Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

253
lượt xem 51
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã được Trần Thanh Vân đề xuất và trở thành một trong những phương pháp nhân nhanh in vitro có hiệu quả. TRong vài năm trở lại đây, phương pháp này đượcnghiên cứu ựng dụng tại một số phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam và đã đem lại kết quả đáng kể trong quá trình nhân nhanh một số đối tượng như : phong lan , dứa. Nhằm cải tiến và hoàn thiện quy trình nhân giống invitro cho cây địa lan bài viết trình bày kết quả của nghiên cứu...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị

nghiªn cøu øng dông ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy l¸t máng tÕ bµo trong nh©n nhanh in vitro cho mét sè gièng ®Þa lan cã gi¸ trÞ Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation of some valuable cymbidium varieties NguyÔn Quang Th¹ch, Hoµng ThÞ Nga, NguyÔn ThÞ Lý Anh, Vò ThÞ Hoµi Summary The thin cell layer method was suggeted by Tran Thanh Van K. We use this method to complete micropropagation of Cymbidium. Experiments were carried out on varieties Miss Kim, Xanh Chieu and Hong Bet originated from China and Viet Nam. The tissue culture was done in artificial conditions (adjustable light, temperature, humidity). There ware 15-50 explants in each variant of experiments. In optimal medium: MS + 150ml coconut water + 1mg kinetin + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Miss Kim) and MS + 150ml coconut water + 1mg BA + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Xanh chieu), the thin layers with size 0,3 – 0,5 mm gave best rate of protocorm formation. Number of protocorms per thin cell layer ware 6,23 (Miss Kim) and 4,21 (Xanh Chieu). Above results show that, the thin cell layer culture is successful method for rapid multiplication of Cymbidium. Key words: Cymbidium, thin cell layer, protocorm 1. §Æt vÊn ®Ò Ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy l¸t máng tÕ bµo ®· ®−îc TrÇn Thanh V©n ®Ò xuÊt (2000) vµ trë thµnh mét trong nh÷ng ph−¬ng ph¸p nh©n nhanh in vitro cã hiÖu qu¶. Trong vµi n¨m trë l¹i ®©y, ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc nghiªn cøu øng dông t¹i mét sè phßng nu«i cÊy m« ë ViÖt Nam vµ ®· ®em l¹i kÕt qu¶ ®¸ng kÓ trong qu¸ tr×nh nh©n nhanh mét sè ®èi t−îng nh−: phong lan (NguyÔn Quang Th¹ch, Hoµng ThÞ Nga, 2000), døa (NguyÔn Quang Th¹ch vµ CS, 2004) vµ c¸c c©y trång kh¸c (D−¬ng TÊn NhËt, 2001). Nh»m c¶i tiÕn vµ hoµn thiÖn quy tr×nh nh©n gièng in vitro cho c©y ®Þa lan, chóng t«i ®· tiÕn hµnh “Nghiªn cøu øng dông ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy l¸t máng tÕ bµo trong nh©n nhanh in vitro cho mét sè gièng ®Þa lan cã gi¸ trÞ.” . 2. vËt liÖu, ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. VËt liÖu nghiªn cøu C¸c gièng ®Þa lan dïng trong nghiªn cøu lµ: “ Miss Kim” (nguån gèc tõ Trung Quèc), Xanh chiÓu, Hång BÖt (2 gièng ®−îc −a chuéng vµ phæ biÕn ë §µ L¹t) . 