Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ SỐ: 62620301

NĂM 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ SỐ: 62620301

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS.TS. VŨ NGỌC ÚT

TS. PHẠM ANH TUẤN

NĂM 2020

i

TÓM TẮT

Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis (11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis (2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 106 cfu/mL. Khi thử nghiệm trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến 35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1 không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1 có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ.

ABSTRACT

Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V. parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26 Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B. siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at 106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V. parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model (1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V. parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin. Since B. subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 could be used directly to produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming.

iii

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................... i TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii ABSTRACT ......................................................................................................................... iii CAM KẾT KẾT QUẢ ......................................................... Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC ............................................................................................................................. v DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... xiii Chương 1: GIỚI THIỆU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................................... 3 1.5 Tính mới của luận án: ...................................................................................................... 3 1.6 Thời gian thực hiện .......................................................................................................... 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4 2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ......... 4 2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới .................................................. 4 2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam ................................................... 5 2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................. 6 2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi ......................................................................... 7 2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi .................. 8 2.4.1 Chẩn đoán AHPND ................................................................................... 8 2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi ............................................................. 9 2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................................................................... 12 2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ...................................................... 12 2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ....................................................... 14 2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ............................................................................................. 18 2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 18 2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ............................................................................ 18 2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ..................................................................... 18 2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ......................................................................... 19 2.6.1 Sơ lược về B. subtilis ............................................................................... 19 2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 20 2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ................................. 22 2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử ................................... 22 2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ....... 26 2.7 Bacteriocin ..................................................................................................................... 29 2.7.1 Khái niệm ................................................................................................ 29 2.7.2 Phân loại Bacteriocin .............................................................................. 31 2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ............................. 31

2.7.4 Subtilosin A ............................................................................................. 33 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ........................................................ 35 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 36 3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm ........................................................................................................... 37 3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được .......................................................................................................................... 37 3.2.3.1 pirA .................................................................................................... 39 3.2.3.2 pirB .................................................................................................... 39 3.2.3.3 toxR ................................................................................................... 39 3.2.3.4 tdh ...................................................................................................... 40 3.2.3.5 trh ...................................................................................................... 40 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus .................................. 40 3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp ...................................................................................................... 41 3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu........................................................................ 41 3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ................................ 41 3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 42 3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus ........................................................................... 42 3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính protease cao ................................................................................................... 42 3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính amylase cao ................................................................................................... 42 3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính cellulase cao .................................................................................................. 43 3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ............ 43 3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 ............................................................................................... 43 3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....................................................................................................................... 43 3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....... 44 3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 ..... 44 3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của subtilosin A ................................................................................................... 44

3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập được .......................................................................................................................... 45

3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trên trình tự 16S rDNA ............................................................................................................. 45 3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích MLST ............................................................................................................ 46 3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp. ........................................................................................ 47

3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT ...................... 48 3.2.12 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm .......................................................................................................................... 49 3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp. ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................. 50 3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao ................................. 50 3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít .................. 51 3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít ........................................ 52 3.2.14.1 Bố trí thí nghiêm: ............................................................................ 52 3.2.14.2 Phương thức thực hiện: ................................................................... 52 3.2.14.3 Cho ăn và quản lý ........................................................................... 52 3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................... 53 3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 53 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 54 4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp.................. 54 4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng PCR ....................................................................................................................................... 55 4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus ............................ 55 4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh ........................................................................ 58 4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh ......................................................................... 59 4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA ...................................................................... 60 4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB ...................................................................... 60 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ................................................................................................................. 62 4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 62 4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 63 4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 64 4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp .............. 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nuôi tôm công nghiệp ......................................................................................................... 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus ............................................................................................. 67 4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao . 68 4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao . 69 4.5.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 ................ 72 4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 ......... 72 4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 ............................................................................................................. 75

vii

4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng BRB2.1 .......................................................................................................... 75 4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A ............................................. 76

4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu ...................................................... 77 4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA ......................... 77 4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA ................................................ 77

4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST .......................................................................... 78 4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA ............................................................................ 78 4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST ............................................................................................................... 79 4.8 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ...................................................................................... 85 4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3................................................................................... 85 4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ............................................................................................ 86 4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ....................................................................................... 86 4.9 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên TTCT .................................................................................................................................... 87 4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm ......... 89 4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở quy mô phòng thí nghiệm .............................................................................................. 91 4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm ...................................................................... 91 4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít............................. 93 4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở quy mô nuôi 1000 lít ....................................................................................... 95 4.12.1. Sự biến động của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá trình thử nghiệm ............................................................................................... 97 4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm ............ 99 Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ............................................................................. 101 5.1 Kết luận ......................................................................................................................... 101 5.2 Đề xuất .......................................................................................................................... 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 103 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ....................................................................... 128 PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................. 149 PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN LẬP ..................................................................................................................................... 150 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA ................................................................. 161

viii

PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ......................................................................... 164 PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM ....................................................... 171

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B. cereus bằng kỹ thuật MLST ................................................................................................................ 25 Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp. được công bố trong khoảng thời gian 2000- 2019 ............................................................................................................................ 32 Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau .............................. 35 Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A ....... 45 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST ................................................ 46 Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio ................................ 54 Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi trường Chromagar Vibrio ........................................................................................... 57 Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ......................................................................... 62 Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ........................................ 63 Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy .................................................................................. 65 Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .............................. 65 Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping” ....................................... 81 Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................. 85 Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ........................................................................... 86 Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau .............................................................................. 87 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít ....................................................................... 88 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ ...................................................................................... 90 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước nuôi tôm ..................................................................................................................... 93 Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm .... 94 Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức ...................................... 96 Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL) ........................................................................................................ 98 Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL) ..................................................................................................................... 98 Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau thí nghiệm ................................................................................................................ 100 Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA .......................................... 150 Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS ...................................... 151 Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) .................................................................... 151

Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) ............................................................... 152 Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) ........................................ 153 Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) .................................... 154 Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) ................................. 155 Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong nước sau 24h cấy trên môi trường TCBS .......................................................................... 156 Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) ............................................................................. 156 Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ........................................................................ 157 Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) .......................................... 157 Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ...................................... 158 Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ............................. 158 Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ......................................................................... 159 Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ...................................... 160

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB ..................................... 8 Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus .......... 8 Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) ... 9 Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử (https://www.ppdictionary.com/bacteria/gnbac/parahemolyticus.htm) ..................... 13 Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al., 2015) .......................................................................................................................... 13 Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017).................. 16 Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V. parahaemolyticus (Lin et al., 2017) .......................................................................................................................... 16 Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B. subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al., 2008) .......................................................................................................................... 19 Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011)....................................... 33 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án ..................................................................... 36 Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus .... 38 Hình 3.3. Hình thái các loài Vibrio trên môi trường CHROMagar (CHROMagar, Paris, France).............................................................................................................. 38 Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau ...... 55 Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 57 Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ........ 59 Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ......... 59 Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 60 Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được ....... 61

Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) ......................................................... 61 Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau ....................................................................................................................... 66 Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4, BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 68 Hình 4.10 Vòng ức chế vi sinh vật kiểm định (D-d) của 6 chủng nghi là Bacillus có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. .................................................................................................................................... 68 Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường thạch SM. ..................................................................... 69 Hình 4.12 Khả năng sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus ................ 69 Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường Starch Agar. .................................................................. 70 Hình 4.14 Khả năng sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................. 70 Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường CMC. ............................................................................ 71 Hình 4.16 Khả năng sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................ 71 Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng BRB2.1 ................. 73 Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA trong vector pJET1.2............................. 74 Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 và 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 75 Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 76 Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................................. 77 Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu. ...................................................................................................... 78 Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với các chủng tham chiếu dựa trên trình tự 16S rDNA........................................................................................ 79 Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C); glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G) ...................................................................... 80 Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả phân tích MLST của 26 chủng Bacillus ....................................................................................................................... 83 Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X. ................... 89 Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit) ................................................... 90 Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 91 Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) .............. 95 độ phóng đại 200X ..................................................................................................... 95

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC

TIẾNG ANH

TIẾNG VIỆT

AHPND

Bệnh hoại tử gan tụy cấp

Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease

BHI

Brain heart infusion

Môi trường canh thang não – tim

BNNPTNT

Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn

CMC

Carboxymethyl cellulose

Môi trường CMC

CFU

Colony forming unit

Khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axid nucleic

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

EHP

Enterocytozoon Hepatopenaei Vi bào tử trùng

EMS

Early Mortality Syndromy

Hội chứng tôm chết sớm

ĐC

Đối chứng

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

FAO

Tổ chức Nông Lương Thế giới

Food and Agriculture Organization of the United Nations

IHHNV

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

IMNV

Infectious myonecrosis virus Vi rút gây bệnh hoại tử cơ

LAB

Lactic acid bacteria

Vi khuẩn lactic

LB

Luria-Bertani broth

Môi trường LB

MLST

Multi-locus Sequence Typing Kỹ thuật MLST

MRS

Môi trường MRS

de Man, Rogosa and Sharpe agar

NA

Nutrient Agar

trường

thạch dinh

Môi dưỡng

xiii

NB

Nutrien Broth

Canh trường dinh dưỡng

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học

NGS

Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

NT

Nghiệm thức

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn cắt

RNA

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

SBO

Subtilosin

Môi trường SM Skim milk medium

Môi trường sữa gầy

TCBS

Môi trường TCBS

Thiosulfate-Citrate Bile- Sucrose agar

TDH

Độc tố TDH

Thermostable Direct Hemolysin

TRH

TDH Related Hemolysin

Độc tố TRH

TLH

Thermolabile Hemolysin

Độc tố TLH

TSB

Trypto-casein soy broth

Môi trường TSB

TSV

Taura syndrome virus

Vi rút gây hội chứng Taura

TTCT

Tôm thẻ chân trắng

VASEP

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam

Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

WSSV

White spot syndrome virus

Vi rút gây bệnh đốm trắng

YHV

Yellow head virus

Vi rút gây bệnh đầu vàng

pirA

Photorhabdus insect-related toxin – like gene A

Gen mã hóa độc tố liên quan Photorhabdus A

pirB

Photorhabdus insect-related toxin – like gene B

Gen mã hóa độc tố liên quan Photorhbdus B

xiv

toxR

Cholera toxin transcriptional activator gene

Gen mã hóa hoạt hóa phiên mã độc tố tả

tdh

Thermostable direct hemolysin gene

Gen mã hóa hemolysin trực tiếp bền nhiệt

trh

TDH-related hemolysin gene Gen mã hóa hemolysin liên

quan TDH

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh. Các loài tôm nước lợ được nuôi công nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon). Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn, góp phần quan trọng trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới. Năm 2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000 tấn. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục thủy sản, 2018).

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng, do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại vùng ĐBSCL. Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng, gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre. Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản, năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện tích tôm nuôi bị bệnh. Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 % tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y).

Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS. Lightner (Đại học Arizona) đã công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V. parahaemolyticus, chủng Vibrio này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al., 2013). Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V. parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác). Bên cạnh

đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nguồn gốc gây bệnh do vi khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu do vi khuẩn Vibrio gây nên. Vi khuẩn Vibrio có thể làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể trong nghề nuôi tôm công nghiệp.

Để khống chế dịch bệnh ở tôm nuôi, hạn chế tác động của AHPND ở tôm nuôi do nhóm vi khuẩn Vibrio, cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ sinh học, kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học hữu hiệu để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp. Một số chủng Bacillus đã được áp dụng thành công trong chế phẩm sinh học, ví dụ, chủng B. subtilis UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus (Balcázar et al., 2007), hay hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức ăn giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn 1,5 lần và giúp tăng khả năng đề kháng với V. harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al., 2012). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp” được thực hiện nhằm tìm kiếm giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus, hạn chế dịch AHPND, đóng góp các giải pháp nuôi tôm công nghiệp hiệu quả và bền vững.

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus nhằm kiểm soát dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Phân lập, lựa chọn và đánh giá các chủng Bacillus sp. đối kháng được vi

khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.

- Đánh giá và xác định được đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn

Bacillus sp. trong ao nuôi tôm sú/tôm thẻ thâm canh.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm công nghiệp và

nghiên cứu về các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. bằng PCR

- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến

sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp.

- Phân lập các chủng Bacillus sp. từ ao nuôi tôm công nghiệp và đánh giá tính đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus, khả năng sinh enzyme thủy phân của các chủng phân lập được và xác định gen mã hóa bacteriocin ở chủng có hoạt tính đối kháng cao.

- Xác định đa dạng di truyền của nhóm Bacillus sp. trong ao nuôi tôm công

nghiệp.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến

sự phát triển của các chủng Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng cao.

- Thử nghiệm khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ

chân trắng (L. vannamei) của vi khuẩn Bacillus sp. ở qui mô phòng thí nghiệm.

1.4 Ý nghĩa nghiên cứu

Kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở khoa học và thực tiễn về đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. và khả năng đối kháng của Bacillus sp. đối với V. parahaemolyticus trong ao nuôi tôm nước lợ công nghiệp; tìm kiếm các giải pháp ức chế sự phát triển V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trong nuôi tôm công nghiệp.

Kết quả của luận án góp phần vào các giải pháp nuôi tôm công nghiệp bền vững theo hướng phòng chống bệnh Hoại tử gan tụy cấp bằng giải pháp sinh học.

1.5 Tính mới của luận án:

Luận án đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng gây AHPND. Lần đầu tiên luận án ứng dụng thành công phương pháp MLST để phân loại Bacillus sp.

1.6 Thời gian thực hiện Từ tháng 9/2013 đến 9/2017

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ)

2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới

Ngành nuôi tôm là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là tại Châu Á. Giá trị kim ngạch ngành tôm trên toàn thế giới hiện được ước tính khoảng 40 tỷ USD và dự đoán sẽ đạt mức 68 tỷ USD trong mười năm tới (Moss, 2018). Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu thị trường, các quốc gia sản xuất tôm hiện đang gặp rất nhiều thách thức như sự thiếu hụt nguồn cung, dịch bệnh, ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng kháng sinh, hàng rào kỹ thuật của quốc gia nhập khẩu…

Trước năm 2000, Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới trong đó chủ yếu nuôi tôm sú (Portley, 2016). Từ sau 2000, phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng (TTCT) được chú ý ở nhiều nước. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), sản lượng tôm nuôi thế giới năm 2013 đạt 4,45 triệu tấn; trong đó có gần 80% là TTCT.

Các báo cáo của FAO cho thấy Trung Quốc hiện đang là nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất Thế giới, xấp xỉ 1,4-1,6 triệu tấn mỗi năm (GOAL, 2017). Phần lớn sản lượng tôm này là dành để tiêu thụ trong thị trường Trung Quốc (Portley, 2016). Cần nhấn mạnh rằng do tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, tổng sản lượng tôm của Trung Quốc có xu hướng giảm liên tục trong thời gian vừa qua (GOAL, 2017).

Ngành nuôi tôm nước lợ ở Thái Lan bắt đầu tại các vùng ven biển vào những năm 1970. Năm 1990, có đến 15.060 trại nuôi tôm. Năm 1995, số trại nuôi tăng vọt lên 25.210, đối tượng nuôi chủ yếu là tôm sú. Năm 2010, sản lượng TTCT đã tăng lên 552.319 tấn (chiếm khoảng 90% tổng sản lượng tôm Thái Lan). Năm 2011, Thái Lan là quốc gia đứng thứ 2 về sản xuất TTCT trên thế giới, sau Trung Quốc (Holmyard, 2016). Tuy nhiên, cũng do tình hình dịch bệnh, tổng sản lượng tôm của Thái Lan trong những năm gần đây giảm xuống mức trên 300000 tấn/năm (GOAL, 2017).

Hội chứng tôm chết sớm hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease hay AHPND) đã được ghi nhận tại nhiều quốc gia: Trung Quốc năm 2009, Việt Nam năm 2010, Malaysia năm 2011, Thái Lan năm 2012, Mexico năm 2013, Philippines năm 2014 (Flegel, 2012; Lightner et

al., 2012). Đây là nguyên nhân chính gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành nuôi tôm, đặc biệt là TTCT tại các quốc gia châu Á. Năm 2013, có đến 80-90% diện tích ao nuôi ở Đông Thái Lan phải ngừng sản xuất do AHPND (Tổng cục Thủy sản, 2013).

2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm ở Việt Nam hình thành vào những năm đầu thế kỷ 20. Năm 1974, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đạt khoảng 70.000 ha. Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có 15.000 ha nuôi tôm nước lợ. Nghề nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam thực sự phát triển từ sau năm 1987 (Vu Do Quynh, 1989). Năm 2000, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam là 250.000 ha, đến năm 2003 đạt mức 530.000 ha. Năm 2016, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 697.645 ha trong đó tôm sú là 600.399 ha và TTCT là 94.246 ha, với tổng sản lượng đạt 657.282 tấn trong đó tôm sú là 263.853 tấn và 393.429 tấn TTCT. Năm 2017, cả nước có tổng diện tích thả nuôi là 721.100 ha, sản lượng 701.000 tấn; tăng 3,8% về diện tích và tăng 6,7% sản lượng so với 2016 (Tổng cục Thủy sản, 2018).

Với các ưu thế về điều kiện tự nhiên, ĐBSCL là vùng nuôi tôm nước lợ chủ yếu của cả nước, với tổng diện tích tôm nuôi khoảng trên 600.000 ha. Trong năm 2016, ĐBSCL chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch của cả nước. Năm 2017, diện tích nuôi tôm sú vùng ĐBSCL chiếm 94,3% và TTCT chiếm 75,8% diện tích nuôi của cả nước; tương ứng với sản lượng tôm sú chiếm 94,7% và TTCT chiếm 74,4% so với tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước (Tổng cục Thủy sản, 2018).

Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (BNNPTNT), năm 2010, khoảng 40.000 ha nuôi tôm ở ĐBSCL có mức độ thiệt hại vì dịch bệnh từ 20 đến 80%, nhất là tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang. Đỉnh điểm vào năm 2012, diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại vì dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL khoảng trên 100.000 ha (trong đó tôm sú là 91.174 ha và tôm thẻ 7.068 ha). Bệnh ở tôm nuôi thường gặp nhất là AHPND, sau đó là đốm trắng, đầu vàng. Trong hai năm 2010 và 2011, AHPND đã bùng phát thành dịch, gây thiệt hại hơn 97 nghìn ha, tập trung ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre. Năm 2012, AHPND tiếp tục diễn ra tại Trà Vinh, Kiên Giang, và lan rộng tới một số tỉnh ven biển phía Bắc và Bắc Trung bộ, Nam Trung bộ. Ở nước ta đã có quy hoạch phát triển nghề nuôi tôm nước lợ từ cấp quốc gia, cấp

tỉnh, cấp huyện. Tuy nhiên, do việc phát triển tràn lan diện tích nuôi tôm tại một số khu vực dẫn đến ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng của thuốc thú y, mật độ thả nuôi cao, dịch bệnh trên tôm nuôi thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại lớn cho người nuôi.

2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam

Theo Lightner et al. (2012), năm 2009, bệnh hoại tử gan tụy cấp lần đầu xuất hiện và được gọi tên là “hội chứng tôm chết sớm”. Tới năm 2011 bệnh được gọi dưới tên “hội chứng hoại tử gan tụy cấp” (AHPNS) dựa trên mô tả bệnh tích. Tới năm 2013 khi tác nhân gây bệnh được xác định do một số chủng V. parahaemolyticus, bệnh được gọi tên “bệnh hoại tử gan tụy cấp”. AHPND xảy ra ở giai đoạn đầu tôm nuôi thương phẩm (cả ở tôm thẻ chân trắng và tôm sú), khả năng gây thiệt hại có thể lên đến 100% trong vòng 20-30 ngày sau khi thả nuôi. Tôm bị bệnh có gan tụy sưng hoặc teo, trắng nhạt; vỏ mềm, tăng trưởng chậm, khi sắp chết tôm chìm xuống chết ở đáy ao (Lightner et al., 2012).

Năm 2010 dịch bệnh lan rộng ở Trung Quốc và bắt đầu lan ra ở một số vùng nuôi tôm ở Việt Nam. Tại Malaysia, AHPND xuất hiện đầu tiên năm 2010 ở Johor. Ở Thái Lan, năm 2012, khoảng 0,7% tổng số ao nuôi tôm đã bị nhiễm bởi AHPND, xảy ra ở các tỉnh Rayong, Chantaburi, Trat (Flegel, 2012). Nghiên cứu trong và ngoài nước trong thời gian này cho rằng nguyên nhân gây nên AHPND có thể do nhiều loại tác nhân khác nhau: vi khuẩn, virus, độc tố từ tảo hoặc từ thuốc trừ sâu và quản lý ao nuôi không tốt.

Ở Việt Nam trong nhiều năm qua ở ĐBSCL, tôm nuôi chết hàng loạt trên diện rộng do virus gây bệnh đốm trắng và dịch AHPND (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012; Bùi Quang Tề, 2003). Năm 2011, diện tích tôm chết nhiều nhất, ở một số tỉnh ĐBSCL thiệt hại lên tới 97.691 ha diện tích nuôi. Năm 2012 cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ) bao gồm dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng và dịch AHPND. Các tỉnh có diện tích tôm nuôi bị thiệt hại nhiều là Sóc Trăng 23.371,5 ha (chiếm 56,6 % diện tích thả nuôi); Bạc Liêu 16.919 ha (chiếm 41,9 % diện tích thả nuôi); Bến Tre 2.237 ha (chiếm 29,1 % diện tích thả nuôi); Trà Vinh 12.200 ha tôm sú (chiếm 49,3 % diện tích thả nuôi) và 24,2 ha tôm thẻ chân trắng; Cà Mau diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh là 958,58 ha, tăng nhiều hơn so với năm 2011 là 420,02 ha (Tổng cục Thủy sản, 2012; 2013). Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long của Việt Nam, năm 2015 bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng gây thiệt hại 8,9 triệu đôla và trên tôm sú là 1,8

triệu đôla (Tổng cục Thủy sản, 2016). Ngoài ra, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh năm 2018 là 12.359 ha

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã xác định nguyên nhân gây AHPND ở tôm nuôi bao gồm: tôm giống có chất lượng không đảm bảo (nhiễm Vibrio, có dấu hiệu bất thường gan tụy, thậm chí đã hoại tử gan tụy cấp), thả nuôi trong điều kiện môi trường bất lợi (hiện diện của thuốc bảo vệ thực vật, oxy hòa tan thấp, độ mặn cao, ô nhiễm hữu cơ..) và có hiện diện của Vibrio và phage (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). Năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I đã phân lập được một số loài vi khuẩn Vibrio (V. alginolyticus, V. ordalii, V. vulnificus, V. fischerii) trên tôm bị AHPND, đồng thời khẳng định tảo độc không liên quan đến hiện tượng tôm chết do hoại tử gan tụy. Khảo sát tại một số vùng vừa xảy ra AHPND ở khu vực phía Bắc đầu năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I đã phát hiện tôm bị AHPND có nhiễm Vibrio sp. với tỷ lệ cao, đặc biệt là V. vulnificus và V. parahaemolyticus.

2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi

Tác nhân gây AHPND là do các chủng V. parahaemolyticus có khả năng sinh độc tố PirA/PirB. Nhận định này đi từ các thử nghiệm nhân tạo trong đó dịch nuôi cấy chủng gây bệnh V. parahaemolyticus được lọc tiệt trùng (để loại bỏ vi khuẩn) trước khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tôm khỏe cũng sẽ gây ra các triệu chứng tương tự AHPND (Tran et al., 2013). Tiếp đó, bằng cách sử dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, Yang et al. (2014) đã giải trình tự toàn bộ hệ gen của 3 chủng V. parahaemolyticus gây AHPND và một chủng không gây bệnh. Kết quả so sánh dữ liệu giải trình tự cho thấy tồn tại một plasmid đặc trưng có kích thước khoảng 70 kb ở cả 3 chủng gây bệnh. Plasmid này không tồn tại ở chủng lành tính và được đặt tên là pVA1 (Hình 2.1). Phân tích trình tự của plasmid này cho thấy nó có mang hai gen pirA và pirB (Hình 2.2) mã hóa cho các protein có độ tương đồng cao với độc tố nhị thể PirA/PirB của Photorhabdus vốn gây độc cho các loài côn trùng (Yang et al., 2014). Vai trò của các protein này đối với AHPND sau đó được khẳng định bởi nhiều nghiên cứu (Lai et al., 2015; Tinwongger et al., 2016; Theethakaew et al., 2017). Hiện nay, các protein này của V. parahaemolyticus chính thức được đặt tên là PirA/PirB.

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB

Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus

2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi

2.4.1 Chẩn đoán AHPND

Bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi có thể được chẩn đoán thông qua phân tích mô học (quan sát mô gan tụy) hoặc phát hiện gen mã hóa độc tố bằng kỹ thuật PCR. Khi quan sát các ống gan tụy của tôm bệnh, có thể thấy sự thoái hóa của mô ở nhiều vị trí khác nhau (các mô gan tụy bị bong tróc thành các hạt hình tròn trong lòng ống) (Hình 2.3) (Nunan et al., 2014). Ngoài ra, vào giai đoạn cuối của bệnh, phản ứng viêm và nhiễm khuẩn thứ cấp cũng có thể được quan sát thấy (Nunan et al., 2014). AHPND cũng có thể được chẩn đoán bằng phương pháp PCR một bước, phát hiện sự có mặt của gen pirA hoặc pirB với độ chính xác cao trên 90% (Han et al., 2015; Sirikharin et al., 2015). Ngoài ra, phương pháp PCR lồng AP4, real-time PCR với mẫu dò TaqMan, hay kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP cũng đã được áp dụng để phát hiện AHPND với độ chính xác cao mà không cần đến bước làm giàu vi khuẩn (Koiwai et al., 2016).

Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) A: mô gan tụy thông thường; B: mô gan tụy mắc AHPND

2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi

Cũng như các loại bệnh khác có căn nguyên là tác nhân vi khuẩn, bệnh AHPND có thể được điều trị bằng các loại kháng sinh (Wang et al., 2018). Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất để điều trị các bệnh vi khuẩn trên tôm (Neela et al., 2007). Tuy nhiên, hậu quả trực tiếp của việc lạm dụng kháng sinh trong phòng chống AHPND ở tôm là tồn dư kháng sinh hoặc chất cấm vượt quá mức quy định tại các quốc gia nhập khẩu tôm. Rất nhiều lô hàng tôm xuất khẩu của Việt Nam đã bị tiêu hủy hoặc trả về vì lý do này, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hình ảnh của ngành sản xuất thủy sản của nước ta. Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài sẽ làm phát sinh tính kháng thuốc ở tác nhân gây bệnh cũng như làm lan truyền tính kháng thuốc trong tập hợp vi khuẩn trong môi trường nuôi tôm (Cabello, 2006; Thuy et al., 2011). Đây là vấn đề hết sức nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt khi các hộ nuôi sử dụng các loại kháng sinh chuyên dụng cho người để điều trị bệnh cho tôm. Một số chủng V. parahaemolyticus gây AHPND tại Mexico đã được xác định là kháng với cả oxytetracycline và tetracycline (Han et al., 2015). Nghiên cứu của Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv (2017) tại vùng nuôi tôm tập trung ở Quỳnh Lưu, Nghệ An đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây AHPND có kết quả 100% kháng với thuốc ampicillin, 90,9% kháng với neomycin, 66,7% kháng với erythromycin và 55,6% kháng với tetracycline. Đặc biệt, hiện tượng đa kháng được tìm thấy với 33,3% tổng số chủng kháng với 4 loại thuốc (Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2017). Các kết quả nghiên cứu này cho thấy liệu pháp điều trị AHPND bằng kháng sinh là không có tính bền vững.

Một giải pháp có tính căn cơ khác để phòng chống AHPND ở tôm là ngăn ngừa sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh bằng cách đảm bảo an toàn sinh học

thông qua việc kiểm soát chặt chẽ chất lượng nguyên liệu đầu vào (con giống, thức ăn...), nước, môi trường xung quanh (ao nuôi trong nhà kín, vệ sinh, tiêu độc sát trùng). Tuy nhiên, giải pháp này thường chỉ phù hợp với các công ty lớn do đòi hỏi chi phí đầu tư ban đầu rất cao và chỉ có những công ty này mới có khả năng đảm bảo được toàn bộ các khâu trong quá trình nuôi từ con giống, nguồn nước đến thức ăn. Cần nhấn mạng rằng phần lớn sản lượng tôm nuôi ở nước ta là đến từ những hộ nuôi nhỏ lẻ không có khả năng ứng dụng giải pháp có tính tổng thể này.

Để thay thế cho tác dụng phòng và chữa bệnh của kháng sinh, một số chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với môi trường được coi là giải pháp an toàn sinh học thay thế các thuốc hóa học tổng hợp (Renu, 2010). Khi thêm dịch chiết từ lá trầu không (Piper betle) vào khẩu phần ăn của tôm, Mohtar et al (2016) nhận thấy dịch chiết này có tác dụng giảm thiểu AHPND. Ở nước ta, Đặng Thị Lụa và ctv (2015) cũng chỉ ra hoạt tính kháng các chủng V. parahaemolyticus gây AHPND in vitro của các dịch chiết lá trầu không, lá ổi (Psidium guajava) cũng như của lá sim và hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa). Gần đây, Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv (2017) đã thử nghiệm hoạt tính kháng V. parahaemolyticus gây AHPND của dịch chiết thân lá cây thồm lồm (Polygonum chinense L.). Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus gây AHPND là rất mạnh. Bên cạnh đó, việc bổ sung dịch chiết này với liều lượng 30 g/m3 tại nhiều thời điểm cho phép giảm tỷ lệ tôm chết do AHPND từ 100% xuống 40% (Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2017). Các kết quả nghiên cứu này cho thấy triển vọng của việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược trong việc phòng chống AHPND ở tôm. Tuy nhiên, việc áp dụng giải pháp này hiện nay vẫn chưa được áp dụng ở quy mô sản xuất lớn do thiếu nguồn nguyên liệu ổn định và giá thành sản xuất cao.

Một giải pháp rất hữu hiệu khác để phòng chống AHPND ở tôm là sử dụng thực khuẩn thể đặc hiệu với V. parahaemolyticus. Cần nhấn mạnh rằng thực khuẩn thể đã được nghiên cứu từ rất lâu trong điều trị nhiễm khuẩn ở người. Tuy nhiên, với sự ra đời của kháng sinh, các nghiên cứu thực khuẩn thể dần bị quên lãng (Marks and Sharp, 2000). Do hiện trạng kháng thuốc kháng sinh ngày càng gia tăng mà liệu pháp thực khuẩn thể lại trở thành một giải pháp công nghệ sinh học đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Cơ chế diệt khuẩn của thực khuẩn thể dựa trên khả năng lây nhiễm của một số loại virus trên vật chủ là vi khuẩn với kết quả cuối cùng là tế bào vật chủ bị ly giải (Alagappan et al., 2010).

Dựa trên cơ chế này, thực khuẩn thể đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngay từ các năm 1990 để ức chế vi khuẩn Lactococcus garveyi ở cá cam Nhật (Yellow tail fish). Ngoài khả năng diệt khuẩn hữu hiệu, ưu điểm của liệu pháp thực khuẩn thể còn là tính đặc hiệu cao (chỉ diệt vi khuẩn đích mà không ảnh hưởng đến các vi khuẩn hữu ích khác trong môi trường) và giá thành thấp (do khả năng tự tái bản trong môi trường tự nhiên) (Kalatzis et al., 2018). Thực khuẩn thể được phân lập từ môi trường nước lợ có thể ly giải hiệu quả các chủng V. parahaemolyticus thử nghiệm (Alagappan et al., 2010). Gần đây, Jun et al. (2016) đã lần đầu tiên sử dụng một thực khuẩn thể có tên là pVp-1 thuộc nhóm Siphoviridae, để thử nghiệm khả năng diệt V. parahaemolyticus gây AHPND. Kết quả thử nghiệm cho thấy pVp-1 có khả năng ly giải 20/22 (90%) chủng gây AHPND (Jun et al., 2016). Tiếp theo, nhóm nghiên cứu này đã thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND trên mô hình TTCT. Các kết quả thử nghiệm cho thấy pVp-1 có khả năng giúp tôm sống 100% khi cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus gây AHPND nếu như thực khuẩn thể này được sử dụng trong cả giai đoạn phòng bệnh (prophylactic treatment) và giai đoạn chữa bệnh (therapeutic treatment). Mẫu đối chứng không được xử lý với pVp-1 cho tỷ lệ chết là 100% với các triệu chứng điển hình của AHPND (Jun et al., 2018). Tuy rất có triển vọng nhưng các liệu pháp sử dụng thực khuẩn thể đều có nguy cơ về an toàn sinh học do khả năng chuyển độc tính vào chủng vi khuẩn (Flegel et al., 2005). Yêu cầu tiên quyết là các chủng thực khuẩn thể phải có đặc tính ly giải nhưng không có khả năng trở lại trạng thái tiềm tan (lysogenic) và không được mang các gen độc tính có thể chuyển vào vi khuẩn chủ làm cho vi khuẩn này trở nên nguy hiểm hơn (Kalatzis et al., 2018).

Gần đây, một số công nghệ mới quản lý chất lượng nước trong chăn nuôi thủy sản cũng đã được đề xuất như là các giải pháp phụ trợ để phòng và giảm thiểu tác hại của AHPND trên tôm như công nghệ bio-floc, sử dụng vi tảo, rêu, nuôi cùng với cá hay các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ (Dash et al., 2017). Bản chất của công nghệ bio-floc là dựa trên việc bổ sung nguồn carbon (rỉ đường, saccharoza, tinh bột) vào nước nuôi để chuyển hóa lượng nitơ dưới dạng NH4+ và nitơ hữu cơ khác về dạng nitơ sinh khối, có thể được dùng làm thức ăn cho chính loại thủy sản nuôi một cách trực tiếp hay gián tiếp (Crab et al., 2012). Trong quá trình phát triển sinh khối, một số loại vi khuẩn có thể tổng hợp poly-b-hydroxy butyrate (PHB), một loại polymer của các axít béo mạch ngắn có tính kháng khuẩn mạnh (Sinha et al., 2008). Tuy nhiên, công nghệ bio-floc vẫn tồn tại một

số nhược điểm như giá thành cao, cần nguồn oxy lớn hay nguy cơ tồn tại vi khuẩn có hại trong nguồn nước tái sử dụng (Ray & Leffler, 2013). Tương tự như vậy, một số loại vi tảo có khả năng sinh tổng hợp các axít hữu cơ tự do có tính kháng khuẩn phổ rộng (Dash et al., 2017), nhưng khó có thể áp dụng trên diện rộng do giá thành cao và chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (Charoonnart et al., 2018)

Trong những năm gần đây, các chế phẩm probiotic, có bản chất là các vi khuẩn có lợi cho người và vật nuôi, bắt đầu được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng. Cơ chế hoạt động của probiotic bao gồm: (i) có tác dụng ức chế các tác nhân gây bệnh; (ii) cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột của vật nuôi; (iii) cạnh tranh nguồn thức ăn và vị trí gắn trên đường ruột; (iv) cải thiện các chức năng tiêu hóa; (v) kích hoạt hệ miễn dịch và (vi) cải thiện chất lượng nước (Verschuere et al., 2000; Balcázar et al., 2006; Nimrat et al., 2012; Wang et al., 2018; Nguyen et al., 2018). Hoạt tính kháng khuẩn của các loại probiotic là gắn liền với khả năng tiết các enzyme phân hủy, các bacteriocins, H2O2, và các axít hữu cơ mạch ngắn như axít lactic, acetic, butyric, propionic... (Loh, 2017; Tinh, 2007). Các nghiên cứu gần đây sử dụng các chủng Lactobacillus plantarum, Pseudoalteromonas spp. và Bacillus subtilis cho phép cải thiện tỷ lệ sống của TTCT khi được cảm nhiễm bằng các chủng V. parahaemolyticus gây AHPND (Nguyen et al., 2018; Wang et al., 2018; Taylor et al., 2017). Ưu điểm của giải pháp probiotic là có giá thành thấp so với các giải pháp đã nêu ở trên, an toàn đối với môi trường và tính hiệu quả đã được chứng minh trong thời gian dài (Leyva-Madrigal et al., 2011; Sapcharoen and Rengpipat, 2013; Pham et al., 2014).

