskelis, P., and Dambrauskiene, E .(2003).

106

Influence of nitrogen fertilizers on the Yield and Composition of Thyme (Thymus vulgaris). J. Agric. Food Chem., 51: 7751-7758.

29. Bensaddek L., F. Gillet, J. E. Nava-Saucedo and M. A. Fliniaux (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotecnology, 85: 35-40.

30. Buitelaar R. M., E. J. T. M. Leenen, G. Geurtsen, D. Groot and J. Tramper (1993). Effects of the addition of XAD-7 and of elicitor treatment on growth, thiophene production, and excretion by hairy roots of Tagetes patula, Enzyme and Microbial Technology, 15: 670-676.

31. Cai Z. H., S. L. Gao and D. R. Xu (1991). Research on rapid-propagation technology of Salvia miltiorrhiza in vitro culture. Journal of China Pharmaceutical University, 22: 65-68.

32. Canter P. H., H. Thomas and E. Ernst (2005). Bringing medicinal plants into in

for biotechnology. Trends

cultivation: opportunities and challenges Biotechnology, 23: 180-185.

33. Chai T. O., Ahmad S., Johnson S. and Mahmood M. (2012). Efficiency of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy roots induction in Solanum mammosum. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 29(3):421-30. 34. Chang H. M., K. P. Cheng, T. F. Choang, H. F. Chow, K. Y. Chui, P. M. Hon, F. W. L. Tan, Y. Yang and Z.P. Zhong (1990). Structure elucidation and total synthesis of new tanshinones isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen). The Journal of Organic Chemistry, 55: 3537-3543.

35. Chen H., F. Chen, Y. L. Zhan and J. Y. Song (1999). Production of lithospermic acid B and rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 22: 133–138.

36. Chen Z., H.T. Song and B. A. Chen (1991). The field assay of fertilizers in Salvia

miltiorrhiza. Journal of Chinese Materia Medica, 14: 11-12.

37. Chen Z., H.T. Song and B. A. Chen (1992). Effect of concentration of nutrients solution on the growth of Salvia miltiorrhiza Bge. China Journal of Chinese Materia Medica, 17(141-2): 191.

38. Cheng Q., Y. He, G. Li, Y. Liu, W. Gao and L. Huang (2013). Effects of Combined Elicitors on Tanshinone Metabolic Profiling and SmCPS Expression in Salvia miltiorrhiza Hairy Root Cultures. Molecules, 18: 7473-7485.

39. Christen P., T. Aoki and K. Shimomura (1992). Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4. Plant Cell Reports, 11(12): 597-600.

40. Choi K. T., I. O. Ahn and J.C. Park (1994). Production of ginseng saponin in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). Russian Journal of Plant Physiology, 41: 784-788.

41. Debnath M., C. P. Malik and P. S. Bisen (2006). Micropropagation: a tool for the production of high quality plant-based medicines. Current Pharmaceutical Biotechnology, 7: 33-49.

42. Dinh S. T., I. T. Baldwin and I. Galis (2013). The herbivore elicitor-regulated1 gene enhances abscisic acid levels and defenses against herbivores in Nicotiana attenuata plants. Plant Physiology, 162: 2106-2124.

107

43. Diof M. F., A. Hehn, A. Ptak, F. Chrétien, S. Doerper, E. Gontier, F. Bourgaud, M. Henry, Y. Chapleur and D. Laurain - Mattar (2006). Hairy root and tissue cultures of Leucojum aestivum L. - Relationships to galanthamine content. Phytochemistry Reviews, 6: 137-141.

44. Dordas C. (2009). Foliar application of calcium and magnesium improves growth, yield, and essential oil yield of oregano (Origanum vulgare ssp. hirtum). Ind. Crop. Prod., 29: 599-608

46. Du Guanhua and Juntian Zhang (2015). Overview of Modern research on Danshen in Dan shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 2: Pharmacology and Quality Control Editor by Xijun Yan. Springer: 3 - 6.

47. Eibl R. and Eibl D. (2009). Cell and Tisue reaction Engineeering: Principles and

Practice, Chapter 8: Plant Cell-Base Bioprocessing. Springer: 323-324.

48. Eschen-Lippold L., R. Landgraf, U. Smolka, S. Schulze, M. Heilmann, I. Heilmann, G. Hause and S. Rosahl (2012). Activation of defense against Phytophthora infestans in potato by down-regulation of syntaxin gene expression. New Phytologist, 193: 985-996.

49. Fang C. N., P.L. Chang and T. P. Hsu (1976). The antibacterial components of

Danshen, Acta Chimica Sinica, 34: 197-209.

50. Feng L., S. Guo, S. Zhou, M. Fan and J. Zhou (2004). Research on propagative technique of Salvia miltiorrhiza Bunge in vitro, Wuhan Botanical Research, 22(5): 463-468.

51. Fett-Neto A.G., S. J. Melanson, K. Sakata and F. DiCosmo (1993). Improved growth and taxol yield in developing calli of Taxus cuspidata by medium composition modification. Biotechnology, 11: 731-734.

52. Furuya T., H. Kojima, K. Syono, T. Ishii and K. Uotani (1973). Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 21(1): 98-101.

53. Gao S. L., D. R. Xu, Z. H. Cai and D. N. Zhu (1992). Studies on the breeding of autotetraploid of Salvia miltiorrhiza Bunge. Journal of China Pharmaceutical University, 23: 224-228.

54. Gao Y., Z. S. Liang and Y. Liu (2004). Study on water consumption characteristics and water use efficiency of Salvia miltiorrhiza in different soil water. Acta Botanica Boreali-Occidentadia Sinica, 24: 2221-2227.

55. Gao W., G. H. Cui, J. Q. Kong, K. D. Cheng, W. Wang, Y. Yuan and L.Q. Huang (2008). Optimizing expression and puriﬁcation of recombinant Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase protein in E. coli and preparation of rabbit antiserum against SmCPS. Acta Pharmacologica Sinica, 43: 766–772.

56. Gao W., M. L. Hillwig, L Q. Huang, G. H. Cui, X. Y. Wang, J. Q. Kong, B. Yang and R. J. Peters (2009). A functional genomics approach to tanshinone biosynthesis provides stereochemical insights. Organic Letters, 11: 5170–5173.

45. Diallo M.S., A. Ndiaye, M. Sagna, Y.K. Gassama-Dia (2008). Plants regeneration from African cowpea variety (Vignaunguiculata L. Walp.). Af. J. Biotech, 7: 2828-2833.

108

57. Gao Y., K. Zhang, F. Zhu, Z. Wu, X. Chu, X. Zhang, Y. Zhang, J. Zhang and L. Chu (2014). Salvia miltiorrhiza (Danshen) inhibits L-type calcium current and attenuates calcium transient and contractility in rat ventricular myocytes. Journal of Ethnopharmacology, 158: 397–403.

58. Ge X and J. Wu (2005). Tanshinone production and isoprenoid pathways in Salvia miltiorrhiza hairy roots induced by Ag+ and yeast elicitor. Plant Science, 168 (2): 487-491.

59. Gordon M. H and X. C Weng (1992). Antioxidant properties of extracts from

tanshen (Salvia miltiorrhiza Bunge). Food Chemistry, 44: 119-122.

60. Guillon S., J. Tremouillaux-Guiller, P. K. Pati, M. Rideau and P. Gantet (2006). Harnessing the potential of hairy roots: dawn of a new era. Trends in Biotechnology, 24: 403-409.

61. Gupta S. K., R. Liu, S. Liaw, H. Chan and H. Tsay (2011). Enhanced tanshinone production in hairy roots of „Salvia miltiorrhiza Bunge‟ under the influence of plant growth regulators in liquid culture. Botanical Studies, 52: 435-443.

62. Gubis L., Lajchová, Z., Faragó, J., Jureková, Z. (2003). Effect of genotype and explant type on shoot regeneration in Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro. Czech J. Gen. Plant Breed, 39: 9-14.