2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu + §iÒu kiÖn nu«i cÊy: c¸c thÝ nghiÖm nu«i cÊy in vitro ®−îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn nh©n t¹o cho phÐp chñ ®éng ®iÒu chØnh c¸c chÕ ®é ¸nh s¸ng, nhiÖt ®é, Èm ®é. + C¸c thÝ nghiÖm ®−îc bè trÝ ngÉu nhiªn, 3 lÇn lÆp l¹i, mçi c«ng thøc theo dâi 15 - 50 c¸ thÓ. + ThÝ nghiÖm ®−îc quan s¸t, theo dâi th−êng xuyªn 10 - 15 ngµy/lÇn + Sè liÖu ®−îc xö lý thèng kª theo ch−¬ng tr×nh IRRISTAT. 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña kÝch th−íc l¸t c¾t máng ®Õn sù h×nh thµnh protocorm
Víi môc ®Ých ®Ó t¨ng nhanh sè l−îng protocorm, chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¸c nghiªn cøu nu«i cÊy l¸t máng c¾t tõ thÓ protocorm ban ®Çu víi ®é dµy tõ 0,1mm – 1mm trªn m«i tr−êng MS +1% saccarose + 1ppm kinetin (K) + 0,65% agar. §©y lµ m«i tr−êng phï hîp cho nh©n nhanh c¸c thÓ protocorm nguyªn vÑn ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®−îc trong c¸c nghiªn cøu tr−íc (NguyÔn Quang Th¹ch vµ cs, 2000; 2004). KÕt qu¶ thÝ nghiÖm tr×nh bµy trong b¶ng 1. B¶ng 1. ¶nh h−ëng cña kÝch th−íc l¸t máng ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm (sau 8 tuÇn ) Gièng ®Þa lan KÝch th−íc Tû lÖ sèng (%) Protocorm/l¸t l¸t c¾t (mm) c¾t Xanh chiÓu 0,1 16,60 2,00 0,3 63,65 3,00 0,5 75,41 2,83 0,7 87,45 2,50 1,0 92,18 2,30 Hång bÖt 0,1 33,67 2,25 0,3 57,61 3,33 0,5 69,56 3,00 0,7 81,64 2,57 1,0 94,28 2,37 Nh− vËy, kÝch th−íc cña l¸t c¾t cã ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn tû lÖ sèng vµ sù h×nh thµnh protocorm. NÕu ®é dµy cña l¸t c¾t t¨ng th× tû lÖ sèng t¨ng nh−ng tû lÖ t¹o protocorm l¹i gi¶m vµ ng−îc l¹i. ë kÝch th−íc tõ 0,3 - 0,5mm kÕt qu¶ ®¹t ®−îc lµ cao nhÊt víi tû lÖ sèng lµ 63,65 - 75,41% vµ sè protocorm/l¸t c¾t lµ 3,00 – 2,83 protocorm cho gièng Xanh chiÓu, cßn ®èi víi gièng Hång bÖt c¸c chØ tiªu t−¬ng tù lµ: 57,61- 69,56% vµ 3,33 - 3,00 protocorm. Nh− vËy, c¸c l¸t c¾t víi ®é dµy 0,3 - 0,5 mm lµ phï hîp cho viÖc nu«i cÊy ®Ó t¹o protocorm. 3.2. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña ph−¬ng thøc nu«i cÊy ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm Trong thÝ nghiÖm nµy, chóng t«i sö dông m«i tr−êng nu«i cÊy: MS +1% ®−êng + 1ppmK + 0,65% agar/ 1lÝt m«i tr−êng. C¸c l¸t máng tÕ bµo ®· ®−îc nu«i cÊy tÜnh trªn m«i tr−êng ®Æc, m«i tr−êng láng vµ nu«i cÊy l¾c trong m«i tr−êng láng. B¶ng 2. ¶nh h−ëng cña ph−¬ng thøc nu«i cÊy ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm (sau 8 tuÇn ) Ph−¬ng thøc KÝch th−íc Xanh chiÓu Hång bÖt nu«i cÊy l¸t c¾t Tû lÖ sèng (%) Protocorm /l¸t Tû lÖ sèng (%) Protocorm /l¸t (mm) c¾t c¾t §Æc 0,3 63,65 3,00 57,61 3,33 0,5 75,41 2,83 69,56 3,00 Láng + kh«ng 0,3 37,21 2,67 37,43 2,88 l¾c 0,5 42,16 2,50 47,28 2,50 Láng + l¾c 0,3 43,54 4,67 49,24 4,00 0,5 59,82 3,30 57,37 3,25 Sè liÖu thùc nghiÖm ë b¶ng 2 cho thÊy: kh«ng chØ ®é dµy cña líp c¾t mµ ph−¬ng thøc nu«i cÊy còng lµ nh©n tè t¸c ®éng m¹nh mÏ ®Õn tû lÖ sèng vµ kh¶ n¨ng t¹o protocorm cña l¸t c¾t nu«i cÊy. Trong c¶ ba ph−¬ng thøc nu«i cÊy, l¸t c¾t cã ®é dµy 0,3mm ®Òu cã tû lÖ sèng thÊp h¬n nh−ng sè protocorm t¹o thµnh /l¸t c¾t nhiÒu h¬n so víi l¸t c¾t dµy 0,5mm. Ph−¬ng thøc nu«i cÊy tÜnh trong m«i tr−êng láng cã hiÖu qu¶ kÐm nhÊt do tû lÖ mÉu chÕt cao vµ sè protocorm/l¸t c¾t thÊp nhÊt. Ph−¬ng thøc nu«i cÊy l¾c trong m«i tr−êng láng tuy cã sè protocorm/l¸t c¾t cao nhÊt nh−ng tû lÖ sèng cña l¸t c¾t kh«ng cao nªn tæng sè protocorm t¹o ®−îc vÉn Ýt h¬n so víi ph−¬ng thøc nu«i cÊy tÜnh trªn m«i tr−êng ®Æc. V× vËy, víi c¸c l¸t