2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus

V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn Gram âm, hình que, ưa ấm, có khả năng di động, thường tồn tại trong môi trường nước biển và vùng cửa biển vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Wang et al., 2015). Dưới kính hiển vi điện tử, V. parahaemolyticus có hình dạng của một trực khuẩn với roi ở một đầu (Hình 2.4). Tuy nhiên, trên thực tế, V. parahaemolyticus có thể có hai hệ thống roi (Hình 2.5): hệ thống roi ở đầu cực để di chuyển, trong khi đó hệ thống roi ngang giúp tế bào bám vào nhau để hình thành màng sinh học (biofilm) (Wang et al., 2015). Đặc tính này giúp V. parahaemolyticus có khả năng thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh luôn thay đổi. Ngoài ra, trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có các

thụ thể QS (quorum sensing) và SS (stress-sensing) giúp V. parahaemolyticus tồn tại được trong các môi trường khắc nghiệt như pH kiềm, nồng độ muối cao. Trong quá trình lây nhiễm, V. parahaemolyticus sử dụng các yếu tố bám dính như MAM7 để liên kết với fibronectin và axít phosphatidic trên bề mặt tế bào vật chủ, từ đó tiết các chất tác động biến cấu (effectors) và các độc tố vào tế bào vật chủ qua hai hệ thống tiết là T3SS (bao gồm T3SS1 và T3SS2) và T6SS (bao gồm T6SS1 và T6SS2) (Hình 2.5) (Gode-Potratz et al., 2011).

Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử (https://www.ppdictionary.com/bacteria/gnbac/parahemolyticus.htm)

Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al., 2015)

2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus

Các độc tố của V. parahaemolyticus đã được xác định bao gồm TDH (TDH-related hemolysin), TLH (Thermostable direct hemolysin), TRH (Thermolabile hemolysin) và PirA/PirB. Đây chính là cơ chế gây bệnh của một số chủng V. parahaemolyticus. Hiện nay, V. parahaemolyticus thường được phân loại dựa vào đặc điểm huyết thanh với ít nhất là 12 kiểu kháng nguyên O và trên 70 kiểu kháng nguyên K trên lớp bào nang (Xu et al., 2014).

TDH và TRH là hai yếu tố độc lực của V. parahaemolyticus với đặc tính gây độc tế bào và độc tố ruột (Wang et al., 2015). Hai loại protein độc tố này đều có hoạt tính phân giải tế bào hồng cầu người trong môi trường có nồng độ muối cao. Các phân tích dịch tễ học phân tử cho thấy trên 95% các chủng gây bệnh V. parahaemolyticus mang gen tdh. Trên môi trường thạch máu Wagatsuma, TDH sẽ phân giải tế bào hồng cầu, tạo vòng phân giải, đặc trưng cho khả năng gây bệnh viêm dạ dày ruột (Liu, 2003). Độc lực của TDH là gắn liền với hai hoạt tính sinh học của protein này: hoạt tính ly giải tế bào hồng cầu và hoạt tính gây độc tế bào. TDH bám vào màng tế bào hồng cầu hoặc một số loại tế bào khác của vật chủ, và tạo ra các lỗ trên bề mặt màng, kết quả là khiến tế bào bị ly giải (Matsuda et al., 2010). Hoạt tính gây độc tế bào còn lại liên quan đến khả năng tạo kênh vận chuyển trên màng tế bào, kết quả là làm tăng nồng độ Ca2+ ngoại bào và sự tiết ion Cl- (Matsuda et al., 2010). Khi áp suất thẩm thấu của tế bào tăng quá mức cho phép sẽ làm thay đổi hình thái, cuối cùng là gây chết tế bào. Tương tự như TDH, TRH cũng có các hoạt tính ly giải tế bào và gây độc tế bào (Takahashi et al., 2000; Ceccarelli et al., 2013).

Thuộc nhóm enzyme phospholipase, TLH (Thermolabile hemolysin) là một loại protein độc lực khác ở V. parahaemolyticus. Loại độc tố này cũng có khả năng ly giải tế bào hồng cầu (McCarthy et al., 1999; Wang et al., 2015). TLH có mặt trong toàn bộ các chủng V. parahaemolyticus được phân lập từ tự nhiên (Bej et al., 1999). Độc tính của TLH cũng đã được chứng minh in vitro trên một số dòng tế bào (Hela, Changliver, và RAW264.7) (Wang et al., 2012). Do vậy, TLH có thể có chức năng tương tự như các độc tố TDH và TRH trong quá trình gây bệnh của V. parahaemolyticus.

Hệ gen của V. parahaemolyticus đã được giải trình tự toàn bộ, bao gồm hai nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước là 3,3 và 1,9 Mb, mã hóa cho khoảng 4800 gen (Makino et al., 2003). Trên các chủng gây bệnh tiêu chảy, các gen độc tố tdh và trh đều nằm gần nhau trên nhiễm sắc thể 1. Chủng V. parahaemolyticus

phân lập từ mẫu bệnh có thể mang gen tdh hoặc trh, hoặc có cả 2 loại. Chỉ một tỷ lệ nhỏ các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ môi trường có các gen này (Nishibuchi & Kaper, 1995). Ở một số chủng V. parahaemolyticus, gen tdh và trh nằm trên operon độc tố toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR và gen toxS. Operon Vp-toxRS có cấu trúc và chức năng tương tự với operon độc tố của V. cholerae (toxRS). Trình tự của operon Vp-toxRS đã được phát hiện có trong tất cả các chủng V. parahaemolyticus (Nishibuchi & Kaper, 1995). Ở V. cholerae, gen toxR điều hòa sự biểu hiện của gen ctx mã hóa cho độc tố của phẩy khuẩn tả. Các nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra gen toxR là gen chủ chốt trong điều hòa sự biểu hiện của nhiều gen khác bao gồm: gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin- coregulated pili) và gen ompU, ompT mã hóa các protein màng ngoài (OMPs) ở V. cholerae. Gen toxR cũng tham gia vào quá trình điều hòa sự biểu hiện của các OMP (outer membrane protein) ở V. vulnificus. Trình tự nucleotide của gen toxR ở ba loài V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus có độ tương đồng từ 52 đến 63%, cho phép thiết kế các cặp mồi phát hiện đặc hiệu V. parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR.

Các nghiên cứu về cấu trúc của PirA/PirB từ V. parahaemolyticus cho thấy có sự liên quan giữa các độc tố PirA/PirB với độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017). Các protein Cry này chính là tác nhân diệt côn trùng của thuốc trừ sâu sinh học Bt. Tuy có rất nhiều biến thể nhưng các độc tố Cry đều có cấu trúc tương tự nhau bao gồm 3 vùng: domain I tạo lỗ, domain II gắn với thụ thể và domain III gắn với đường (Hình 2.6) (Bravo et al., 2007). Tính đặc hiệu và cơ chế gây độc của các độc tố Cry được quy định bởi các domain này. Ví dụ, Cry1A sử dụng các domain II và domain III để liên kết với các thụ thể (alkaline phosphatase hoặc or aminopeptidase N) nằm ở trung tràng của các ấu trùng côn trùng. Sau đó, bằng cách tương tác với thụ thể khác CAD (cadherin-like receptor), vùng xoắn α1 trong domain I sẽ bị protease của côn trùng phân cắt. Sự phân cắt này sẽ giúp hình thành nên cấu trúc oligomer của Cry, tạo ra các lỗ màng không đặc hiệu trên màng tế bào đường ruột của côn trùng. Kết quả là gây ra quá trình ly giải tế bào dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu.

Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017)

Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V. parahaemolyticus

(Lin et al., 2017)

Kết quả nghiên cứu cấu trúc cho thấy PirB nhiều khả năng mang cả domain tạo lỗ và domain tương tác với thụ thể (tương tự như domain I và II của các độc tố Cry) (Lin et al., 2017). Vùng đầu N của PirB có chứa nhiều chuỗi xoắn  và tồn tại nhiều gốc axít amin kỵ nước nằm ở trung tâm các chuỗi xoắn  này (Lin et al., 2017). Cấu trúc này là đặc trưng cho các độc tố tạo lỗ vốn có khả năng thay đổi cấu trúc giữa trạng thái tan và trạng thái xuyên màng tế bào (Dal Peraro & van der Goot, 2016). Khi thay đổi cấu trúc, các gốc axít amin kỵ nước này sẽ lộ ra trên bề mặt của protein và sẽ có thể tương tác với màng lipit. Một điểm cần nhấn mạnh là các chuỗi xoắn này thường dài hơn 40 Å, đủ để chúng xuyên qua được lớp màng lipit kép (độ dài của lớp lipit kép là khoảng 40 Å). Các dữ liệu này cho thấy vùng đầu N của PirB có khả năng tạo ra các lỗ trên màng tế bào, gây ra hiện tượng ly giải tế bào. Trong khi đó vùng đầu C của PirB có ba nếp gấp

β ngược chiều với cấu trúc không gian tương tự như domain II của các protein

Cry vốn bao gồm một cấu trúc tương tự immunoglobulin có khả năng tham gia vào tương tác giữa protein và thụ thể (Lin et al., 2017). Như đã đề cập ở trên, chính domain II của các protein Cry sẽ tham gia vào quá trình tương tác của Cry với các thụ thể của tế bào trung tràng của côn trùng. Do vậy, rất có thể vùng đầu C của PirB đóng vai trò là domain liên kết với thụ thể (Lin et al., 2017).

Về PirA, cấu trúc của protein này mang hai nếp gấp β ngược chiều với cấu

trúc không gian tương tự như domain III của các độc tố Cry vốn bao gồm domain liên kết với galactose. Khi Cry1Ac tương tác với aminopeptidase N, đầu tiên domain III sẽ liên kết với N-acetylgalactosamine nằm trên thụ thể của aminopeptidase N, tạo điều kiện để độc tố có thể tiếp tục tương tác với các thụ thể khác trong các bước tiếp theo (Bravo et al., 2007). Các mô hình về cấu trúc cho thấy PirA từ V. parahaemolyticus không những có thể tương tác với các đường đơn như N-acetylgalactosamine mà còn với cả các oligosaccharide (Lin et al., 2017).

Như vậy về mặt cơ chế, độc tố nhị thể PirA/PirB từ V. parahaemolyticus rất có thể hoạt động như các độc tố Cry từ B. thuringiensis với ba bước: liên kết với thụ thể, oligomer hóa và tạo lỗ trên màng tế bào. Tuy nhiên, vẫn cần phải làm sáng tỏ rất nhiều vấn đề như: PirA và PirB tương tác với nhau như thế nào để tạo cấu trúc có hoạt tính sinh học; đâu là các thụ thể của PirA/PirB trong mô gan tụy của tôm; loại đường tương tác với PirA.

2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V. parahaemolyticus

2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

tối

tăng

trưởng

(mesophiles), nhiệt độ

Tất cả các loài vi sinh vật có một giới hạn nhiệt độ xác định trong quá trình sinh trưởng phát triển. Nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn V. parahaemolyticus nói riêng. Thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm thiểu của V. parahaemolyticus khoảng 5°C, phát triển tối ưu trong khoảng nhiệt độ từ 35- 37°C, có thể phát triển ở nhiệt độ tối đa 42 - 44°C (Burnham et al., 2009). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là phụ thuộc vào chủng và các điều kiện nuôi cấy khác. Trong nuôi trồng thủy sản, nhiệt độ nước có ảnh hưởng rõ rệt đến mật độ Vibrio. Vi khuẩn V. parahaemolyticus rất nhạy cảm với nhiệt độ môi trường, có thể nhân lên nhanh chóng ở khoảng nhiệt độ 20 - 40°C (Yoon et al., 2008). Một số nghiên cứu cho thấy khi bảo quản thực phẩm hải sản chế biến sẵn ở nhiệt trên 13oC, vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể tồn tại và sinh trưởng. Để hạn chế mật độ của các vi khuẩn V. parahaemolyticus cần bảo quản thực phẩm dưới 10oC (Kim et al., 2012).

2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH

Vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể tồn tại và sinh trưởng trong khoảng pH từ 4,8 đến 11 (Beuchat, 1976). Tuy nhiên, pH tối ưu cho sự sinh trưởng của loại vi khuẩn này thường nằm trong khoảng từ 7,6 đến 8,6 (Beuchat, 1976; Parveen et al., 2013). Ở vùng pH axít (pH thấp hơn 6,0), sự sinh trưởng của V. parahaemolyticus thường yếu hoặc bị bất hoạt hoàn toàn (Whitaker et al., 2010). Cần nhấn mạnh rằng, cũng như các vi khuẩn đường ruột khác ở người, V. parahaemolyticus cần phải chống chịu được môi trường axít trong dạ dày (pH từ 1,5 đến 3,5) trước khi có thể lây nhiễm trong tuyến tiêu hóa người bệnh. Điều này cho thấy tồn tại cơ chế chống chịu môi trường axít của V. parahaemolyticus trong cơ thể vật chủ.

2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn

Môi trường sống ưa thích của V. parahaemolyticus là vùng cửa biển vốn là môi trường có nồng độ muối thay đổi một cách liên tục. Do vậy, V. parahaemolyticus phải có cơ chế thích ứng với điều kiện bất lợi này. Vốn là loại vi khuẩn ưa muối vừa phải, V. parahaemolyticus cần nồng độ NaCl thấp nhất là 0,086 M (0,5%) để sinh trưởng (Palasuntheram, 1981). Nồng độ NaCl lớn nhất

còn cho phép sự sinh trưởng của loại vi khuẩn này là 1,5 M (Whitaker et al., 2010). Khả năng chịu muối cao như vậy cho phép phân biệt V. parahaemolyticus với nhiều loài Vibrio khác sống trong cùng môi trường tự nhiên như V. cholerae, V. vulnificus, V. fischeri. Nồng độ NaCl tối ưu cho sự phát triển của V. parahaemolyticus là dao động quanh giá trị 3,0% (Beuchat, 1976). Một điểm cần nhấn mạnh là tốc độ chuyển động của loài Vibrio nhờ roi là phụ thuộc vào nồng độ Na+ trong môi trường (Atsumi et al., 1992).

2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis.

2.6.1 Sơ lược về B. subtilis

Bacillus subtilis (B. subtilis) là một loại vi khuẩn Gram dương không gây bệnh, hình que, catalaza dương tính, ưa ấm, được tìm thấy trong tự nhiên trong đất, thực vật và đường tiêu hóa của động vật. Cũng như các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, B. subtilis có khả năng tạo nội bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt (nhiệt độ cao, hoạt độ nước thấp). Dưới kính hiển vi điện tử, B. subtilis có hình dạng điển hình của trực khuẩn với nhiều roi (Hình 2.8). Tế bào B. subtilis có chiều dài dao động trong khoảng 2,5-10,0 μm và đường kính dao động trong khoảng 0,3-1,0 μm tùy thuộc vào giai đoạn phát triển và môi trường nuôi cấy (Sargent, 1975). Vi khuẩn B. subtilis có nhiều hình thái khuẩn lạc khác nhau và có thể thay đổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy. Trên môi trường NA, đường kính khuẩn lạc dao động từ 2 đến 4 mm sau 24 giờ nuôi cấy, có hình tròn đều hoặc có mép gợn sóng. Bề mặt khuẩn lạc thường có màu trắng đục và sần sùi (Zeigler & Perkins, 2008).

Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B. subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al., 2008)

Về mặt sinh sản, B. subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo ra hai tế bào con hoặc bất đối xứng để tạo ra một nội bào tử duy nhất, tồn tại trong thời gian dài ở các điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, nhiễm mặn, pH hoặc bức xạ cao. Trước khi sinh bào tử, các tế bào B. subtilis thường trải qua một số quá trình như phát triển hệ thống roi, hấp thu DNA từ môi trường xung quanh, tạo kháng sinh. Những phản ứng này được cho là nỗ lực tìm kiếm thêm nguồn dinh dưỡng mới hoặc môi trường sống thuận lợi hơn, hoặc ức chế, tiêu diệt những tác nhân cạnh tranh dinh dưỡng trong môi trường hiện có.

Do được coi là sinh vật “mô hình” cho các vi khuẩn Gram dương, B. subtilis hiện là một trong các vi sinh vật được nghiên cứu kỹ nhất. Trình tự thể gen của chủng B. subtilis 168 được công bố từ rất sớm vào năm 1997 (Kunst et al., 1997). Khác với V. parahaemolyticus, hệ gen của B. subtilis 168 chỉ bao gồm một nhiễm sắc thể ở dạng vòng duy nhất với kích thước xấp xỉ 4,2 Mbp mã hóa cho 4100 gen, trong đó 192 gen là không thể thay thế và 79 gen khác có chức năng thiết yếu. Hầu hết các gen thiết yếu này đều tham gia vào các quá trình trao đổi chất cơ bản trong tế bào. Một nửa trong số này có chức năng liên quan đến chuyển hóa DNA, RNA và tổng hợp protein. Khoảng 20% các gen thiết yếu có chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp vách tế bào, hình dạng tế bào và phân chia tế bào. Khoảng 10% các gen thiết yếu là liên quan đến quá trình hô hấp, chuyển hóa năng lượng trong tế bào. Có khoảng 4% các gen thiết yếu có chức năng chưa được xác định (Kobayashi et al., 2003). Kết quả giải trình tự thể gen cũng cho thấy B. subtilis có năm gen mã hóa peptidase phân cắt các trình tự peptít dẫn đường. Điều này giải thích cho việc rất nhiều chủng B. subtilis có khả năng tiết enzyme ngoại bào rất mạnh cũng như tiết các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn để ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác (Ara et al., 2007).

2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis

Cũng giống các loài Bacillus khác, B. subtilis được tìm thấy ở nhiều môi trường khác nhau như đất, nước ngọt, ven biển, đại dương, đường ruột của người và động vật (Earl et al., 2008). Điều này có thể do khả năng tạo nội bào tử của B. subtilis, giúp chúng tồn tại được trong các môi trường khắc nghiệt. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy trong các môi trường kể trên, B. subtilis được tìm thấy chủ yếu ở dạng bào tử mà không phải ở dạng hoạt động. Do đó, môi trường sống thực sự của B. subtilis hiện vẫn còn rất nhiều tranh cãi (Earl et al., 2008).

B. subtilis có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng, thấp nhất ở 5- 20oC, cao nhất ở 45-55oC, tối ưu trong khoảng từ 30-37oC (Warth, 1978). Một

nghiên cứu bởi Nicholas et al (1995) cũng đã chỉ ra rằng B. subtilis còn có khả năng thích ứng với nhiệt độ thấp (11oC). Tuy nhiên, việc phát triển ở nhiệt độ cao hoặc thấp bất thường có thể kích hoạt các gen liên quan đến quá trình thích ứng với các điều kiện bất lợi (Hecker et al., 1996; Holtmann and Bremer, 2004). Trong đó, sự biểu hiện của một số protein như GroEL, GroES, và DnaK được quan sát thấy khi B. subtilis bị sốc nhiệt độ cao (Holtmann and Bremer, 2004). Mặt khác, giảm nhiệt độ đột ngột có khả năng ức chế khả năng dịch mã của tế bào vi khuẩn, do chức năng của ribosome bị ảnh hưởng và việc hình thành các mRNA có cấu trúc bậc hai bền vững (Weber & Marahiel, 2002; Mansilla et al., 2004).

Ngoài ra, B. subtilis tăng sinh tốt nhất trong điều kiện hiếu khí, mặc dù có

thể phát triển trong điều kiện yếm khí (Earl et al., 2008).

Về ảnh hưởng của pH, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng B. subtilis có thể phát triển tốt nhất trong khoảng pH từ 6,0 đến 8,0. Tuy nhiên, giá trị pH tối ưu cho nuôi cấy B. subtilis vẫn là 7,0 (Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018). Ở pH này, khả năng sinh bacteriocin của B. subtilis đối kháng Vibrio sp. cũng được cho là tốt nhất (Đỗ Thị Hiền, 2018).

B. subtilis có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ muối cao đến 7% (Bosch et al., 1994). Khi nồng độ muối trong môi trường tăng đột ngột, B. subtilis sẽ phản ứng với sốc thẩm thấu này bằng cách tích trữ ion K+ hoặc Na+ từ môi trường thông qua các kênh vận chuyển đặc hiệu hoặc không đặc hiệu (Sleator and Hill, 2002). Bằng cách này, B. subtilis có thể cân bằng áp suất thẩm thấu giữa tế bào chất với môi trường bên ngoài giúp duy trì sự sinh trưởng của tế bào ở một mức độ nhất định (Brill et al., 2011). Tuy nhiên, sự tăng nồng độ muối trong tế bào chất quá mức cũng ảnh hưởng xấu đến hoạt động của tế bào. Rất nhiều enzyme bị bất hoạt khi nồng độ NaCl hay KCl vượt quá mức 0,1-0,2M (Yancey et al., 1982). Do vậy, việc tích lũy K+ hoặc Na+ thường được coi là giải pháp tình huống để thích ứng với sốc thẩm thấu, nhưng không phải là phương pháp lâu dài để đối mặt với nồng độ muối cao trong môi trường. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sau giai đoạn tích lũy K+, B. subtilis sẽ tổng hợp nên các chất bảo vệ thẩm thấu như glycine betaine, proline, carnitine (Sleator and Hill, 2002). Những chất này, ngoài khả năng tạo cân bằng áp suất thẩm thấu, còn giúp ổn định cấu trúc của protein, enzyme nội bào. Trong nghiên cứu của Đỗ Thị Hiền (2018), khả năng kháng Vibrio sp. của chủng B. subtilis có tính đối kháng cao tăng khi nồng độ muối tăng dần từ 2-3,5%. Tuy nhiên, ở nồng độ NaCl 4%, khả năng

kháng Vibrio sp. giảm (thông qua đo đường kính vòng kháng khuẩn). Trong một nghiên cứu khác, Hồ Thị Trường Thy và ctv (2015) cũng quan sát thấy chủng B. subtilis B20.1 phát triển mạnh nhất ở nồng độ NaCl 3% (pH 6,0).

2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống

Bacillus là một chi có sự đa dạng sinh học cao với trên 200 loài (Cote & Welkos, 2015), do đó, việc phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa là rất phức tạp. Một trong những nghiên cứu đầu tiên cho phép phân loại một cách có hệ thống 18 loài thuộc chi Bacillus sử dụng một bộ tiêu chí gồm 33 đặc điểm hình thái và sinh lý. Hiện nay, phần lớn các loài Bacillus vẫn được xác định dựa trên nền tảng của nghiên cứu này.

Ngoài hạn chế về quy trình phức tạp và tốn thời gian, phương pháp phân loại truyền thống còn có nhược điểm là độ đặc hiệu thấp đặc biệt đối với B. subtilis (Rooney et al., 2009). Ví dụ, O’Donnell et al. (1980) đã chỉ ra rằng các chủng thuộc các loài B. subtilis, B. pumilus và B. licheniformis (cùng thuộc nhóm B. subtilis) có rất nhiều các đặc điểm kiểu hình giống nhau. Một số test sinh hóa (khả năng sinh α-amylase, khả năng lên men lactose...) được mô tả bởi Welker và Campbell (1967) được cho là có khả năng phân biệt B. subtilis và B. amyloliquefaciens. Tuy nhiên, kết luận này lại không được ủng hộ bởi Gordon et al. (1973).

Trong 30 năm trở lại đây, nhiều loài vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với B. subtilis đã được mô tả như Bacillus amyloliquefaciens (Priest et al., 1987), Bacillus atrophaeus (Nakamura et al., 1999), Bacillus axarquiensis (Ruiz-García et al., 2005; Wang et al., 2007), Bacillus malacitens (Wang et al., 2007), Bacillus mojavensis (Roberts et al., 1996), Bacillus sonorensis (Palmisano et al., 2001), Bacillus tequilensis, Bacillus vallismortis (Roberts et al., 1996) và Bacillus velezensis (Ruiz-García et al., 2005). Các loài vi khuẩn có trình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng rất cao với B. subtilis (≥ 99%) và rất khó để phân biệt các loài này với B. subtilis dựa trên đặc điểm kiểu hình hay đặc tính sinh hóa (Rooney et al., 2009). Do vậy, dựa trên ý tưởng của Gordon et al. (1973), các loài mới này được đề xuất xếp chung vào nhóm B. subtilis hay phức hợp B. subtilis (B. subtilis group hay B. subtilis complex) (Rooney et al., 2009).

2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử

Cùng với các tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực giải trình tự gen và sự ra đời của các cơ sở dữ liệu trình tự gen, phân loại vi sinh vật hiện nay chủ yếu dựa vào

các phương pháp sinh học phân tử. Cách tiếp cận hiệu quả nhất là định tên sơ bộ loài bằng kỹ thuật giải trình tự gen sau đó sử dụng phương pháp truyền thống để khẳng định lại kết quả giải trình tự.

Trong phân loại học vi khuẩn, giải trình tự gen 16S rDNA là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản và sự phong phú của các cơ sở dữ liệu với hàng chục triệu trình tự từ các loài vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên, đối với chi Bacillus nói chung hay loài B. subtilis nói riêng, kết quả giải trình tự 16S rDNA thường có độ tương đồng cao (> 98%) và chỉ cho phép sắp xếp các chủng vào các phân nhóm. Trong một nghiên cứu tiên phong, Rössler et al. (1991) đã giải trình tự 16S rDNA của B. alvei, B. laterosporus, B. macerans, B. macquariensis, B. polymyxa và B. stearothermophilus và tiến hành so sánh với trình tự 16S rDNA của B. subtilis. Các kết quả giải trình tự chỉ ra rằng chi Bacillus ít nhất được chia thành 4 “cluster” là B. subtilis (bao gồm B. stearothermophilus), B. brevis bao gồm B. laterosporus, B. alvei bao gồm B. macerans, B. maquariensis và B. polymyxa và B. cycloheptanicus. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng giải trình tự 16S rDNA không cho phép phân biệt các loài có quan hệ gần gũi với nhau, đặc biệt là các loài thuộc chi Bacillus do các trình tự có độ tương đồng quá cao (Janda and Abbott, 2007; Wang et al., 2007; Rooney et al., 2009). Ví dụ, hai loài B. globisporus và B. psychrophilus có độ tương đồng về trình tự 16S rDNA lên đến trên 99,5% (Fox et al., 1992).

Để giải quyết hạn chế này, một số cách tiếp cận mới đã được áp dụng bao gồm giải trình tự các gen cấu trúc (vốn có xu hướng tiến hóa nhanh hơn so với trình tự 16S rDNA); RFLP-PCR; độ dài đoạn inter-tRNA, MLST (Multi-locus Sequence Typing), giải trình tự toàn bộ thể gen bằng các công nghệ giải trình tự thế hệ mới.

Một trong những gen cấu trúc được đề xuất để thay thế cho 16S rDNA là gyrB. Đây là gen mã hóa cho protein tiểu đơn vị B của enzyme DNA gyrase, một DNA topoisomerase loại II, đóng vai trò thiết yếu trong sao chép DNA và được phân bố phổ biến ở vi khuẩn (Watt and Hickson, 1994; Huang, 1996). Tốc độ tiến hóa của gen gyrB được cho là nhanh hơn so với gen 16S rRNA (Yamamoto and Harayama, 1995). Vùng trình tự của gen này cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu cây phân loại của các chi Pseudomonas, Acinetobacter, Mycobacterium… Khi ứng dụng giải trình tự gen gyrB để phân loại 8 loài Bacillus, vốn được coi thuộc nhóm B. subtilis, Wang et al. (2007) đã nhận thấy độ tương đồng về trình

tự gen gyrB giữa 8 loài này biến đổi từ 75,4 đến 95,0% (trung bình là 81,6%) trong khi đó độ tương đồng về trình tự 16S rDNA là từ 98,1 đến 99,8 % (trung bình 98,9%). Các kết quả này cho thấy tốc độ biến đổi nucleotide của gen gyrB là cao hơn rõ rệt so với 16S rDNA. Khả năng phân loại khi sử dụng giải trình tự gen gyrB cũng cao hơn nhiều so với 16S rDNA và có khả năng phân biệt ở mức dưới loài. Một cách tương tự, giải trình tự gen đồng thời cả 2 gen cấu trúc rpoB và recA đã được áp dụng để xác định các loài Bacillus được phân lập từ đất để làm probiotic (Mohkam et al., 2016). Về mặt chức năng, rpoB mã hóa cho tiểu đơn vị β của RNA polymerase vốn đóng vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã ở vi khuẩn; trong khi đó recA mã hóa cho recombinase A ở vi khuẩn. Các kết quả giải trình tự cho thấy, cả rpoB và recA đều có khả năng phân loại cao hơn so với giải trình tự 16S rDNA. Đặc biệt, kết hợp cả hai trình tự gen này cho phép phân loại được hầu hết các chủng Bacillus (trừ một chủng cần khẳng định bằng thử nghiệm kiểu hình). Các kết quả này cho thấy giải trình tự các gen cấu trúc là một phương pháp thay thế hữu hiệu cho việc định tên các chủng Bacillus bằng giải trình tự 16S rDNA.

Một kỹ thuật cũng được sử dụng để xác định các chủng Bacillus được phân lập từ môi trường là RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Sen et al., 2015). Trong nghiên cứu này, tính đa hình trong trình tự gen HSP60 (Heat shock protein) đã được khai thác để phân loại các chủng Bacillus phân lập từ ao nuôi cá. Các bước của quy trình phân tích bao gồm: tách chiết DNA của chủng vi khuẩn, khuếch đại gen HSP60 bằng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, phân cắt bằng enzyme giới hạn (PstI hoặc TaqI), điện di sản phẩm cắt, và phân tích kết quả. Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật RFLP-PCR cho phép xác định được tên loài Bacillus trong hầu hết các trường hợp.

Kỹ thuật MLST (Multi-locus Sequence Typing) được đề xuất vào năm 1998 như là một kỹ thuật phổ quát để phân loại vi sinh vật. Như tên gọi đã chỉ ra, nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng trình tự của nhiều gen cấu trúc hoặc gen liên quan đến đặc tính gây bệnh để phân loại các chủng vi khuẩn hay nấm. Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng nhiều gen cấu trúc thay vì một gen cho phép xác định với độ tin cậy cao loài vi sinh vật. Mặt khác, kỹ thuật này còn cho phép định týp các chủng vi sinh vật trong cùng một loài (Maiden, 2006). Trong nghiên cứu tiên phong của mình, Maiden et al. (1998) đã đánh giá khả năng phân loại của MLST với 11 gen cấu trúc (housekeeping genes) trên một tập hợp gồm 107 chủng chuẩn Neisseria meningitides. Kết quả cho thấy khả năng phân loại của

MLST hoàn toàn tương đương với các phương pháp phân loại truyền thống khác. Bên cạnh đó, với dữ liệu từ 6 trình tự gen cấu trúc có tính đa hình cao nhất đã đủ để đạt đến độ phân giải khi sử dụng tất cả 11 trình tự gen. Ngoài khả năng phân loại cao, ưu điểm chủ yếu của kỹ thuật MLST so với các phương pháp phân loại khác là trình tự rõ ràng, có khả năng so sánh dễ dàng với các ngân hàng dữ liệu về trình tự trên thế giới. Hiện nay, có hơn 30 quy trình phân tích MLST và cơ sở dữ liệu đã được công bố, chủ yếu dành cho vi khuẩn và nấm gây bệnh (Maiden, 2006). Phương pháp này cũng đã được áp dụng thành công để phân loại các chủng thuộc nhóm B. cereus, bao gồm B. cereus, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis và B. anthracis (Helgason et al., 2004). Với việc sử dụng 7 gen cấu trúc (Bảng 2.1), MLST cho phép phân loại được 53 kiểu trình tự từ 67 chủng chuẩn trong đó 5 chủng B. anthracis đều có cùng một kiểu trình tự. Các kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp MLST có độ phân giải rất cao cho phép phân biệt được chủng vi khuẩn ở mức độ dưới loài (Helgason et al., 2004). Do vậy, phương pháp MLST rất phù hợp để sử dụng trong nghiên cứu này, nhằm xác định và phân loại các chủng B. subtilis phân lập được từ các ao nuôi tôm.

Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B. cereus bằng kỹ thuật MLST

Tên gen

Chức năng

ilvD ptA purH pycA glpF rpoD tpiA

Dihydroxy-acid dehydratase Phosphate acetyltransferase Bifunctional purine biosynthesis protein Pyruvate carboxylase Glycerol uptake facilitator protein RNA polymerase sigma factor Triosephosphate isomerase

Gần đây, với các tiến bộ trong các công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing hay NGS), có thể tiến hành định tên, phân loại các chủng vi khuẩn dựa trên trình tự toàn bộ hệ gen của chúng. Kulsum et al. (2018) đã phát triển NGSPanPipe cho phép xác định loài vi khuẩn cũng như phân loại chúng dựa trên các dữ liệu đọc thô từ các công nghệ NGS hiện hành.

Số lượng các nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể vi khuẩn trong đất, trong ao nuôi trồng thủy sản ở nước ta hiện còn rất ít. Thời gian gần đây bắt đầu có một vài nghiên cứu về đa dạng di truyền như: nghiên cứu sử dụng chỉ số

đa dạng sinh học loài H (species diversity Shannon and Weiner’s index) trong đánh giá tính đa dạng di truyền của quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat phân lập từ nước ao nuôi cá tra (Lê Quang Khôi và Cao Ngọc Điệp. 2013); sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Xanthomonnas (Phan Hữu Tôn, 2009)... Tuy nhiên, theo sự hiểu biết của tác giả, hiện chưa có nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá đa dạng di truyền của vi khuẩn Bacillus sp. được phân lập từ môi trường ao nuôi tôm. Các hiểu biết này rất cần thiết để phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm bền vững ở nước ta.