63. Halim V. A., L. Eschen-Lippold, S. Altmann, M. Birschwilks, D. Scheel and S. Rosahl (2007). Salicylic acid is important for basal defense of Solanum tuberosum against Phytophthora infestans. Molecular Plant-Microbe Interactions Journal, 20: 1346-1352.

64. Han J. P. and Z. S Liang (2005). Regulation of Salvia miltiorrhiza growth and danshensu and tanshinone IIA accumulation under nitrogen and phosphorus. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 36: 756-759.

65. Han J. P., Z. S. Liang and W. S. Zhang (2005). Effect of microelement on growth and active ingredient of Salvia miltiorrhiza Bge. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 11: 560-563.

66. Han J. P., Z S. Liang, Q. Sun, W. L. Wang, Y. S. Wei, Z. L. Ye and J. M. Wang (2003). Effects of nitrogenous and phosphorous on the root growth and accumulation of total tanshinones of Salvia miltiorrhiza. Acta Botanica Boreali- Occidentalia Sinica, 23: 603-607.

67. Hu P., G. A. Luo and Z.Z. Zhap (2005). Quality assessment of Radix Salviae

miltiorrhiza. Chem Pharm Bull, 53: 481-486.

68. Hu Z. B. and A. W. Alfermann. (1993). Diterpene production in hairy root

cultures of Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry, 32: 699-703.

69. Hsia C. N., J. F. Lin, U. C. Chen, C. Y. Tsao and H. S. Chan (2007). Establishment hairy root culture system of Salvia miltiorrhiza. International Symposium on Ecological and Environmental Biosafety of Transgenic Plants, Taichung, Taiwan.

70. Ji X. Y., B. K. Tan and Y. Z. Zhu (2000). Salvia miltiorrhiza and ischemic

diseases. Acta Pharmacologica Sinica, 21: 1089-1094.

109

71. Jiang C. Z. and X. R. Wei (2004). Study on the choice of cultivation area of Salvia

miltiorrhiza Bge. Research and Practice of Chinese Medicines, 18: 15-17.

72. Jiang C. Z., X. R. Wei, Z. S. Liang, J. M. Wang and R. F. Huang (2004). Standard operation practices (SOP) of Danshen. Research and Information on Traditional Chinese Medicine, 6: 16-24.

73. Jiang J. H., G. Y. Kai, X. Y. Cao, F. M. Chen, D. N. He and Q. Liu (2006). Molecular cloning of a HMG-CoA reductase gene from Eucommia ulmoides Oliver. Bioscience Reports, 26:171–181.

74. Jiang R. W., K. M. Lau, P. M. Hon, T.C. Mak, K.S. Woo and K. P. Fung (2005). Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives from Salvia miltiorrhiza. Current Medicinal Chemistry, 12: 237-246.

75. Johnson G. A., T. Hoverstad, R. E. Greenwald (1998). Integrated weed management using narow corn row spacing, herbicides and cultivaton. Agron. J. Madison 90 (1): 40 - 46.

76.

Jun T. and L. Ling (2005). Genetic transformation of Torenia Fournieri L. mediated by Agrobacterium rhizogenes. South Africa Journal of Botany, 72: 211-216.

77. Kai G. Y., P. Liao, T. Zhang, W. Zhou, J. Wang, H. Xu, Y.Y. Liu and L. Zhang (2010). Characterization, expression proﬁling and functional identiﬁcation of a gene encoding geranylgeranyl diphosphate synthase from Salvia miltiorrhiza. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15: 236–245.

78. Kai G., H. Xu, C. Zhou, P. Liao, J. Xiao, X. Luo, L. You and L. Zhang (2011). Metabolic engineering tanshinone biosynthetic pathway in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures. Metabolic Enginerring, 13(3): 319-327.

79. Kai G., P. Liao, H.Xu, J. Wang, C. Zhou, W. Zhou, Y. Qi, J. Xiao, Y. Wang and L. Zhang tanshinone (2012). Molecular mechanism of elicitor-induced accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures. Acta Physiology Plant, 34: 1421-1433.

80. Kamoun S., P. van West, V. G. Vleeshouwers, K. E. de Groot and F. Govers (1998). Resistance of nicotiana benthamiana to phytophthora infestans is mediated by the recognition of the elicitor protein INF1. Plant Cell, 10: 1413-1426.

81. Kaschani F., M. Shabab, T. Bozkurt, T. Shindo, S. Schornack, C. Gu, M. Ilyas, J. Win, S. Kamoun and R. A. van der Hoorn (2010). An effector-targeted protease contributes to defense against Phytophthora infestans and is under diversifying selection in natural hosts. Plant Physiology, 154: 1794-1804.

82. Kim J. S., S. Y. Lee and S. U. Park (2008). Resveratrol production in hairy root of transformed with defferent Agrobacterium

peanut, Arachis hypogaea L. rhizogenes strains. African Journal Biotechnology, 7: 3788-3790.

83. Kohda H., O. Takeda, S. Tanaka, K. Yamasaki, A. Yamashita, T. Kurokawa and S. Ishibashi (1989). Isolation of inhibitors of adenylate cyclase from Dan-shen, the root of Salvia miltiorrhiza. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37: 1287-1290.

84. Komalavalli N. and M. V. Rao (2000). In vitro micropropagation of Gymnema sylvestre – a multipurpose medicinal plant. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 61: 97-105.

110

85. Kumar N., Vijayanand, K.G., Reddy, M.P. (2011). Plant regeneration in non-toxic Jatropha curcas - impacts of plant growth regulators, source and type of explants. J Plant Biochem Biotechnol., 20: 125-133.

86. Kumar V., A. Sharma, B. C. N. Prasad, H. B. Gururaj and G. A. Ravishankar (2006). Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of Biotechnology, 9 (4): 349-357.

87. Lay I. S., C. C. Hsieh, J. H. Chiu, M. S. Shiao, W.Y. Lui and C. W. Wu (2003). Salvianolic acid B enhances in vitro angiogenesis and improves skin flap survival in Sprague - Dawley rats. The Journal of Surgical Research, 115: 279-285.

88. Lee S. Y., S. G. Kim, S W. Song, Y. K. Kim, N. I. Park and S. U. Park (2010). Influence of different strains of Agrobacterium rhizogenes on hairy root induction and production ofalizarin and purpurin in Rubia akane Nakai. Biotechnology Letters, 15: 5405-5409.

89. Li X. C., C. Yu, W. K. Sun, G. Y. Liu, J. Y. Jia and Y. P. Wang (2004a). Simultaneous determination of magnesium lithospermate B, rosmarinic acid, and lithospermic acid in beagle dog serum by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Communicatious in Mass Spectrometry, 18: 2878-2882.

90. Li X. C., C. Yu, W. K. Sun, G. Y. Liu, J. Y. Jia and Y. P. Wang (2004b). Pharmacokinetics of magnesium lithospermate B after intravenous administration in beagle dogs. Acta Pharmacologica Sinica, 25: 1402-1407.

91. Liao P., W. Zhou, L. Zhang, J. Wang, X. M. Yan, Y. Zhang, R. Zhang, L. Lim, G. Y. Zhoum and G. Y. Kai (2009). Molecular cloning, characterization and expression analysis of a new gene encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from Salvia miltiorrhiza. Acta Physiology Plant, 31: 565– 572.

92. Lièvre K., H. Alain, T. L. M. Tran, G. Antoine, T. Brigitte, B. Frederic and G. Eric (2005). Genetic transformation of the medicinal plant Ruta graveolens L. by an Agrobacterium tumefaciens - mediated method. Plant Science, 168: 883–888.

93. Lili G., Lihong N., M. G. Peter, S. Changlong, S. Fuping, Dafang Huang and Z. Jie (2011). Efficient production of Agrobacterium rhizogenes-transformed roots and composite plants in peanut (Arachis hypogaea L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 109 (3): 491-500.