máng tÕ bµo ph−¬ng thøc nu«i cÊy tÜnh trªn m«i tr−êng ®Æc lµ hiÖu qu¶ h¬n c¶. Quy luËt nµy thÓ hiÖn trªn c¶ hai gièng nghiªn cøu (Xanh chiÓu vµ Hång bÖt). 3.3. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm Khi ®· x¸c ®Þnh ®−îc ®é dµy l¸t c¾t vµ ph−¬ng thøc nu«i cÊy phï hîp, chóng t«i còng ®· bæ sung c¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng kh¸c nhau ë tr¹ng th¸i riªng rÏ còng nh− d¹ng tæ hîp vµo m«i tr−êng nu«i cÊy nh»m t×m ra tæ hîp vµ nång ®é thÝch hîp nhÊt võa ®¶m b¶o kÝch thÝch l¸t máng h×nh thµnh nhiÒu thÓ protocorm võa ®¶m b¶o ®−îc chÊt l−îng cña nguån mÉu. Nh−ng kÕt qu¶ kh¶ quan nhÊt chØ ®¹t ®−îc khi sö dông riªng rÏ c¸c xytokinin. §iÒu nµy ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 3 vµ 4. B¶ng 3. ¶nh h−ëng cña Benzyl adenin (BA) ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm (sau 8 tuÇn) Gièng C«ng thøc Tû lÖ mÉu Tû lÖ mÉu protocorm Sè protocorm / 1 protocorm ban ®Þa lan thÝ nghiÖm t¹o t¹o chåi /l¸t máng ®Çu protocorm (%) Sè protocorm % so víi ®èi (%) chøng Miss I (§/C) 57,44 42,54 2,85 11,12 100 Kim I + 0,3mg BA 70,86 29,14 4,50 20,25 182,1 I + 0,5mg BA 81,42 18,58 5,70 27,01 242,9 I + 1mg BA 76,67 23,33 4,00 17,95 161,4 I + 1,5mg BA 85,00 25,00 3,50 15,77 141,8 I + 2mg BA 86,19 13,81 3,40 13,36 120,1 LSD (5%) 0,18 Xanh I (§/C) 90,40 9,60 2,90 10,25 100 chiÓu I + 0,3mg BA 89,30 10,70 3,25 12,23 119,3 I + 0,5mg BA 100 0 3,88 15,01 146,4 I + 1mg BA 100 0 4,21 19,05 185,9 I + 1,5mg BA 90,90 9,10 3,88 18,52 180,7 I + 2mg BA 100 0 3,51 15,90 155,1 LSD (5%) 0,10 Ghi chó: I (§C): MS + 15% n−íc dõa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1 lÝt m«i tr−êng Tõ c¸c kÕt qu¶ b¶ng 3 vµ 4 cho thÊy viÖc bæ sung chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng vµo m«i tr−êng nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña l¸t máng rÊt râ rÖt. §èi víi gièng “Miss Kim”, trªn c¸c m«i tr−êng cã bæ sung BA tæng sè protocorm t¹o ®−îc/1 protocorm ban ®Çu cao h¬n ®èi chøng tõ 20,1- 142,9% vµ khi bæ sung kinetin chØ tiªu nµy lµ 41,6-144,5 %. ë m«i tr−êng cã nång ®é BA b»ng 0,5ppm hay kinetin b»ng 1ppm cã thÓ thu ®−îc 27 hay 30 thÓ protocorm tõ mét protocorm ban ®Çu sau 8 tuÇn nu«i cÊy. Trªn gièng Xanh chiÓu quy luËt còng diÔn ra t−¬ng tù. Nh−ng víi gièng nµy nång ®é thÝch hîp cña BA vµ kinetin ®Òu lµ 1mg/l. Trªn c¸c m«i tr−êng cã bæ sung BA vµ kinetin ë nång ®é 1mg/l, sau 8 tuÇn nu«i cÊy cã thÓ thu ®−îc 16-19 protocorm tõ 1 protocorm ban ®Çu. V× vËy sau khi t¹o ®−îc nguån vËt liÖu khëi ®Çu (protocorm) tõ ®Ønh chåi hay c¸c m¾t ngñ cña chåi bªn, ®Ó t¨ng nhanh nguån mÉu cho qu¸ tr×nh nh©n tiÕp theo th× viÖc sö dông nu«i cÊy l¸t máng tÕ bµo lµ ph−¬ng ph¸p tèi −u nhÊt.