2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản

Các chủng B. subtilis đóng một vai trò quan trọng trong các quy trình lên men công nghiệp, giúp thay thế các quá trình tổng hợp hóa học truyền thống, kém hiệu quả và thường gây ô nhiễm môi trường. Các sản phẩm thương mại từ B. subtilis bao gồm các hợp chất hóa học, kháng sinh cho tới vitamin và enzyme thực phẩm (Schallmey et al., 2004). Ưu điểm của việc sử dụng Bacillus nói chung hay B. subtilis nói riêng so với các loại vi khuẩn khác là khả năng nuôi cấy dễ dàng với mật độ cao, khả năng biến đổi gen nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp, khả năng tiết enzyme và các sản phẩm thứ cấp.

Một ứng dụng quan trọng khác của Bacillus là probiotic. Theo định nghĩa của Tổ chức Nông lương (FAO) hay Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của ký chủ. Riêng đối với nuôi trồng thủy sản, cần nhấn mạnh rằng hệ vi sinh đường ruột của các cá thể trong ao nuôi không tồn tại riêng rẽ, mà có sự tương tác liên tục với môi trường nước xung quanh. Do vậy, hệ vi sinh vật trong môi trường nước ao nuôi có ảnh hưởng qua lại đến hệ vi sinh vật của tôm, cá (Cahill, 1990).

Trong nuôi trồng thủy hải sản, tôm cá có thể phải sống trong môi trường có nhiều vi sinh vật gây bệnh do tồn tại nhiều chất thải và dinh dưỡng dư thừa, có lợi cho sự phát triển của mầm bệnh. Do vậy, việc bổ sung probiotic vào môi trường nuôi trồng thủy sản ngoài tác dụng trực tiếp tăng sự đề kháng của vật nuôi còn cho phép cải thiện điều kiện môi trường, giảm nguy cơ phát triển của mầm bệnh. Các cơ chế hoạt động của các chế phẩm probiotic đã được xác định bao gồm: tăng khả năng cạnh tranh không gian và dinh dưỡng, sinh các chất ức chế diệt mầm bệnh, khả năng cải thiện môi trường, cơ chế điều hòa miễn dịch và giảm stress cho vật nuôi (Mohkam et al., 2016).

Nhiều vi khuẩn gây bệnh cần bám vào các thụ thể trên đường tiêu hóa vật chủ để lây nhiễm gây bệnh. Probiotic có thể cạnh tranh các vị trí bám thụ thể trong đường tiêu hóa của vật chủ và cản trở sự sinh sôi của vi sinh vật gây bệnh (Balcazar et al., 2006). Một ví dụ cho cơ chế này là các chủng Lactobacilli có khả năng bám dính cao trên bề mặt mô ruột. Việc bổ sung các probiotic hoạt động theo cơ chế này được khuyến cáo nên thực hiện sớm, khi mật độ vi sinh vật có hại còn thấp (Irianto and Austin, 2002).

Vi khuẩn probiotic có khả năng tạo ra các hợp chất diệt khuẩn hoặc ức chế vi khuẩn như các bacteriocin, hydrogen peroxide, lysozyme hay protease. Một số ví dụ cho cơ chế này là indole benzopyrrole và Subtilosin A. Ngoài ra, một số loài còn có khả năng sinh axít (axít lactic, axít acetic, axít butyric và axít propionic), dẫn đến giảm pH trong ống tiêu hóa và ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh (Mohkam et al., 2016).

Sự tồn tại của các quần thể vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào khả năng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn khác trong cùng môi trường. Nhiều vi sinh vật probiotic, bao gồm Lactobacillus và Bacillus sp., cạnh tranh các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của mầm bệnh. Một ví dụ khác là các vi khuẩn sinh siderophore, có khả năng tích tụ ion sắt từ môi trường vào nội bào, khiến các vi sinh vật gây hại khác không có đủ ion sắt cần thiết cho sự phát triển (Tinh, 2007). Theo cơ chế này, sự phát triển của Vibrio anguillarum bị ức chế khi có sự hiện diện của Pseudomonas fluorescens (Holden et al., 1999).

Probiotic được cho là có thể cải thiện khả năng miễn dịch tự nhiên của tôm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm khi bổ sung probiotic vào ao nuôi (Balcazar et al., 2006). Từ đó, tăng sức đề kháng của tôm với các bệnh như Vibriosis hay đốm trắng (Ahilan et al., 2004).

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng đối kháng của vi khuẩn B. subtilis đối với nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh. Một nghiên cứu điển hình trong lĩnh vực này là của Balcázar et al. (2007). Nhóm nghiên cứu đã phân lập được chủng probiotic B. subtilis UTM 126 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm giống (L. vannamei) đối với bệnh Vibriosis gây ra bởi V. harveyi. Cụ thể, tôm giống được cho ăn bổ sung chủng B. subtilis nói trên ở nồng độ 105 cfu/g trong 28 ngày liên tục trước khi được cảm nhiễm chủ động với V. harveyi TR51 ở nồng độ 105 cfu/mL trong 24 giờ. Kết quả cho thấy tỉ lệ chết của tôm giống giảm 2,84 lần từ 51,75% xuống 18,25%. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu này cũng đã quan sát thấy

loài B. subtilis UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối kháng các dòng vi khuẩn thuộc loài V. alginolyticus và V. parahaemolyticus tuy nhiên khả năng đối kháng là kém so với V. harveyi.

Nghiên cứu của Zokaeifar et al. (2012) cho thấy bổ sung hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức ăn giúp tăng trưởng về khối lượng của tôm tăng nhanh gấp hơn 1,5 lần. Sau 8 tuần được bổ sung probiotic, tôm được gây cảm nhiễm chủ động với V. harveyi. Kết quả phân tích cho thấy nhóm tôm được bổ sung probiotic có tỷ lệ chết (20,0% với liều bổ sung là 108 cfu/g thức ăn và 33,3% với liều bổ sung là 105 cfu/g thức ăn) thấp hơn nhiều (63,3%) so với nhóm đối chứng (không được bổ sung probiotic). Kết quả nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến hệ miễn dịch của tôm bằng real-time RT-PCR cho thấy các gen này đều có sự biểu hiện tăng lên đáng kể. Từ đây, nhóm tác giả cho rằng việc bổ sung hỗn hợp 2 chủng B. subtilis L10 và G1 đã giúp tăng khả năng đề kháng với V. harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm.

Xu et al. (2013) lại ứng dụng chủng B. subtilis NT-6 để kiểm soát sự phát triển của V. parahaemolyticus trong ao nuôi tôm. Loài B. subtilis này có khả năng sinh bacteriocin AMPNT-6 ức chế V. parahaemolyticus (đường kính vòng kháng khuẩn lên đến 15,5 mm; MIC = 1,25 mg/mL). Hơn nữa, khi nuôi cấy V. parahaemolyticus ở các nồng độ bacteriocin khác nhau, đều có thể quan sát thấy thời gian “lag phase” của Vibrio bị kéo dài và lượng vi khuẩn có sự suy giảm sau 12 giờ. Cuối cùng, khi nuôi cấy cùng với tôm, với nồng độ AMPNT-6 ở mức 2,5 mg/mL, sự phát triển của V. parahaemolyticus có thể được kiểm soát ở mức dưới 1 Log cfu/mL.

Trong một nghiên cứu khác, Liu et al. (2015) sau khi phân lập được 249 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm thủy sản, đã phát hiện 24 chủng có khả năng đối kháng trực tiếp với Vibrio. Trong số đó, 2 chủng vi khuẩn thuộc loài B. pumilus và B. mojavensis có khả năng tiết các chất ức chế vi khuẩn Vibrio (đường kính vòng kháng khuẩn lên đến 11 mm trên đĩa nuôi các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus ATCC 33847, V. vulnificus và V. harveyi). Kết quả này cho thấy, hai chủng Bacillus nói trên có tính đối kháng với nhiều loài Vibrio gây hại khác nhau.

Khả năng đối kháng Vibrio của B. pumilus cũng được quan sát thấy bởi Gao (2017). Các tác giả chỉ ra rằng chủng B. pumilus H2 có khả năng đối kháng 29 chủng Vibrio khác nhau thông qua các hợp chất ngoại bào, nồng độ ức chế tối

thiểu nằm trong khoảng 0,25 đến 64 μg/mL. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nhóm tác giả quan sát thấy nhiều hư hại trên bề mặt tế bào và cả các cơ quan nội bào của vi khuẩn Vibrio. Các hợp chất kháng Vibrio này có cấu trúc tương tự với amicoumacin A, tuy nhiên, cơ chế hoạt động chi tiết vẫn chưa rõ ràng (Gao, 2017).

2.7 Bacteriocin

2.7.1 Khái niệm

Giống như tất cả các sinh vật trong tự nhiên, vi khuẩn cũng có cơ chế tự bảo vệ riêng. Các hợp chất như kháng sinh, bacteriocin, lysozyme, siderophore, protease, axít hữu cơ làm giảm pH môi trường được vi khuẩn tạo ra để bảo vệ chúng khỏi các tác nhân gây hại khác hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh trong môi trường sống. Trong số đó, bacteriocin được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, hàng trăm loại bacteriocin khác nhau đã được phát hiện (Riley and Gordon, 1992).

Bacteriocin có bản chất là các peptide kháng khuẩn được tổng hợp ở ribosom ở nhiều loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin là rất lớn đi từ lĩnh vực bảo quản thực phẩm đến việc phát triển các loại kháng sinh thế hệ mới thay thế cho các kháng sinh cổ điển hiện đang còn không còn tác dụng trên các loại vi khuẩn kháng thuốc (Gillor and Ghazaryan, 2007). Khác với nhiều loại kháng sinh truyền thống được sử dụng trong y tế, khả năng kháng khuẩn của bacteriocin là nhờ việc hình thành các lỗ trên bề mặt tế bào (gây ly giải tế bào) hoặc can thiệp vào quá trình tổng hợp thành tế bào (ức chế sự sinh trưởng) (Riley et al., 2011).

Bên cạnh các vi khuẩn lactic (LAB), chi Bacillus được coi là nhóm vi khuẩn sản xuất bacteriocin quan trọng thứ hai (Abriouel et al., 2011). Hiện nay, người ta quan tâm ngày càng nhiều đối với các bacteriocin từ chi Bacillus bởi vì chúng có phổ ức chế rộng hơn LAB (Abriouel et al., 2011). Các bacteriocin từ LAB chủ yếu có hoạt tính trên các vi khuẩn Gram dương, trong khi một số chủng Bacillus sinh bacteriocin có thể ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, cũng như nấm. Vi khuẩn B. subtilis đã được chứng minh là tạo ra một loạt các bacteriocin như Subtilin, Subtilosin A, ericin S và ericin A (Teixeira et al., 2013).

Môi trường nước biển có sự khác biệt đáng kể với môi trường sống trên cạn và nước ngọt. Mật độ ước tính của vi khuẩn trong nước biển và trầm tích biến đổi lần lượt từ 105 đến 107 cfu/mL và 108 - 1010 cfu/g (Austin, 1988). Hiện nay,

bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn phân lập từ biển được các nhà nghiên cứu quan tâm do tiềm năng ứng dụng của chúng làm men vi sinh và kháng sinh trong ngành thủy sản (Pilet et al., 2011). Loại bacteriocin nước mặn đầu tiên được phân lập từ V. harveyi bởi McCall và Sizemore khi sàng lọc 795 chủng Vibrio sp. được phân lập từ đảo Galveston (McCall and Sizemore, 1979). Việc xác định harveyicin đã dẫn đến nhiều nghiên cứu sàng lọc bacteriocin ở vi khuẩn nước mặn, trong đó tập trung vào đặc tính hóa sinh của các bacteriocin. Một nghiên cứu khác của Wilson et al (2010) cho thấy có khoảng 10% vi khuẩn biển trong các biofilm có hoạt tính kháng khuẩn. Sàng lọc kháng khuẩn đối với 258 chủng vi khuẩn từ nước và trầm tích ở bán đảo Yucatan đã phát hiện 46 chủng vi khuẩn từ các chi Aeromonas, Burkholderia, Photobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia và Stenotrophomonas với hoạt tính kháng khuẩn. Khoảng 50% tính kháng khuẩn này được quy cho các bacteriocin (Garcia et al., 2010). Một loại bacteriocin chịu nhiệt BL8 từ B. licheniformis ở trầm tích biển cũng đã được phát hiện (Smitha and Bhat, 2012). Một số vi khuẩn đặc biệt là những vi khuẩn trong đường tiêu hóa, cũng có khả năng tạo bacteriocin nhằm kiểm soát sự xâm nhập của mầm bệnh tiềm tàng trong cá (Sugita et al., 1997). Điển hình, chủng B. amyloliquefaciens BTSS3 từ ruột cá mập có khả năng tạo bacteriocin chịu nhiệt và chịu pH (Bindiya et al., 2015).

Gen sboA (mã hóa Subtilosin A) và spaS (mã hóa Subtilin) là hai ví dụ điển hình về gen sinh bacteriocin ở Bacillus. sboA lần đầu được phát hiện ở B. subtilis, dài 132 bp, và mã hóa cho một peptide tiền chất dài 43 axít amin (Babasaki et al., 1985). Trình tự peptide này mang một đoạn peptide dẫn đường ở đầu N (8 axít amin) được vận chuyển đến màng tế bào và được các peptidase ở màng ngoài tế bào cắt bỏ peptide dẫn đường và tiết peptide chín (dài 35 axít amin) ra bên ngoài tế bào (van Belkun et al., 2011). Hiện nay, sboA còn được tìm thấy ở B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, Bacillus sp., và có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng (Velho et al., 2013).

Gen spaS lần đầu được phát hiện ở B. subtilis, dài 171 bp, và mã hóa cho một tiền chất peptide dài 56 axít amin (Chung et al., 1992). Tiền chất Subtilin sau khi sinh ra sẽ được loại bỏ trình tự dẫn đường (24 axít amin ở đầu N) và vận chuyển qua màng tế bào chất bởi các protein SpaB, SpaC và ABC transporter để tiết ra ngoài môi trường (Stein et al., 2003). Tương tự sboA, spaS được phát hiện ở một số chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. amyloliquefaciens (Velho et al.,

2013). Subtilin có khả năng diệt nhiều loài vi khuẩn Gram dương ngay từ ngưỡng nồng độ thấp, ở mức nanomolar (Parisot et al., 2007).

2.7.2 Phân loại Bacteriocin

Theo Rea et al. (2011), bacteriocin có thể được chia thành 4 nhóm sau:

 Nhóm I: bao gồm các bacteriocin gọi chung là lantibiotic, có khối lượng < 5kDa, có chứa axít amin đặc biệt bao gồm lanthionine (Lan), α–methyllanthionin (MeLan), dehydroalanine, và dehydrobutyrine. Dựa vào cấu trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn nhóm I lại được chia thành loại A và B lantibiotic.

Lantibiotic loại A có chuỗi peptid dài và mang điện tích dương. Một số lantibiotic loại A điển hình như: nisin từ Lactococcus lactis, lactocin S từ Lactobacillus sake, subtilosin A từ B. subtilis, gallidermin từ S. epidermidis và lacticin 481 từ L. lactis.

từ Streptomyces cinnamoneus; ancovenin và duramycin

Lantibiotic loại B là peptid dạng cầu có kích thước nhỏ hơn, tích điện âm hoặc không mang điện. Đại diện cho nhóm này như: mersacidin từ Bacillus spp.; cinnamycin từ Streptomyces và Streptoverticilium.

 Nhóm II: Các bacteriocin có kích thước < 10kDa, bền nhiệt và tác động lên màng tế bào, trong đó phân nhóm IIA là các bacteriocin giống như pediocin có hoạt tính kháng Listeria, phân nhóm IIB là các bacteriocin có cấu trúc gồm 2 chuỗi peptid.

 Nhóm III: bao gồm các protein có hoạt tính kháng khuẩn với kích thước >

30kDa, không bền nhiệt như heveticins từ Lactobacillus heleveticus.

 Nhóm IV: các bacteriocin có cấu trúc phức hợp với lipid hay cacbohydrat

để thể hiện hoạt tính.

Về cấu trúc, phần lớn các loại bacteriocin có cấu trúc phức tạp, thường chứa một số axít amin hiếm và nhiều cầu bisulfua giữa các axít amin không phải Cystein (subtilosin, lactisin, nisin,...).

2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản

Hiện nay, một số chủng Bacillus được bán trên thị trường dưới dạng probiotic, có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây hại thông qua sản sinh bacteriocin. Một số cơ chế hoạt động bao gồm tạo lỗ trên màng tế bào vi sinh vật gây bệnh (lantibiotics) hay kìm hãm các quá trình sinh tổng hợp

(mersacidin và nisin) (Sahoo et al., 2014). Ví dụ, chủng Bacillus sp. S11 (Rengpipat et al., 1998), Bacillus sp. 48 (Wang et al., 2008), B. coagulans SC8168 (Zhou et al., 2010) hay hỗn hợp các chủng Saccharomyces cerevisiae, S. exiguous, Phaffia rhodozyma (Scholz, 1999) đã được áp dụng thành công trong nuôi tôm công nghiệp

Tiếp tục hướng nghiên cứu này, nhiều công bố gần đây đã phát hiện các loại bacteriocin từ Bacillus sp. có khả năng kháng cả vi khuẩn gây bệnh Gram âm và Gram dương (Bảng 2.2). Ứng dụng các loại bacteriocin này hoặc các chủng vi khuẩn tổng hợp ra chúng sẽ giúp phát triển nuôi trồng thủy sản một cách bền vững.

Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp. được công bố trong khoảng thời gian 2000-2019

Tác giả

Đặc tính bacteriocin

Tên vi khuẩn phân lập bacteriocin

Park et al., 2002 B. subtilis CAU131

B. cereus

Torkar et al., 2003

Ghanbari et al., 2009

Bacillus sp. strain RF 140

B. subtilis R75

Sharma et al., 2011

B. subtilis H27

B. thuringiensis subsp. kurstaki Bn1

B. sonorensis MT93

Kindoli et al., 2012 Ugras et al., 2013 Chopra et al., 2013

Kim et al., 2014 Bacillus sp. SW1-1

Subtilein đối kháng Bacillus sp., Streptococcus sp., E. coli, Pseudomonas sp., Shigella sp. Bacteriocin đối kháng B. licheniformis, B. subtilis, Enterococcus faecalis, E. coli, S. aureus, Lactobacillus helveticus, L.casei Bacteriocin đối kháng L. monocytogenes, C. perfringens và Bacillus sp. Bacteriocin đối kháng L. monocytogenes, L. plantarum, S. aureus, B. subtilis, C. perfringens, B.cereus, E. coli, L. mesenteroides Bacteriocin đối kháng B. cereus, L. monocytogenes Bacteriocin đối kháng B. cereus, Lactococcus lactis, L. monocytogenes Bacteriocin đối kháng L. monocytogenes, S. aureus Bacteriocin đối kháng E. tarda, S. iniae, S. parauberis, V. anguillarum, and V. harveyi.

B. subtilis KKU213

Khochamit et al., 2015

B. subtilis GAS101

Sharma et al., 2018

Qin et al., 2019

B. subtilis L-Q11

Bacteriocin đối kháng B. cereus, L. monocytogenes, Micrococcus luteus, S. aureus Bacteriocin đối kháng S. epidermidis, E. coli Bacteriocin đối kháng B. amyloliquefaciens, B. cereus, Lactococcus lactis, L. plantarum, S. aureus, E. coli, E. faecalis, fungi

2.7.4 Subtilosin A

Subtilosin A là một loại peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi B. subtilis ATCC 6633 và các chủng B. subtilis khác, cũng như một số chủng B. amyloliquefaciens (Babasaki et al., 1985; Stein et al., 2004; Sutyak et al., 2008) và B. atrophaeus (Stein et al., 2004).

Về mặt cấu trúc, đây là một peptide vòng bao gồm 35 axít amin trong đó đầu N và đầu C được nối với nhau bởi liên kết amide giữa gốc asparagine và gốc glycine (Hình 2.9). Nó cũng chứa ba cầu nối bisulfua của cystein và nguyên tử carbon alpha của phenylalanine và threonine (Marx et al., 2001; Kawulka et al., 2003, 2004). Chính vì điểm đặc biệt trong các cầu nối bisulfua của Subtilosin A so với các bacteriocin khác (thường bao gồm các axít amin lanthionine và methyllanthionine) nên bacteriocin này được phân loại thành một phân nhóm riêng trong nhóm lantibiotic (Kawulka et al., 2003, 2004).

Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011)

Với khối lượng phân tử 3399,7 Da (Marx et al., 2001), subtilosin A có điểm đẳng điện axít (Stein et al., 2004) và độ ổn định cao dưới sự thay đổi của nhiệt độ và pH (Sutyak et al., 2008). Ngoài ra, bacteriocin này có đặc tính kháng

khuẩn chống lại L. monocytogenes và cũng như một số vi khuẩn Gram âm (Shelburne et al., 2007).

Một biến thể của subtilosin A (subtilosin A1) được sản xuất bởi một đột biến tán huyết (hemolytic mutant) của B. subtilis. Nó có sự thay thế của một threonine ở vị trí thứ 6 bằng isoleucine (Huang et al., 2009). Đột biến này của Subtilosin A1 làm tăng hoạt động kháng khuẩn đối với Bacillus sp., E. faecalis, S. pyogenes, Staphylococcus carnosus và L. monocytogenes (Huang et al., 2009).

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu

Mẫu được thu tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau với 5 đợt thu mẫu (trong

khoảng thời gian từ tháng 9/2013 đến tháng 9/2015. Số lượng mẫu thu được trình bày trong Bảng 3.1; thông tin chi tiết về địa điểm, thời gian, và tính hình ao thu mẫu được trình bày trong bảng A1 phục lục A.

Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau

Mẫu đã lấy

Địa bàn

Mẫu nước

Mẫu bùn

Mẫu tôm

Bạc Liêu

(5 ao bệnh, 6 ao khỏe)

Cà Mau

(5 ao bệnh, 5 ao khỏe)

Sóc Trăng

(3 ao bệnh, 3 ao khỏe)

Tổng

Các nội dung và trình tự nghiên cứu được tóm tắt và sơ đồ hóa như Hình

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.1:

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

a) Vị trí lấy mẫu

- Mẫu vi khuẩn trong nước, bùn và ruột tôm được thu tại các ao tôm khỏe và các ao tôm đang bệnh ở 3 tỉnh Bạc Liêu (6 ao khỏe, 5 ao bệnh), Sóc Trăng (3 ao khỏe, 3 ao bệnh) và Cà Mau (6 ao khỏe, 4 ao bệnh). Các ao tôm khỏe và bệnh có các đặc điểm như sau:

- Ao tôm khỏe là ao tôm nuôi đạt năng suất cao trong 2-3 vụ liên tục. Mẫu được lấy tại thời điểm tôm khỏe với khối lượng 25- 45g (tôm sú) và 15-25g (tôm thẻ) (12 ao tôm sú khỏe và 3 ao tôm thẻ chân trắng khỏe). Ao tôm bệnh là những ao tôm nuôi bị dịch bệnh và thất bại trong 2-3 vụ liên tục. Mẫu được thu tại thời điểm tôm bệnh trong các ao tôm sú, và tôm thẻ ở giai đoạn 25-30 ngày tuổi (7 ao tôm sú bệnh và 5 ao tôm thẻ chân trắng bệnh).

Mẫu sau đó được bảo quản và chuẩn bị theo TCVN 6507:2005 và

TCVN 6404:2007, TCVN 5287:2008.

b) Cách thức thu mẫu

Mẫu vi khuẩn được thu trong nước và bùn tại 5 vị trí trong ao và được trộn đều để thu nhận mẫu đại diện. Sau đó, mẫu được bảo quản trong thùng đá và được chuyển ngay về phòng thí nghiệm để phân tích (Tran et al., 2013; OIE, 2013).

- Mẫu nước: Bình thủy tinh 500 mL có nút đậy đã khử trùng được dùng để thu mẫu, gắn bình vào cây có thước đo độ dài, nút bình cột vào một sợi dây, sau đó thả bình xuống tới độ sâu khoảng 1 m rồi rút dây kéo nắp bình lên để cho nước tràn vào bình. Thu nước ở 5 điểm (4 góc cạnh ao và ở giữa ao), trộn đều và phân phối 50 mL vào 6 ống falcon tiệt trùng.

- Mẫu bùn được thu tại 5 điểm (4 góc cạnh ao và ở giữa ao), mỗi điểm lấy khoảng 500 gam đất, trộn đều và phân phối (đổ đầy) vào 4 ống falcon 50 mL tiệt trùng.

- Mẫu tôm được thu ngẫu nhiên (khoảng 30 con) tại mỗi ao nuôi. Sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm, khử trùng bề mặt tôm bằng cồn 70%, dùng dao kéo đã khử trùng cắt mổ lấy tuyến tiêu hóa rồi nghiền trong cối sứ.

3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm

Để phân lập Vibrio sp. từ các mẫu tôm, đất và nước ao nuôi tôm; 1 g mẫu được đồng hóa trong 9 mL canh trường APW (Alkaline Peptone Water). Mẫu sau quá trình tăng sinh bằng cách ủ ở 37°C trong 24 giờ, được tiến hành pha loãng đến các nồng độ pha loãng thích hợp (10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Tiếp đó, 100 µL các dịch pha loãng được cấy trải lên đĩa petri chứa môi trường thạch TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt agar). Các đĩa thạch được ủ ở 37ºC trong 48 giờ. Sau đó, tiến hành chọn các khuẩn lạc tròn đường kính 2-3 mm có màu vàng (nghi là V. cholera, V. fluvialis hay V. alginolyticus) hoặc có màu xanh lá (nghi là V. parahemolyticus hoặc V. vulnificus) để cấy ria lên môi trường thạch TCBS cho tới khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc duy nhất trên môi trường. Các chủng nghi là Vibrio sau đó được bảo quản trong glycerol 50% ở -80ºC cho tới khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

Các dòng khuẩn lạc có màu xanh lá trên môi trường TCBS tiếp tục được cấy ria lên môi trường CHROMagar Vibrio Chromogenic. Những khuẩn lạc có màu tím hoa cà trên môi trường này được xác định là V. parahaemolyticus.

3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được

Việc phát hiện các gen độc tố ở các chủng Vibrio được tiến hành theo quy

trình chung được trình bày ở Hình 3.2.

Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus

Đầu tiên, các chủng Vibrio được cấy ria trên môi trường CHROMagar và được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc được tạo thành (Hình 3.3).

Hình 3.3. Hình thái các loài Vibrio trên môi trường CHROMagar (CHROMagar, Paris, France)

Sinh khối của một khuẩn lạc đặc trưng được lấy bằng đầu côn và chuyển vào ống eppendorf chứa 100 µl TE (10 mM Tris-Cl pH 8,5; 1 mM EDTA). Sau đó, ống eppendorf này được ủ ở 95oC trong 10 phút rồi làm nguội trong đá trước khi được ly tâm 10000 × g trong 2 phút. Sau khi ly tâm, 2 µl dịch nổi chứa DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR phát hiện các gen độc tố theo các quy trình cụ thể được trình bày ở dưới đây.

3.2.3.1 pirA

Việc phát hiện gen pirA ở các chủng Vibrio phân lập từ ao nuôi tôm được tiến hành theo quy trình PCR công bố bởi nhóm nghiên cứu của Han et al. (2015). Các phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 50 μL chứa 25 μL GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix 2X (Promega); 0,5 μM mồi xuôi VpPirA-284F (5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG-3’) và 0,5 μM mồi ngược VpPirA-284R (5’-CACGACTAGCGCCATTGTTA-3’), 2 µL DNA. Chương trình nhiệt đã được sử dụng để khuếch đại gen pirA: biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ khuếch đại (biến tính ở 94oC trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 60oC trong 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 30 giây) và kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR (284 bp) được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2% sử dụng đệm TAE 1X. Sau khi điện di, gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/mL) và rửa với nước sạch trước khi chụp ảnh với ánh sáng kích thích UV ở bước sóng 254 nm.

3.2.3.2 pirB

(5’-TGATGAAGTGATGGGTGCTC-3’)

và VpPirB-392F

Việc phát hiện gen pirB ở các chủng Vibrio phân lập từ ao nuôi tôm được tiến hành tương tự như đối với gen pirA (Han et al., 2015). Cặp mồi VpPirB- 392F (5’- TGTAAGCGCCGTTT-AACTCA-3’) được sử dụng để khuếch đại một đoạn dài 392 bp của gen này.

3.2.3.3 toxR

lập được có phải

Việc xác định các chủng Vibrio phân

2X

(Promega);

toxR-F

xuôi

mồi

là V. parahaemolyticus hay không được tiến hành dựa vào sự phát hiện gen toxR theo quy trình được công bố bởi Kim et al. (1999). Các phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 50 μL chứa 25 μL GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix (5’- μM 0,5 toxR-R (5’- GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’) và 0,5 μM mồi ngược ATACGAGTGGTTGCTGTCATG -3’), 2 µL DNA. Chương trình nhiệt cho PCR là: biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ khuếch đại (biến tính ở 94oC trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 63oC trong 1 phút 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 30 giây) và kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR (366 bp) được phân tích bằng điện di trên gel agarose như đã miêu tả ở trên.

3.2.3.4 tdh

Việc xác định các chủng Vibrio phân lập được có sinh độc tố TDH hay không được thực hiện thông qua việc phát hiện gen tdh theo quy trình được công bố bởi Bej et al., (1999). Các phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 50 μL chứa 25 μL GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix 2X (Promega); 0,5 μM mồi xuôi L-tdh (5’-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3’) và 0,5 μM mồi ngược R-tdh (5’-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3’), 2 µL DNA. Chương trình nhiệt cho PCR là: biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ khuếch đại (biến tính ở 94oC trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 58oC trong 1 phút, kéo dài ở 72oC trong 30 giây) và kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR (269 bp) được phân tích bằng điện di trên gel agarose như đã miêu tả ở trên.

3.2.3.5 trh

Tương tự như đối với gen tdh, việc phát hiện gen trh bằng PCR sẽ cho phép xác định chủng Vibrio phân lập được có sinh độc tố TRH hay không (Bej et al., 1999). Quy trình được tiến hành hoàn toàn giống như đối với gen tdh ngoài việc cặp mồi được sử dụng ở đây là L-trh (5’-TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT- 3’) và R-trh (5’-CATAACAAACATATGCCCATTTCCG-3’) để phát hiện một đoạn dài 500 bp của gen này.

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus

Ảnh hưởng của các thông số môi trường nhiệt độ, pH, độ mặn đến sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus được thực hiện qua từng thí nghiệm riêng biệt và được bố trí trong các ống falcon 15 mL (thể tích nuôi 3 mL). Cụ thể, các chủng vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Mật độ vi khuẩn sau đó được xác định bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng ở OD600 (dựa vào đường chuẩn tương quan xây dựng được). Các chủng vi khuẩn sau đó được cấp giống vào các ống falcon với mật độ ban đầu là 103 cfu/mL. pH của các ống nuôi được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH 1N. Các ống falcon được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ ổn định, kết hợp với máy lắc 200 vòng/phút (Beuchat, 1973). Sau 24 giờ, 50 µL dịch nuôi được cấy trải lên đĩa thạch TCBS và số khuẩn lạc được đếm sau 24 giờ và 48 giờ ủ tại 37oC. Số vi khuẩn sống được tính theo công thức: (số khuẩn lạc/thể tích cấy trải) × hệ số pha loãng. Các thí nghiệm bao gồm:

a - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi

khuẩn V. parahaemolyticus

Thí nghiệm được bố trí với các mức nhiệt độ khác nhau tương ứng với các nghiệm thức ở 26oC, 30oC, 37oC, mỗi nghiệm thức được bố trí 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện trong ống falcon 15 ml, mỗi ống cho 3 mL môi trường TSB (Himedia) có bổ sung thêm 2% NaCl, điều chỉnh pH ban đầu ổn định ở mức 8,0.

b - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi

khuẩn V. parahaemolyticus

Thí nghiệm được bố trí tương tự như trên ở các mức pH khác nhau tương ứng với các nghiệm thức là 5,0; 6,0; 7,0 và 8,0. Mỗi nghiệm thức cũng được lặp lại 3 lần. pH được điều chỉnh bằng HCl 1N (hoặc NaOH 1N) để có được các giá trị pH thí nghiệm.

c - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ NaCl (độ mặn) đến sự

phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus

Các độ mặn được bố trí tương ứng với các nghiệm thức khác nhau bao gồm 0‰, 5‰, 10‰, 20‰, và 40‰. Độ mặn được điều chỉnh bằng cách dùng nước muối 100‰ pha với nước ngọt để có được độ mặn thích hợp ở các nghiệm thức. Nước có độ mặn thích hợp sau đó được khử trùng trước khi sử dụng. Tương tự như các thí nghiệm khác, mỗi nghiệm thức cũng được bố trí 3 lần lặp lại.

3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp

3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu được thực hiện như đã trinh bày trong mục 3.2.1

3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm

Các chủng Bacillus sp. được phân lập từ các mẫu tôm, đất và nước ao nuôi tôm theo khóa phân loại Bergey (2009) có biến đổi một số thông số. Để phân lập Bacillus sp. từ các mẫu tôm, đất và nước ao nuôi tôm, 1 g mẫu được đồng hóa trong 9 mL canh trường NB (Nutrient broth). Mẫu đồng hóa được ủ 10 phút ở 80oC trong bể ổn nhiệt nước để loại bỏ tế bào sinh dưỡng. Dịch nổi tiếp đó được pha loãng thập phân bằng canh trường NB đến các nồng độ pha loãng thích hợp (10-2, 10-3, 10-4, 10-5). Sau đó, 100 µL các dịch pha loãng được cấy trải lên đĩa Petri chứa môi trường NA (Nutrient agar). Các đĩa thạch được ủ ở 37ºC trong 24

giờ. Các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cho Bacillus sp. (trắng đục hoặc mờ (không trong suốt), bề mặt xù xì, dạng hạt hay có rìa răng cưa không đều) được tiếp tục cấy ria lên môi trường NA cho tới khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc duy nhất trên môi trường để thu nhận các chủng thuần khiết. Sau đó, các đặc tính sinh lý, sinh hóa cơ bản của các chủng được phân lập như nhuộm Gram, hoạt tính catalase được xác định để sàng lọc sơ bộ các chủng Bacillus sp. Các chủng nghi là Bacillus sau đó được bảo quản trong glycerol 50% ở -80ºC cho tới khi được định danh bằng giải trình tự 16S rDNA và MLST.

3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp.