94. Liu A. H., L. Li, M. Xu, Y. H. Lin, H. Z. Guo and D. A. Guo (2006a). Simultaneous quantification of six major phenolic acids in the roots of Salvia miltiorrhiza and four related traditional Chinese medicinal preparations by HPLC- DAD method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41: 48-56.

95. Liu C., L. Wang, X. L. Zhao, Y. Chen, W. An and L. X. Gong (2006b). The influence of different planting density on production and quality of Carthamus tinctorius. Journal of Henan University of Chinese Medicine, 7: 17-18.

96. Liu W. T., Z. S. Liang, L. L. Fu, X. R. Wei and J. Q. Bai (2003). Effect of planting density on active constituents and output of Salvia miltiorrhiza Bunge. Research and Practice of Chinese Medicines, 17: 14-17.

111

97. Long W., Zhang SC, Wen L, Mu L, F. Yang and G. Chen (2014). In vivo distribution and pharmacokinetics of multiple active components from Danshen and Sanqi and their combination via inner ear administration. J Ethnopharmacol., 156:199-208.

98. Huang L., M. Chen and L. Guo (2015). Distribution and Habitat of Danshen in

Dan shen (Salvia miltiorrhiza). Springer: 11 - 15.

99. Lu Y. and L. Y. Foo (2002). Polyphenolics of Salvia--a review. Phytochemistry,

59: 117-140.

100. Machinandiarena M. F., M. C. Lobato, M. L. Feldman, G. R. Daleo and A. B. Andreu (2012). Potassium phosphite primes defense responses in potato against Phytophthora infestans. Plant Physiology, 169: 1417-1424.

101. Martina S., W. Michael and S. Koichiro (1991). Influence of Light and in Transformed Root Cultures

Phytohormones on Alkaloid Production of Hyoscyamus albus. Journal of Plant Physiology, 140 (2): 147–152.

102. Morgan J. A., C. S. Barney, A. H. Penn and J. V. Shanks (2000). Effects of buffered media upon growth and alkaloid production of Catharanthus roseus hairy roots. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(3): 262-265.

103. Minhui L., L. Qianquan, Z. Chunhong, N. Zhang, C. Zhanhu, L. Huang and P. Xiao (2013). An ethnopharmacological investigation of medicinal Salviaplants (Lamiaceae) in China. Acta Pharmaceutica Sinica B. 3(4): 273–280.

104. Murashige T. and F. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant, 15: 473-497

105. Nhut D. T., H. X. Chien, N. B. Truc, N. B. Nam, T. X. Tinh, V. Q. Luan, N. V. Binh, V. T. Hien, T. T. Huong, N. C. T. Han, L. N. M. Thuy, L. T. M. Nga, T. T. Hien and N. T. Hai (2010). Micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv. Journal of Biotechnology, 8(3B): 1211-1219.

106. Nhut D. T., B. V. T. Vinh, T. T. Hien, N. P. Huy, N. B. Nam and H. X. Chien (2012). Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et. Grushv.). African Journal of Biotechnology, 11(5): 1084-1091.

107. Petersen M. and M. S. J. Simmond (2003). Rosmarinic acid. Phytochemistry, 62:

121-125.

108. Pitta-Álvarez S. I., T. C. Spollansky and A. M. Giulietti (2000). The influence of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida. Enzyme and Microbial Technology, 26: 252-258.

109. Porter P. M., D. R. Hicks, W. E. Lueschen, J. H. Ford, D. D. Warnes, T. Hoverstad (1997). Corn response to row width and plant population in the Northern Corn Belt. J. Product. Agric. Madison, 10(2).

110. Qin S. L. (2006) The postmarket of Danshen is worthy of attentions.

112

111. Reddy M. P., N. Kumar, G. Vijayanand, A. H. Singh, S. Singh (2008). Method for micropropagation of Jatropha curcas plants from leaf explants (Patent filed US and PCT Application No. 2537.

112. Reddy P. S., G. R. Gopal and G. L. Sita (1998). In vitro multiplication of

Gymnema sylvestre, an important medicinal plant. Current Science, 75: 843-845.

113. Rahimi K., K. Haghbeen, J. Marefatjo, F. R. Jazii and R. Sheikhani (2008). root of Valeriana sisymbriifolium by

Successful production of hairy Agrobacterium rhizogenes. Biotechnology Journal, 7: 200-204.

114. Read P. E., J. E. Preece (2003). Environmental management for optimizing

micropropagation. Acta Hort. 616: 129-133.

115. Sato A., S. S. Delima., V. R. Affonso, L. M. A. Esquibe and C. L. S. Lage (2006). Micropropagation of Chamomilla recutita (L.) Rauschert: A shock treatment model with growth regulators. Scientia Horticulturae, 109: 160-164.

116. Sheng S. (2007). Cultivation and quality studies of Danshen (Salvia miltiorrhiza)

in Australia. Doctor thesis, RMIT University.

117. Shi H. P. and S. Kintzios (2003). Genetic transformation of Pueraria phaseoloides with Agrobacterium rhizogenes and peurarin production in hairy root. Plant Cell Reports, 21: 1103-1107.

118. Sifola, M. I. And G. Barbieri (2006). Growth, yield and essential oil content of three cultivars of basil grown under different levels of nitrogen in the field. Sci. Hortic., 108: 408-413.

119. Shu Z. M., Z. S. Liang, X. R. Wei, L. Fu and X. W. Zhangs (2004). Danshen GAP

standard cultivation technique. Shanxi Agricultural Science: 98-99.

120. Sivakumar G., K. W. Yu, E. J. Hahn and K. Y. Paek (2005). Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large-scale bioreactors. Current Science, 89: 641-649.

121. Subarna H., K. Suman and T. Pramod (2010). In vitro propagation of the the National

medicinal orchid Dendrobium chrysanthum. Proceedings of Academy of Sciences, 76(1): 1-6.

122. Sze F. K., F. F. Yeung, E. Wong and J. Lau (2005). Does Danshen improve disability after acute ischaemic stroke. Acta Neurologica Scandinavica, 111: 118-125.

123. Tariq, J. M. T., M. Arif, H. Akbar and S. Ali (2007). Response of wheat to source, type and time of nitrogen application. Sarhad Journal of Agriculture 23(4): 871–879.

124. Thorpe T., C. Stasolla, E. C. Yeung, G. J. de Klerk, A. Roberts and E. F. George (2008). The components of plant tissue culture media II: Organic additions, osmotic and pH effects, and support systems. Springer: 115-174.

125. Toivonen L., S. Laakso and H. Rosenqvist (1992). The effect of temperature on hairy root cultures of Catharanthus roseus: Growth, indole alkaloid accumulation and membrane lipid composition. Plant Cell Reports, 11(8): 395-399.

126. Wang X. J., Z. Wu, Z.C. Zhu and X. Q. Zhu (2002). A comparative experiment on ways of reproducing Salvia miltiorrhiza. Journal of Shangluo Teachers Colleage, 16: 37-39.

113

127. Wang X. J., X. Q. Zhu, Z. Wu and Z. C. Zhu (2003). The productive quality, standard of management and rules of operation of Salvia in Shangluo City. Journal of Shangluo Teachers College, 17: 44-47.

128. Wang, X. L., J. P. Hao, Z. X. Wu and H. G. Xie (2004). Study on stem tip culture and rapid propagation of Salvia miltiorrhiza. Journal of Shanxi University, 27: 182-184.

129. Wang X., Y. Wei, S. Yuan, G. Liu, Y. Lu, J. Zhang and W. Wang (2005). Potential anticancer activity of tanshinone IIA against human breast cancer, International Journal of Cancer, 116: 799-807.

130. Wang X. Y., G. H. Cui, W. Gao and L. Q. Huang (2009). New method of “ingredient difference phonetypical cloning” for functional gene cloning from medicinal plants. China Journal of Chinese Materia Medica, 34: 14–17.

131. Wei X. Y. (2002). The production of Chinese herbal medicines should not be blindly developed. China Federation of Supply and Marketing of Business (integration edition), 18.