B¶ng 4. ¶nh h−ëng cña kinetin ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm (sau 8 tuÇn) Gièng C«ng thøc thÝ Tû lÖ mÉu Tû lÖ protocorm Sè protocorm / 1 ®Þa lan nghiÖm t¹o mÉu t¹o /l¸t máng protocorm ban ®Çu protocorm chåi (%) Sè % so víi (%) protocorm ®èi chøng Miss I (§/C): 60,50 39,50 2,60 12,17 100 Kim I + 0,3mg K 67,27 32,73 4,07 19,47 160,0 I + 0,5mg K 78,26 21,74 4,60 20,65 169,7 I + 1mg K 80,98 19,02 6,23 29,76 244,5 I + 1,5mg K 86,19 13,81 4,25 17,25 141,7 I + 2mg K 83,35 16,65 4,09 17,24 141,6 LSD (5%) 0,07 Xanh I (§/C): 94,43 5,57 2,71 9,58 100 chiÓu I + 0,3mg K 89,27 10,73 3,08 11,85 123,7 I + 0,5mg K 91,18 8,82 3,12 14,11 147,3 I + 1mg K 92,76 7,24 3,70 15,95 166,5 I + 1,5mg K 82,31 17,69 3,18 12,52 130,7 I + 2mg K 90,90 9,10 3,14 11,93 124,5 LSD (5%) 0,06 Ghi chó: I(§C): MS + 15% n−íc dõa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1lÝt m«i tr−êng 4. KÕt luËn C¸c l¸t c¾t protocorm cã chiÒu dµy 0,3- 05mm lµ thÝch hîp cho nu«i cÊy líp máng ®Ó nh©n nhanh protocorm. Ph−¬ng thøc nu«i cÊy phï hîp nhÊt ®Ó nu«i cÊy l¸t máng protocorm lµ nu«i cÊy tÜnh trªn m«i tr−êng ®Æc. M«i tr−êng nu«i cÊy cho hÖ sè nh©n vµ sè protocorm t¹o thµnh cao nhÊt: + §èi víi gièng “Miss Kim” lµ: MS+ 150mlND + 1mgKinetin + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lÝt. Trªn m«i tr−êng nµy sè protocorm/l¸t c¾t ®¹t: 6,23 vµ tæng sè protocorm/1 protocorm ban ®Çu ®¹t: 29,76. + §èi víi gièng Xanh chiÓu lµ: MS+ 150mlND + 1mg BA + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lÝt. Trªn m«i tr−êng nµy sè protocorm/l¸t c¾t ®¹t: 4,21 vµ tæng sè protocorm/1 protocorm ban ®Çu ®¹t: 19,05. Tµi liÖu tham kh¶o NguyÔn Quang Th¹ch, Hoµng ThÞ Nga, 2000. “Nghiªn cøu øng dông nu«i cÊy l¸t máng trong nh©n nhanh c¸c gièng Vanda, Cattleya vµ Phaleanopsis”. T¹p chÝ N«ng nghiÖp, C«ng nghiÖp thùc phÈm, sè 12/2000, trang 546 – 548. NguyÔn Quang Th¹ch, §inh Tr−êng S¬n, NguyÔn ThÞ H−¬ng, 2004. “Nh©n nhanh gièng døa §µi n«ng 4 b»ng kü thuËt nu«i cÊy m«”. T¹p chÝ Khoa häc Kü thuËt N«ng nghiÖp, Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp I. TËp II , sè 3/2004, trang: 185-190. Nhut D.T., Bui V.L., Teixeira da Silva J.A., Aswth C.R., 2001. Thin cell layer culture system in Lilium: regeneration and transformation perspectives. In vitro Cell Dev Biol. 37, p: 516-523. Tran Thanh Van K., Bui V.L., 2000. Curent status of thin cell layer method for the induction of organogenesis or somatic embryogenesis. In: somatic embryogenesis in woodly plants. Mohan S.J., Gupta P.K., Newton R.J. (eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 6, p: 51-92