3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ và khuếch tán trên môi trường thạch theo Bauer et al (1959) có kèm một số thay đổi như sau: đầu tiên, 100 µL dịch nuôi cấy (107-108 cfu/mL) các chủng Vibrio sp. (đã được xác định bằng PCR) được cấy trải trên bề mặt đĩa thạch LB. Mặt đĩa thạch sau đó được đục lỗ (đường kính 0,6 cm) và điền đầy (khoảng 100 μL) bằng huyền phù vi khuẩn Bacillus sp. (nuôi ở môi trường LB lỏng, mật độ 106-107 cfu/mL). Đĩa thạch được ủ ở 37○C trong 24 giờ. Hoạt tính đối kháng được xác định dựa vào kích thước của vòng ức chế (D-d mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ khoan thạch (giá trị ≥ 2 mm được cho là có ý nghĩa) (Patil et al., 2010). Thí nghiệm được lặp lại ba lần để tính giá trị trung bình.

3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính protease cao

Để kiểm tra khả năng sinh enzyme protease, các chủng Bacillus thử nghiệm được cấy chấm điểm trên môi trường thạch SM (Himedia) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đĩa nuôi cấy được ủ trong tủ ấm ở 35○C và kết quả được đánh giá bằng xác định đường kính vòng phân giải sau 48h và 72h.

3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính amylase cao

Để kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase, các chủng Bacillus thử nghiệm được cấy chấm điểm trên môi trường thạch Starch Agar (Himedia) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đĩa nuôi cấy được ủ trong tủ ấm ở 37○C trong 72 giờ và kết quả được đánh giá bằng xác định đường kính vòng phân giải sau khi nhỏ dung dịch Lugol 0,1N để xác định vòng phân giải.

3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính cellulase cao

Hoạt tính enzyme được kiểm tra trên môi trường thạch TB có bổ sung 0,5% CMC (Carboxy Methyl Cellulose), 3% NaCl. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch và được ủ trong tủ ấm ở 37○C. Tại các thời điểm 48 giờ và 72 giờ, khả năng sinh cellulase của các chủng thử nghiệm được kiểm tra bằng cách nhỏ dung dịch Lugol 0,1N để xác định vòng phân giải. 3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus

DNA hệ gen (genomic DNA) của các chủng Bacillus được tách chiết bằng sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đầu tiên, một khuẩn lạc đặc trưng được cấy vào 5 mL canh trường LB (Himedia) và nuôi qua đêm ở 37oC, lắc 220 vòng/phút. Toàn bộ sinh khối sau đó được thu nhận bằng ly tâm ở 8000  g trong 5 phút, hòa tan trong 180 μL dung dịch ly giải vi khuẩn Gram dương (20 mM Tris-HCl pH 8,0; 2 mM EDTA; 1,2% Triton X-100; 20 mg/mL lysozyme) và ủ ở 37oC trong 30 phút. Tiếp đó, 200 μL dung dịch ly giải (Lysis solution) và 20 μL Proteinase K được bổ sung vào ống rồi ủ ở 56oC, lắc 300 vòng/phút trong 1 giờ. Để loại bỏ RNA, 20 μL dung dịch RNase A được thêm vào ống và ủ ở 37oC trong 10 phút. Sau đó, 400 μL ethanol 50% được bổ sung vào ống và đảo trộn đều. Dung dịch nhận được (tổng thể tích khoảng 820 μL) được đưa lên cột GeneJET Genomic DNA Purification Column (chia làm 2 lần, mỗi lần 410 μL) rồi ly tâm 1 phút ở 6000  g để DNA bám cột. Tiếp theo, cột chứa DNA được rửa lần lượt bằng 500 μL đệm rửa I (Wash Buffer I) và 500 μL đệm rửa II (Wash Buffer II). Trong mỗi lần rửa, cột được ly tâm ở 8000  g trong 1 phút và loại bỏ dịch qua cột. Sau khi rửa với đệm rửa II, cột được ly tâm ở tốc độ 12000  g trong 3 phút để loại bỏ hết cồn bám trên màng. Cột sau đó được chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới và DNA được rửa giải từ cột bằng 200 μL Elution Buffer kết hợp với ly tâm ở 8000  g trong 1 phút. Mẫu DNA sau đó được xác định nồng độ bằng hệ thống Nanodrop và bảo quản ở -20ºC.

3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1

3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1

Cặp mồi khuếch đại gen spaS và sboA lần lượt được thiết kế bằng chương trình Primer3 tại địa chỉ http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ dựa trên trình tự gen

spaS của chủng B. subtilis ATCC 6633 (mã hiệu GenBank: M83944.1) và trình tự gen sboA của chủng B. subtilis 168 (mã hiệu GenBank: NC_000964.3).

3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1

Gen spaS và sboA lần lượt được khuếch đại bằng PCR với hai cặp mồi: (i) (5’- (5’-ATGTCAAAGTTCGATGATTTCG-3’) và Subtilin-R Subtilin-F (5’- (ii) Subtilosin-F TTATTTAGAGATT-TTGCAGTTACAAG-3’) và ATGAAAAAAGCTGTCATTGTAG-AAA-3’) (5’- Subtilosin-R và TTATCCCCATAGACCGAATAGAC-3’) và khuôn là DNA hệ gen của chủng Bacillus BRB2.1. Thành phần phản ứng PCR có thể tích 50 µL bao gồm: 25 µL GoTaq® Colorless Master Mix 2X (Promega); 0,5 µM mỗi mồi, 10 ng DNA và H2O. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR là: 95°C, 3 phút; 35 chu kỳ (95°C, 30 giây; bắt cặp mồi trong 1 phút; 68°C, 1 phút); 68°C, 2 phút. Nhiệt độ bắt cặp mồi được biến đổi tại các giá trị: 54, 56, 58 và 60oC nhằm tối ưu hóa điều kiện phản ứng.

3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1

Sản phẩm PCR của gen sboA được tinh sạch trực tiếp bằng QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, sản phẩm PCR đã tinh sạch nối với vector pJET1.2 bằng CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm nối (5 µL) được biến nạp vào 100 µL tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42oC trong 30 giây, sau đó tế bào được bổ sung 900 µL môi trường LB lỏng nuôi ở 37oC có lắc trong 1 giờ trước khi được trải trên đĩa LB rắn có bổ sung ampicillin (100 mg/L) và nuôi qua đêm ở 37oC (Froger and Hall, 2007). Các khuẩn lạc mọc trên đĩa được sàng lọc bằng phương pháp PCR với cặp mồi pJET1.2F (5’- CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’) và pJET1.2R (5’- AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’). Sau khi sàng lọc, hai dòng tế bào cho kết quả PCR dương tính được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (100 mg/L) ở 37oC qua đêm để tách chiết lấy plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hai dòng plasmid này sau đó được gửi đi giải trình tự tại công ty 1st Base (Malaysia) với mồi pJET1.2R bằng phương pháp Sanger.

3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của subtilosin A

Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA 4.1 theo phương pháp Neighbor Joining với giá trị Bootstrap là 1000 (Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv.,

2016). Trình tự nucleotide và axít amin của subtilosin A được kiểm tra và hiệu chỉnh bằng phần mềm Bioedit 7.2. Tổng cộng, 10 chủng vi khuẩn đại diện trong ngân hàng dữ liệu GenBank được sử dụng để so sánh và phân tích được trình bày thông tin ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A

Tên chủng

ST T

Mã GenBank trình tự Protein

Mã GenBank trình tự Nucleotide

1 CAD23198.1

AJ430547.1

B. subtilis ATCC 6633

2 AJN00601.1

KP279466.1

B. subtilis VT03

3 CAB15763.1

AL009126.3

B. subtilis 168

4 ACO72599.1

FJ151507.1

B. amyloliquefaciens MZ-40

5 ARW33602.1

CP021507.1

B. licheniformis SRCM101441

6 SPU05234.1

UAQB01000062.1

B. tequilensis NCTC13306

7 AKP46487.1

CP012024.1

B. smithii DSM 4216

8 KKB33129.1

JWJE02000084.1

QuasiBacillus thermotolerans SGZ-8

9 PXA63632.1

QEJU01000004.1

Staphylococcus pseudintermedius ST498

10 PUZ18135.1

PZDF01000024.1

Staphylococcus capitis SNUC 895

3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập

được

3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trên trình tự 16S rDNA

Trình tự 16S rDNA của các mẫu vi khuẩn được khuếch đại bằng PCR bằng cách sử dụng các đoạn mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) theo Bakermans and Madsen (2002). Phản ứng PCR được thực hiện với nhiệt độ biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ (biến tính ở 95oC trong 30 giây; bắt cặp mồi ở 55oC trong 1 phút; và kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút). Bước kéo dài cuối cùng được thực hiện ở 72oC trong 10 phút. Hỗn hợp phản ứng thể tích 50 µL chứa 25 µL của GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix 2X (Promega, USA), 0,4 pmol/µL của mỗi mồi và 10 ng mẫu DNA. Các sản phẩm PCR được tinh chế bằng cách sử dụng bộ sinh phẩm QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và gửi đến hãng Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) để giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Trình tự DNA sau đó được so

sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bằng BLASTN và được phân tích bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999). Phần mềm MEGA X được sử dụng để xây dựng các cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp neighbor-joining với 1000 thử nghiệm bootstrapping (Kumar et al., 2018).

3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích MLST

Do phương pháp giải trình tự 16S rDNA không đủ độ phân giải để định tên đến loài các chủng vi khuẩn Bacillus sp. đã phân lập, phương pháp MLST, vốn có khả năng định týp được đến chủng, đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của tập hợp chủng vi khuẩn này. Kết quả giải trình tự 16S rDNA cho thấy có 4/30 chủng là thuộc nhóm B. cereus có khả năng gây bệnh, không thích hợp cho việc ứng dụng làm chế phẩm probiotic. Do vậy, trong nội dung nghiên cứu này, 26 chủng Bacillus còn lại được phân tích bằng MLST với việc giải trình tự các đoạn gen cấu trúc là glpF, ilvD, ptA, purH, pycA, rpoD và tpiA như khuyến cáo của của cơ sở dữ liệu MLST về B. subtilis (Jolley and Maiden, 2010).

Các mồi cho khuếch đại PCR bảy đoạn gen trên được thiết kế bằng phần mềm Primer3 (Untergasser et al., 2012) và trình tự của chúng được trình bày trong Bảng 3.3. Quá trình khuếch đại PCR được thực hiện bằng Promega GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix 2X như đã đề cập ở trên. Phản ứng thể tích 50 µL chứa 25 µL GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix 2X, 0,4 pmol/µL của mỗi mồi, 10 ng mẫu DNA. Một chương trình nhiệt duy nhất đã được sử dụng để khuếch đại bảy gen: biến tính ban đầu ở 95oC trong 3 phút, 40 chu kỳ (biến tính ở 95oC, 30 giây; bắt cặp mồi ở 54oC trong 30 giây và kéo dài ở 72oC trong 50 giây) và một bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Sau khi khuếch đại, các sản phẩm PCR được tinh chế bằng cách sử dụng bộ sinh phẩm QIAquick PCR Purification Kit hoặc QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và gửi đến hãng Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) để giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Trình tự DNA sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bằng BLASTN và được phân tích bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999).

Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST

Mồi

Trình tự (5’-3’)

Kích thước sản phẩm PCR

384 bp

rpoD-F rpoD-R

GCCGAAGAAGAATTTGACCTTAA CGTTTRCTTCTGCTHGGATGTCT

384 bp

470 bp

414 bp

420 bp

399 bp

glpF-F glpF-R ilvD-F ilvD-R ptA-F ptA-R tpiA-F tpiA-R PycA-F PycA-R purH-F purH-R

WTGACAGCATTTTGGGG GTAAAATACRCCGCCGA ATGAGATATTCGCTGCC CTTCGTTAATGCGTTCTAAAGAG ATACATATGAAGGSATGGAAGA TAGCCGATGTTTCCTGCT TCAGCTTCGTTGAAGAAGTGAAA GGACTCTGCCATATATTCTTTA AAATCAGARGCGAAAGC CCTGAGCGGTAAGCCAT TTTGAGAAAAAACAATCGCT TCGGCTCCCTTTTCGTCGG

Trình tự DNA sau khi đã xử lý được so sánh bằng công cụ CLASTALW (ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Các alen khác nhau được tính dựa trên sự khác biệt ít nhất một nucleotide và được đánh số lần lượt. Đối với mỗi chủng vi khuẩn, trình tự của cả bảy alen xác định kiểu trình tự (Sequence Type) của nó. Phần mềm MEGA X được sử dụng để xây dựng các cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp neighbor-joining với các thử nghiệm bootstrapping (Kumar et al., 2018). Phần mềm phân tích tái tổ hợp (START) (phiên bản 1.0.5) được sử dụng để tính toán hàm lượng (G + C) và giá trị dN/dS. Chỉ số thể hiện khả năng phân loại (D.I.) được tính toán theo như mô tả của Hunter and Gaston (1988).

3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp.

Ảnh hưởng của các thông số môi trường nhiệt độ, pH, độ mặn đến sự phát triển của 2 chủng vi khuẩn Bacillus BRB2.1 và BĐK2.3 được thực hiện theo Đỗ Thị Hiền (2018) với một số chỉnh sửa. Thí nghiệm được thực hiện riêng biệt và được bố trí trong các ống falcon 15 mL (thể tích nuôi 3 mL). Cụ thể các chủng vi khuẩn được tăng sinh 24h trước khi bắt đầu thí nghiệm. Mật độ vi khuẩn sau đó được xác định bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng ở OD600. Các chủng vi khuẩn sau đó được cấp giống vào các ống falcon với mật độ ban đầu là 103 cfu/mL. pH của các ống nuôi được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH 1N. Các ống falcon được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ ổn định, kết hợp với máy lắc 200 vòng/phút (Beuchat, 1973). Sau 24 giờ, 50 µL dịch nuôi được cấy trải lên đĩa thạch NA và số khuẩn lạc được đếm sau 24 giờ và 48 giờ ủ tại 37oC. Số vi khuẩn sống được tính theo

công thức: (số khuẩn lạc/thể tích cấy trải) × hệ số pha loãng. Các thí nghiệm bao gồm:

a - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi

khuẩn Bacillus sp.

Thí nghiệm được bố trí với các mức nhiệt độ khác nhau tương ứng với các nghiệm thức ở 26oC, 30oC, 37oC, 40oC, mỗi nghiệm thức được bố trí 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện trong ống falcon 15 mL, mỗi ống cho 3 mL môi trường NB có bổ sung thêm 2% NaCl, điều chỉnh pH ban đầu ổn định ở mức 8,0.

b - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi

khuẩn Bacillus sp.

Thí nghiệm được bố trí tương tự như trên ở các mức pH khác nhau tương ứng với các nghiệm thức là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 và 8,0. Mỗi nghiệm thức cũng được lặp lại 3 lần. pH được điều chỉnh bằng HCl 1N (hoặc NaOH 1N) để có được các giá trị pH thí nghiệm.

c - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi

khuẩn Bacillus sp.

Các độ mặn được bố trí tương ứng với các nghiệm thức khác nhau bao gồm 0‰, 5‰, 20‰ và 40‰. Độ mặn được điều chỉnh bằng cách dùng nước muối 100‰ pha với nước ngọt để có được độ mặn thích hợp ở các nghiệm thức. Nước có độ mặn thích hợp sau đó được khử trùng trước khi sử dụng. Mỗi nghiệm thức cũng được bố trí 3 lần lặp lại.

3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT

a. Bố trí thí nghiêm

Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức được lặp lại 3 lần:

A1: chủng Vibrio BĐB 1.3v

A2: chủng Vibrio BĐB 1.4v

A3: chủng Vibrio BNB 3.1v

A4: chủng Vibrio BRB 1.1v

A5: chủng Vibrio CĐB 6v

A6: Mẫu đối chứng (nước sạch)

b. Phương pháp thực hiện

Quy trình nuôi TTCT được thực hiện như sau: 18 thùng (120 Lít) được bổ sung 100 Lít nước ao sạch (đã xử lý chlorine 30 ppm) có lắp đặt hệ thống sục khí oxy. Sau đó, 30 con tôm post 15 đến 20 ngày (nặng 20-30 mg/con) được thả vào nuôi thí nghiệm. Tôm đã được xét nghiệm các tác nhân gây bệnh WSSV, IHHNV, AHPND, TSV, YHV, IMNV bằng phương pháp PCR, hoặc RT-PCR để đảm bảo sạch bệnh.

Các chủng vi khuẩn Vibrio được nuôi tăng sinh trong môi trường LB 24 giờ trước khi được xác định mật độ. Sau đó, chủng vi khuẩn Vibrio với mật độ 104 cfu/mL (Fu et al., 2014; Soto-Rodriguez et al., 2015) được bổ sung vào mỗi bình nuôi tôm sạch bệnh. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ được quan sát sau 36 giờ.

Theo dõi các chỉ tiêu về tỉ lệ tôm chết và biểu hiện bệnh của tôm như mệt mỏi, lờ đờ, gan tôm trở nên nhạt màu, teo, vỏ tôm mềm, ruột đứt đoạn và rỗng, nhiều khi gan có đốm hay sọc đen.

Mô tôm chết được phân tích tích theo phương pháp của Lightner (1996). Đầu tiên, mẫu được cố định trong dung dịch Davidson với tỉ lệ mẫu/dung dịch cố định là 1/10. Sau cố định, mẫu tôm được cắt tỉa định hướng trước khi được khử nước và đúc khối lần lượt trong dung dịch ethyl alcohol 70%, 80%, 95%, 100% và xylen. Sau đó, khối mẫu được cắt thành các lát mỏng 4-5 µm và nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E), quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi ở các vật kính 40X. Tổng cộng 6 cá thể tôm từ mỗi nghiệm thức được kiểm tra mô học.

3.2.12 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm

Thí nghiệm được thực hiện theo Tran et al. (2013) và được lặp lại 3 lần. Chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v được tăng sinh qua đêm trong môi trường TSB (32 oC, 120 rpm). Mật độ vi khuẩn sau đó được kiểm tra bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng OD600. Khi mật độ vi khuẩn đạt 2×108 cfu/mL (OD600 = 1), canh trường được pha loãng về các nồng độ vi khuẩn 105 cfu/mL; 3,2×105 cfu/mL; 106 cfu/mL; 3,2×106 cfu/mL; 107 cfu/mL, với thể tích cuối là 1L. Sau đó, 30 con tôm được ngâm 30 phút trong 1L hỗn hợp vi khuẩn vừa chuẩn bị (với sục khí). Sau khi ngâm, toàn bộ dung dịch vi khuẩn và tôm được chuyển sang bể chứa 99 L nước muối 2% (được sử lý chlorine 30 ppm) và được sục khí. Bể nuôi được giữ ở 32 oC, pH 7.5, chu kì sáng/tối là 12h/12h. Tỉ lệ tôm chết được xác định vào thời điểm 24h sau cảm nhiễm. Các mẫu tôm chết cũng được lấy mẫu để phân tích mô bệnh học. Tỉ lệ chết của tôm được quy về giá trị Probit theo hàm

(Finney, 1971) với P là tỉ lệ tôm chết và Y là giá trị Probit. Sau đó, phần mềm Excel được sử dụng để dựng đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa giá trị Probit và Log10(mật độ vi khuẩn cảm nhiễm), và giá trị LD50 được tính dựa vào đường chuẩn thu nhận được.

Toàn bộ tôm chết được phân tích mô học theo phương pháp được liệt kê ở

trên

3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp. ở quy mô phòng thí nghiệm

3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao

Căn cứ vào các kết quả thu được từ vi khuẩn có hoạt tính đối kháng và hoạt tính enzyme để lựa chọn 02 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp. ức chế mạnh V. parahaemolyticus; đồng thời có hoạt tính enzyme phân hủy các chất hữu cơ cao (protease, amylase và cellulase) thông qua đánh giá đường kính vòng phân giải cơ chất hình thành xung quanh khuẩn lạc.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong các bình tam giác 100 mL, chứa nước ao nuôi tôm chuẩn bị thả giống đã được tiệt trùng. Bình tam giác được đặt trong thiết bị lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 28oC, pH 8,0, độ mặn 20‰ tối ưu cho nuôi tôm.

Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây AHPND được nuôi trong môi trường LB qua đêm và được pha loãng về mật độ 104 cfu/mL trong bình tam giác chứa nước ao nuôi tôm.

Sau đó, các chủng vi khuẩn Bacillus sp. được đưa vào các bình tam giác chứa chủng V. parahaemolyticus để đạt mật độ cuối cùng từ 105 – 107 cfu/mL nhằm đánh giá mức độ đối kháng, ức chế sự phát triển của V. parahaemolyticus các nghiệm thức bao gồm:

B1: V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B2: chủng Bacillus BRB2.1 (105 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B3: chủng Bacillus BRB2.1 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B4: chủng Bacillus BRB2.1 (107 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B5: chủng Bacillus BĐK2.3 (105 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B6: chủng Bacillus BĐK2.3 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

B7: chủng Bacillus BĐK2.3 (107 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104 cfu/mL)

Mật độ các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus được đánh giá bằng cách đếm số khuẩn lạc sau khi nuôi cấy lên đĩa môi trường TCBS sau 24 giờ và 48 giờ thí nghiệm. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.

3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít

a. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm có 2 nhân tố là vi khuẩn Bacillus và V. parahaemolyticus

BĐB1.4v:

NT C1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn Bacillus và V. parahaemolyticus) NT C2: V. parahaemolyticus BĐB1.4v (104 cfu/mL) NT C3: chủng Bacillus BRB2.1 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus BĐB1.4v (104 cfu/mL) NT C4: chủng Bacillus BĐK2.3 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus BĐB1.4v (104 cfu/mL) NT C5: hai chủng Bacillus BRB2.1 và Bacillus BĐK2.3 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus BĐB1.4v (104 cfu/mL)

b. Phương pháp thực hiện

Thí nghiệm được bố trí trong 15 bể nuôi tôm chuyên dụng với thể tích 100L nước độ mặn 20‰ (đã xử lý chlorine 30 ppm) và được sục khí. Tôm thẻ chân trắng, giai đoạn postlarvae 15-20 ngày (nặng 20-30 mg/con) đã được xét nghiệm các tác nhân gây bệnh (WSSV, IHHNV, AHPND, TSV, YHV, IMNV) bằng phương pháp PCR, hoặc RT-PCR và phân tích mô, được bố trí với số lượng 30 cá thể/bể (tương đương với mật độ nuôi 300 cá thể/m3 nước, là giá trị tiệm cận đối với mô hình nuôi tôm siêu thâm canh hiện nay).

Hai chủng vi khuẩn Bacillus được nuôi tăng sinh trong môi trường LB trong thời gian 24 giờ. Sau đó mật độ các chủng vi khuẩn Bacillus được xác định và cấy các vi khuẩn Bacillus này vào từng bể để đạt mật độ cuối cùng là 106 cfu/mL. Chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v được tăng sinh qua đêm trong môi trường TSB (32 oC, 120 rpm). Mật độ vi khuẩn sau đó được kiểm tra bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng OD600. Canh trường được pha loãng về mật độ 5×105 cfu/mL. Tôm được cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm như đã trình bày ở mục

3.2.11 trong tổng thể tích 2L canh trường. c. Chỉ tiêu theo dõi

Biểu hiện mô bệnh học và tỉ lệ sống của tôm được theo dõi vào thời điểm sau 36 giờ thí nghiệm. Mẫu tôm thí nghiệm được thu và phân tích theo phương pháp của Lightner (1996) như miêu tả bên trên. Toàn bộ các cá thể tôm chết ở các nghiệm thức (trừ đối chứng dương) được phân tích mô học. Riêng đối với nghiệm thức đối chứng dương, 6 cá thể tôm chết được phân tích mô học

3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít

3.2.14.1 Bố trí thí nghiêm:

Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, bao gồm:

NT D1: Nghiệm thức đối chứng (không cấy vi khuẩn).

NT D2: Chỉ cấy V. parahaemolyticus BĐB1.4v với mật độ 104 cfu/mL.

NT D3: Cấy Bacillus BRB2.1 (106 cfu/mL) + V. parahaemolyticus (104

cfu/mL)

3.2.14.2 Phương thức thực hiện:

Thí nghiệm được tiến hành trong các bể composite dung tích 1,2 m3 chứa 1000L nước đặt trong hệ thống nhà lưới. Nước biển có độ mặn 20‰ được xử lý bằng clorine (30 ppm) và sục khí liên tục cho đến khi hết dư lượng clorine, sau đó được cấp vào bể qua túi lọc (5 µM).

Tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn PL32 đã được xét nghiệm các tác nhân gây bệnh (WSSV, IHHNV, AHPND, TSV, YHV, IMNV) bằng phương pháp PCR, hoặc RT-PCR và phân tích mô, để lựa chọn tôm giống sạch bệnh đưa vào thí nghiệm. Tôm được bố trí vào bể composite với mật độ 200 con/bể và được cảm nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v bằng cách bổ sung trực tiếp canh trường vi khuẩn vào bể đến mật độ là 104 cfu/mL.

3.2.14.3 Cho ăn và quản lý

Tôm được cho ăn bằng thức ăn DE HEUS 4 lần/ngày vào các mốc thời gian 7 giờ, 10 giờ, 14 giờ và 17 giờ mỗi ngày. Lượng thức ăn được tính theo phần trăm trọng lượng thân và qua quan sát hàng ngày để điều chỉnh cho thích hợp theo từng bể. Bể nuôi được xi phông 3 ngày/lần, và được thay 30% nước khi các chỉ tiêu môi trường vượt quá các thông số cho phép.

3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi

Các chỉ tiêu nhiệt độ, pH, oxy hòa tan (DO) được đo định kỳ hằng ngày bằng máy đo điện tử; NH3, NO2 được đo 3 ngày/lần (trong 31 ngày) thông qua bộ test nhanh Sera.

Các chỉ tiêu vi khuẩn (vi khuẩn tổng số và mật độ Vibrio) được thu mẫu nước tại các thời điểm ngay sau cảm nhiễm, 4, 7, 10, 16, 23, 27, 31 ngày sau cảm nhiễm và được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên các môi trường tương ứng với từng chỉ tiêu (Vibrio trên môi trường TCBS và tổng khuẩn trên môi trường NA).

Tốc độ tăng trưởng về chiều dài, trọng lượng, tỉ lệ sống, hệ số chuyển đổi

thức ăn của tôm được xác định sau 15 ngày và khi kết thúc thí nghiệm.

- Tính tỉ lệ sống của tôm (%) = (Số cá thể cuối/Số cá thể đầu) x 100 - Khối lượng gia tăng = khối lượng cuối - khối lượng đầu - FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) = thức ăn sử dụng/khối lượng tôm gia

tăng

- Chỉ số tăng trưởng đặc hiệu (SGR) của tôm = {[(ln(Wf) - ln(W0)] / T} × 100% với Wf là trọng lượng cuối, W0 là trọng lượng ban đầu, và T là thời gian thí nghiệm

3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được phân tích sử dụng giá trị trung bình bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. Phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và so sánh kết quả trung bình giữa các nghiệm thức được tiến hành bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XVI (StatPoint, Inc., USA) dựa trên kiểm định LSD (Fishers Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa 5%.

Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp

Theo số liệu của tổng cục thủy sản năm 2012, diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND chiếm khoảng 45,7% diện tích tôm nuôi bị bệnh. Khi lấy mẫu từ các ao bệnh trong nghiên cứu này, tỉ lệ nói trên được giả thiết không đổi. Do vậy, việc lấy mẫu từ 12 ao tôm bệnh sẽ đảm bảo thu nhận được mẫu nhiễm V. parahaemolyticus gây AHPND với xác suất là 99,9% (100% - 0,54312×100%) (với 0,543 là xác xuất không thu được mẫu nhiễm V. parahaemolyticus từ 1 ao, và 0,54312 là xác xuất không thu được bất cứ mẫu nhiễm V. parahaemolyticus nào từ 12 ao). Kết quả phân lập cho phép thu nhận được 51 chủng Vibrio sp. từ mẫu nước, mẫu bùn và tôm (Bảng 4.1).

Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio

Số chủng vi khuẩn Vibrio phân lập được

Tỉnh

Mẫu nước

Mẫu bùn

Mẫu tôm

Bạc Liêu Cà Mau Tổng

6 7 13

12 5 17

12 9 21

Về kết quả phân lập Vibrio sp. trên môi trường thạch TCBS (Hình 4.1 và Phụ lục C), có hai loại khuẩn lạc chính quan sát được trên môi trường này là các khuẩn lạc màu vàng (lên men được đường saccharoza) và các khuẩn lạc màu xanh (không lên men được đường saccharoza). Trong hai loại khuẩn lạc đã phân lập, các khuẩn lạc màu xanh được chú ý đặc biệt vì V. parahaemolyticus không có khả năng lên men đường saccharoza nên sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh. Tuy nhiên, một số loài Vibro khác như V. vulnificus cũng sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trường này. Do vậy, để khẳng định các khuẩn lạc màu xanh có đúng là V. parahaemolyticus hay không, cần tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen toxR của loại vi khuẩn này. Kết quả cho thấy các khuẩn lạc màu xanh được phân lập từ cả ao tôm bệnh và ao tôm khỏe. Do vậy, nhiều khả năng là V. parahaemolyticus hiện tồn tại phổ biến trong môi trường nuôi tôm ở vùng ĐBSCL, vốn là vùng nước lợ rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của loại vi khuẩn này (Wang et al., 2015).

Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau

4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng PCR

4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus

Như đã trình bày ở phần tổng quan, toxR là gen điều hòa các gen độc lực có mặt ở nhiều loài Vibrio gây bệnh như V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus. Tuy nhiên, có sự khác biệt về trình tự nucleotide của gen toxR giữa các loài Vibrio nói trên (độ tương đồng cao nhất là 83% giữa V. parahaemolyticus và V. alginolyticus). Do vậy, Kim et al. (1999) đã phát triển một phương pháp xác định V. parahaemolyticus dựa trên kỹ thuật PCR hướng đến vùng trình tự đặc hiệu trên gen toxR của loại vi khuẩn này. Ứng dụng phương pháp này trên tập hợp 31 chủng Vibrio được lựa chọn ngẫu nhiên từ 51 chủng phân lập ban đầu, kết quả phân tích cho thấy có 12 trên 31 chủng cho kết quả dương tính (băng sản phẩm có kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết là 368 bp) (Hình 4.2). Khi so sánh với hình thái khuẩn lạc của các chủng này trên môi trường CHROMagar Vibrio (Bảng 4.2), nhận thấy có sự tương hợp hoàn toàn giữa màu tím của khuẩn lạc với kết quả PCR dương tính. Từ đây, có thể kết luận

rằng có thể sử dụng trực tiếp môi trường CHROMagar Vibrio để phân lập V. parahaemolyticus với độ chính xác cao. Còn khi sử dụng môi trường TCBS, các khuẩn lạc màu xanh cần phải khẳng định một lần nữa bằng PCR với mồi toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus.

Xét về nguồn gốc các chủng V. parahaemolyticus phân lập được, có 2 chủng được phân lập từ ao khỏe và 10 chủng được phân lập từ ao tôm bệnh. Nếu xét trên tổng số lượng chủng Vibrio có nguồn từ ao khỏe (7 chủng) và ao bệnh (24 chủng), tỷ lệ phân lập V. parahaemolyticus/Vibro sp. từ ao khỏe là 2/7 (28,6%), thấp hơn so với tỷ lệ từ ao bệnh (10/24 hay 41,7%). Tuy nhiên, sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê (Fisher’s exact test, P = 0.68). Cần nhấn mạnh rằng các kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Giang và ctv (2016) trong đó các tác giả này đã chỉ ra tỷ lệ dương tính với V. parahaemolyticus đạt giá trị cao nhất tại các mẫu tôm bị bệnh (lên đến 77,5%).

Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được. Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen)

Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi trường Chromagar Vibrio

TT

Tên chủng Vibrio

toxR

Màu của khuẩn lạc trên môi trường Chromagar Vibrio

BNB1.1v

Trắng

BNB3.1v

Tím

BNB3.2v

Tím

BNB3.3v

Tím

BNK7v

Trắng

BNK10v

Xanh

CNB5v

Tím

CNB6v

Tím

BRB5.2v

Trắng

10 CRB1.1v

Trắng

11 CRB3.1v

Không màu

12 CRB3.2v

Tím

13 BĐB1.1v

Tím

14 BĐB1.2v

Không màu

15 BĐB5.1v

Không màu

16 BĐB6.1v

Trắng

17 BĐB6.2v

Không màu

Tím

18 BĐB8.2v

Trắng

19 BĐB11.1v

Không màu

20 BĐB11.2v

Không màu

21 BRB1.1v

Trắng

22 BRB1.2v

Tím

23 BĐB1.3v

Trắng

24 BĐB6.4v

Tím

25 BĐK7.2v

Không màu

26 CĐK1.1v

Trắng

27 CRK1.2v

Không màu

28 CRB1.2v

Trắng

29 CNK3.1v

Tím

30 CNK4v

Tím

31 BĐB1.4v

4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh

Để xác định trong tập hợp 31 chủng Vibrio đã lựa chọn, có chủng nào có khả năng sinh độc tố TDH, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu L-tdh và R- tdh đã được sử dụng. Kết quả ở Hình 4.3 cho thấy cả 31 chủng Vibrio thử nghiệm đều âm tính với gen tdh. Chứng dương PCR vẫn cho băng sản phẩm có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (269 bp). Do vậy, có thể kết luận toàn bộ các chủng Vibrio được thử nghiệm đều không mang gen độc lực tdh. Kết quả này cũng khá phù hợp với các công bố trước đây khi tỷ lệ chủng V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu môi trường dương tính với tdh thường rất thấp (khoảng 1- 2%) (Asgarpoor et al., 2018). Kết quả này cũng phù hợp nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và Nguyễn Thị Cẩm Ly (2012), không phát hiện các gen tdh và trh từ các chủng Vibrio phân lập từ mẫu hải sản từ Việt Nam.

Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; (+): chứng dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen)

4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh

Tương tự như gen tdh, cả 31 chủng Vibrio thử nghiệm đều âm tính với gen trh (Hình 4.4). Chứng dương PCR vẫn cho băng sản phẩm có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết là khoảng 500 bp. Do vậy, có thể kết luận toàn bộ các chủng Vibrio được thử nghiệm đều không mang gen độc lực trh. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố trước đây khi tỷ lệ chủng V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu môi trường dương tính với trh thường rất thấp (Asgarpoor et al., 2018).

Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; (+): chứng dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen)

4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA

Để xác định khả năng sinh độc tố PirA của tập hợp 31 chủng Vibrio đã lựa chọn, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu VpPirA-284F và VpPirA-284R đã được áp dụng. Kết quả (Hình 4.5) cho thấy chỉ có chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v (giếng 31) là dương tính với gen pirA (băng sản phẩm có kích thước gần với tính toán lý thuyết là 284 bp tương tự như các mẫu dương tính). Đây là chủng V. parahaemolyticus được phân lập từ mẫu bùn của một ao bệnh từ Bạc Liêu. Do vậy, đây rất có thể là chủng đã gây AHPND cho ao tôm này. Tuy nhiên, như đã trình bày ở phần Tổng quan, để có thể gây ra triệu chứng điển hình của AHPND, cần sự có mặt của cả hai gen pirA và pirB mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB. Do vậy, trong nội dung tiếp theo, sự có mặt của gen pirB tiếp tục được phát hiện bằng kỹ thuật PCR.

Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; (+): chứng dương PCR; Đường chạy M: 50bp DNA markers (Bioland Scientific LLC)

4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB

Kết quả phát hiện gen pirB bằng PCR (Hình 4.6) cho thấy chủng BĐB1.4v là cho băng sản phẩm có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (392 bp). Bên cạnh đó, hai mẫu BĐB11.1v (giếng 19) và CRK1.2v (giếng 27) cũng cho băng sản phẩm gần với tính toán lý thuyết. Do vậy, các sản phẩm PCR này đã được điện di lại một lần nữa cùng với các mẫu dương tính. Kết quả điện di (Hình 4.7) cho thấy chỉ có duy nhất mẫu BĐB1.4v là cho sản phẩm PCR có kích thước phù hợp. Các kết quả tách dòng và giải trình tự gen các sản phẩm PCR của các hai

mẫu BDB11.1v và CRK1.2v cho thấy đây là các trình tự gen thuộc thể gen của V. parahaemolyticus, hoàn toàn không có liên quan đến gen pirB.

Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; M1: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen); M2: 50bp DNA markers (Bioland Scientific LLC)

Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; (+): chứng dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen).

Tóm lại trong tập hợp 31 chủng vi khuẩn Vibrio được lựa chọn, có 12 chủng là V. parahaemolyticus trong đó 2 chủng có nguồn gốc từ ao khỏe và 10 chủng có nguồn gốc từ ao bệnh. Trong các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ ao bệnh, chỉ có duy nhất chủng BĐB1.4v, phân lập từ Bạc Liêu, là dương tính với cả hai gen pirA/pirB. Đây rất có thể là chủng gây AHPND tại ao nuôi tôm này trong thời gian trước. Toàn bộ các chủng thử nghiệm đều âm tính với các gen độc lực tdh và trh.

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V. parahaemolyticus

4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đạt được sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 4.3) cho thấy mật độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37oC (8,59 log cfu/ml) sau 48 giờ. Dựa vào các số liệu ở thời điểm 24 giờ, khoảng nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của chủng vi khuẩn này là từ 30-37ºC. Kết quả này khá phù hợp với các nghiên cứu của Beuchat (1975). Tuy nhiên, sau 48 giờ, mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v là tương đương nhau trong khoảng nhiệt độ từ 26 đến 37ºC (P > 0,05). Điều này có thể được giải thích là sau 48 giờ nuôi cấy, mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đã đạt đến giai đoạn bão hòa.

Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy

Nhiệt độ 26oC 30oC 37oC Thời gian

8,21±0,12a 8,55±0,13b 8,39±0,19ab 24h

Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

8,43±0,06a 8,46±0,18a 8,59±0,26a 48h

Một số nghiên cứu cho thấy chủng V. parahaemolyticus không thể phát triển ở nhiệt độ thấp. Cook (1994) nhận định rằng V. parahaemolyticus không có khả năng phát triển trong nước ngọt hoặc nước biển ở nhiệt độ dưới 10°C, Kim et al. (2012) ghi nhận chủng V. parahaemolyticus 33844 có nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu là 13°C. Ngoài ra, tác giả cũng nhận thấy một số chủng Vibrio khác như V. vulnificus phân lập từ hàu và sashimi và V. vulnificus ATCC 27562 cũng có nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu là 11°C. Những kết quả này cho thấy khi được bảo quản ở nhiệt độ thấp <10°C sẽ kiểm soát sự phát triển của Vibrio sp. ngay cả trên các loại thực phẩm tươi sống (hàu hay sashimi). Trong nghiên cứu này, ở nhiệt độ từ 26oC đến 37oC, chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đã phát triển mạnh và đạt mật độ cao sau 24 giờ nuôi cấy.

Theo Van and Scarpa (1999) nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của tôm thẻ chân trắng là khoảng 24-32oC. Khi nuôi tôm ở nhiệt độ thấp sẽ làm giảm khả năng tăng trưởng của tôm. Tuy nhiên, khoảng nhiệt độ này trùng với khoảng nhiệt độ mà vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể sinh trưởng mạnh. Do đó, việc kiểm soát yếu tố nhiệt độ để ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường nuôi tôm là khó có thể thực hiện được.

4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đạt được sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 4.4) cho thấy mật độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất ở pH 8,0 (8,42 log cfu/mL) sau 48 giờ nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) so với các giá trị mật độ đạt được tại pH 5,0 và 6,0. Beuchat (1975) cũng nhận định pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus là 7,6 – 8,6. Ở giá trị pH axít 5,0, sau 24 giờ nuôi cấy, không ghi nhận sự có mặt của V. parahaemolyticus, chứng tỏ chủng vi khuẩn BĐB1.4v đã bị tiêu diệt ở pH này. Nghiên cứu tương tự của Vanderzant and Nickelson (1972) cho thấy khi nuôi cấy V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng với pH = 5,0 thì vi khuẩn này cũng không sống sót.

Theo Boyd et al. (2002), khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của tôm thẻ chân trắng là 7,7 – 8,5 và đây cũng là vùng pH mà chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong nghiên cứu này phát triển tốt nhất. Do đó, tương tự như nhiệt độ, việc khống chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng cách kiểm soát pH cũng rất khó để thực hiện.

Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy

pH

5,0

6,0

7,0

8,0

Thời gian

Âm tínha

7,32±0,11b

7,61±0,52b

7,32±0,19b

24h

Âm tínha

7,53±0,19b 8,12±0,25bc 8,42±0,09bc

48h

4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 4.5) cho thấy mật độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất trong khoảng độ mặn từ 20 - 40‰ sau 48 giờ nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) so với các độ mặn thấp hơn từ 0‰ đến 10‰. Chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v không phát triển được trong khoảng độ mặn từ 0‰ đến 5‰.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ mặn có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển của Vibrio. Phần lớn các loài Vibrio chuyển động được nhờ roi, tốc độ chuyển động của vi khuẩn phụ thuộc vào nồng độ Na+ trong môi trường (Atsumi et al., 1990). Vi khuẩn V. parahaemolyticus là loài ưa muối, độ mặn cho sự phát triển tốt nhất của V. parahaemolyticus là 30‰ (Miles et al., 1997; Liu et al., 2008; Yang et al., 2009; Baker-Austin et al., 2010; Fernandez-Piquer et al., 2011). Vibrio parahaemolyticus cần có độ mặn, hàm lượng ion Na+ cho sự phát triển. Giới hạn độ mặn cho sự phát triển của V. parahaemolyticus là 20 -70‰, khoảng tối ưu là 20 - 40‰ (Beuchat, 1973). Trong môi trường nước ngọt (độ mặn 0‰), V. parahaemolyticus bị bất hoạt hoàn toàn.

Tôm thẻ chân trắng có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu tốt giúp chúng có thể sống được trong môi trường nước có độ mặn khác nhau dao động từ 0,5 – 40‰ (Bray et al., 1994; Saoud et al., 2003). Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng đã cho thấy tôm thẻ chân trắng tăng trưởng tốt ở độ mặn khá thấp từ 10 – 15‰ (Đào Văn Trí, 2002; Trần Văn Quỳnh, 2004).

Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v bị ức chế ở độ mặn 0 - 10‰ nhưng tôm thẻ chân trắng có thể phát triển tốt ở độ mặn 10-15‰, do đó nuôi tôm thẻ ở độ mặn thấp khoảng 10‰ có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus.

Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy

Độ mặn

0‰

5‰

10‰

20‰

30‰

40‰

Thời gian

Âm tínha Âm tínha 0,30±0,30b 7,46±0,18c 8,11±0,19d 8,11±0,08d

24 giờ

Âm tínha Âm tínha 0,57±0,51b 8,39±0,09c 8,45±0,07c 8,25±0,12c

48 giờ

4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp

Để sàng lọc các chủng Bacillus có

tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus, 149 chủng có khả năng tạo bào tử đã được phân lập từ 29 ao nuôi tôm công nghiệp (Bảng 4.6). Số lượng chủng này tương đương với các nghiên cứu đã công bố về việc phân lập các chủng vi khuẩn đối kháng sử dụng làm probiotic hoặc tác nhân kiểm soát sinh học. Từ 109 chủng phân lập từ mẫu nước, bùn, và ruột cá vược, Ravi et al. (2007) đã phân lập được 3 chủng Paenibacillus sp., B. cereus, và P. polymyxa từ mẫu bùn có hoạt tính đối kháng cao đối với V. harveyi và V. vulnificus. Từ 198 chủng phân lập từ mẫu nước, bùn, và tuyến gan tụy tôm thẻ chân trắng, Mirbakhsh et al. (2013) đã phân lập được 2 chủng B. subtilis và B. vallismortis từ tuyến gan tụy tôm có hoạt tính đối kháng V. harveyi. Từ 42 chủng phân lập từ nước biển, Galaviz-Silva et al., 2018 phân lập được 15 chủng Bacillus và Virgibacillus có hoạt tính đối kháng Staphylococcus aureus và V. parahaemolyticus.

Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus

Số chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được

Tỉnh

Mẫu nước

Mẫu bùn

Mẫu tôm

17 14 10 41

28 20 15 63

21 12 12 45

Bạc Liêu Cà Mau Sóc Trăng Tổng

Hình thái đại diện các khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus sp. được trình bày ở các Hình 4.8 và Phụ lục C. Có thể nhận thấy hình thái các khuẩn lạc đã phân lập được khá đa dạng với màu sắc biến đổi từ trắng trong, trắng đục đến vàng hoặc xanh; hình dạng từ tròn nguyên đến tròn răng cưa hoặc chia thùy, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ ủ tại 37ºC biến đổi từ 1 đến 8 mm.

Quy trình phân lập Bacillus trong nghiên cứu này sử dụng bước xử lý nhiệt ở 80ºC như là tác nhân chọn lọc để loại bỏ các vi khuẩn không chịu nhiệt và kích hoạt sự nảy chồi của nội bào tử Bacillus. Do vậy, về mặt bản chất, quy trình phân tích được sử dụng cho phép phân lập chủ yếu các bào tử có trong môi trường ao nuôi tôm. Để xác định chính xác liệu các chủng vi khuẩn đã phân lập có thuộc chi Bacillus hay không cần tiến hành các phép thử kiểu hình với bộ tiêu chí phức tạp (33 chỉ tiêu) hoặc đơn giản hơn là thực hiện việc giải trình tự 16S rDNA. Tuy nhiên, từ tính đa dạng hình thái khuẩn lạc như trên, có thể kết luận sơ bộ là tập hợp các chủng vi khuẩn tạo bào tử đã phân lập được là khá đa dạng, tạo tiền đề để phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus có tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus.

Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau

4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nuôi tôm công nghiệp

4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus

Để tuyển chọn được các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế được V. parahaemolyticus nói chung và đặc biệt là chủng V. parahaemolyticus gây AHPND, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được áp dụng với các chủng vi khuẩn kiểm định là 5 chủng V. parahaemolyticus được phân lập từ ao bệnh BNB3.1v, BĐB1.4v, BĐB1.1v, CNB6v và BĐB1.3v. Năm chủng Vibrio được sử dụng đều là V. parahaemolyticus có nguồn gốc từ ao bệnh, trong đó có chủng BRB1.4v mang cả hai gen pirA/pirB mã hóa độc tố nhị thể gây AHPND.

Trong luận án này, từ 149 chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus, 130 chủng được lựa chọn dựa trên hoạt tính catalase dương tính. Các kết quả sàng lọc bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy chỉ có 6/130 (4,6%) chủng thử nghiệm là có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus đáng kể (D-d≥ 2 mm) (Hình 4.9). Kết quả này khá phù hợp với các nghiên cứu được liệt kê ở trên (Galaviz-Silva et al., 2018; Mirbakhsh et al., 2013; Ravi et al., 2007). Trong số 6 chủng này, hai chủng vi khuẩn BRB2.1 (phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm của một ao bệnh từ Bạc Liêu) và BĐK2.3 (phân lập từ mẫu bùn của một ao khỏe từ Bạc Liêu) có hoạt tính kháng 5 chủng V. parahaemolyticus cao hơn 4 chủng còn lại (Hình 4.10, Phụ lục A2). Riêng đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v mang cả hai gen pirA/pirB, chủng Bacillus BRB2.1 thể hiện hoạt tính đối kháng cao nhất (Hình 4.9 và Hình 4.10) với đường kính vòng kháng khuẩn đạt giá trị 13,3 mm cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với các chủng còn lại. Do vậy, hai chủng BRB2.1 và BĐK2.3 được lựa chọn cho các thử nghiệm kháng V. parahaemolyticus trong các quy mô 100 L và 1000 L sau này.

Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4, BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v

Hình 4.10 Khả năng đối kháng V. parahaemolyticus của 6 chủng nghi là Bacillus. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn.

4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao

Từ tập hợp 130 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. nói trên, tiến hành lựa chọn 30 chủng đại diện (nguồn gốc khác nhau) để cấy trên môi trường thạch SM (Himedia) để sàng lọc các chủng có khả năng sinh protease có hoạt tính cao. Kết quả phân tích (Hình 4.11, Hình 4.12, Phụ lục A3) cho thấy 29/30 chủng thử nghiệm có khả năng tiết protease trên môi trường thạch SM. Chủng BRK5.3 không có hoạt tính protease (Hình 4.11) rất có thể là do không phát triển được

trên môi trường SM. Ba chủng BNB1.1, BNB1.2 và BNK2.2 phân lập được ở mẫu nước tại tỉnh Bạc Liêu cho kết quả vòng hoạt tính cao nhất là 29 mm. Hai chủng BRB2.1 và BĐK2.3 cũng có khả năng tiết protease cao với đường kính vòng thủy phân lần lượt là 26 và 25 cm. Ngoài tính đối kháng với V. parahaemolyticus, khả năng sinh protease cao này của hai chủng BRB2.1 và BĐK2.3 sẽ góp phần cải thiện môi trường nước nếu được sử dụng làm chế phẩm vi sinh.

Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường thạch SM.

Hình 4.12 Khả năng sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus

4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao

Tương tự như đối với hoạt tính protease, khả năng sinh amylase của tập hợp 30 chủng đã được lựa chọn ở trên tiếp tục được đánh giá bằng phương pháp cấy

chấm điểm trên môi trường Starch Agar (Himedia). Trong số các chủng thử nghiệm, chỉ có duy nhất chủng BRK5.3 là không phát triển và không tiết amylase. Các chủng tiết amylase cao nhất là BNK2.2, BNK2.3, BNK7.1, BRB2.1, BĐK2.3, BĐB3.1 và BĐB11.1 với đường kính vòng thủy phân từ 14 đến 17 mm (Hình 4.13, Hình 4.14, Phụ lục A4).

Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường Starch Agar.

Hình 4.14 Khả năng sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus

4.5.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao

Hoạt tính tiết cellulase của tập hợp 30 chủng đã lựa chọn ở trên được đánh giá trên môi trường chứa CMC. Trừ chủng BRK5.3 không phát triển được, 29 chủng còn lại đều có khả năng tiết cellulase với đường kính vòng thủy phân dao động từ 13 đến 29 mm. Các chủng sinh cellulase cao nhất (Hình 4.15, Hình 4.16, và Phụ lục A5) bao gồm BNB1.1, BNK2.2, BNK2.3, BRK4.5, BRK5.4, BRK7.3,

tính đối kháng cao với V. BDB2.2, BDB11.1. Hai chủng có hoạt parahaemolyticus là BRB2.1 và BĐK2.3 cũng có khả năng sinh cellulase khá cao với đường kính vòng thủy phân lần lượt là 25 và 26 mm.

Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường CMC.

Hình 4.16 Khả năng sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus

Như vậy, từ các kết quả sàng lọc ở trên, có thể rút ra các kết luận sau:

- Hai chủng BRB2.1 (phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm của một ao bệnh từ Bạc Liêu) và BĐK2.3 (phân lập từ mẫu bùn của một ao khỏe từ Bạc Liêu) có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus mạnh. Hai chủng này cũng có khả năng tiết các enzyme ngoại bào tốt.

- Hai chủng BNK2.2 và BNK2.3, có nguồn gốc từ nước của một ao khỏe từ Bạc Liêu, có khả năng tiết các enzyme protease, amylase và cellulase cao hơn so với các chủng còn lại.

4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1

Từ các kết quả trình bày ở trên, có thể nhận thấy chủng BRB2.1 có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus rất mạnh ở điều kiện in vitro. Tính kháng khuẩn mạnh như vậy rất có thể là do chủng BRB2.1 có khả năng tạo một bacteriocin có khả năng kháng V. parahaemolyticus. Giả thuyết được đặt ra là chủng này có khả năng sinh subtilin (spaS) và subtilosin A (sboA) vốn là các bacteriocin đặc trưng của chi Bacillus. Gen mã hóa subtilin (spaS), được tách dòng lần đầu tiên từ chủng B. subtilis ATCC 6633, là một trình tự dài 171 bp mã hóa cho đoạn peptide có chiều dài là 56 axít amin (Chung et al., 1992). Subtilin là bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, hoạt động ngay từ mức nồng độ nM (Parisot et al., 2008). Tương tự như các bacteriocin cation khác, cơ chế hoạt động của subtilin dựa trên khả năng tương tác với các hợp phần của màng ngoài lipid của tế bào vi khuẩn từ đó tạo ra các lỗ trên màng tế bào kết quả là các thành phần quan trọng trong nội bào sẽ bị mất mát vào môi trường và tế bào vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt (Parisot et al., 2008). Gen mã hóa subtilosin A (sboA) lần đầu tiên được tách dòng từ chủng B. subtilis 168 (Babasaki et al., 1985). Sau đó, trình tự đầy đủ của đoạn peptide SboA được công bố bởi Zheng et al. (1999). Khung đọc mở của sboA dài 132 bp mã hóa cho peptide dẫn đường dài 8 axít amin và đoạn peptide chín dài 35 axít amin (Zheng et al., 1999). Tương tự như subtilin, subtilosin A có hoạt tính kháng khuẩn rộng đối với cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương bao gồm E. faecalis OGX-1, L. monocytogenes ATCC 19115, P. gingivalis ATCC 33277, P. gingivalis ATCC 33277 KDP129, P. gingivalis ATCC 33277 KDP133, K. pneumoniae UMN5, K. pneumoniae UMN3, K. rhizophila ATCC 9341, E. aerogenes ATCC 13408, S. pyogenes ATCC 19615, S. sonnei ATCC 25931 (Shelburne et al., 2007). Trong nội dung nghiên cứu này, kỹ thuật PCR đã được sử dụng để khuếch đại trình tự gen mã hóa hai loại bacteriocin nói trên từ chủng BRB 2.1 nhằm xác định liệu chủng vi khuẩn này có sản xuất các bacteriocin nói trên hay không.

4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1

Với mục đích thu nhận được sản phẩm PCR đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp mồi trong phản ứng PCR khuếch đại gen spaS và sboA đã được biến đổi từ 54oC đến 60oC để tối ưu hóa.

Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng BRB2.1

Đường chạy 1,2,3,4: lần lượt là sản phẩm PCR khuếch đại gen spaS mẫu âm tính với nhiệt độ gắn mồi 54, 56, 58, 60oC; Đường chạy 5, 6, 7, 8: lần lượt là sản phẩm PCR khuếch đại gen spaS từ chủng BRB2.1 với nhiệt độ gắn mồi 54, 56, 58, 60oC; Đường chạy M: GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific); Đường chạy 9, 10, 11, 12: lần lượt là sản phẩm PCR khuếch đại gen sboA mẫu âm tính với nhiệt độ gắn mồi 54, 56, 58, 60oC; Đường chạy 13, 14, 15, 16: lần lượt là sản phẩm PCR khuếch đại gen sboA từ chủng BRB2.1 với nhiệt độ gắn mồi 54, 56, 58, 60oC.

Kết quả trên Hình 4.17 cho thấy các phản ứng PCR khuếch đại gen spaS đều cho kết quả âm tính, trong khi đó, các phản ứng PCR khuếch đại gen sboA đều cho kết quả dương tính ở cả 4 nhiệt độ gắn mồi thử nghiệm với kích thước của sản phẩm phù hợp với tính toán lý thuyết là 132 bp. Thông thường, nhiệt độ gắn mồi cao nhất sẽ cho kết quả đặc hiệu nhất, vì vậy sản phẩm PCR khuếch đại gen sboA với nhiệt độ gắn mồi là 60oC được lựa chọn để tách dòng và giải trình tự. Các kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng chủng BRB2.1 nhiều khả năng không mang gen spaS mã hóa subtilin. Một khả năng khác là cặp mồi được thiết kế không phù hợp để khuếch đại gen spaS từ chủng này. Hiện nay, toàn bộ hệ gen của chủng BRB2.1 đang được giải trình tự. Các dữ liệu mới này sẽ cho phép khẳng định liệu chủng BRB2.1 có chứa gen mã hóa subtilin và các bacteriocin khác hay không.

Khi sàng lọc các dòng khuẩn lạc E. coli DH10b thu được sau khi biến nạp sản phẩm nối gen sboA vào vector pJET1.2 bằng kỹ thuật PCR, không sử dụng cặp mồi Subtilosin-F và Subtilosin-R mà dùng cặp mồi của vector là pJET1.2F và pJET1.2R. Vì vậy, kích thước dự kiến của sản phẩm PCR là 251 bp, trong đó

kích thước gen sboA là 132 bp và kích thước của phần vector pJET1.2 là 119 bp. Kết quả sàng lọc các dòng khuẩn lạc được trình bày ở Hình 4.18.

Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA trong vector pJET1.2

Đường chạy 1: 50 bps DNA Ladder (Bioland Scientific); Đường chạy 2-13: sản phẩm PCR sàng lọc gen sboA trong vector pJET1.2.

Có 11/12 dòng khuẩn lạc cho kết quả sàng lọc dương tính với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết là 251bp. Hai dòng khuẩn lạc dương tính (SBO_3 và SBO_8) được lựa chọn để tách chiết plasmid và giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy cả 2 dòng plasmid SBO_3 và SBO_8 đều có cùng một đoạn chèn với trình tự là:

ATGAAAAAAGCTGTCATTGTAGAAAACAAAGGTTGTGCAACATGCTC GATCGGAGCCGCTTGTTTAGTGGACGGCCCAATCCCTGATTTTGAAAT TGCCGGTGCAACAGGTCTATTCGGTCTATGGGGATAA.

Trình tự đoạn peptide được mã hóa tương ứng là: MKKAVIVENKGCATCSIGAACLVDGPIPDFEIAGATGLFGLWG.

Kết quả BlastP trình tự peptide này với ngân hàng dữ liệu GenBank cho thấy trình tự peptide được mã hóa hoàn toàn trùng khớp với 151 trình tự Subtilosin A đi từ chi Bacillus trong đó bao gồm: B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. murimartini, B. tequilensis, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. gibsonii, B. licheniformis, B. intestinalis, … Như vậy, trình tự gen đã tách dòng thực sự mã hóa cho subtilosin A.

4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1

4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng BRB2.1

Trong nghiên cứu này, đã tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền của chủng BRB2.1 với 7 chủng thuộc chi Bacillus (3 chủng B. subtilis và 4 chủng thuộc các loài Bacillus khác), 1 chủng thuộc chi QuasiBacillus thermotolerans và 2 chủng thuộc chi Staphylococcus. Tất cả 10 chủng tham chiếu này đều có đầy đủ trình tự axít amin và trình tự nucleotide của subtilosin A trên GenBank. Trước hết, trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 được so sánh với trình tự axít amin subtilosin A của 10 chủng tham chiếu.

Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 và 10 chủng tham chiếu.

Chủng BRB2.1 được đánh dấu () trên cây phả hệ và cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA 4 sử dụng phương pháp neighbor joining tree với giá trị bootstrap là 1000.

Kết quả phân tích cây phả hệ (Hình 4.19) cho thấy toàn bộ trình tự axít amin subtilosin A của các chủng thuộc chi Bacillus nằm riêng trong một phân nhóm và được hỗ trợ bởi giá trị bootstrap 94. Trong đó, chủng BRB2.1 có trình tự axít amin subtilosin A (43 amino axít) giống hệt với 5 chủng B. subtilis ATCC 6633,

B. subtilis VT03, B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens MZ-40 và B. licheniformis SRCM101441.

4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A

Kết quả so sánh chi tiết trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 so với 10 chủng tham chiếu (Hình 4.20) cho thấy: (i) chuỗi peptide subtilosin A của tất cả các chủng đều có độ dài là 43 axít amin. Chủng BRB2.1 có trình tự axít amin subtilosin A giống hệt với 5 chủng B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis VT03, B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens MZ-40 và B. licheniformis SRCM101441, (ii) chủng Bacillus tequilensis NCTC13306 có 3 sai khác axít amin ở các vị trí 5(VI), 20(AV), 32(IV) nhưng các sai khác này nhiều khả năng không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của peptide vì đây đều là các axít amin kị nước, (iii) chủng Bacillus smithii DSM 4216 có 13/43 (30 %) axít amin bị biến đổi, trong đó các vị trí 13(AS) , 14(TA), 38(LT), 42(WV) có thể ảnh hưởng mạnh đến cấu trúc của peptide, (iv) chủng QuasiBacillus thermotolerans SGZ-8 và 2 chủng thuộc chi Staphylococcus có ít nhất 14/43 (>33 %) axít amin bị biến đổi, trong đó có nhiều vị trí có thể ảnh hưởng mạnh đến cấu trúc của peptide.

Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng

BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu.

Ghi chú: dấu (.) biểu thị giống với trình tự axít amin sboA của chủng BRB2.1, sự sai khác axít amin của các chủng tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng.

4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu

4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA

Sau khi dựng cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 và 10 chủng tham chiếu, chúng tôi tiếp tục xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide của gen sboA.

Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng tham chiếu.

Kết quả phân tích cây phả hệ (Hình 4.21) cho thấy toàn bộ trình tự nucleotide sboA của các chủng thuộc chi Bacillus nằm trong cùng một phân nhóm lớn, khác xa với các chủng còn lại. Trong đó, chủng BRB2.1 nằm riêng một phân nhóm, có trình tự nucleotide sboA có quan hệ gần gũi với 5 chủng B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis VT03, B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens MZ- 40 và B. licheniformis SRCM101441.

4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA

Kết quả so sánh chi tiết trình tự nucleotide sboA của chủng BRB2.1 so với 10 chủng tham chiếu (Hình 4.22) cho thấy: (i) trình tự nucleotide gen sboA của 4 chủng B. subtilis VT03, B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens MZ-40 và B. licheniformis SRCM101441 giống hệt nhau, (ii) trình tự nucleotide gen sboA của BRB2.1 có độ tương đồng cao (97%) với chủng B. subtilis VT03 vốn được phân lập từ cá và có hoạt tính kháng Aeromonas. Cần nhấn mạnh rằng trình tự nucleotide sboA của chủng BRB 2.1 (có trình tự nuccleotide dài 132 bp, mã hóa cho

peptide dài 43 amino axít) là không trùng với bất cứ trình tự tham chiếu nào. Điều này cho thấy tính mới của nghiên cứu này.

Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng

BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu.

Ghi chú: dấu (.) biểu thị giống với trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1, sự sai khác nucleotide của các chủng tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng

4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST

4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA

Trong nghiên cứu này, để giảm thiểu chi phí phân tích, 30 trên 130 chủng vi khuẩn có hoạt tính catalase dương tính được giải trình tự 16S rDNA. Kết quả cho thấy toàn bộ 30 chủng này đều thuộc chi Bacillus. Điều này cho thấy quy trình phân lập sử dụng xử lý nhiệt ở 80ºC có hiệu quả rất cao để phân lập Bacillus sp. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự này trong đa số các trường hợp không cho phép xác định chính xác được đến loài. Ít nhất bốn loài khác nhau đã được xác định cho mỗi chủng phân lập có độ tương đồng trong khoảng từ 99 đến 100% (Phụ lục D). Trong số 30 chủng được giải trình tự 16S rDNA, 4 chủng được xác định là thuộc nhóm B. cereus có khả năng gây bệnh nên các chủng này đã được loại bỏ trong các nghiên cứu tiếp theo. Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rDNA của 26 chủng còn lại (Hình 4.23) cho thấy các giá trị bootstrap rất thấp (đa số nhỏ hơn 60), do vậy không đủ độ tin cậy để phân loại các chủng Bacillus đã phân lập. Các kết quả này đều cho thấy giải trình tự 16S rDNA không cho phép định tên được đến loài đối với chi Bacillus.

Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với các chủng tham chiếu dựa trên trình tự 16S rDNA Dấu * biểu hiện chủng từ ao bệnh

4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST

Đầu tiên, các trình tự mồi khuếch đại 7 vùng gen cấu trúc ở trên được thiết kế bằng phần mềm Primer3 do cơ sở dữ liệu MLST về B. subtilis hiện chưa có các thông tin này. Các kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng các cặp mồi đã thiết kế (Hình 4.24) cho thấy hầu hết các chủng đều cho sản phẩm đặc hiệu (một băng duy nhất có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết), đủ chất lượng cho

việc tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR. Một số mẫu có sản phẩm phụ (băng phụ có kích thước nhỏ hơn) được tiến hành tinh sạch trên gel.

610 bp

854 bp

622 bp

690 bp

545 bp

568 bp

620 bp

Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C); glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G) M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen); 1: chủng BNK 2.2; 2: chủng BNK 2.3; 3: chủng BDK 2.3; 4: chủng BRB 2.1; 5: chủng BDB 6.1; 6: chủng BRK 6.1; 7: chủng BRK 7.3; 8: chủng BRB 2.2; 9: chủng BNB 1.2; 10: chủng BRB 6.3.

Sau khi tinh sạch, các sản phẩm PCR được xác định trình tự bằng phương pháp Sanger. Các kết quả tóm lược về đặc điểm trình tự, cấu hình alen, và số lượng điểm đa hình của bảy gen cấu trúc đã được trình bày trong Bảng 4.7. Độ dài của các vùng gen được khuếch đại dao động từ 384 đến 470 bp, chiếm từ 11,58% (pycA) đến 55,12% (tpiA) của chuỗi gen hoàn chỉnh. So sánh các trình tự bằng công cụ Clustal Omega cho thấy không xuất hiện các đột biến chèn/mất đoạn. Tuy nhiên, các điểm đa hình thay thế nucleotide rất phổ biến. Có 146 (38,02%), 164 (34,89%), 105 (25,36%), 137 (34,34%), 168 (42,10%), 108

(28,12%) và 89 (21,19%) điểm đa hình cho lần lượt các gen glpF, ilvD, pta, purH, pycA, rpoD, và tpiA. Hơn nữa, đối với mỗi locus, có từ 11 đến 19 alen, được tính dựa trên sự khác biệt từ một nucleotide trở lên. Hàm lượng trung bình (G + C) của mỗi đoạn gen khuếch đại là khoảng 49 - 54%, tương tự như hàm lượng (G + C) của các gen tương ứng từ chủng B. subtilis 168, vốn là hệ gen tham chiếu đầu tiên cho chi Bacillus. Giá trị dN/dS trung bình nhỏ hơn 1 nhiều lần, cho thấy bảy đoạn gen được phân tích có tính bảo thủ cao. Số đột biến không thay đổi axít amin cao gấp ít nhất 16 lần so với số đột biến thay đổi axít amin ở 7 locus (1/0,061). Điều này có thể được giải thích bởi các chức năng quan trọng của các gen cấu trúc này ở vi khuẩn Bacillus, do đó không xuất hiện nhiều các đột biến gây thay đổi axít amin.

Chỉ số phân biệt (Discriminatory Index, D.I) cũng được tính toán để so sánh khả năng phân loại của từng gen. Giá trị D.I thấp nhất trong bảy locus là 0,908, cho thấy khả năng phân loài cao và hiệu quả trong việc phân biệt các chủng đã phân lập được. Vùng gen glpF có chỉ số D.I cao nhất ở 0,972 (18 alen, 38,02% vị trí đa hình). Một điểm đáng chú ý là đoạn gen có nhiều điểm đa hình nhất (pycA, 42,10% vị trí đa hình) lại không thể hiện D.I cao nhất (0,966). Những kết quả này cho thấy có thể đơn giản hóa hơn nữa quy trình MLST cho phân loại vi khuẩn Bacillus bằng cách chỉ sử dụng các locus có chỉ số D.I cao nhất.

Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping”

Gen

Số alen

D.I.

dN/dS

Độ dài đoạn khuếch đại

Số điểm đa hình

% điểm đa hình (%)

Độ bao phủ vùng mã hóa

Hàm lượng G+C trung bình (%)

glpF

384

46.55

38.02

0.972

0.061

146

ilvD

470

28.03

34.89

54.5

0.957

0.040

164

pta

414

42.59

25.36

51.4

0.942

0.020

105

purH

399

25.93

34.34

50.4

0.96

0.080

137

pycA

399

11.58

42.10

49.6

0.966

0.048

168

rpoD

384

34.41

28.12

49.2

0.908

0.001

108

tpiA

420

55.12

21.19

49.3

0.932

0.041

D.I.: Discrimination Index

Sau khi ghép vùng gen với nhau, tổng cộng 22 nhóm đã được phát hiện trong số 26 mẫu phân lập. Một cây phả hệ (Hình 4.25) được xây dựng bằng phần

mềm MEGA X. Dựa trên công cụ BLASTN, 12 trình tự tham chiếu đại diện cho các loài Bacillus đã được chọn từ cơ sở dữ liệu của GenBank để hình thành “ingroup” và “outgroup”. Phân cụm tất cả các trình tự cho thấy bốn nhóm chính, không chồng chéo, được hỗ trợ bởi giá trị bootstrap tuyệt đối là 100. Bốn nhóm này tương ứng với bốn loài thuộc chi Bacillus: B. velezensis, B. siamensis, B. subtilis và B. licheniformis. Có thể nhận thấy sự phân bố không đồng đều của các chủng vào 4 nhóm trên. Nhánh B. velezensis và B. subtilis chiếm hơn 73% tổng số chủng (lần lượt 8 và 11 chủng phân lập). Về phân bố của các loài Bacillus trong các ao bệnh và ao khỏe, không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi nhận trừ một ngoại lệ đối với nhóm B. licheniformis. Hai chủng B. licheniformis chỉ được tìm thấy trong ao bệnh. Tuy nhiên, kết quả sơ bộ này cần nghiên cứu thêm với nhiều mẫu phân lập hơn để được khẳng định.