132. Wu T. W., L. H. Zeng, K. P. Fung, J. Wu, H. Pang, A. A. Grey, R. D. Weisel and J. Y. Wang (1993). Effect of sodium tanshinone IIA sulfonate in the rabbit myocardium and on human cardiomyocytes and vascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology, 46: 2327-1332.

133. Xu H., L. Zhang, C. Zhou, J. Xiao, P. Liao and G. Kai (2010). Metabolic regulation and genetic engineering of pharmaceutical component tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza. Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2591-2597.

134. Xu M. Y. and Q. Z. Sun (2008). Buds induction and high – frequency plant regeneration of Salvia miltiorrhiza Bunge. Journal of Agricultural Science and Technology, 10(1): 76- 80.

135. Yan Q., Z. Hu, R. X. Tan and J. Wu (2005). Efficient production and recovery of diterpenoid tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures with in situ adsorption, elicitation and semi-continuous operation. Journal of Biotechnology, 119: 416-424.

136. Yan X. M., L. Zhang, J. Wang, P. Liao, Y. Zhang, R. Zhang and G. Y. Kai (2009). Molecular characterization and expression of 1-deoxy-D-xylulose 5- phosphate reductoisomerase (DXR) gene from Salvia miltiorrhiza. Acta Physiology Plant, 31: 1015-1022.

137. Yang C. Y. and S. C. Teng. (2005). Effects of kinds of fertilizers and the employed

quantities on root yield of Salvia miltiorrhiza. Tillage and Cultivation: 20-21.

138. Yang L. J., C. J. Jeng, H. N. Kung, C. C. Chang, A. G. Wang, G. Y. Chau, M. J. Don and Y. P Chau (2005). Tanshinone IIA isolated from Salvia miltiorrhiza elicits the cell death of human endothelial cells. Journal of Biomedical Science, 12: 347-361.

139. Yu Y., M. L. Liu,Y. G. Zhang, Z. Sha and X. F. Zou (2006). Effects of different plant density on vegetative growth and root production of Ligusticum jeholense. Journal of Jilin Agricultural University, 28: 181-183.

114

140. Zebarjadi A. R., S. Najafi, H. R. Ghasempour, J. Motamedi (2011). Establishment of a practical tissue culture for producing hairy roots of Valeriana officinalis L. via Agrobacterium rhizogenes. Journal of Medicinal Plants Research, 5(20): 4984-4992.

141. Zhang Y. H. and Y. F. Zhang (2004). Studies on Taishan Danshen biological

features and the techniques of artificial breeding. Chinese wild Plant Resources,

23: 64-65.

142. Zhao D. C., X. Qui, G. Liu, B. Lu and J. Y. Pan (2003). Tissue culture and plantlets regeneration of Salvia miltiorrhiza Bunge. Journal of Shaanxi Normal University, 31(11): 99-102.

143. Zhao Y. J., S. B. Chen, G. Y. Gao, Y. X. Feng, S. L. Yang, L. Z. Xu, L. J. Du, J. Lin and M. Li (2004). Content of inorganic elements of Salvia miltiorrhiza root in different area and physicochemical properties of its growing soil. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 29: 844-850.

144. Zhao Y. X., M. Y. Ding and D. L. Liu (2005). Phenolic acids analysis in ligusticum chuanxiong using HPLC. Journal of Chromatographic Science, 43: 389-393.

145. Zhou L., Z. Zuo and M. S Chow (2005). Danshen: an overview of its chemistry,

pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use. Journal of Clinical

Pharmacology, 45: 1345-1359.

Tài liệu internet:

146. Linh Doan (2012). Thiên sứ hộ tâm đan. http://www.benhhoc.com/thuoc/2477-

Thien-su-ho-tam-dan.html, truy cập ngày 15/12/2015.

147. http://chuyengiatimmach.blogspot.com/2013/09/an-sam-tam-that-vi-thuoc-quy-

trong-ieu.html, truy cập ngày 15/12/2015, dẫn theo Lê Phƣợng dịch.

115

PHỤ LỤC 1

Một số hình ảnh Đan sâm trồng ngoài đồng ruộng

Hình 1: Cây giống Đan sâm trong vƣờn ƣơm trƣớc khi đƣa ra ruộng sản xuất

Hình 2: Ruộng thí nghiệm ảnh hƣởng của mật độ trồng Đan sâm

116

Hình 3: Hoa của cây Đan sâm trong thí nghiệm ảnh hƣởng của phân bón

117

PHỤC LỤC 2. THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG MS, B5

MS (mg/l)

B5 (mg/l)

Thành phần

1650

NH4NO3

134

(NH4)2SO4

2500

1900

KNO3

150

440

CaCl2.2H2O

250

370

MgSO4.7H2O

170

KH2PO4

150

NaH2PO4

23,3

MnSO4.4H2O

8,6

ZnSO4.7H2O

6,2

H3BO3

0,75

0,83

0,25

Na2MoO2.2H2O

0,025

CuSO4.5H2O

0,025

CoCl2.6H2O

37,3

Na2EDTA

27,8

FeSO4. 7H2O

Thiamine HCl

0,1

Nicotinic axit

0,5

Pyridoxine HCl

0,5

Glycine

Myo-inositol

100

118

Thành phần

Khối lƣợng g/l

Tryptone

Yeast extract

NaCl

PHỤC LỤC 3. THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG LB

Phân bón

Nguồn gốc

Phân vi sinh

Phân vi sinh Sông Gianh

Đạm

Phân đạm Phú Mỹ

Photpho

Phân lân Phú Mỹ

Kali

Phân kali Phú Mỹ

PHỤC LỤC 4. PHÂN BÓN SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

119

PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ B NG CHƢƠNG TRÌNH IRRISTAT 5.0

Ảnh hƣởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Đan sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE GA3HAT 6/ 9/13 16:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong ga3 den gieo hat VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 55.9989 13.9997 17.49 0.000 2 * RESIDUAL 10 8.00620 .800620 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 64.0051 4.57179 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SL FILE GA3HAT 6/ 9/13 16:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong ga3 den gieo hat VARIATE V004 SL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 6.40243 1.60061 0.62 0.661 2 * RESIDUAL 10 25.8395 2.58395 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 32.2420 2.30300 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GA3HAT 6/ 9/13 16:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong ga3 den gieo hat MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CC SL 1 3 1.94667 5.43067 2 3 4.61333 7.35333 3 3 4.74667 6.20000 4 3 6.91000 6.00000 5 3 7.40000 6.09000 SE(N= 3) 0.51659 0.928072 5%LSD 10DF 1.62782 2.92439 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GA3HAT 6/ 9/13 16:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong ga3 den gieo hat F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CC 15 5.1233 2.1382 0.89477 17.6 0.0002 SL 15 6.0148 1.5176 1.6075 26.1 0.6607

Ảnh hƣởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE BANHAN 6/ 9/13 16:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong BA den nhan nhanh

120

VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 61.2198 15.3050 885.35 0.000 2 * RESIDUAL 10 .172868 .172868E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 61.3927 4.38519 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SL FILE BANHAN 6/ 9/13 16:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong BA den nhan nhanh VARIATE V004 SL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 549.654 137.414 107.00 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.8427 1.28427 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 562.497 40.1784 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SC FILE BANHAN 6/ 9/13 16:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong BA den nhan nhanh VARIATE V005 SC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 21.3608 5.34021 97.59 0.000 2 * RESIDUAL 10 .547204 .547204E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 21.9080 1.56486 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANHAN 6/ 9/13 16:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong BA den nhan nhanh MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CC SC 1 3 3.13267 1.08000 2 3 4.08000 5.05000 3 3 3.67000 4.63000 4 3 3.59000 3.77000 5 3 2.92000 3.53000 SE(N= 3) 0.759096E-01 0.654287 0.135056 5%LSD 10DF 0.239194 2.06168 0.425567 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANHAN 6/ 9/13 16:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 anh huong BA den nhan nhanh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CC 15 3.4785 2.0941 0.13148 2.6 0.0000 SC 15 3.6120 1.2509 0.23392 7.3 0.0000

121

Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE KINHAN 6/ 9/13 17: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua KI den nhan nhanh dan sam VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 .808749 .202187 3.41 0.053 2 * RESIDUAL 10 .593506 .593506E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1.40226 .100161 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SL FILE KINHAN 6/ 9/13 17: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua KI den nhan nhanh dan sam VARIATE V004 SL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 57.5591 14.3898 2.83 0.083 2 * RESIDUAL 10 50.8889 5.08889 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 108.448 7.74629 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SC FILE KINHAN 6/ 9/13 17: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua KI den nhan nhanh dan sam VARIATE V005 SC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 .862177 .215544 1.31 0.331 2 * RESIDUAL 10 1.64711 .164711 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.50929 .179235 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KINHAN 6/ 9/13 17: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong cua KI den nhan nhanh dan sam MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CC SC 1 3 3.13267 1.08000 2 3 3.83333 2.58000 3 3 3.23500 2.58000 4 3 3.41767 2.61667 5 3 3.67500 3.04233 SE(N= 3) 0.140654 0.234315 5%LSD 10DF 0.443206 0.738336 ------------------------------------------------------------------------------- Ảnh hƣởng của BA và NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SC FILE BANAA 3/ 1/14 9:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANH HUONG BA + NAA DEN NHAN NHANH CHOI

122

VARIATE V003 SC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1.78444 .356889 43.41 0.000 3 2 N.LAI 2 .311111E-01 .155556E-01 1.89 0.200 3 * RESIDUAL 10 .822225E-01 .822225E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.89778 .111634 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE BANAA 3/ 1/14 9:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 ANH HUONG BA + NAA DEN NHAN NHANH CHOI VARIATE V004 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 .911028 .182206 47.84 0.000 3 2 N.LAI 2 .564444E-02 .282222E-02 0.74 0.505 3 * RESIDUAL 10 .380889E-01 .380889E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 .954761 .561624E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANAA 3/ 1/14 9:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 ANH HUONG BA + NAA DEN HE SO NHAN CHOI MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SC CC 0 3 5.05000 4.08000 1 3 3.36667 3.58333 2 3 2.93333 2.98667 3 3 3.16667 2.96333 4 3 3.13333 2.97000 5 3 2.36667 3.05333 SE(N= 3) 0.523522E-01 0.356319E-01 5%LSD 10DF 0.164964 0.112277 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANAA 3/ 1/14 9:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 ANH HUONG BA + NAA DEN NHAN NHANH CHOI F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N.LAI | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | SC 18 3.3361 0.33412 0.90677E-01 3.0 0.0000 0.2001 CC 18 3.2727 0.23699 0.61716E-01 5.4 0.0000 0.5046 Ảnh hƣởng của BA và Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KINHAN 6/ 9/13 17: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 anh huong cua BA + KI den nhan nhanh dan sam

123

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CC 15 3.3250 0.31648 0.24362 14.8 0.0527 SC 15 3.1416 0.42336 0.40585 17.7 0.3313

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SC FILE BAKI 3/ 1/14 8: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANH HUONG BA + KI DEN HE SO NHAN CHOI VARIATE V003 SC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1.01167 .202333 28.90 0.000 3 2 N.LAI 2 .333333E-02 .166667E-02 0.24 0.794 3 * RESIDUAL 10 .700001E-01 .700001E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.08500 .638235E-01 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE BAKI 3/ 1/14 8: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 ANH HUONG BA + KI DEN HE SO NHAN CHOI VARIATE V004 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1.34236 .268472 68.86 0.000 3 2 N.LAI 2 .271445E-01 .135722E-01 3.48 0.070 3 * RESIDUAL 10 .389889E-01 .389889E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.40849 .828526E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BAKI 3/ 1/14 8: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 ANH HUONG BA + KI DEN HE SO NHAN CHOI MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SC CC 0 3 5.05000 4.08000 1 3 3.16667 3.56333 2 3 2.73333 3.15000 3 3 2.76667 2.67667 4 3 2.56667 3.11333 5 3 2.56667 3.36667 SE(N= 3) 0.483046E-01 0.360504E-01 5%LSD 10DF 0.152210 0.113596 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT N.LAI ------------------------------------------------------------------------------- N.LAI NOS SC CC 1 6 2.81667 1.24333 2 6 2.80000 1.15333 3 6 2.83333 1.17167 SE(N= 6) 0.341565E-01 0.254915E-01 5%LSD 10DF 0.107628 0.803245E-01

124

------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BAKI 3/ 1/14 8: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 ANH HUONG BA + KI DEN HE SO NHAN CHOI F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N.LAI |

Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SR FILE NAARE 6/ 9/13 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong NAA den ra re VARIATE V003 SR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 .777711 .155542 0.68 0.647 2 * RESIDUAL 12 2.73607 .228006 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 3.51378 .206693 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDR FILE NAARE 6/ 9/13 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong NAA den ra re VARIATE V004 CDR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 14.2127 2.84254 2.77 0.069 2 * RESIDUAL 12 12.3092 1.02576 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 26.5219 1.56011 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAARE 6/ 9/13 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong NAA den ra re MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SR CDR 1 3 2.40000 4.23000 2 3 2.84000 6.15000 3 3 3.36667 7.06000 4 3 3.04333 5.33333 5 3 2.90000 5.21667 6 3 3.46667 3.79533 SE(N= 3) 0.275684 0.584740 5%LSD 12DF 0.849477 1.80178 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAARE 6/ 9/13 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong NAA ra re F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | |

125

SR 18 3.0027 0.45463 0.47750 19.3 0.6471 CDR 18 5.2975 1.2490 1.0128 22.9 0.0686

Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SR FILE IBARE 6/ 9/13 16:36 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua IBA den ra re VARIATE V003 SR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 4.05309 .810619 4.66 0.014 2 * RESIDUAL 12 2.08907 .174089 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 6.14216 .361304 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDR FILE IBARE 6/ 9/13 16:36 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua IBA den ra re VARIATE V004 CDR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 23.2010 4.64021 11.59 0.000 2 * RESIDUAL 12 4.80500 .400417 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 28.0061 1.64741 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBARE 6/ 9/13 16:36 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua IBA den ra re MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SR CDR 1 3 2.40000 4.23000 2 3 3.50000 6.30000 3 3 3.88000 5.26000 4 3 3.65000 7.24000 5 3 3.10000 4.16000 6 3 3.25333 6.30000 SE(N= 3) 0.240893 0.365339 5%LSD 12DF 0.742275 1.12573 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBARE 6/ 9/13 16:36 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong cua IBA den ra re F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SR 18 3.2972 0.60109 0.41724 12.7 0.0137 CDR 18 5.5817 1.2835 0.63278 11.3 0.0003 Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SR FILE IAARE 6/ 9/13 16:35

126

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong IAA den ra re VARIATE V003 SR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 28.9398 5.78796 63.81 0.000 2 * RESIDUAL 12 1.08840 .906999E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 30.0282 1.76636 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDR FILE IAARE 6/ 9/13 16:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong IAA den ra re VARIATE V004 CDR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 80.2418 16.0484 33.23 0.000 2 * RESIDUAL 12 5.79480 .482900 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 86.0366 5.06098 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IAARE 6/ 9/13 16:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong IAA den ra re MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SR CDR 1 3 2.40000 4.23000 2 3 3.71000 8.63000 3 3 3.69000 9.65000 4 3 4.25000 11.0300 5 3 6.19000 9.29000 6 3 5.62000 9.02000 SE(N= 3) 0.173877 0.401207 5%LSD 12DF 0.535775 1.23625 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IAARE 6/ 9/13 16:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong IAA den ra re F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SR 18 4.3100 1.3290 0.30116 7.0 0.0000 CDR 18 8.6417 2.2497 0.69491 8.0 0.0000 Ảnh hƣởng của tuổi cây trên môi trƣờng ra rễ đến sinh trƣởng và phát triển của cây ngoài vƣờn ƣơm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE GIATHE 18/ 9/13 21:39