Để xác định xem sự tái tổ hợp (recombination event) có thường xuyên xảy ra trong các mẫu phân lập hay không, các cây phát sinh chủng loại của 7 gen riêng rẽ đã được xây dựng dựa trên sự khác biệt về tổng số nucleotide với CLUSTALW (www.ebi.ac.uk/Tools/msa). Các cây phát sinh chủng loại đơn lẻ này có tổng thể hình dạng tương tự với cây xây dựng dựa trên các vùng gen được nối với nhau. Cụ thể, bốn nhánh chính đã được quan sát, bao gồm các thành viên như trên. Điều này cho thấy sự tiến hóa dựa chủ yếu trên đột biến trong các mẫu đã được phân lập.

Như vậy, các kết quả vừa trình bày cho thấy phương pháp MLST đã sử dụng trong nghiên cứu cho phép xác định chính xác loài của tất cả 26 chủng Bacillus đã phân lập; trong đó hai chủng có tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus được định tên là B. subtilis (chủng BRB2.1) và B. siamensis (chủng BĐK2.3). Hai chủng BNK2.2 và BNK2.3 có khả năng tiết các enzyme protease, amylase và cellulose mạnh được định tên lần lượt là B. velezensis và B. siamensis. Ngoải ra, các kết quả này cũng một lần nữa khẳng định MLST là phương pháp phân loại vi khuẩn Bacillus phù hợp hơn so với giải trình tự 16S rDNA truyền thống.

Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả phân tích MLST của 26 chủng Bacillus Dấu * biểu hiện chủng từ ao bệnh

Nhìn chung, bảy gen được sử dụng trong MLST đều thể hiện khả năng phân loài cao (D.I > 0,90). Đáng chú ý, việc có nhiều vị trí đa hình nhất không thể hiện khả năng phân loài cao nhất. Phân tích tái tổ hợp cho thấy tần số tái tổ hợp rất thấp của các locus được nghiên cứu. Do đó, có thể chỉ cần sử dụng 3

locus có khả năng phân loại cao nhất (glpF, purH và pycA) là đã đủ để phân biệt các chủng vi khuẩn của nhóm B. velezensis, B. siamensis, B. subtilis và B. licheniformis. Tuy nhiên, cần có số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá chi tiết giả thuyết này.

Cây phát sinh chủng loại dựa trên các mảnh gen được nối với nhau cho thấy bốn nhóm riêng biệt tương ứng với bốn loài Bacillus, được phân tách bằng các giá trị bootstrap đáng tin cậy (100). Các mẫu phân lập chủ yếu là B. velezensis và B. subtilis (73%). Số lượng mẫu lớn nhất của B. subtilis có thể là do chúng thường được sử dụng trong chế phẩm sinh học hoặc thức ăn bổ sung (Farzanfar, 2006; Buruiană et al., 2014). Đối với B. velezensis, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chúng có hoạt tính diệt khuẩn (Palazzini et al., 2016) và thể hiện hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cho cá (Yi et al., 2018), bao gồm cả V. parahemolyticus, tác nhân gây AHPND ở tôm nuôi. Do đó, các loài vi khuẩn này có thể đã được sử dụng thường xuyên và trở nên phổ biến trong các ao nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam. Tuy nhiên, trường hợp này không đúng đối với loài B. licheniformis. Mặc dù rất phổ biến trong các sản phẩm chế phẩm sinh học (Elshaghabee et al., 2017), chỉ có hai chủng phân lập của nhóm này được xác định. Trong thực tế, Bacillus sp. có mặt khắp nơi và được tìm thấy nhiều trong đất (Garbeva et al., 2003).

Tất cả các loài Bacillus được phát hiện trong nghiên cứu này đã được chứng minh là có tác dụng có lợi trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản. Ví dụ, B. subtilis và B. licheniformis thường được sử dụng trong các sản phẩm chế phẩm sinh học và lợi ích của chúng đã được nghiên cứu kỹ lưỡng (Van Hai & Fotedar et al., 2010; Zokaeifar et al., 2012). Một số nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của B. velezensis và B. siamensis trong các chế phẩm sinh học hoặc sử dụng làm chất diệt khuẩn trong nuôi trồng thủy sản công nghiệp (Buruiană et al., 2014; Palazzini et al., 2016; Meidong et al., 2017). Chúng đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ dinh dưỡng của động vật nuôi, chất lượng nước và kiểm soát dịch bệnh (Moriarty, 1997).

Tác dụng đối kháng của vi khuẩn Bacillus đối với V. parahaemolyticus, tác nhân chủ yếu của AHPND ở tôm, đã được nghiên cứu trước đây (Liu et al., 2015; Tran et al., 2013; Xu et al., 2013). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về sự hiện diện và phân bố của các chủng Bacillus giữa các ao tôm bệnh và ao khỏe. Hai chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng cao nhất với V. parahaemolyticus được phân lập từ nghiên cứu này cũng

có nguồn gốc là từ cả ao bệnh (chủng BRB2.1) và ao khỏe (BĐK2.3). Mặt khác, các chủng B. pumilus và B. mojavensis, được biết đến là có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus, đã không được phát hiện trong nghiên cứu này.

4.8 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3

4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đạt được sau 24 giờ nuôi cấy (Bảng 4.8, Phụ lục A6) cho thấy mật độ vi khuẩn của cả hai chủng đều đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37oC (9,57 log cfu/mL đối với chủng BĐK2.3 và 9,55 log cfu/mL đối với chủng BRB2.1), so với các giá trị nhiệt độ khác trong khoảng khảo sát từ 26 đến 40ºC vốn là phổ nhiệt độ tại vùng ĐBSCL. Tuy nhiên, có thể nhận thấy, sự chênh lệch về mật độ vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy giữa các nghiệm thức là không nhiều. Điều này có thể là so với lượng giống đầu vào được cấp là 3 log cfu/mL sau 24 giờ nuôi cấy, cả hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đều đã đạt đến (hoặc gần) pha cân bằng. Một khả năng khác là cả hai chủng Bacillus này đều có khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu rộng trong khoảng giá trị đã khảo sát.

Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau

Chủng Bacillus

Nhiệt độ (oC)

26 BĐK2.3

BRB2.1

Mật độ vi khuẩn (Log cfu/mL) 9,39±0,06a 9,46±0,05a 9,57±0,01 a 9,51±0,02 a 9,32±0,11a 9,39±0,17a 9,55±0,02 a 9,49±0,03 a

30 37 40 26 30 37 40

Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một cột có mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến mật độ của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đạt được sau 24 giờ nuôi cấy (Bảng 4.9, Phụ lục A7) cho thấy mật độ vi khuẩn của cả hai chủng đều đạt giá trị cao nhất ở giá trị pH là 7,0 (9,33 log cfu/mL đối với chủng BĐK2.3 và 9,36 log cfu/mL đối với chủng BRB2.1). Tuy nhiên, khác với V. parahaemolyticus, ảnh hưởng của pH trong khoảng khảo sát từ 5,0 đến 8,0 lên sự phát triển của hai chủng Bacillus này là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này cho thấy hai chủng Bacillus này có khả năng thích ứng rộng trong khoảng pH được khảo sát.

Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau

Mật độ vi khuẩn

Chủng Bacillus

pH

4,0

5,0

BĐK2.3

6,0

7,0

(Log cfu/mL) 9,1±0,06a 9,14±0,05ab 9,20±0,03bc 9,33±0,04cd 9,14±0,1ab

8,0

4,0

5,0

BRB2.1

6,0

7,0

9,22±0,07bc 9,20±0,1bc 9,26±0,03bc 9,36±0,03c 9,12±0,05ab

8,0

4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến mật độ của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đạt được sau 24 giờ nuôi cấy (Bảng 4.10, Phụ lục A8) cho thấy mật độ vi khuẩn của cả hai chủng đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong khoảng độ mặn được khảo sát là từ 0‰ đến 40‰. Điều này cho thấy cả hai chủng vi khuẩn này đều có khả năng thích ứng cao với điều kiện độ mặn khác nhau của môi trường. Nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền

(2010) cũng cho thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus có thể chịu đựng được nồng độ muối cao hơn so với độ mặn thường gặp ở môi trường nuôi tôm nước lợ.

Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau

Mật độ vi khuẩn

Chủng Bacillus

Nồng độ NaCl

(Log cfu/mL) 9,03±0,02a

8,96±0,2a

5‰

BĐK2.3

9,01±0,08a

20‰

9,05±0,04a

40‰

0% 9,12±0,12a

5‰

9,07±0,05a BRB2.1 9,15±0,09a

20‰

40‰ 9,12±0,08a

Như vậy, hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng phát triển trong các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH và độ mặn. Đặc tính thích ứng cao này có thể giúp hai chủng vi khuẩn này tồn tại lâu dài trong môi trường nuôi tôm nói riêng và nuôi trồng thủy sản nói chung.

4.9 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên TTCT

Như đã trình bày ở trên, trong số 12 chủng là V. parahaemolyticus đã được phân lập, chỉ có chủng BĐB1.4v là dương tính với PCR phát hiện hai gen pirA/pirB mã hóa cho độc tố nhị thể gây AHPND. Tuy nhiên, khả năng gây AHPND của chủng vi khuẩn này vẫn chưa được kiểm chứng trên thực nghiệm. Do vậy, trong nội dung nghiên cứu này, chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v và bốn chủng V. parahaemolyticus khác được phân lập từ ao bệnh (BNB3.1v, BĐB1.1v, CĐB6v và BĐB1.3v) đã được lây nhiễm chủ động vào TTCT nuôi trong hệ thống bể dung tích 100 lít. Các kết quả thử nghiệm (Bảng 4.11, Phụ lục A9) cho thấy chủng BĐB1.4v gây chết 100% tôm sau 36 giờ gây nhiễm trong khi đó ở nghiệm thức sử dụng bốn chủng V. parahaemolyticus còn lại được phân lập

từ ao bệnh, tỷ lệ chết của tôm sai khác không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Các kết quả PCR khuếch đại gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus cho thấy các mẫu tôm ở các nghiệm thức bị gây nhiễm với V. parahaemolyticus đều dương tính với loại vi khuẩn này. Như vậy, khả năng gây chết 100% tôm là điểm đặc trưng của chủng BĐB1.4v chứ không liên quan đến sự nhiễm V. parahaemolyticus nói chung. Kết quả phân tích mô bệnh học (Hình 4.26) cho thấy ở các mẫu tôm bị nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v có hiện tượng bong tróc của các tế bào biểu mô của ống gan tụy, vốn đặc trưng cho AHPND, trong khi đó, ở các mẫu tôm chết do chủng BNB3.1v không có hiện tượng này.

Từ tất cả các đặc điểm kiểu gen và kiểu hình nói trên, có thể kết luận là chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v chính là tác nhân gây AHPND. Trong các nghiên cứu tiếp theo, chủng này sẽ được sử dụng để làm tác nhân gây AHPND trên TTCT.

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít

NT Chủng Vibrio

Trung bình tỉ lệ tôm chết (%)

Kết quả mô bệnh học

Kết quả PCR với gen toxR

Kết quả PCR với gen pirA

Kết quả PCR với gen pirB

3,33±5,77b

Âm tính

Dương tính

Âm tính

BĐB1.3v

BĐB1.4v

100,00±0,00a Dương tính

Dương tính

BNB3.1v

3,33±3,34b

Âm tính

Dương tính

BRB1.1v

6,67±8,82b

Âm tính

Dương tính

CĐB6v

2,22±1,92b

Âm tính

Dương tính

ĐC

0,00±0,00b

Âm tính

Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một cột mang các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X. Mũi tên màu vàng: Bong tróc các tế bào trong lòng ống gan.

4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm

Trong nghiên cứu tiên phong của Tran et al. (2013), để tạo mô hình AHPND trên tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp ngâm đã được sử dụng với mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus gây bệnh là 2×106 cfu/mL. Các kết quả nghiên cứu của Soto-Rodriguez et al. (2015) cho thấy các chủng V. parahaemolyticus gây AHPND được phân lập ở Mexico có độc tính khác nhau; một số chủng không có khả năng gây chết tôm 100%. Mật độ cảm nhiễm có khả năng gây bệnh của các chủng này cũng đã được xác định là từ 104 cfu/mL trở lên. Gần đây, giá trị LD50 của một chủng V. parahaemolyticus gây AHPND phân lập từ Trung Quốc được xác định là dao động trong khoảng 104- 106 cfu/mL, tùy thuộc vào thời gian cảm nhiễm từ 9 đến 38 giờ (Fu et al., 2018). Do đó, để đánh giá độc lực của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v so với các dữ liệu đã được công bố, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị LD50 sau 24 giờ cảm nhiễm.

Số lượng tôm chết sau 24 giờ thử nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.12 và Phụ lục A10. Tôm ở các nghiệm thức được cảm nhiễm bởi chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v có tỉ lệ chết từ 12,22 đến 100 % với mật độ cảm nhiễm từ 103 cfu/mL đến 105 cfu/mL. Sau khi tỉ lệ tôm chết được chuyển đổi về giá trị probit, hồi quy tuyến tính Log(mật độ vi khuẩn) vs. probits cho thấy mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa giá trị probit và Log(mật độ cảm nhiễm V. parahaemolyticus) (R2 = 0.931) (Hình 4.27). Từ đường chuẩn xây dựng được (Hình 4.27), giá trị LD50 sau 24 giờ cảm nhiễm tính toán được là 8008 cfu/mL.

Phân tích mô gan tụy các mẫu tôm cảm nhiễm với mật độ BĐB1.4v là 104 cfu/mL (tôm sống và tôm chết ở thời điểm 24 giờ) có thể quan sát thấy các giai đoạn tiến triển bệnh đặc trưng của AHPND là: (i) các tế bào biểu mô bong tróc và

rơi vào lòng ống mô gan tụy (Hình 4.28B); (ii) sự hoại tử và biến dạng của tế bào và ống mô gan tụy (Hình 4.28C); (iii) sự biến mất của tế bào B và R và nhân một số tế bào biểu mô bị trương phồng (Hình 4.28D).

Từ toàn bộ các kết quả này, có thể kết luận chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND có độc lực rất mạnh, ít nhất tương đương với chủng V. parahaemolyticus PB1937 trong nghiên cứu của Fu et al. (2018). Để thuận tiện cho việc so sánh với các nghiên cứu trước, mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v được sử dụng trong các mô hình nuôi TTCT 100L và 1000L là 104 cfu/mL (tương đương giá trị LD54 sau 24 giờ).

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ

Mật độ cảm nhiễm (cfu/mL)

Giá trị probit

Số tôm ban đầu

Tỉ lệ tôm chết (%)

Kiểm chứng âm

103

12,22±1,92

3,84

3,2×103

42,22±1,92

4,80

104

56,67±3,33

5,17

3,2×104

70±3,33

5,52

105

100

NA: không xác định

Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V.

parahaemolyticus BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit)

Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V.

parahaemolyticus BĐB1.4v (A)Đối chứng âm; (B) tế bào biểu mô bong tróc và rơi vào lòng ống gan tụy; (C) sự hoại tử và biến dạng của tế bào và ống mô gan tụy , (D) sự biến mất của tế bào B và R và nhân một số tế bào biểu mô bị trương phồng. Mũi tên màu vàng: Bong tróc các tế bào trong lòng ống gan.. Mũi tên màu xanh: hoại tử ống gan tụy. Mũi tên màu đen: Nhân tế bào biểu mô gan tụy bị phình to.

4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở quy mô phòng thí nghiệm

4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm

Như đã trình bày ở trên, hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 thể hiện hoạt tính đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Tuy nhiên, câu hỏi được đặt ra ở đây là liệu hoạt tính kháng khuẩn này còn được bảo toàn trong môi trường nuôi tôm. Để kiểm tra khả năng này, hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đã được gây nhiễm chủ động với liều lượng 105, 106 và 107 cfu/mL vào bình tam giác chứa nước nuôi tôm đã cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v. Ở thí nghiệm trên, giá trị LD50 sau 24h đối với V. parahaemolyticus BĐB1.4v là 8008 cfu/mL, do đó, mật độ cảm nhiễm được sử dụng là 104 cfu/mL (tương

đương giá trị LD54). Kết quả thử nghiệm (Bảng 4.13, Bảng Phụ lục A11) cho thấy ở liều cấp giống thấp nhất của cả 2 chủng Bacillus là 105 cfu/mL, vi khuẩn V. parahaemolyticus vẫn tiếp tục sinh trưởng trong nước nuôi tôm để đạt mật độ khoảng 106 cfu/mL sau 24 giờ và xấp xỉ 107 cfu/mL sau 48 giờ. Tuy nhiên, khi liều cấp giống được tăng lên mức 106 và 107 cfu/mL, cả hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đều thể hiện hoạt tính diệt V. parahaemolyticus rất mạnh: sau 24 giờ, mật độ V. parahaemolyticus giảm từ mức 104 cfu/mL xuống còn khoảng 102 cfu/mL; sau 48 giờ, V. parahaemolyticus bị diệt hoàn toàn. Như vậy, để ức chế hiệu quả V. parahaemolyticus ở mức gây AHPND là 104 cfu/mL (Soto-Rodriguez et al., 2015), cần thiết phải cung cấp ít nhất là 106 cfu/mL các chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3. Điều này có thể được giải thích là khi cấp giống ở mật độ thấp hơn sẽ không ức chế kịp thời được V. parahaemolyticus và vi khuẩn gây bệnh này một khi đã tăng trưởng đủ số lượng sẽ cạnh tranh nguồn dinh dưỡng với các chủng Bacillus (mật độ Bacillus giảm ở thời điểm 48 giờ ở các nghiệm thức B2 và B5). Từ các kết quả này, trong các nội dung nghiên cứu tiếp theo, các chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sẽ được nhiễm chủ động ở mức 106 cfu/mL để thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND trên TTCT.

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước nuôi tôm

Mật độ vi khuẩn theo thời gian (cfu/mL)

NT

Nghiệm thức

24 giờ

48 giờ

Bacillus

Vibrio

Bacillus

Vibrio

BĐB 1.4v

Âm tính

7,5.106

Âm tính

1,5.107

(không có Bacillus)

B2 BRB2.15-BĐB1.4v4

2,2.108

1,3.106

5,3.109

1,9.107

B3 BRB2.16-BĐB1.4v4

2,4.108

1,0.102

2,2.109

Âm tính

B4 BRB2.17-BĐB1.4v4

4,0.108

2,0.102

2,9.109

Âm tính

B5 BĐK2.35-BĐB1.4v4

1,6.108

1,4.106

2,4.109

0,8.106

B6 BĐK2.36-BĐB1.4v4

8,1.107

2,0.102

5,2.108

Âm tính

B7 BĐK2.37-BĐB1.4v4

2,2.108

2,1.102

1,3.109

Âm tính

4.11.2 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít

Để trả lời câu hỏi liệu hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có tác dụng phòng chống AHPND trên TTCT hay không, hai chủng vi khuẩn này đã được nhiễm chủ động vào các bể nuôi tôm có thể tích 100 lít để đạt mật độ cuối cùng là 106 cfu/mL cùng với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v (mật độ cuối 104 cfu/mL). Sau 36 giờ gây nhiễm, tỷ lệ tôm sống được xác định và các quan sát mô bệnh học được tiến hành. Các kết quả (Bảng 4.14, Phụ lục A12) cho thấy nghiệm thức C2 (chỉ gây nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v), toàn bộ các cá thể tôm đều bị chết trong khi đó ở các nghiệm thức có bổ sung chủng B. subtilis BRB2.1 và/hoặc B. siamensis BĐK2.3, tỷ lệ tôm sống tăng lên đáng kể, mặc dù vẫn thấp hơn nghiệm thức đối chứng (không nhiễm chủng BĐB1.4v). Nghiệm thức cho kết quả tốt nhất là khi sử dụng chủng B. subtilis BRB2.1, sau đó đến chủng B. siamensis BĐK2.3 (P < 0,05). Các kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu thu được bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Một điểm thú vị là trong nghiệm thức C5, khi sử dụng đồng thời hai chủng đối kháng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3, tỉ lệ sống của tôm thấp hơn đáng kể (P<0,05) so với nghiệm thức sử dụng chủng BRB2.1. Hiện tượng này có thể do các cơ chế kháng khuẩn của hai chủng Bacillus này là khác

nhau do vậy khi đồng nuôi cấy sẽ gây ra hiện tượng ức chế lẫn nhau, khiến cho khả năng diệt V. parahaemolyticus gây AHPND giảm xuống. Hiện tượng này cũng được quan sát trong nghiên cứu của Wang et al. (2018). Nhóm tác giả nhận thấy hiệu quả bảo vệ tôm thẻ chân trắng khỏi AHPND của hỗn hợp hai chủng Pseudoalteromonas CDM8 và CDA22 là kém hơn khi sử dụng riêng từng chủng (tôm chết 88,6% sau 120 giờ cảm nhiễm khi sử dụng hỗn hợp so với 36,6% đối với CDM8 và 76,7% đối với CDA22).

Kết quả về mô bệnh học của tôm (Hình 4.29) cho thấy hiện tượng nhân tế bào gan tụy trương to, tế bào bị hoại tử rơi vào trong lòng ống gan tụy (đặc trưng của AHPND) chỉ quan sát được ở nghiệm thức C2. Các mẫu tôm sống và chết ở các nghiệm thức khác không thấy xuất hiện các triệu chứng nói trên.

Tất cả các kết quả này chỉ ra rằng việc sử dụng một trong hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 cho phép phòng chống AHPND, tăng tỷ lệ tôm sống và ngăn chặn các triệu chứng của AHPND xuất hiện. Tuy nhiên, do thời gian thử nghiệm vẫn còn ngắn nên để thu nhận được các kết quả có tính khái quát hơn, cần theo dõi các chỉ tiêu phân tích trong suốt lứa phát triển của tôm.

Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm

Kết quả mô học

Nghiệm thức

Tỉ lệ sống (%) của tôm

Phát hiện gen pirA bằng PCR

Phát hiện pirB bằng PCR

AHPND

ĐC âm

97,78±3,85a

Âm tính

0,00±0,00d

Dương tính Dương tính Dương tính

ĐC dương (gây nhiễm BĐB1.4v)

85,56±1,93c

Âm tính

BRB2.1- BĐB1.4v

76,67±6,67b

Âm tính

BĐK2.3- BĐB1.4v

64,44±5,09b

Âm tính

BRB2.1- BĐK2.3- BĐB1.4v

Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) độ phóng đại 200X Mũi tên màu xanh dương: các thể granulom Mũi tên màu vàng: bong tróc các tế bào trong lòng ống gan

4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm của chủng B. subtilis BRB2.1 khỏi AHPND ở quy mô nuôi 1000 lít

Kết quả trình bày ở phần trên cho thấy rõ về khả năng đối kháng V. parahaemolyticus và phòng chống AHPND của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong các điều kiện khác nhau từ in vitro đến quy mô 100 lít sau 36 giờ cảm nhiễm. Các kết quả nghiên cứu cho thấy chủng B. subtilis BRB2.1 cho khả năng đối kháng và bảo vệ tôm khỏi AHPND cao hơn so với chủng B. siamensis BĐK2.3. Do vậy, trong nội dung nghiên cứu này, để đánh giá khả năng phòng chống AHPND ở quy mô lớn hơn (1000 lít) và trong thời gian dài hơn, chủng B. subtilis BRB2.1 đã được sử dụng. Ba nghiệm thức được bố trí tiến hành bao gồm mẫu tôm được nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v (D2), mẫu tôm được nhiễm đồng thời chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v và chủng B. subtilis BRB2.1 (D3) và mẫu tôm đối chứng (D1, không được cảm nhiễm).

4.12.1. Sự biến động của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm

Để đảm bảo đánh giá đúng sự ảnh hưởng của chủng B. subtilis BRB2.1 đến sự phát triển của tôm cũng như khả năng bảo vệ tôm khỏi tác nhân V. parahaemolyticus gây AHPND, các chỉ tiêu môi trường cần được kiểm soát nằm

trong giới hạn cho phép và đồng đều giữa các nghiệm thức. Các kết quả đo đạc các thông số này (Bảng 4.15, Phụ lục A13-20) cho thấy:

- Nhiệt độ nước nuôi là ổn định (dao động quanh mức 30ºC) và không có sự khác biệt quá lớn giữa các nghiệm thức. Theo Van and Scarpa (1999) nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của TTCT là khoảng 24-32ºC. Như vậy, nhiệt độ nước nuôi trong nghiên cứu này là hoàn toàn thích hợp với sự phát triển của tôm;

- pH của nước nuôi là ổn định và không có sự chênh lệch quá lớn giữa các nghiệm thức (dao động trong khoảng từ 8,01 đến 8,04, và nằm trong khoảng pH thích hợp cho sự phát triển của TTCT (từ 7,7 đến 8,5);

- Hàm lượng oxy hòa tan trong nước (DO) tương đối cao và ổn định do được sục khí liên tục dao động từ 8,75 – 8,94 mg/L giữa các nghiệm thức; nằm trong khoảng phù hợp cho sự phát triển của tôm, cá (từ 5 đến 15 mg/L)

- Nồng độ NH3 dao động giữa các nghiệm thức từ 0,09 – 0,12 mg/L và có xu hướng tăng theo thời gian, tuy nhiên khi NH3 tăng quá mức cho phép thì các bể nuôi được thay một phần nước để duy trì trong giới hạn cho phép. Riêng nghiệm thức D2, tôm chết 95% sau 36 giờ nên nghiệm thức đã được kết thúc và ghi nhận kết quả. Đối với các nghiệm thức còn lại, nồng độ NH3 cao nhất ở nghiệm thức D3 (0,12±0,01) mg/L cao hơn so với nghiệm thức D1 (0,11±0,02) mg/L. Rất có thể ở nghiệm thức D3, việc bổ sung Bacillus đã giúp các chất hữu cơ trong bể được chuyển hóa mạnh hơn để tạo thành NH3 thông qua quá trình amon hóa

- Nồng độ NO2 dao động trong khoảng 0,1 đến 0,67 mg/L giữa các nghiệm

thức, nhỏ hơn 2 mg/L nên thích hợp cho sự sinh trưởng của TTCT.

Như vậy, toàn bộ các chỉ tiêu chính yếu đều ổn định, phù hợp với sự phát

triển của TTCT và không có sự chênh lệch quá lớn giữa các nghiệm thức.

Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức

Chỉ tiêu

D1 (Đối chứng) 29,9±0,1 8,04±0,01 8,94±0,03 0,11±0,02 0,30±0,07

D2 (nhiễm BĐB1.4v) 30,2±0,3 8,02±0,03 8,90±0,05 0,09±0,01 0,10±0,00

D3 (nhiễm BĐB1.4v + BRB2.1) 30,0±0,1 8,01±0,02 8,75±0,03 0,12±0,01 0,67±0,03

Nhiệt độ (toC) pH DO (mg/L) NH3 (mg/L) NO2 (mg/L)

4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá trình thử nghiệm

Để đánh giá ảnh hưởng của chủng B. subtilis BRB2.1 lên hệ vi sinh vật tổng số, cũng như vi khuẩn thuộc chi Vibrio trong quá trình nuôi TTCT ở quy mô bể 1000 lít, hai chỉ tiêu này đã được theo dõi trong suốt 31 ngày thử nghiệm, dựa vào nhận định rằng đặc trưng của AHPND là tử vong hàng loạt ở tôm trong 30 ngày đầu thả nuôi (Leano and Mohan, 2012). Các kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật tổng số (Bảng 4.16) cho thấy tại thời điểm ban đầu có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức. Điều này là do việc cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v và chủng B. subtilis BRB2.1 vào các nghiệm thức D2 và D3. Do sau 4 ngày nuôi, toàn bộ tôm trong nghiệm thức D2 đều chết nên chỉ tiêu vi sinh vật tổng số chỉ được xác định thêm tại thời điểm 4 ngày. Trong nghiệm thức đối chứng, mật độ vi sinh vật tổng số có xu hướng tăng dần theo thời gian và đạt giá cao nhất là khoảng 6.104 cfu/mL. Điều này có thể là do sự tăng sinh của vi sinh vật trong bể cùng với sự tích lũy của chất hữu cơ có nguồn gốc từ thức ăn hay chất thải của tôm. Đối với nghiệm thức D3 (cảm nhiễm đồng thời vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v và chủng B. subtilis BRB2.1), mật độ vi sinh vật tổng số khá ổn định (dao động quanh mức 106 cfu/mL là liều cấp giống của chủng B. subtilis BRB2.1) dù quá trình thay một phần nước trong bể diễn ra khá thường xuyên. Rất có thể phần lớn lượng vi sinh vật tổng số trong nghiệm thức D3 chính là chủng B. subtilis BRB2.1 vì ở công thức đối chứng D1, chỉ tiêu vi sinh vật tổng số chỉ tăng từ mức 103 đến 6.104 cfu/mL, không có khả năng tăng sinh được lên đến mức 106 cfu/mL. Điều này cũng cho thấy khả năng tồn tại lâu dài của chủng B. subtilis BRB2.1 trong môi trường nuôi tôm.

Về chỉ tiêu mật độ vi khuẩn Vibrio sp., ở nghiệm thức D2 có 2 giá trị dao động quanh mức 104 cfu/mL tương ứng với đúng liều cấp giống của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v. Tôm trong nghiệm thức này chết đến 95% sau 36 giờ. Theo Moriarty (1998) mật độ vi khuẩn Vibrio vượt quá 103 cfu/mL sẽ gây hại cho tôm. Tương tự như chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, ở nghiệm thức đối chứng D1, mật độ vi khuẩn Vibrio sp. có xu hướng tăng dần và đạt giá trị cực đại vào cuối đợt thử nghiệm (1,5.103 cfu/mL). Trong khi đó, ở nghiệm thức D3 có chủng B. subtilis BRB2.1 đối kháng với V. parahaemolyticus thì mật độ của vi khuẩn Vibrio sp. là giảm dần từ mức 1,6.104 cfu/mL xuống mức 2,7.102 cfu/mL (Bảng 4.17). Các kết quả này cho thấy hoạt tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 đối với V. parahaemolyticus được thể hiện trong suốt quá trình thử nghiệm.

Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL)

Ngày nuôi

D1 (ĐC)

D2 1,9.104 1,3.104 a

Âm tính

1,1.103 1,7.103 b 8,0.103 b 1,3.104 b 1,9.104 b 3,0.104 b 5,7.104 b 6,0.104 b

D3 1,6.106 1,0.106 a 9,3.105a 1,6.106 a 2,1.106 a 1,1.106 a 2,3.106 a 1,3.106 a

Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL)

Ngày nuôi

D1 (ĐC)

D2

D3

1,5.102

1,8.104

1,6.104

1,3.102 a

5,0.103 b

2,8.103 b

2,3.102 a

1,3.103 b

2,9.102 a

1,1.103 ab

2,8.102 a

7,5.102 b

5,4.102 a

5,1.102 a

7,5.102 a

4,3.102 ab

1,5.103b

2,7.102 a

Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NA: không xác định

4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm

Tỉ lệ sống của TTCT ở các nghiệm thức được trình bày ở Bảng 4.18. Trong nghiệm thức D2, tôm chết 95% sau 4 ngày do AHPND (10/200 cá thể tôm còn sống, phụ lục A17). Trong hai nghiệm thức còn lại thì tôm ở nghiệm thức D3 (bổ sung chủng B. subtilis BRB2.1) có tỉ lệ sống cao nhất (87,83% so với 55,00%; P < 0,05). Như vậy, ngoài khả năng phòng chống AHPND, chủng B. subtilis BRB2.1 còn có thể giúp tăng tỷ lệ sống của tôm khi theo dõi trong thời gian dài. Ngoài ra, kết quả này một lần nữa cho thấy hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của chủng Bacillus BRB2.1.

Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân và Trần Sương Ngọc (2014) cũng cho thấy việc bổ sung vi khuẩn Bacillus sp. sẽ cải thiện tỉ lệ sống của TTCT. Theo Vasecharan et al. (2003), sử dụng vi khuẩn Bacillus trong nuôi tôm giúp nâng cao tỉ lệ sống của tôm và còn tăng cường sự tăng trưởng của tôm. Do vậy, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (SGR) của tôm của hai nghiệm thức D1 và D3 đã được xác định (Bảng 4.18). Kết quả cho thấy hệ số chuyển đổi thức ăn ở nghiệm thức D3 là thấp nhất (1,11 so với 1,32) (p<0,05) và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu ở nghiệm thức này cũng cao nhất. Điều đó cho thấy việc bổ sung chủng B. subtilis BRB2.1 ngoài việc đối kháng với V. parahaemolyticus gây AHPND, còn góp phần làm tăng tốc độ tăng trưởng và tăng hiệu quả hấp thu và chuyển hóa thức ăn của tôm thẻ chân trắng. Theo Ziaei- Nejad et al. (2006), các vi khuẩn Bacillus vốn có khả năng tiết enzyme thủy phân potease, amylase và cellulase rất mạnh. Do đó, việc bổ sung lợi khuẩn Bacillus có thể giúp tăng khả năng hấp thu thức ăn cho tôm và qua đó, giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn.

Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau thí nghiệm

Nghiệm thức

D1 (ĐC)

D2

D3

55,00±3,97b

87,83±4,07a

Tỉ lệ sống (%)

FCR SGR

1,32±0,03b 7.82±0.06

1,11±0,05a 8.03±0.09

Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NA: không xác định

Như vậy, khả năng ứng dụng chủng B. subtilis BRB2.1 để làm chế phẩm probiotic trong nuôi tôm công nghiệp là hoàn toàn có cơ sở, mở ra khả năng phòng chống AHPND bằng biện pháp hoàn toàn sinh học. Thứ nhất, như đã đề cập ở phần tổng quan, do tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận (Generally Recognized As Safe công nhận bởi FDA) nên chủng B. subtilis BRB2.1 có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học. Thứ hai, các quy trình sản xuất chế phẩm bào tử của B. subtilis đã được nghiên cứu tối ưu hóa rất nhiều. Điều này sẽ tạo tiền đề để phát triển nhanh chóng quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học dựa trên chủng B. subtilis BRB2.1. Sử dụng bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học có ưu điểm cơ bản là đơn giản hóa điều kiện bảo quản cũng như quy trình sản xuất (Duc et al., 2004).

100

Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

- Đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus, bao gồm cả chủng gây AHPND; hai chủng B. velezensis BNK2.2 và B. siamensis BNK2.3 có khả năng tiết các enzyme protease, amylase và cellulase mạnh;

- Chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng phát triển trong một khoảng rộng về nhiệt độ từ 26 đến 40ºC; pH từ 4,0 đến 8,0; và độ mặn từ 0‰ đến 40‰;

- Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm là 106 cfu/mL; hai chủng này giúp phòng chống hiệu quả AHPND trên mô hình tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 L; tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm khi sử dụng hai chủng này lần lượt là 85,56 và 76,67%.