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TUOICAY 3/ 1/14 11:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANH HUONG TUOI CAY TOI CHAT LUONG CAY RA NGOI VARIATE V003 CC

127

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 5.63927 2.81963 102.78 0.001 3 2 N.LAI 2 .114001E-01 .570003E-02 0.21 0.821 3 * RESIDUAL 4 .109734 .274336E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 5.76040 .720050 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SL FILE TUOICAY 3/ 1/14 11:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 ANH HUONG TUOI CAY TOI CHAT LUONG CAY RA NGOI VARIATE V004 SL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 17.3867 8.69333 56.70 0.002 3 2 N.LAI 2 .320000 .160000 1.04 0.433 3 * RESIDUAL 4 .613333 .153333 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 18.3200 2.29000 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TUOICAY 3/ 1/14 11:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 ANH HUONG TUOI CAY TOI CHAT LUONG CAY RA NGOI MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CC SL 1 3 4.18333 7.06667 2 3 4.32000 9.3333 3 3 5.92667 9.4000 SE(N= 3) 0.956270E-01 0.226078 5%LSD 4DF 0.374837 0.886175 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT N.LAI ------------------------------------------------------------------------------- N.LAI NOS CC SL 1 3 4.76000 8.6667 2 3 4.84000 9.0667 3 3 4.83000 9.0667 SE(N= 3) 0.956270E-01 0.226078 5%LSD 4DF 0.374837 0.886175 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TUOICAY 3/ 1/14 11:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 ANH HUONG TUOI CAY TOI CHAT LUONG CAY RA NGOI F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N.LAI | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CC 9 4.8100 0.84856 0.16563 3.4 0.0011 0.8207 SL 9 10.933 1.5133 0.39158 3.6 0.0023 0.4332

Ảnh hƣởng của giá thể đến sức sống của cây in vitro Đan sâm ngoài nhà lƣới VARIATE V003 CHIEUCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

128

SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3 19.4607 6.48690 6.66 0.015 2

2 N.LAI 2 .114001E-01 .570003E-02 0.21 0.821 3

* RESIDUAL 8 7.78827 .973534 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 27.2490 2.47718 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE GIATHE 18/ 9/13 21:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua gia the den suc song cay in vitro dan sam VARIATE V004 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 3 109.690 36.5633 8.48 0.008 2

2 N.LAI 2 .114001E-01 .570003E-02 0.21 0.821 3

* RESIDUAL 8 34.4800 4.31000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 144.170 13.1064 ---------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GIATHE 18/ 9/13 21:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua gia the den suc song cay in vitro dan sam MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO SOLA 1 3 3.41667 3.40000 2 3 3.34333 9.26667 3 3 4.30667 9.06667 4 3 3.32667 2.86667 SE(N= 3) 0.569659 1.19861 5%LSD 8DF 1.85760 3.90855 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GIATHE 18/ 9/13 21:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong cua gia the den suc song cay in vitro dan sam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 12 2.5983 1.5739 0.98668 38.0 0.0148 SOLA 12 6.1500 3.6203 2.0761 33.8 0.0076

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE A514 9/ 6/14 21:47

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua nen moi truong toi su tang sinh khoi re to dong a5.14 VARIATE V003 KLT Khoi luong tuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 1.79307 1.79307 255.54 0.000 2 * RESIDUAL 4 .280667E-01 .701667E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 1.82113 .364227 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLK FILE A514 9/ 6/14 21:47

129

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Anh huong cua nen moi truong toi su tang sinh khoi re to dong a5.14 VARIATE V004 KLK Khoi luong kho LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 .881666E-02 .881666E-02 37.79 0.005 2 * RESIDUAL 4 .933334E-03 .233333E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 .975000E-02 .195000E-02 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE A514 9/ 6/14 21:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Anh huong cua nen moi truong toi su tang sinh khoi re to dong a5.14 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS KLT KLK MS 3 3.25000 0.296667 B5 3 4.34333 0.373333 SE(N= 3) 0.483621E-01 0.881917E-02 5%LSD 4DF 0.189569 0.345693E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE A514 9/ 6/14 21:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Anh huong cua nen moi truong toi su tang sinh khoi re to dong a5.14 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLT 6 3.7967 0.60351 0.83766E-01 2.2 0.0004 KLK 6 0.33500 0.44159E-010.15275E-01 4.6 0.0047 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE A416 9/ 6/14 21:55 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua nen moi trong toi su tang sinh khoi re to dong a416 VARIATE V003 KLT Khoi luong tuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 3.40507 3.40507 198.93 0.001 2 * RESIDUAL 4 .684674E-01 .171168E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 3.47353 .694707 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLK FILE A416 9/ 6/14 21:55 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE ST 9/ 6/14 22:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua dieu kien chieu sang toi su tang sinh khoi re to dong a 514 VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 10.4517 2.61293 25.45 0.000 2 * RESIDUAL 10 1.02667 .102667 -----------------------------------------------------------------------------

130

* TOTAL (CORRECTED) 14 11.4784 .819884 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLK FILE ST 9/ 6/14 22:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua dieu kien chieu sang toi su tang sinh khoi re to dong a 514 VARIATE V004 KLK LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 .343600E-01 .859000E-02 31.43 0.000 2 * RESIDUAL 10 .273334E-02 .273334E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .370933E-01 .264952E-02 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ST 9/ 6/14 22:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua dieu kien chieu sang toi su tang sinh khoi re to dong a 514 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS KLT KLK CT1 3 8.61333 0.573333 CT2 3 10.66667 0.643333 CT3 3 7.54667 0.530000 CT4 3 9.61667 0.660000 CT5 3 8.61000 0.580000 SE(N= 3) 0.184992 0.954522E-02 5%LSD 10DF 0.582918 0.300773E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ST 9/ 6/14 22:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong cua dieu kien chieu sang toi su tang sinh khoi re to dong a 514 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLT 15 9.01067 0.90547 0.32042 3.6 0.0001 KLK 15 0.59733 0.51474E-010.16533E-01 2.8 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE TUAN 9/ 6/14 22:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua thoi diem dung nuoi cay toi su tang sinh khoi re to VARIATE V003 KLT Khoi luong tuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 145.976 36.4939 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .638738E-01 .638738E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 146.039 10.4314 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLK FILE TUAN 9/ 6/14 22:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Anh huong cua thoi diem dung nuoi cay toi su tang sinh khoi re to VARIATE V004 KLK Khoi luong kho LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN =============================================================================

131

1 CT$ 4 .540867 .135217 654.26 0.000 2 * RESIDUAL 10 .206671E-02 .206671E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .542933 .387810E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TUAN 9/ 6/14 22:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Anh huong cua thoi diem dung nuoi cay toi su tang sinh khoi re to MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS KLT KLK CT1 3 1.69333 0.106667 CT2 3 3.73333 0.326667 CT3 3 7.37667 0.490000 CT4 3 10.05000 0.616667 CT5 3 8.93333 0.593333 SE(N= 3) 0.461425E-01 0.830002E-02 5%LSD 10DF 0.145397 0.261537E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TUAN 9/ 6/14 22:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Anh huong cua thoi diem dung nuoi cay toi su tang sinh khoi re to F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLT 15 6.35733 3.2298 0.79921E-01 1.3 0.0000 KLK 15 0.42667 0.19693 0.14376E-01 3.4 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE BINHA514 10/ 6/14 8:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua dang binh nuoi cay toi su tang sinh khoi dong re to a514 VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 20.1047 6.70156 168.59 0.000 2 * RESIDUAL 8 .318000 .397500E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 20.4227 1.85661 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLK FILE BINHA514 10/ 6/14 8:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Anh huong cua dang binh nuoi cay toi su tang sinh khoi dong re to a514 VARIATE V004 KLK LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 .588250E-01 .196083E-01 19.45 0.001 2 * RESIDUAL 8 .806666E-02 .100833E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 .668917E-01 .608106E-02 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BINHA514 10/ 6/14 8:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Anh huong cua dang binh nuoi cay toi su tang sinh khoi dong re to a514 MEANS FOR EFFECT CT$ -------------------------------------------------------------------------------

132

CT$ NOS KLT KLK CT1 3 11.9733 0.703333 CT2 3 13.1167 0.836667 CT3 3 8.25000 0.546667 CT4 3 12.9467 0.756667 SE(N= 3) 0.115109 0.183333E-01 5%LSD 8DF 0.375358 0.597831E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BINHA514 10/ 6/14 8:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Anh huong cua dang binh nuoi cay toi su tang sinh khoi dong re to a514 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLT 12 13.129 1.3626 0.19937 1.5 0.0000 KLK 12 0.73583 0.77981E-010.31754E-01 4.3 0.0006 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thoi vu, RCB VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.74778 .873889 0.30 0.752 3 2 TV$ 5 236.856 47.3712 16.10 0.000 3 * RESIDUAL 10 29.4189 2.94189 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 268.023 15.7660 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHANH FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thoi vu, RCB VARIATE V004 NHANH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.19444 .597222 1.36 0.302 3 2 TV$ 5 20.2778 4.05556 9.21 0.002 3 * RESIDUAL 10 4.40556 .440556 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 25.8778 1.52222 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKTAN FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thoi vu, RCB VARIATE V005 DKTAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 8.11111 4.05556 1.65 0.240 3 2 TV$ 5 187.491 37.4982 15.27 0.000 3 * RESIDUAL 10 24.5556 2.45556 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 220.158 12.9505 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CU FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thoi vu, RCB VARIATE V006 SO CU CU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN =============================================================================

133

1 R 2 4.95445 2.47722 5.65 0.023 3 2 TV$ 5 48.4761 9.69522 22.11 0.000 3 * RESIDUAL 10 4.38555 .438555 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 57.8161 3.40095 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CD CU FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thoi vu, RCB VARIATE V007 CD CU CU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.24111 .620555 0.79 0.483 3 2 TV$ 5 184.636 36.9272 47.07 0.000 3 * RESIDUAL 10 7.84556 .784556 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 193.723 11.3955 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DK CU FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Thoi vu, RCB VARIATE V008 DK CU CU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .130833 .654167E-01 7.48 0.010 3 2 TV$ 5 1.61292 .322583 36.87 0.000 3 * RESIDUAL 10 .874999E-01 .874999E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.83125 .107721 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Thoi vu, RCB VARIATE V009 KLCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 105.333 52.6667 0.57 0.588 3 2 TV$ 5 28840.5 5768.10 62.25 0.000 3 * RESIDUAL 10 926.666 92.6666 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 29872.5 1757.21 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Thoi vu, RCB VARIATE V010 NS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .398778E-01 .199389E-01 1.12 0.364 3 2 TV$ 5 4.29184 .858369 48.35 0.000 3 * RESIDUAL 10 .177522 .177522E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 4.50924 .265250 -----------------------------------------------------------------------------

134

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9 Thoi vu, RCB MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS CC NHANH DKTAN SO CU 1 6 31.2667 6.75000 52.8000 9.38333 2 6 30.5333 6.25000 51.4667 8.33333 3 6 30.7167 6.16667 52.9667 9.50000 SE(N= 6) 0.700225 0.270972 0.639734 0.270356 5%LSD 10DF 2.20643 0.853843 2.01582 0.851903 R NOS CD CU DK CU KLCU NS 1 6 23.3833 2.18333 245.833 2.70500 2 6 23.5333 2.06667 240.167 2.66667 3 6 24.0000 2.27500 241.500 2.59167 SE(N= 6) 0.361607 0.381881E-01 3.92994 0.543940E-01 5%LSD 10DF 1.13944 0.120332 12.3834 0.171397 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT TV$ ------------------------------------------------------------------------------- TV$ NOS CC NHANH DKTAN SO CU TV1 3 32.8667 5.96667 54.2000 8.10000 TV2 3 32.5333 6.90000 54.3000 9.90000 TV3 3 36.4667 8.30000 56.9667 12.2333 TV4 3 30.2667 6.53333 51.8667 8.93333 TV5 3 27.3000 5.73333 50.1667 8.06667 TV6 3 25.6000 4.90000 46.9667 7.20000 SE(N= 3) 0.990267 0.383213 0.904720 0.382342 5%LSD 10DF 3.12037 1.20752 2.85081 1.20477 TV$ NOS CD CU DK CU KLCU NS TV1 3 23.0000 2.06667 254.000 2.76333 TV2 3 25.8000 2.36667 275.000 3.11333 TV3 3 29.1667 2.73333 300.000 3.35333 TV4 3 23.5667 2.06667 234.000 2.52333 TV5 3 21.0333 2.01667 215.000 2.25667 TV6 3 19.2667 1.80000 177.000 1.91667 SE(N= 3) 0.511389 0.540061E-01 5.55778 0.769247E-01 5%LSD 10DF 1.61141 0.170175 17.5128 0.242392 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TVDS1 21/7/15 15:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 10 Thoi vu, RCB F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |R |TV$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CC 18 30.839 3.9706 1.7152 5.6 0.7522 0.0002 NHANH 18 6.3889 1.2338 0.66374 10.4 0.3017 0.0019 DKTAN 18 52.411 3.5987 1.5670 3.0 0.2395 0.0003 SO CU 18 9.0722 1.8442 0.66224 7.3 0.0227 0.0001 CD CU 18 23.639 3.3757 0.88575 3.7 0.4830 0.0000 DK CU 18 2.1750 0.32821 0.93541E-01 4.3 0.0104 0.0000 KLCU 18 242.50 41.919 9.6264 4.0 0.5879 0.0000 NS 18 2.6544 0.51502 0.13324 5.0 0.3644 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Mat do, RCB VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .700002 .350001 0.16 0.855 3 2 MD$ 4 94.4467 23.6117 10.80 0.003 3 * RESIDUAL 8 17.4933 2.18667

135

----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 112.640 8.04571 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHANH FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Mat do, RCB VARIATE V004 NHANH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .795999 .398000 1.10 0.379 3 2 MD$ 4 15.2200 3.80500 10.55 0.003 3 * RESIDUAL 8 2.88400 .360500 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 18.9000 1.35000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKTAN FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Mat do, RCB VARIATE V005 DKTAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 7.60000 3.80000 0.84 0.471 3 2 MD$ 4 437.644 109.411 24.05 0.000 3 * RESIDUAL 8 36.4000 4.55000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 481.644 34.4031 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCU FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Mat do, RCB VARIATE V006 SOCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 5.86133 2.93067 9.56 0.008 3 2 MD$ 4 30.8760 7.71900 25.18 0.000 3 * RESIDUAL 8 2.45200 .306500 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 39.1893 2.79924 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDCU FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Mat do, RCB VARIATE V007 CDCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 5.64934 2.82467 1.56 0.268 3 2 MD$ 4 290.349 72.5873 40.07 0.000 3 * RESIDUAL 8 14.4906 1.81133 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 310.489 22.1778 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKCU FILE MDDS1 21/1/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Mat do, RCB VARIATE V008 DKCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .363333E-01 .181667E-01 1.85 0.218 3 2 MD$ 4 1.32333 .330833 33.64 0.000 3 * RESIDUAL 8 .786666E-01 .983332E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1.43833 .102738 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Mat do, RCB VARIATE V009 KLCU