- Chủng B. subtilis BRB2.1, mang gen sboA, mã hóa subtilosin A vốn là một loại bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, giúp phòng chống hiệu quả AHPND, cải thiện tỷ lệ tôm sống và hiệu quả sử dụng thức ăn của tôm trong mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 1000 L.

- Có thể kiểm soát được sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus gây AHPND bằng cách khống chế độ mặn của nước nuôi tôm ở mức 10‰;

- MLST là một công cụ phân loại hiệu quả hơn so với giải trình tự 16S rDNA để xác định các loài Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm công nghiệp;

- Đã phát hiện được bốn loài Bacillus chính từ ao nuôi tôm công nghiệp là B. subtilis, B. velezensis, B. siamensis và B. licheniformis.

5.2 Đề xuất

- Đóng góp lớn nhất của luận án nghiên cứu này là đã phân lập và tuyển chọn được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng đối kháng cao đối với V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm. Từ kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, một giả thuyết được đặt ra sau khi nghiên cứu này kết thúc là subtilosin A chính là loại bacteriocin tạo nên khả năng đối kháng cao của B. subtilis BRB 2.1 đối với V. parahaemolyticus. Tuy nhiên, để khẳng định được giả thuyết này cũng như xác định được tác nhân

101

khác tạo tính đối kháng cao của B. subtilis BRB2.1, các nội dung nghiên cứu sau sẽ có thể được tiến hành:

- Giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng B. subtilis BRB2.1 để xác định toàn bộ các loại bacteriocin có thể được tổng hợp ở chủng vi khuẩn này. Các kết quả giải trình tự cũng sẽ cho phép xác định được cấu trúc các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. Đây sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo bacteriocin tái tổ hợp trong giai đoạn sau.

- Tạo các chủng B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện bacteriocin ở trạng thái dung hợp với các đuôi ái lực, giúp đơn giản hóa quá trình tinh sạch. Sau khi tinh chế và hoàn nguyên (loại bỏ đuôi ái lực), các bacteriocin tái tổ hợp sẽ được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus cũng như các vi khuẩn gây bệnh Gram âm và Gram dương khác. Các kết quả thử nghiệm này sẽ cho phép xác định được loại bacteriocin diệt V. parahaemolyticus cũng như xác định phổ kháng khuẩn của loại bacteriocin này nhằm mở ra các ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực y học và an toàn thực phẩm.

- Tiến hành sản xuất và thử nghiệm các chế phẩm sinh học sử dụng chủng B. subtilis BRB2.1 trên quy mô lớn. Về phương thức ứng dụng của chế phẩm sinh học dựa trên chủng B. subtilis BRB2.1, như kết quả phần trên đã chỉ ra, mật độ của vi khuẩn này cần đạt trong nước nuôi tôm để ức chế hiệu quả chủng V. parahaemolyticus gây AHPND là 106 cfu/mL. Do vậy, để tiết kiệm chi phí, chế phẩm cần được tăng sinh sơ bộ trong môi trường nước nuôi tôm trước (có thể bổ sung cơ chất dinh dưỡng để đảm bảo tỷ lệ tăng sinh và rút ngắn thời gian). Sau khi đạt mật độ cần thiết thì mới bổ sung vào ao nuôi. Các kết quả nghiên cứu trên mô hình 1000 lít đã cho thấy chủng B. subtilis BRB2.1, sau khi cảm nhiễm, có khả năng tồn tại ổn định ở mức 106 cfu/mL trong suốt thời gian nuôi. Do vậy, việc bổ sung chế phẩm cùng thức ăn có thể không thực sự cần thiết. Tuy nhiên, cần khẳng định lại giả thuyết này trên mô hình nuôi tôm siêu thâm canh trong thực tế trước khi được ứng dụng đại trà do tương tác với môi trường nuôi và hệ sinh vật tự nhiên có thể khiến cho mật độ lợi khuẩn giảm xuống mức dưới 106 cfu/mL.

102

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Abriouel H., C.M. Franz, and N. Ben Omar, 2011. Diversity and applications of

Bacillus bacteriocins. FEMS Microbiology Reviews, 35:201–32.

Aguirre-Guzman G., M. Lara-flores, J. Sánchez-Martínez, A. Isidro Campa- Córdova and A. Luna, 2012. The use of probiotics in aquatic organisms: A review. Afr. J. Microbiol. Res., 6(21):4845-4857.

Ahilan B., G. Shine and R. Santhanam, 2004. Influence of probiotics on the growth and gut microbial load of juvenile goldfish (Carassius auratus). Asian Fisheries Science, 17:271-278.

Alagappan K. M., B.Deivasigamani, S. T. Somasundaram and S. Kumaran, 2010. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and its specific phages from shrimp ponds in east coast of India. Curr Microbiol, 61(4):235-240. Ara K., K. Ozaki, K. Nakamura, K. Yamane, J. Sekiguchi and N. Ogasawara, 2007. Bacillus minimum genome factory: effective utilization of microbial genome information. Biotechnol Appl Biochem, 46(3):169-178.

Asgarpoor, Daryoush and Haghi, Fakhri & Zeighami, Habib, 2018. Detection and in Shrimp

Molecular Characterization of Vibrio Parahaemolyticus Samples. The Open Biotechnology Journal, 12: 46-50.

Atsumi T., L. McCartert and Y. Imae, 1992. Polar and lateral flagellar motors of marine Vibrio are driven by different ion-motive forces. Nature, 355(6356):182-184.

Atsumi T., S. Sugiyama, and Y. Imae, 1990. Specific inhibition of the Na+- driven flagellar motors of alkalophilic Bacillus strains by the amiloride analog phenamil. American Society for Microbiology, 172(3):1634-9. Austin B., 1988. Marine Microbiology, xii, 222 p. Melbourne: Cambridge

University Press, 218.

Babasaki K., T. Takao, Y. Shimonishi and K. Kurahashi, 1985. Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis. Journal of Biochemistry, 98:585–603.

occurrence

clinical

impact

and

Baker-Austin C., L. Stockley, R. Rangdale and J. Martinez-Urtaza, 2010. of Vibrio European

parahaemolyticus:

a

Environmental vulnificus and Vibrio perspective. Environmental Microbiology Report, 2:7–18.

103

Bakermans C. and E. L. Madsen, 2002. Diversity of 16S rDNA and naphthalene dioxygenase genes from coal-tar-waste-contaminated aquifer waters. Microbial Ecology, 44(2):95-106.

Balcazar J. L., I. de Blas, I. Ruiz-Zarzuela, D. Cunningham, D. Vendrell and J. L. Muzquiz, 2006. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology, 114(3-4):173-186.

Balcázar, J. L., Rojas-Luna, T., and Cunningham, D. P., 2007. Effect of the addition of four potential probiotic strains on the survival of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) following immersion challenge with Vibrio parahaemolyticus. Journal of Invertebrate Pathology, 96(2): 147- 150.

Bauer A. W., D.M. Perry, W. M. Kirby, 1959. Single-disk antibiotic-sensitivity testing of staphylococci; an analysis of technique and results. AMA Archives of Internal Medicine, 104(2):208–216.

Bej A. K., D. P. Patterson, C. W. Brasher, M. C. Vickery, D. D., Jones and C. A. Kaysner, 1999. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J Microbiological Methods, 36(3):215-225.

Bergey, 2009. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volume 3: The Firmicutes. New York: Springer, 1314 pp. Editors: Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W., Rainey, F.A., Schleifer, K.-H., Whitman, W. (Eds.)

Beuchat L.R., 1973. Interacting Effects of pH, Temperature, and Salt Concentration on Growth and Survival of Vibrio parahaemolyticus. Applied Microbiology, 25(5):844–846.

Beuchat L.R., 1975. Environmental Factors Affecting Survival and Growth of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Milk and Food Technology, 8:476- 480.

Beuchat L. R., 1976. Sensitivity of Vibrio parahaemolyticus to spices and organic

acids. Journal of Food Science, 41(4):899-902.

Bindiya E. S., K. J. Tina and S. S, Raghul , 2015. Characterization of Deep Sea Fish Gut Bacteria with Antagonistic Potential from Centroscyllium fabricii (Deep Sea Shark). Probiotics and Antimicrobial Proteins, 7(2):157–163.

Bộ Thủy sản, 2001. Quy trình công nghệ nuôi thâm canh tôm sú. Danh mục tiêu

chuẩn ngành thủy sản 28 TCN 171:2001.

104

Bosch D., B. Schipper, H. van der Kleij, R. A. de Maagd and W. J. Stiekema, 1994. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management. Biotechnology (N Y), 12(9):915-918.

Boyd E.C., C.W. Wood and T. Thunjai., 2002. Aquaculture pond bottom soil quality management. Pond dynamics. Aquaculture Collaborative Research Support program Oregon state University, Corvallis, Oregon 97331-1641. 41 p.

Bravo A., S. S. Gill and M. Soberon, 2007. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon, 49(4):423-435.

Bray W.A., A. L. Lawrence and J. R. Leung-Trujillo, 1994. The effect of salinity on growth and survival of Penaeus vannamei, with observations on the interaction of IHHN virus and salinity. Aquaculture, 122:133-146. Brill J., T. Hoffmann, M. Bleisteiner and E. Bremer, 2011. Osmotically controlled synthesis of the compatible solute proline is critical for cellular defense of Bacillus subtilis against high osmolarity. Journal of Bacteriology, 193(19):5335-5346.

Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông

nghiệp.

Burnham V. E., M. E. Janes, L. A. Jakus, J. Supan, A. DePaola, and J. Bell, 2009. Growth and survival differences of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus strains during cold storage. Journal of Food Science, 74(6): 314-318.

Buruiană C. T., P. Georgiana and C. Vizireanu, 2014. Effects of probiotic Bacillus species in aquaculture - An overview. Annals of the University Dunarea de Jos of Galati, 38(2): 9-17.

Cabello, F.C., 2006. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environmental Microbiology, 8: 1137–1144.

Cahill M. M., 1990. Bacterial flora of fishes: A review. Microbial Ecology,

19(1): 21-41.

Ceccarelli D., Hasan N. A., Huq A., and Colwell R. R., 2013. Distribution and dynamics of epidemic and pandemic Vibrio parahaemolyticus virulence factors. Frontiers in cellular and infection microbiology, 3: 97-97.

105

Charoonnart, P., Purton, S., and Saksmerprome, V., 2018. Applications of Microalgal Biotechnology for Disease Control in Aquaculture. Biology, 7(2): 24.

Chopra L., Singh G., Choudhary V., and Sahoo D. K., 2014. Sonorensin: an antimicrobial peptide, belonging to the heterocycloanthracin subfamily of bacteriocins, from a new marine isolate, Bacillus sonorensis MT93. Applied and environmental microbiology, 80(10): 2981–2990.

Chung Y.J., Steen M.T., Hansen J.N., 1992. The subtilin gene of Bacillus subtilis ATCC 6633 is encoded in an operon that contains a homolog of the hemolysin B transport protein. Journal of Bacteriology, 174(4): 1417– 1422.

Cook D.W., 1994. Effect of time and temperature on multiplication of Vibrio vulnificus in postharvest Gulf Coast shellstock oysters. Applied and environmental microbiology, 60(9): 3483-3484.

Cote C. K., and Welkos S. L., 2015. Anthrax Toxins in context of Bacillus anthracis Spores and Spore Germination. Toxins, 7(8): 3167-3178. Crab R., Defoirdt T., Bossier P., and Verstraete W., 2012. Biofloc technology in aquaculture: Beneficial effects and future challenges. Aquaculture (Vol. 356-357).

Cục Thú y, Báo cáo tổng kết 2017. Dal Peraro M. and van der Goot F. G., 2016. Pore-forming toxins: ancient, but

never really out of fashion. Nature Reviews Microbiology, 14(2) : 77-92.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012. Các bệnh nguy hiểm trên tôm nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học ĐH Cần thơ, 22c: 106-118.

Đặng Thị Lụa, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Hải Hà, Trương Thị Mỹ Hạnh, Phan Thị Vân, 2015. Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá trầu không (Piper betle L.) và dịch chiết lá ổi ( Psidium guajava) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi nước lợ. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 11: 92-97.

Đào Văn Trí, 2002. Một số đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng và thử nghiệm nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa và Phú Yên. Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long (số đặc biệt), Báo cáo khoa học hội thảo Quốc gia Nghiên cứu khoa học phục vụ nghề NTTS ở các tỉnh phía Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TPHCM, 365 - 369.

106

Dash P., Avunje S., Tandel R. S and Panigrahi A., 2017. Biocontrol of Luminous Vibriosis in Shrimp Aquaculture: A Review of Current Approaches and Future Perspectives. Reviews in Fisheries Science and Aquaculture, 25(3): 245–255.

DiRita V. J., Parsot C., Jander G., and Mekalanos J. J. (1991). Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88(12): 5403-5407.

Đỗ Thị Hiền, 2018. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

Bacteriocin của vi khuẩn Bacillus subtilis và khả năng đối kháng trên chủng Vibrio spp. Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. HCM.

Drancourt M., Bollet C., Carlioz A., Martelin R., Gayral J. P., and Raoult D., 2000. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. Journal of clinical microbiology, 38(10): 3623–3630.

Duc l., Hong H. A., Barbosa T. M., Henriques A. O., and Cutting S. M., 2004. Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Applied and environmental microbiology, 70(4): 2161–2171.

Earl A. M., Losick R. and Kolter R., 2008. Ecology and genomics of Bacillus

subtilis. Trends Microbiol, 16(6): 269-275.

Elshaghabee F. M. F., Rokana N., Gulhane R. D., Sharma C., and Panwar H., 2017. Bacillus As Potential Probiotics: Status, Concerns, and Future Perspectives. Frontiers in microbiology, 8: 1490-1490.

Farzanfar A., 2006. The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol

Med Microbiol, 48(2): 149-158.

for

temperature

storage

effect

the

Fernandez-Piquer J., Bowman J. P., Ross T., Tamplin M. L., (2011). Predictive models on Vibrio of parahaemolyticus viability and counts of total viable bacteria in Pacific oysters (Crassostrea gigas). Appl. Environmental Microbiology, 77: 8687– 8695.

Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed. By D. J. Finney, Cambridge

University Press, 32 E. 57th St., New York, Ny 10022, 1971. xv 333 pp.

Flegel T., 2012. Historic emergence, impact and current status of shrimp

pathogens in Asia. Journal of Invertebrate Pathology, 110(2): 166-173.

Flegel T., Owens L., and Oakey J., 2005. Evidence for Phage-Induced Virulence in the Shrimp Pathogen Vibrio harveyi. In P. Walker, R. Lester and M.G.

107

Bondad-Reantaso (eds). Diseases in Asian Aquaculture V, pp. 329-337. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila.

Fox G. E., Wisotzkey, J. D. and Jurtshuk P., Jr., 1992. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. International Journal of Systematic Bacteriology, 42(1): 166-170. Froger A. and Hall J.E., 2007. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments, (6):253. Fu S., L. Wang, H. Tian, D. Wei, Y. Liu, 2018. Pathogenicity and genomic

characterization of Vibrio parahaemolyticus strain PB1937 causing shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease in China. Annals of Microbiology, 68(4):175-184

Fukami K., Nishijima T., and Ishida Y., 1997. Stimulative and inhibitory effects of bacteria on the growth of microalgae. Hydrobiologia, 358:185-191. Galaviz-Silva L., Iracheta-Villarreal J. M., and Molina-Garza Z. J., 2018. Bacillus and Virgibacillus strains isolated from three Mexican coasts antagonize Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbiology Letter, 365(19).

Gao X.Y., 2017. Mechanism of anti-Vibrio activity of marine probiotic strain Bacillus pumilus H2, and characterization of the active substance. AMB Express, 7(1): 23-23.

Garbeva P., van Veen J. A., and van Elsas J. D., 2003. Predominant Bacillus sp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR- DGGE. Microbial Ecology, 45(3): 302-316.

García P., Rodríguez L., Rodríguez A., and Martínez B. (2010). Food biopreservation: promising strategies using bacteriocins, bacteriophages and endolysins. Trends in Food Science and Technology, 21(8): 373-382. Gillor O., and L. Ghazaryan., 2007. Recent advances in bacteriocin application as

antimicrobials. Recent Pat. Anti-Infective Drug Discovery, 2: 115–122.

Global Aquaculture Alliance (GOAL), 2017. Shrimp Production Review. https://www.aquaculturealliance.org/wp-

from:

Available content/uploads/2018/01/Global-Shrimp-Production-Data-Analysis-Dr.- James-Anderson-GOAL-2017.pdf

Gode-Potratz C. J., Kustusch R. J., Breheny P. J., Weiss D. S., and McCarter L. triggers a

in Vibrio parahaemolyticus

L., 2011. Surface sensing

108

programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology, 79(1): 240-263.

Godič Torkar K., and Matijasic B., 2003. Partial Characterisation of Bacteriocins Produced by Bacillus cereus Isolates from Milk and Milk Products. Food Technology and Biotechnology, 41: 121-129.

Gordon R. E., W. C. Haynes, and C. Hor-Nay Pang., 1973. The genus Bacillus.

U. S. Department of Agri- culture, Washington, D.C.

Han J.E., Tang K.F.J., Tran L.H., Lightner D.V., 2015. Photorhabdus insect- related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp. Disease of Aquatic Organisms, 113: 33-40.

scheme. Frontiers

sequence

typing

Han D., Tang H., Ren C., Wang G., Zhou L., and Han C., 2015. Prevalence and genetic diversity of clinical Vibrio parahaemolyticus isolates from China, revealed by multilocus in microbiology, 6: 291-291.

Hecker M., Schumann W., and Volker U., 1996. Heat-shock and general stress

response in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology, 19(3): 417-428.

Helgason E., Tourasse N. J., Meisal R., Caugant D. A., and Kolstø A. B., 2004. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Applied and environmental microbiology, 70(1): 191.

Hồ Thị Trường Thy, Nguyễn Nữ Trang Thùy, Võ Minh Sơn, 2011. Khảo sát một số đặc tính chủng Bacillus subtilis B20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic phòng bệnh gan thận mũ do Edwardseilla ictaluti trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh. Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Nông Lâm nghiệp, số 3:225-233.

Holden M. T., 1999. Quorum-sensing cross talk: isolation and chemical characterization of cyclic dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and other gram-negative bacteria. Molecular Microbiology, 33(6): 1254-1266. Holmyard, 2016. Lifting the lid on Asian shrimp trade and sustainability.

https://www.seafoodsource.com/features/lifting-the-lid-on-asian-shrimp- trade-and-sustainability (ngày 18/6/2016)

Holtmann G. and Bremer E., 2004. Thermoprotection of Bacillus subtilis by exogenously provided glycine betaine and structurally related compatible solutes: involvement of Opu transporters. Journal of Bacteriology, 186(6): 1683-1693.

109

Huang T., Geng H., Miyyapuram V.R., Sit C.S., Vederas J.C. and Nakano M.M., 2009. Isolation of a variant of subtilosin A with hemolytic activity. Journal of Bacteriology, 191: 5690–5696.

Huang W. M., 1996. Bacterial diversity based on type II DNA topoisomerase

genes. Annual Review of Genetics, 30: 79-107.

Hunter P. R., and Gaston M. A., 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. Journal of Clinical Microbiology, 26(11): 2465-2466.

Irianto A. and Austin B., 2002. Probiotics in aquaculture. Journal of Fish

Diseases, 25(11): 633-642.

Janda J. M., and Abbott S. L., 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology, 45(9): 2761-2764.

Jolley K. A., and Maiden M. C., 2010. BIGSdb: Scalable analysis of bacterial

genome variation at the population level. BMC Bioinformatics, 11: 595.

Jun J. W., Han J. E., Tang K. F. J., Lightner D. V., Kim J., Seo S.W., and Park S. C., 2016. Potential application of bacteriophage pVp-1: Agent combating Vibrio parahaemolyticus strains associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp. Aquaculture, 457: 100-103. Kalatzis P. G., Castillo D., Katharios P. and Middelboe M., 2018. Bacteriophage Interactions with Marine Pathogenic Vibrios: Implications for Phage Therapy. Antibiotics (Basel, Switzerland), 7(1): 15.

Kawulka K., Sprules T., McKay R.T., Mercier P., Diaper C.M., Zuber P. and Vederas J.C., 2003. Structure of subtilosin A, an antimicrobial peptide from Bacillus subtilis with unusual posttranslational modifications linking cysteine sulfurs to alpha-carbons of phenylalanine and threonine. Journal of the American Chemical Society , 125: 4726–4767.

Kawulka K.E., Sprules T., Diaper C.M., Whittal R.M., McKay R.T., Mercier P., Zuber P. and Vederas J.C.., 2004. Structure of subtilosin A, a cyclic antimicrobial peptide from Bacillus subtilis with unusual sulfur to alpha- carbon cross-links: formation and reduction of alpha-thio-alpha-axít amin derivatives. Biochemistry 43: 3385–3395.

Khochamit N., Siripornadulsil S., Sukon P., and Siripornadulsil W., 2015. Antibacterial activity and genotypic-phenotypic characteristics of bacteriocin-producing Bacillus subtilis KKU213: potential as a probiotic strain. Microbiological Research, 170: 36-50.

110

Kim S. Y., Li T., Heo J. Y., Bae Y. M., Hwang I. K., Lee S. Y. and Moon B., 2012. Efficacies of Cleaning Methods for Decontaminating Vibrio parahaemolyticus on the Surfaces of Cutting Boards Cross-Contaminated from Grated Fish Fillet. Journal of Food Safety, 32(4): 459-466.

Kim Y. B., Okuda J., Matsumoto C., Takahashi N., Hashimoto S., and Nishibuchi M., 1999. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene. Journal of Clinical Microbiology, 37(4): 1173-1177.

Kim Y. O., Park I. S., Kim D. J., Nam B. H., Kim D. G., Jee Y. J. and An C. M., 2014. Identification and characterization of a bacteriocin produced by an isolated Bacillus sp. SW1-1 that exhibits antibacterial activity against fish pathogens. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 57(5): 605-612.

Kindoli S., Lee H. A., Heo K., and Kim J. H., 2012. Properties of a bacteriocin from Bacillus subtilis H27 isolated from Cheonggukjang. Food Science and Biotechnology, 21(6): 1745-1751.

Kobayashi K., Ehrlich S. D., Albertini A., Amati G., Andersen K. K. Arnaud, M., Asai K., Ashikaga S., Aymerich S., Bessieres P., Boland F., Brignell S. C., Bron S., Bunai K., Chapuis J., Christiansen L. C., Danchin A., Debarbouille M., Dervyn E., Deuerling E., Devine K., Devine S. K., Dreesen O., Errington J., Fillinger S., Foster S. J., Fujita Y., Galizzi A., Gardan R., Eschevins C., Fukushima T., Haga K., Harwood C. R., Hecker M., Hosoya D., Hullo M. F., Kakeshita H., Karamata D., Kasahara Y., Kawamura F., Koga K., Koski P., Kuwana R., Imamura D., Ishimaru M., Ishikawa S., Ishio I., Le Coq D., Masson A., Mauel C., Meima R., Mellado R. P., Moir A., Moriya S. and Ogasawara N., 2003. Essential Bacillus subtilis genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8): 4678-4683.

acute hepatopancreatic necrosis disease

Koiwai K., Tinwongger S., Nozaki R., Kondo H., and Hirono I., 2016. Detection of strain of Vibrio parahaemolyticus using loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases, 39(5): 603-606.

Kulsum U., Kapil A., Singh H., and Kaur P., 2018. NGSPanPipe: A Pipeline for Pan-genome Identification in Microbial Strains from Experimental Reads. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1052: 39-49.

111

Kumar S., Bhushan P., Krishna V., and Bhattacharya S., 2018. Tapered lateral flow immunoassay based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics, 12(3): 034104.

Lai H.C., T.H. Ng, M. Ando, C.T. Lee, I.T. Chen, J.C. Chuang, R. Mavichak, S.H. Chang, M.D. Yeh, Y.A. Chiang, H. Takeyama, H.O. Hamaguchi, C.F. Lo, T. Aoki and H.C. Wang, 2015. Pathogenesis of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp. Fish and Shellfish Immunology, 47(2):1006-1014.

Lê Quang Khôi và Cao Ngọc Điệp, 2013. Phân lập và phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy polyphosphat trong chất thải trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 10(2):58- 67.

Leano E.M., Mohan C.V., 2012. Early mortality syndrome threatens Asia’s

shrimp farms. Glob. Aquacult. Advocate, pp. 38-39

Leyva-Madrigal K., A. Luna, C. Escobedo-Bonilla, J. Fierro-Coronado and I. Maldonado-Mendoza, 2011. Screening for potential probiotic bacteria to reduce prevalence of WSSV and IHHNV in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) under experimental conditions. Aquaculture, 322-323: 16-22.

Lightner D.V., R.M. Redman, C. Pantoja, B.L. Noble and L. Tran, 2012. Early Asia.

syndrome

shrimp

in

affects mortality https://www.aquaculturealliance.org/advocate/early-mortality-syndrome-affects- shrimp-in-asia/.

Lin S. J., K.C. Hsu and H.C. Wang, 2017. Structural Insights into the Cytotoxic Mechanism of Vibrio parahaemolyticus PirA(vp) and PirB(vp) Toxins. Marine Drugs, 15(12).

Liu D., X. Ning and J. Zhang, 2008. Optimization of growth condition of V. surface

response

parahaemolyticus via methodology. Microbiology, 35:306–310.

Liu H. J. C. J. N. M., 2003. Analysis of the collective food poisoning events in Shanghai from 1990 to 2000. Chinese Journal of Natural Medicines, 5:17- 20.

Liu X. F., et al., 2015. Isolation and characterisation of Bacillus sp. antagonistic to Vibrio parahaemolyticus for use as probiotics in aquaculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 31(5):795-803.

Loh J.Y., 2017. The role of probiotics and their mechanisms of action: an

aquaculture perspective. Journal of the World Aquaculture, 19.

112

Maiden M.C., 2006. Multilocus sequence typing of bacteria. Annual Review of

Microbiology, 60 :561-588.

Maiden M.C., J.A. Bygraves, E. Feil, G. Morell, J.E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang, J. Zhou, K. Zurth, D.A. Caugant, I.M. Feavers, M. Achtman, B.G. Spratt, 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 1998 Mar 17, 95(6):3140-5.

Makino K., K. Oshima, K. Kurokawa, K. Yokoyama, T. Uda, K. Tagomori, Y. Iijima, M. Najima, M. Nakano, A. Yamashita, Y. Kubota, S. Kimura, T. Yasunaga, T. Honda, H. Shinagawa, M. Hattori and T. Iida, 2003. Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that of V. cholerae. Lancet, 361(9359) :743-749.

Mansilla M.C., L.E. Cybulski, D. Albanesi and D. de Mendoza, 2004. Control of thermosensors. Journal of

lipid fluidity by molecular

membrane Bacteriology, 186(20):6681-6688.

Marks T and R. Sharp, 2000. Bacteriophages and biotechnology: a review.

Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 75(1):6-17.

Marx R., T. Stein , K-D. Entian and S.J. Glaser, 2001. Structure of the Bacillus subtilis peptide antibiotic subtilosin A determined by 1H-NMR and matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Journal of Protein Chemistry, 20:501–506.

Matsuda S., T. Kodama, N. Okada, K. Okayama, T. Honda and T. Iida, 2010. Association of Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin with lipid rafts is essential for cytotoxicity but not hemolytic activity. Infection and Immunity, 78(2):603-610.

McCall J.O. and R.K. Sizemore, 1979. Description of a bacteriocinogenic plasmid in Benecka harveyi. Applied and Environmental Microbiology, 38(5):974–979.

thermolabile hemolysin

the

McCarthy S.A., A. DePaola, D.W. Cook, C.A. Kaysner and W.E. Hill, 1999. Evaluation of alkaline phosphatase- and digoxigenin-labelled probes for detection of (tlh) gene of Vibrio parahaemolyticus. Letters in Applied Microbiology, 28(1):66-70.

Meidong R, S. Doolgindachbaporn, W. Jamjan, K. Sakai, Y. Tashiro, Y. Okugawa and S. Tongpim, 2017. A novel probiotic Bacillus siamensis B44v isolated from Thai pickled vegetables (Phak-dong) for potential use

113

as a feed supplement in aquaculture. The Journal of General and Applied Microbiology, 63(4):246-253.

Mignard S. and J.P. Flandrois, 2006. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. Journal of Microbiologycal Methods, 67(3):574-581.

Miles D.W., T. Ross, J. Olley and T.A. McMeekin, 1997. Development and evaluation of a predictive model for the effect of temperature and water activity on the growth rate of Vibrio parahaemolyticus. International Journal of Food Microbiology, 38:133–142.

Miller V. L., V. J. DiRita and J. J. Mekalanos., 1989. Identification of toxS, a regulatory gene whose product enhances toxR-mediated activation of the cholera toxin promoter. Journal of Bacteriology, 171(3): 1288–1293.

Mirbakhsh M., Akhavansepahy A., Afsharnasab M., Khanafari A., and Razavi M. R., 2013. Screening and evaluation of indigenous bacteria from the Persian Gulf as a probiotic and biocontrol agent against Vibrio harveyi in Litopenaeus vannamei post larvae. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 12(4): 873-886.

Mohapatra, S., 2012. Use of different microbial probiotics in the diet of rohu, Labeo rohita fingerlings: effects on growth, nutrient digestibility and retention, digestive enzyme activities and intestinal microflora. Aquaculture Nutrition, 18(1), 1-11.

Mohkam, M., N. Nezafat, A. Berenjian, M. A. Mobasher and Y. Ghasemi, 2016. Identification of Bacillus Probiotics Isolated from Soil Rhizosphere Using 16S rRNA, recA, rpoB Gene Sequencing and RAPD-PCR. Probiotics Antimicrobial Proteins, 8(1), 8-18.

Mohtar S., S. Haulisah and D. Abdul Wahid, 2016. Evaluation of antibacterial activity of piper betle extracts against selected pathogens in tiger shrimp. Faculty of Science and Biotechnology, UMTAS 2016-184/310.

Moriarty D. J. W., 1997. The role of microorganisms in aquaculture ponds.

Aquaculture, 151(1), 333-349.

Moriarty, D.J.W., 1998. Control of luminous Vibrio species in Penaeid

aquaculture ponds. Aquaculture, 164: 351-358.

114

Moss, 2018. The global shrimp market is huge—can businesses profit while still being sustainable?. https://keepingstock.net/the-global-shrimp-market-is- huge-can-businesses-profit-while-still-being-sustainable-b60b5133c1a0 (ngày 20/6/2018)

Nakamura L. K., M. S. Roberts and F. M. Cohan, 1999. Relationship of Bacillus subtilis clades associated with strains 168 and W23: a proposal for Bacillus subtilis subsp. subtilis subsp. nov. and Bacillus subtilis subsp. spizizenii subsp. nov. International Journal of System Bacteriology, 49(3), 1211-1215.

Neela F.A., L. Nonaka, S. Suzuki, 2007. The diversity of multi-drug resistance profiles intetracycline-resistant Vibrio species isolated from coastal sediments and seawater. Journal of Microbiology, 45: 64–68.

Nguyễn Thị Thu Hằng, Lê Quang Hòa, Trần Thị Thanh Hà, Trần Thị Thu Hằng, Nguyễn Viết Không, 2016. Một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrs) phân lập được tại việt nam từ các ổ dịch năm 2007, 2010, 2013. Khoa học kỹ thuật thú y; XXIII (3).

Nguyễn Thị Thùy Giang, Phạm Văn Toàn, Phạm Quốc Hùng., 2016. Hội chứng hoại tử gan tụy ở tôm chân (Litopenaeus vannamei) nuôi thương phẩm tại Ninh Thuận. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản.

Nguyễn Văn Duy và Nguyễn Thị Cẩm Ly, 2012. Phân lập và xác định gen độc tố của Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống ở Nha Trang. Tạp chí Khoa Học – Công Nghệ Thủy Sản.

Nguyen H., L. T. Dang, H. Nguyen, H. Ha Hoang, H. Thi Ngoc Lai, and T.T. Nguyen, 2018. Screening antibacterial effects of vietnamese plant extracts against pathogens caused acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimps. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 11(5): 77.

Nicholas R. A., H. Hamilton, M. S. Cohen, 1995. Principles of Pharmacology.

PL Munson (Ed.), Chapmann and Hall, New York.

Nimrat S., S. Suksawat, T. Boonthai, and V. Vuthiphandchai, 2012. Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth

115

during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei). Veterinary Microbiology, 159(3-4), 443-450.

Nishibuchi M. and J.B. Kaper, 1995. Thermostable direct haemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium. American Society for Microbiology 63: 2093–2099.

Nunan L., D. Lightner, C. Pantoja, and S. Gomez-Jimenez, 2014. Detection of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Mexico. Diseases of Aquatic Organims, 111(1): 81-86.

chromatography, deoxyribonucleic

O’Donnell A. G., J. R. Norris, R. C. W. Berkeley, D. Claus, T. Kaneko, N. A. Logan, and R. Nozaki., 1980. Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, and Bacillus amyloliquefaciens by pyrolysis gas-liquid acid- deoxyribonucleic acid hybridization, biochemical tests and API systems. International Journal of Systemic Bacteriology, 30:448–459.

OIE, 2013. Acute hepatopancreatic necrosis disease etiology epidemiology diagnosis prevention and control, OIE Technical DiseaseCards. Available at: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/do cs/pdf/Aquatic_ Commission/AHPND_DEC_2013.pdf.

Oliver J. D., 1981. Lethal cold stress of Vibrio vulnificus in oysters. Applied

Environmental Microbiolology 41:710-717.

Palasuntheram C., 1981. The halophilic properties of Vibrio parahaemolyticus.

Journal of Genetics and Microbiology, 127(2), 427-428.

Palazzini J. M., C. A. Dunlap, M. J. Bowman, and S. N. Chulze, 2016. Bacillus velezensis RC 218 as a biocontrol agent to reduce Fusarium head blight and deoxynivalenol accumulation: Genome sequencing and secondary metabolite cluster profiles. Microbiological Research, 192: 30-36.

Palmisano M. M., L. K. Nakamura, K. E. Duncan, C. A. Istock, and F. M. Cohan, 2001. Bacillus sonorensis sp. nov., a close relative of Bacillus licheniformis, isolated from soil in the Sonoran Desert, Arizona. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbioloigy, 51(5), 1671-1679.

116

Parisot J., S. Carey, E. Breukink, W.C. Chan, A. Narbad, B. Bonev, 2008. Molecular mechanism of target recognition by subtilin, a class I lanthionine antibiotic. Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 52(2):612-618.