136

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 693.333 346.667 1.69 0.244 3 2 MD$ 4 22482.0 5620.50 27.42 0.000 3 * RESIDUAL 8 1640.00 205.000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 24815.3 1772.52 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Mat do, RCB VARIATE V010 NS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .131880 .659400E-01 9.33 0.008 3 2 MD$ 4 .330360 .825900E-01 11.69 0.002 3 * RESIDUAL 8 .565201E-01 .706501E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .518760 .370543E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9 Mat do, RCB MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS CC NHANH DKTAN SOCU 1 5 35.1000 7.14000 60.3800 11.2200 2 5 35.0000 7.36000 58.7800 10.3000 3 5 34.6000 7.70000 60.1800 9.70000 SE(N= 5) 0.661312 0.268514 0.953939 0.247588 5%LSD 8DF 2.15647 0.875598 3.11070 0.807360 R NOS CDCU DKCU KLCU NS 1 5 27.8200 2.44000 301.000 2.73000 2 5 26.3600 2.32000 289.000 2.67000 3 5 27.4000 2.39000 305.000 2.89200 SE(N= 5) 0.601886 0.443471E-01 6.40313 0.375899E-01 5%LSD 8DF 1.96269 0.144611 20.8799 0.122577 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT MD$ ------------------------------------------------------------------------------- MD$ NOS CC NHANH DKTAN SOCU MD1 3 38.2333 5.63333 52.1667 8.16667 MD2 3 37.1000 7.10000 55.8667 9.36667 MD3 3 34.8000 7.60000 59.3000 10.9333 MD4 3 32.8000 8.53333 65.4000 12.0333 MD5 3 31.5667 8.13333 66.1667 11.5333 SE(N= 3) 0.853750 0.346651 1.23153 0.319635 5%LSD 8DF 2.78399 1.13039 4.01590 1.04230 MD$ NOS CDCU DKCU KLCU NS MD1 3 20.5333 1.91667 231.667 2.65667 MD2 3 24.2000 2.16667 279.333 2.90000 MD3 3 27.5667 2.50000 315.667 3.00000 MD4 3 32.2000 2.70000 327.333 2.71667 MD5 3 31.4667 2.63333 337.667 2.58667 SE(N= 3) 0.777031 0.572518E-01 8.26640 0.485284E-01 5%LSD 8DF 2.53382 0.186692 26.9559 0.158246 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDDS1 21/7/15 15:37 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 10 Mat do, RCB F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |R |MD$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | |

137

OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CC 15 34.900 2.8365 1.4787 4.2 0.8549 0.0029 NHANH 15 7.4000 1.1619 0.60042 8.1 0.3787 0.0032 DKTAN 15 59.780 5.8654 2.1331 3.6 0.4711 0.0003 SOCU 15 10.407 1.6731 0.55362 5.3 0.0078 0.0002 CDCU 15 27.193 4.7093 1.3459 4.9 0.2679 0.0001 DKCU 15 2.3833 0.32053 0.99163E-01 4.2 0.2184 0.0001 KLCU 15 298.33 42.101 14.318 4.8 0.2437 0.0002 NS 15 2.7640 0.19249 0.84054E-01 5.0 0.0084 0.0023 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE PBDS1 21/1/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Phan bon, RCB VARIATE V003 CC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.14533 .572666 0.40 0.687 3 2 PB$ 4 134.751 33.6877 23.51 0.000 3 * RESIDUAL 8 11.4613 1.43267 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 147.357 10.5255 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHANH FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Phan bon, RCB VARIATE V004 NHANH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.36933 .684666 5.64 0.030 3 2 PB$ 4 26.9933 6.74833 55.62 0.000 3 * RESIDUAL 8 .970664 .121333 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 29.3333 2.09524 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKTAN FILE PBDS1 21/1/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Phan bon, RCB VARIATE V005 DKTAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 11.3213 5.66066 3.44 0.083 3 2 PB$ 4 222.731 55.6827 33.84 0.000 3 * RESIDUAL 8 13.1653 1.64567 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 247.217 17.6584 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CU FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Phan bon, RCB VARIATE V006 SO CU CU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .400000 .200000 0.47 0.643 3 2 PB$ 4 35.8867 8.97167 21.28 0.000 3 * RESIDUAL 8 3.37334 .421667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 39.6600 2.83286 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDCU FILE PBDS1 21/1/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Phan bon, RCB VARIATE V007 CDCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 1.43333 .716666 0.90 0.446 3 2 PB$ 4 84.9800 21.2450 26.72 0.000 3 * RESIDUAL 8 6.35998 .794998 -----------------------------------------------------------------------------

138

* TOTAL (CORRECTED) 14 92.7733 6.62667 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DKCU FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Phan bon, RCB VARIATE V008 DKCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .533332E-02 .266666E-02 0.20 0.825 3 2 PB$ 4 .716000 .179000 13.26 0.002 3 * RESIDUAL 8 .108000 .135000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .829333 .592381E-01 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Phan bon, RCB VARIATE V009 KLCU LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 574.533 287.267 3.51 0.080 3 2 PB$ 4 17529.7 4382.43 53.49 0.000 3 * RESIDUAL 8 655.467 81.9334 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 18759.7 1339.98 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Phan bon, RCB VARIATE V010 NS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 R 2 .356133E-01 .178067E-01 2.19 0.174 3 2 PB$ 4 2.68140 .670350 82.35 0.000 3 * RESIDUAL 8 .651198E-01 .813998E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.78213 .198724 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PBDS1 21/1/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9 Phan bon, RCB MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS CC NHANH DKTAN SO CU 1 5 31.9000 6.26000 50.4000 9.40000 2 5 31.2400 5.64000 48.2800 9.00000 3 5 31.7000 6.30000 49.1800 9.20000 SE(N= 5) 0.535288 0.155777 0.573702 0.290402 5%LSD 8DF 1.74552 0.507974 1.87078 0.946972 R NOS CDCU DKCU KLCU NS 1 5 22.7000 2.06000 240.000 2.64200 2 5 22.0000 2.06000 225.000 2.53400 3 5 22.6000 2.10000 230.600 2.54400 SE(N= 5) 0.398748 0.519615E-01 4.04805 0.403484E-01 5%LSD 8DF 1.30028 0.169441 13.2003 0.131572 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT PB$ ------------------------------------------------------------------------------- PB$ NOS CC NHANH DKTAN SO CU PB1 3 27.1333 3.80000 42.6333 6.76667 PB2 3 29.3000 5.53333 47.6000 8.40000 PB3 3 33.0333 6.63333 50.6000 9.60000 PB4 3 33.0667 7.80000 53.4000 11.4000 PB5 3 35.5333 6.56667 52.2000 9.83333 SE(N= 3) 0.691054 0.201108 0.740646 0.374908 5%LSD 8DF 2.25346 0.655792 2.41517 1.22254

139

PB$ NOS CDCU DKCU KLCU NS PB1 3 18.6000 1.70000 180.333 1.91333 PB2 3 21.0000 2.00000 212.000 2.30000 PB3 3 23.5000 2.23333 242.333 2.75000 PB4 3 25.4333 2.33333 282.667 3.13333 PB5 3 23.6333 2.10000 242.000 2.77000 SE(N= 3) 0.514781 0.670820E-01 5.22600 0.520896E-01 5%LSD 8DF 1.67865 0.218748 17.0415 0.169859 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PBDS1 21/7/15 15:53 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 10 Phan bon, RCB F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |R |PB$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CC 15 31.613 3.2443 1.1969 3.8 0.6867 0.0003 NHANH 15 6.0667 1.4475 0.34833 5.7 0.0296 0.0000 DKTAN 15 49.287 4.2022 1.2828 4.6 0.0829 0.0001 SO CU 15 9.2000 1.6831 0.64936 7.1 0.6426 0.0004 CDCU 15 22.433 2.5742 0.89163 4.0 0.4460 0.0002 DKCU 15 2.0733 0.24339 0.11619 5.6 0.8255 0.0016 KLCU 15 231.87 36.606 9.0517 3.9 0.0800 0.0000 NS 15 2.5733 0.44578 0.90222E-01 3.5 0.1738 0.0000

140