Park S. Y., Y. J. Yang, Y. B. Kim, J. H. Hong, and C. Lee, (2002). Characterization of subtilein, a bacteriocin from Bacillus subtilis CAU131 (KCCM 10257). Journal of Microbiology and Biotechnology, 12: 228-234

Parveen S., L. DaSilva, A. DePaola, J. Bowers, C. White, K. A. Munasinghe, K. Brohawn, M. Mudoh, and M. Tamplin, 2013. Development and validation of a predictive model for the growth of Vibrio parahaemolyticus in post- harvest shellstock oysters. International Journal of Food Microbiology, 161(1), 1-6.

Patil, P. B., Zeng, Y., Coursey, T., Houston, P., Miller, I., and Chen, S. (2010). Isolation and characterization of a Nocardiopsis sp. from honeybee guts. FEMS Microbiology Letter, 312(2), 110-118.

Pham C. K., E. Ramirez-Llodra, C. H. S. Alt, T. Amaro, M. Bergmann, M. Canals, J. B. Company, J. Davies, G. Duineveld, F. Galgani, K. L. Howell, V. A. I. Huvenne, E. Isidro, D. O. B. Jones, G. Lastras, T. Morato, J. N. Gomes-Pereira, A. Purser, H. Stewart, I. Tojeira, X. Tubau, D. Van Rooij, and P. A. Tyler, 2014. Marine litter distribution and density in European seas, from the shelves to deep basins. plos One, 9(4), e95839.

Phan Hữu Tôn, 2009. Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa X. oryzae pv.oryzae tại miền Bắc Việt Nam; Báo cáo hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, tr 456.

Phiwsaiya K., W. Charoensapsri, S. Taengphu, H. T. Dong, P. Sangsuriya, G. T. T. Nguyen, H. Q. Pham, P. Amparyup, K. Sritunyalucksana, S. Taengchaiyaphum, P. Chaivisuthangkura, S. Longyant, P. Sithigorngul, and S. Senapi, 2017. A Natural Vibrio parahaemolyticus ΔpirA Vp pirB Vp+ Mutant Kills Shrimp but Produces neither Pir Vp Toxins nor Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease Lesions. Applied and environmental microbiology, 83(16): e00680-00617.

Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018. Lựa chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 ứng dụng sản xuất chế phẩm

117

probiotic trong chăn nuôi tôm. Tạp chí Công nghệ Sinh học 16(1): 167- 172.

Pilet M.F. and F. Leroi, 2011. Applications of protective cultures, bacteriocins, and bacteriophages in fresh seafood and seafood products, In: Lacroix C, editor. Protective cultures antimicrobial metabolites and bacteriophages food and beverage biopreservation, Woodhead Publishing. for Switzerland: ETH Zurich. p. 324– 347.

Portley N., 2016. SFP Report on the Shrimp Sector: Asian Farmed Shrimp Trade

and Sustainability. Sustainable Fisheries Partnership Foundation. 22 pp.

Priest F. G., M. Goodfellow, L. A. Shute, and R. C. W. Berkeley, 1987. Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev. Micriobiology Research, 37(1), 69- 71.

Qin Y., Y. Wang, Y. He, Y. Zhang, Q. She, Y. Chai, P. Li, and Q. Shang (2019). Characterization of Subtilin L-Q11, a Novel Class I Bacteriocin Synthesized by Bacillus subtilis L-Q11 Isolated From Orchard Soil. Frontiers in Microbiology 10(484).

in marine aquaculture. Letters

Ravi A. , Musthafa K. , Jegathammbal G. , Kathiresan K. and Pandian S., 2007. Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against in Applied pathogenic Vibrios Microbiology, 45: 219-223.

Ray A., and Leffler J., 2013. BIOFLOC-BASED SHRIMP CULTURE SYSTEMS: ADVANTAGES, CHALLENGES, AND THE STATE OF CURRENT RESEARCH. Conference: Aquaculture, Nashville

Rea M., R. Paul Ross, P. Cotter, and C. Hill, 2011. Classification of Bacteriocins from Gram-Positive Bacteria. In: Drider D., Rebuffat S. (eds) Prokaryotic Antimicrobial Peptides. Springer, New York, NY

Rengpipat S., W. Phianphak, S. Piyatiratitivorakul, 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth. Aquaculture, 167: 301-313.

Renu S., 2010. Review: Some medicinal plants with antibacterial activity.

International Journal of Pharmaceutical Compounding, 1:1-4.

118

Rezaei M., M. Ghanbari, M. Soltani, G. Shahhosseini, and A. Abedian Kenari (2008). Production of bacteriocin by a novel Bacillus sp. strain RF 140, an intestinal bacterium of Caspian Frisian Roach (Rutilus frisii kutum). Journal of Biotechnology, 136.

Riley M.A. and D.M. Gordon., 1992. A survey of col plasmids in natural isolates of Escherichia coli and an investigation into the stability of col-plasmid lineages. Journal of Microbiology 138(7): 1345-1352.

and

Riley M.A., D. Drider, S. Rebuffat, 2011. Bacteriocin-mediated competitive interactions of bacterial populations and communities. IN: Prokaryotic Antimicrobial Peptides- From Genes to Applications, Springer, New York, USA, pp.13-26.; Bierbaum G, Sahl HG: Lantibiotics: mode of action, biosynthesis in Pharmaceutical bioengineering. Currents Biotechnology,2009(10): 2-18.

Roberts M. S., L. K. Nakamura, and F. M. Cohan, 1996. Bacillus vallismortis sp. nov., a Close Relative of Bacillus subtilis, Isolated from Soil in Death Valley, California. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(2), 470-475.

Rooney A. P., N. P. Price, C. Ehrhardt, J. L. Swezey, and J. D. Bannan, 2009. Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov. International Jourrnal of Systemic and Evolutionary Microbiology, 59(Pt 10), 2429-2436.

Rössler D., W. Ludwig, K. H. Schleifer, C. Lin, T. J. McGill, J. D. Wisotzkey, P. Jurtshuk, Jr., and G. E. Fox, 1991. Phylogenetic diversity in the genus Bacillus as seen by 16S rRNA sequencing studies. Systemic Applied Microbiology, 14(3), 266-269.

Ruiz-García C., E. Quesada, F. Martínez-Checa, I. Llamas, M. C. Urdaci, and V.B. éjar, 2005. Bacillus axarquiensis sp. nov. and Bacillus malacitensis sp. nov., isolated from river-mouth sediments in southern Spain. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 55(3) :1279-1285.

119

Sahoo T., K. Jena, A. K. Patel, and S. Seshadri, 2014. Bacteriocins and their applications for the treatment of bacterial diseases in aquaculture: A review Aquaculture Research,Vol. 47(4):1013-1027.

Saoud Imad and Donald Davis and David Rouse, 2003. Suitability studies of inland well waters for Litopenaeus vannamei culture. Aquaculture, 217: 373-383.

Sapcharoen P., and S. Rengpipat, 2013. Effects of the probiotic Bacillus subtilis (BP11 and BS11) on the growth and survival of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Aquaculture Nutrition, 19(6):946-954.

Sargent M. G., 1975. Control of cell length in Bacillus subtilis. Journal of

Bacteriology, 123(1):7-19.

Schallmey M., A. Singh, and O. P. Ward, 2004. Developments in the use of industrial production. Canadian Journal of

for

Bacillus species Microbiology, 50(1):1-17.

Scholz T., 1999. Parasites in cultured and feral fish. Veterinary Parasitology,

84(3):317-335.

Sen R., S. Tripathy, S. K. Padhi, S. Mohanty, and N. K. Maiti, 2015. Assessment of genetic diversity of Bacillus sp. isolated from eutrophic fish culture pond. 3 Biotech, 5(4):393-400.

Sharma G., S. Dang, S. Gupta, and R. Gabrani (2018). Antibacterial Activity, Cytotoxicity, and the Mechanism of Action of Bacteriocin from Bacillus subtilis GAS101. Medical Principals and Practices, 27(2):186-192.

Sharma N., R. Kapoor, N. Gautam, and R. Kumari (2011). Purification and Characterization of Bacteriocin Produced by Bacillus subtilis R75 Isolated from Fermented Chunks of Mung Bean (Phaseolus radiatus). Food Technology and Biotechnology, 49(2):169.

Shelburne C.E., F.Y. An, V. Dholpe, A. Ramamoorthy, D.E. Lopatin and M.S. Lantz., 2007. The spectrum of antimicrobial activity of the 18 bacteriocin subtilosin A. Journal of Antimicrobials and Chemotherapy 59: 297–300.

Sinha A. K., K. Baruah, and P. Bossier. 2008. Horizon Scanning: The potential use of biofloc as an anti infective strategy in aquaculture: an overview. Aquaculture. Health Intl.,13:8–10.

120

Sirikharin R., S. Taengchaiyaphum, P. Sanguanrut, T. D. Chi, R. Mavichak, P. Proespraiwong, B. Nuangsaeng, S. Thitamadee, T.W. Flegel and K. Sritunyalucksana, 2015. Characterization and PCR Detection Of Binary, Pir-Like Toxins from Vibrio parahaemolyticus Isolates that Cause Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in Shrimp. PLOS ONE, 10(5), e0126987..

Skopova K., B. Tomalova, I. Kanchev, P. Rossmann, M. Svedova and I. Adkins, 2017. Cyclic AMP-Elevating Capacity of Adenylate Cyclase Toxin- Hemolysin Is Sufficient for Lung Infection but Not for Full Virulence of Bordetella pertussis. Infect Immun, 85(6): e00937-00916.

Sleator R. D., and C. Hill, 2002. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiology Reviews, 26(1), 49- 71.

Smitha S. and S.G. Bhat, 2012. Thermostable bacteriocin BL8 from Bacillus isolated from marine sediment. Journal of Applied

licheniformis Microbiology, 114(3):688–694.

Soto-Rodriguez S.A., B. Gomez-Gil, R. Lozano-Olvera, M. Betancourt-Lozano, M.S. Morales-Covarrubias, 2015. Field and experimental evidence of Vibrio parahaemolyticus as the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp (Litopenaeus vannamei) in northwestern Mexico. Applied Environmental Microbiology, 81: 1689–1699.

Stein T., Heinzmann S., Kiesau P., Himmel B., Entian K.D., 2003. The spa-box

for transcriptional activation of subtilin biosynthesis and immunity in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology, 47: 1627–1636.

Stein T., S. Dusterhus, A. Stroh and K.D. Entian., 2004. Subtilosin production by two Bacillus subtilis subspecies and variance of the sbo-alb cluster. Applied Environmental Microbiology, 70: 2349–2353.

Sugita H., N. Matsuo and Y. Hirose, 1997. Vibriosp. Strain NM 10, isolated from the intestine of a Japanese coastal fish, has an inhibitory effect against Pasteurella piscicida. Applied Environmental Microbiology, 63(12):4986– 4989.

Sutyak K.E., R.E. Wirawan, A.A. Aroutcheva and M.L. Chikindas, 2008. Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the

121

dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens. Journal of Applied Microbiology, 104: 1067–1074.

induced by

epithelial

colonic

cells

in

Takahashi A., N. Kenjyo, K. Imura, Y. Myonsun, and T. Honda, 2000. Cl(-) the Vibrio thermostable direct

toxin

to

secretion parahaemolyticus hemolytic hemolysin. Infection and Immunity, 68(9), 5435-5438.

Taylor D., A. Stevens, M. Choi, D. Drahos, S. D'Imperio, S. Smith, J. Heffron, and D. Kuhn, 2017. Direct-Fed Probiotics Improve Survival in Shrimp, Litopenaeus vannamei, Under AHPND/EMS Challenge. Conference: Aquaculture America, San Antonio.

Teixeira M.L., A. Dalla Rosa, A. Brandelli, 2013: Characterization of an antimicrobial peptide produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii showing inhibitory activity towards Haemo philus parasuis. Microbiology 159: 980–988.

Theethakaew C., S. Nakamura, D. Motooka, S. Matsuda, T. Kodama, K. Chonsin, O. Suthienkul and T. Iida (2017). Plasmid dynamics in Vibrio parahaemolyticus strains related to shrimp Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS). Infection Genetics and Evolution, 51:211- 218.

Thuy H.T.T., L.P. Nga, T.T.C. Loan, 2011. Antibiotic contaminants in coastal wetlandsfrom Vietnamese shrimp farming. Environmental Science and Pollution, 18: 835–841.

Tinh N. T. N., 2007. N-acyl homoserine lactone-degrading microbial enrichment cultures isolated from Penaeus vannamei shrimp gut and their probiotic properties in Brachionus plicatilis cultures. FEMS Microbiology Ecology, 62(1), 45-53.

Tinwongger S., Y. Nochiri, J. Thawonsuwan, R. Nozaki, H. Kondo, S. P.A. wasthi, A. Hinenoya, S. Yamasaki, and I. Hirono, 2016. Virulence of acute hepatopancreatic necrosis disease PirAB-like relies on secreted proteins not on gene copy number. Journal of Applied Microbiology, 121(6), 1755- 1765.

122

Tổng cục Thủy sản, 18/06/2013. “Hội thảo bàn về giải pháp khống chế Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ” Sóc Trăng, ngày 12 tháng 6 năm 2013. Tạp chí Thủy sản Việt Nam (online).

Tổng cục thủy sản, 2018. Giải pháp phát triển bền vững ngành tôm. https://tongcucthuysan.gov.vn/vi-vn/nu%C3%B4i-tr%E1%BB%93ng- th%E1%BB%A7y-s%E1%BA%A3n/-nu%C3%B4i-th%E1%BB%A7y- s%E1%BA%A3n/doc-tin/010509/2018-05-10/giai-phap-phat-trien-ben- vung-nganh-tom (20-08-2018)

Tổng cục thủy sản, tháng 12/2012. Hội nghị tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh trên tôm năm 2012 và triển khai kế hoạch nuôi tôm nước lợ năm 2013”. Trang thông tin điện tử - Tổng cục thủy sản

Tổng cục thủy sản, tháng 2/2012. Báo cáo “Hội nghị tổng kết tình hình nuôi tôm nước lợ năm 2011 và bàn giải pháp triển khai kế hoạch sản xuất năm 2012”. Tạp chí Thương mại Thủy sản, ngày 09/02/2012.

Tổng cục thủy sản, tháng 5/2013. Hội nghị bàn giao về nuôi tôm nước lợ và sản xuất giống các tỉnh Nam Trung Bộ. Cổng thông tin điện tử - Bộ Nông nghiệp và PTNT.

Tran L., L. Nunan, R.M. Redman, L.L. Mohney, R.C.R. Pantoja, K. Fitzsimmons, D.V. Lightner., 2013. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 105: 45–55.

Trần Thị Thu Hiền, 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản. Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách khoa Hà Nội.

Trần Văn Quỳnh, 2004. Những thông tin về đặc điểm sinh học và nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở một số nước và Việt Nam, Trung tâm Khuyến ngư Quốc gia.

Trương Thị Mỹ Hạnh, Kim Văn Vạn, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Phan Thị Vân, 2017. Mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn Vibrio Spp. và độ mặn trong ao nuôi tôm. Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, số 4:455-461.

Trương Thị Mỹ Hạnh, Phạm Thị Yến, Phạm Thị Huyền, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Tiến Lâm, Trần Thị Hoài Vân, Phan Thị Vân, 2017. Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết thân lá thồm lồm (Polygonum

123

chinense L.) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi nước lợ. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Số 17(6):19-24.

Ugras S., K. Sezen, H. Kati and Z. Demirbag, 2013. Purification and characterization of the bacteriocin Thuricin Bn1 produced by Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Bn1 isolated from a hazelnut pest. Journal of Microbiology and Biotechnology, 23(2):167-176.

Untergasser A., I. Cutcutache, T. Koressaar, J. Ye, B.C. Faircloth, M. Remm and S.G. Rozen, 2012. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research, 40(15):e115.

van Belkun M.J., Martin-Visscher L.A., Vederas J.C., 2011. Structure and genetics of circular bacteriocins. Trends in Microbiology,19: 411–418.

Van Hai N. and R. Fotedar, 2010. A Review of Probiotics in Shrimp

Aquaculture. Journal of Applied Aquaculture, 22(3):251-266.

Van Wyk P. and J. Scarpa, 1999. Water quality requirements and management.

Farming Marine Shrimp in Recirculating Freshwater Systems, 128-138.

Vanderzant C., and R. Nickelson, 1972. Procedure for isolation and enumeration of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Applied Microbiology, 23(1):26- 33.

Velho R., Basso A., Segalin J., Costa-Medina L., and Brandelli A., 2013. The presence of sboA and spaS genes and antimicrobial peptides subtilosin A and subtilin among Bacillus strains of the Amazon basin. Genetics and molecular biology, 36: 101-104.

Verschuere L, G. Rombaut, P. Sorgeloos, W. Verstraete, 2000. Probiotic bacteria as biological control agants in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4): 655- 671.

Vu Do Quynh, 1989. Coastal aquaculture in the Southern Provinces, World

Aquaculture, 20 (2):22-28.

Wang L.T, F.L Lee, C.J. Tai, H.P. Kuo, 2008. Bacillus velezensis is a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58:671–675.

Wang H., C. Wang, Y. Tang, B. Sun, J. Huang and X. Song, 2018. Pseudoalteromonas probiotics as potential biocontrol agents improve the

124

survival of Penaeus vannamei challenged with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)-causing Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture, 494:30-36.

Wang L.T., F.L. Lee, C.J. Tai and H. Kasai, 2007. Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the International Journal of Systematic and Bacillus subtilis group. Evolutionary Microbiology, 57(8):1846-1850.

Wang R., S. Fang, D. Wu, J. Lian, J. Fan, Y. Zhang, S. Wang and W.J.A.E.M. Lin, 2012. Screening of a ScFv Antibody that Can Neutralize Effectively the Cytotoxicity of Vibrio parahaemolytucs TLH. Applied and Environmental Microbiology, 78(14): 4967-4975.

Wang R., Y. Zhong, X. Gu, J. Yuan, A.F. Saeed and S. Wang, 2015. The pathogenesis, detection, and prevention of Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in microbiology, 6:144-144.

Warth A. D., 1978. Relationship between the heat resistance of spores and the optimum and maximum growth temperatures of Bacillus species. Journal of bacteriology, 134(3):699-705.

Watt P. M. and I.D. Hickson, 1994. Structure and function of type II DNA

topoisomerases. The Biochemical journal, 303(3):681-695.

in

Weber M.H.W. and M.A. Marahiel, 2002. Coping with the cold: the cold shock the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis. response Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Journal of Biological sciences, 357(1423):895-907.

Welker N.E. and L.L. Campbell, 1967. Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 94(4):1124-1130.

Whitaker W. B., M. A. Parent, L. M. Naughton, G. P. Richards, S. L. Blumerman, and E. F. Boyd, 2010. Modulation of responses of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 to pH and temperature stresses by growth at different salt concentrations. Applied and environmental microbiology, 76(14), 4720-4729.

125

Wilson G.S., D.A. Raftos and S.L. Corrigan., 2010. Diversity and antimicrobial activities of surface–attached marine bacteria from Sydney Harbour, Australia. Microbiological Research, 165(4):300–311.

Woo P. C., Lau, S. K., Fung, A. M., Chiu, S. K., Yung, R. W., and Yuen, K. Y.,

2003. Gemella bacteraemia characterised by 16S ribosomal RNA gene sequencing. Journal of clinical pathology, 56(9), 690–693.

Xu D., Y. Wang, L. Sun, H. Liu, and J. Li, 2013. Inhibitory activity of a novel

antibacterial peptide AMPNT-6 from Bacillus subtilis against Vibrio parahaemolyticus in shrimp. Food Control, 30(1): 58-61.

Xu X., Q. Wu, J. Zhang, J. Cheng, S. Zhang, and K. Wu, 2014. Prevalence,

pathogenicity, and serotypes of Vibrio parahaemolyticus in shrimp from Chinese retail markets. Food Control, 46: 81-85.

Yamamoto S., and S. Harayama, 1995. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains. Applied and Environmental Microbiology, 61(3): 1104-1109.

Yancey P. H., M. E. Clark, S. C. Hand, R. D. Bowlus, and G. N. Somero, 1982. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science, 217(4566): 1214.

Yang Z. Q., X. A. Jiao, P. Li, Z. M. Pan, J. L. Huang, R. X. Gu, 2009. Predictive model of Vibrio parahaemolyticus growth and survival on salmon meat as a function of temperature. Food Microbiology, 26: 606–614.

Yang Y. T., I. T. Chen, C. T. Lee, C. Y. Chen, S. S. Lin, L. I. Hor, T. C. Tseng, Y. T. Huang, K. Sritunyalucksana, S. Thitamadee, H. C. Wang, and C. F. Lo, 2014. Draft genome sequences of four strains of Vibrio parahaemolyticus, Three of Which Cause Early Mortality Syndrome/Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease in Shrimp in China and Thailand. Genome Announcements, 2(5).

Yi Y., Z. Zhang, F. Zhao, H. Liu, L. Yu, J. Zha, G. Wang, 2018. Probiotic

potential of Bacillus velezensis JW: Antimicrobial activity against fish pathogenic bacteria and immune enhancement effects on Carassius auratus. Fish and Shellfish Immunology, 78: 322-330.

Yoon K. S., K. J. Min, Y. J. Jung, K. Y. Kwon, J. K. Lee, and S. W. Oh, 2008. A model of the effect of temperature on the growth of pathogenic and nonpathogenic Vibrio parahaemolyticus isolated from oysters in Korea. Food Microbiology, 25(5): 635-641.

126

Zeigler D., and J. Perkins, 2008. The Genus Bacillus. (pp. 309-337). Zheng G., L. Z. Yan, J. C. Vederas and P. Zuber, 1999. Genes of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis are required for production of the antilisterial bacteriocin subtilosin. Journal of Bacteriology, 181: 7346-7355. Zhou X., Y. Wang, Q. Gu, and W. Li, 2010. Effect of dietary probiotic, Bacillus coagulans, on growth performance, chemical composition, and meat quality of Guangxi Yellow chicken. Poultry Science, 89(3): 588-593.

Ziaei-Nejad S., M. H. Rezaei, G.A. Takami, D.L. Lovett, A.R. Mirvaghefi, M.

Shakouri, 2006. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture, 252: 516-524.

Zokaeifar H., J. L. Balcázar, M.S. Kamarudin, K. Sijam, A. Arshad, C. R. Saad,

2012. Selection and identification of non-pathogenic bacteria isolated from fermented pickles with antagonistic properties against two shrimp pathogens. The Journal of antibiotics, 65(6): 289-294.

Zweers J. C., I. Barák, D. Becher, A. J. M. Driessen, M. Hecker, V. P. Kontinen, M. J. Saller, L. U. Vavrová, and J. M. van Dijl, 2008. Towards the development of Bacillus subtilis as a cell factory for membrane proteins and protein complexes. Microbial Cell Factories, 7(1): 10.

http://www.foodsafety.govt.nz/ (ngày 25/6/2016)

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0 (ngày 25/6/2016)

https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/ (ngày 17/7/2016)

https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/product-information-

sheets/g/gotaq-colorless-master-mix.pdf (ngày 27/8/2017)

https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=3987caa6-ef28-4abd-

927e-d5759d986658&lang=en (ngày 21/9/2017)

https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=89bfa021-7310-4c0f-

90e0-6a9c84f66cee&lang=en (ngày 21/9/2017)

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0721 (ngày 21/9/2017) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1231 (ngày 21/9/2017)

127

PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM

Bảng A1: Địa điểm thu mẫu phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus sp. và Vibrio sp.

Địa điểm Tình hình ao nuôi Tỉnh Thời gian 18/09/2013

Cô Tiền (Kênh 7, TP Bạc Liêu)

3 Ao: - Ao 1: Tôm thẻ bệnh, 1,5 tháng, tôm bị rớt sàng. - Ao 2: Tôm sú khỏe, 2 tháng. - Ao 3: Tôm sú bệnh gan tụy 4 tháng, nước bị tảo đỏ, tôm bị đém mang, rớt đáy. Cả 3 ao đều mắc EMS trong vụ tôm 2012 25/08/2014

2 Ao bệnh: tôm sú bệnh, 3 tháng. Cả 2 ao đều mắc EMS trong vụ tôm 2012, 2013 Chú Long (Long Điền, Đông Hải) Bạc Liêu

2 Ao: tôm sú khỏe, 4 tháng.

04/09/2015 3 Ao: Tôm sú khỏe, 4 tháng.

1 Ao: Tôm sú bệnh gan, 3 tháng, mắc EMS năm 2014

18/09/2013 2 Ao: Tôm sú khỏe, 5,5 tháng. Chú Ba Tươi (Long Điền, Đông Hải) Chú Chánh (Long Điền, Đông Hả) Anh Út (Long Điền, Đông Hải) Anh Huấn (Đầm Dơi, TP Cà Mau)

2 Ao: Tôm thẻ khỏe 2,5 tháng Anh Tân (Đầm Dơi, TP Cà Mau)

25/08/2014 1 Ao tôm sú khỏe 2,5 tháng. Anh Quý (Cái Nước, TP Cà Mau) Cà Mau

Anh Đen (Cái Nước, TP Cà Mau) 2 Ao: - Ao 1: tôm thẻ bệnh, 2 tháng - Ao 2: tôm thẻ khỏe 2 tháng. Cả 2 ao đều mắc EMS vụ tôm 2014 09/09/2015

2 Ao: Tôm thẻ bệnh gan 1,5 tháng, mắc EMS vụ tôm 2013, 2014

128

1 Ao: Tôm thẻ bệnh 1,5 tháng, mắc EMS vụ tôm 2014 Anh Sự (Đầm Dơi, TP Cà Mau) Anh Sớt (Đầm Dơi, TP Cà Mau)

20/9/2015

3 Ao: tôm sú bệnh, 2 tháng, mắc EMS vụ tôm 2014. Anh Năm (Lai Hòa - Vĩnh Châu)

Sóc Trăng

129

3 Ao: tôm sú khỏe, 2 tháng. Anh Na (Lai Hòa - Vĩnh Châu)

Bảng A2: Kết quả đường kính vòng vô khuẩn của một số chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng vi khuẩn Vibrio

Đơn vị: mm

Vibrio BNB3.1v BĐB1.4v BĐB1.1v CNB6v BĐB1.3v

d D D-d d D D-d d D D-d d D D-d d D D-d Bacillus

8 21 13 8 19 11 6 17 11 10 18 8 6 15 9

BRB2.1 8 20 12 6 20 14 6 18 12 10 18 8 6 15 9

9 21 12 7 20 13 6 17 11 8 18 10 7 16 9

6 18 12 9 18 9 6 18 12 6 17 11 6 16 10

BĐK2.3 7 18 11 6 18 12 6 18 12 7 17 10 6 16 10

7 19 12 6 18 12 7 18 11 6 18 12 6 17 11

BNK 6.1 6 11 5 12 20 8 8 18 10 12 17 5 6 11 5

11 20 9 8 12 4 8 18 10 12 18 6 7 11 4

9 18 9 6 12 6 7 16 9 10 16 6 6 11 5

6 12 12 18 6 6 13 20 7 12 16 4 6 11 5

BRK4.4 12 18 6 6 11 6 12 18 6 11 16 5 6 11 5

10 19 9 6 12 6 12 19 7 10 16 6 6 12 6

6 14 8 8 15 7 6 14 8 7 14 7 6 13 7

BNK7.1 8 14 6 6 14 8 6 14 8 7 14 7 6 12 6

7 16 9 6 14 8 7 16 9 8 14 6 6 14 8

6 10 4 12 19 7 8 16 8 12 16 4 6 11 5

BNB11.1 12 19 7 6 11 5 8 16 8 12 16 4 6 11 5

130

11 19 8 6 10 4 6 15 9 10 15 5 6 11 5

Bảng A3: Khả năng sinh enzyme protease của 30 vi khuẩn Bacillus

Đơn vị: mm

Protease

STT 36h 48h 72h Chủng Bacillus D d D-d D d D-d D d D-d

1 BNB1.1 26 6 28 20 6 22 36 7 29

2 BNB1.2 25 5 28 20 5 23 35 6 29

3 BNB5.2 23 8 28 15 9 19 36 14 22

4 BNK2.2 25 5 27 20 5 22 35 6 29

5 BNK2.3 25 7 28 18 8 20 35 9 26

6 BNK7.1 24 10 28 14 12 16 35 18 17

7 BNK8 25 7 29 18 10 19 39 15 24

8 BRK4.4 26 20 31 6 23 8 42 32 10

9 BRK4.5 23 10 25 13 12 13 32 15 17

10 BRK5.3 - - - - - - - - -

11 BRK5.4 20 5 23 15 9 14 32 13 19

12 BRK6.1 21 9 25 12 11 14 41 33 8

13 BRK6.3 17 6 19 11 7 12 25 9 16

14 BRK7.1 18 6 20 12 8 12 25 11 14

15 BRK7.2 19 7 20 12 18 2 26 10 16

16 BRK7.3 24 12 27 12 16 11 34 18 16

17 BRB1.1 22 5 24 17 5 19 32 9 23

18 BRB2.1 24 7 30 17 8 22 36 10 26

19 BRB2.2 23 10 26 13 12 14 37 19 18

20 BĐK2.3 20 4 24 16 5 19 31 6 25

21 BĐK9.2 22 3 25 19 8 17 32 5 27

22 BĐB1.1 20 7 22 13 8 14 29 10 19

23 BĐB1.2 24 10 27 14 13 14 35 17 18

24 BĐB3.1 20 5 22 15 7 15 31 19 12

25 BĐB3.2 22 12 24 10 16 8 33 24 9

26 BĐB3.4 21 7 24 14 10 14 34 16 18

27 BĐB3.5 26 14 29 12 17 12 40 28 12

28 BĐB6.1 24 7 28 17 9 19 35 13 22

131

29 BĐB11.1 22 9 25 13 9 16 34 10 24

Ghi chú:

D: đường kính vòng sáng, d: đường kính khuẩn lạc, D-d: đường kính vòng hoạt tính

30 CNB9.3 24 8 16 26 9 17 35 12 23

Bảng A4: Khả năng sinh enzyme amylase của 30 vi khuẩn Bacillus

Đơn vị: mm

Amylase

36h 48h 72h STT Chủng Bacillus D d D-d D d D-d D d D-d

1 BNB1.1 8 11 22 16 6 18 8 10 19

2 BNB1.2 13 8 28 18 10 18 9 9 21

3 BNB5.2 10 12 30 18 12 19 7 12 22

4 BNK2.2 5 15 28 12 16 16 4 12 20

5 BNK2.3 7 13 28 13 15 19 7 12 20

6 BNK7.1 13 9 31 15 16 18 6 12 22

7 BNK8 10 11 29 16 13 18 8 10 21

8 BRK4.4 15 6 28 22 6 18 10 8 21

9 BRK4.5 10 10 28 14 14 17 7 10 20

10 BRK5.3 - - - - - - - - -

11 BRK5.4 8 13 27 15 12 17 6 11 21

12 BRK6.1 10 8 26 14 12 16 7 9 18

13 BRK6.3 5 4 17 11 6 10 4 6 9

14 BRK7.1 8 10 25 13 12 14 7 7 18

15 BRK7.2 7 8 21 10 11 11 6 5 15

16 BRK7.3 13 6 27 17 10 16 10 6 19

17 BRB1.1 13 7 27 17 10 17 9 8 20

18 BRB2.1 9 10 27 13 14 16 8 8 19

19 BRB2.2 8 10 18 11 7 17 5 12 18

20 BĐK2.3 14 9 31 16 15 20 12 8 23

21 BĐK9.2 13 6 29 23 6 16 7 9 19

22 BĐB1.1 14 6 28 23 5 15 7 8 20

23 BĐB1.2 10 9 26 13 13 19 10 9 19

24 BĐB3.1 7 26 10 16 16 6 20 10 13

25 BĐB3.2 13 8 31 23 8 17 9 8 21

132

26 BĐB3.4 10 8 24 13 11 17 9 8 18

27 BĐB3.5 19 9 10 20 10 10 25 14 11

28 BĐB6.1 18 8 10 20 10 10 24 13 11

29 BĐB11.1 19 8 11 22 11 11 29 12 17

D: đường kính vòng sáng, d: đường kính khuẩn lạc, D-d: đường kính vòng hoạt tính

CNB9.3 16 7 9 22 12 10 26 14 12 30 Ghi chú:

Bảng A5: Khả năng sinh enzyme cellulase của 30 vi khuẩn Bacillus

Đơn vị: mm

Cellulase

36h 48h 72h STT Chủng Bacillus D d D-d D d D-d D d D-d

1 BNB1.1 23 3 20 5 25 20 34 7 27

2 BNB1.2 23 5 18 5 26 21 35 9 26

3 BNB5.2 24 7 17 7 25 18 33 8 25

4 BNK2.2 24 5 19 7 27 20 35 8 27

5 BNK2.3 26 6 20 7 27 20 36 7 29

6 BNK7.1 23 5 18 6 25 19 35 9 26

7 BNK8 26 7 19 7 28 21 25 12 13

8 BRK4.4 22 6 16 9 26 17 33 14 19

9 BRK4.5 23 5 18 9 28 19 37 10 27

10 BRK5.3 - - - - - - - - -

11 BRK5.4 23 4 19 7 26 19 36 8 28

12 BRK6.1 25 7 18 10 25 15 33 10 23

13 BRK6.3 20 4 16 5 22 17 26 6 20

14 BRK7.1 26 9 17 10 29 19 37 13 24

15 BRK7.2 26 7 19 9 31 22 37 12 25

16 BRK7.3 25 6 19 6 26 20 34 6 28

17 BRB1.1 24 5 19 12 28 16 34 16 18

18 BRB2.1 24 9 15 9 28 19 37 12 25

19 BRB2.2 22 4 18 5 25 20 33 5 28

20 BĐK2.3 24 9 15 9 25 16 35 9 26

21 BĐK9.2 24 7 17 7 25 18 31 14 17

22 BĐB1.1 23 6 17 10 25 15 34 19 15

133

23 BĐB1.2 25 7 18 7 27 20 34 9 25

24 BĐB3.1 22 7 15 26 7 19 35 12 23

25 BĐB3.2 24 9 15 26 10 16 35 10 25

26 BĐB3.4 23 8 15 25 8 17 37 12 25

27 BĐB3.5 22 8 14 25 8 17 22 8 14

28 BĐB6.1 25 6 19 26 7 19 33 12 21

29 BĐB11.1 23 5 18 28 6 22 37 10 27

D: đường kính vòng sáng, d: đường kính khuẩn lạc, D-d: đường kính vòng hoạt tính

CNB9.3 22 7 15 25 7 18 32 18 14 30 Ghi chú:

Bảng A6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h

Mật số vi khuẩn (cfu/mL) Bacillus 26oC 28oC 30oC 32oC 37oC 40oC

2,1.109 2,7.109 2,6.109 2,8.109 3,7.109 3,3.109

BĐK2.3 2,5.109 2,6.109 2,8.109 2,3.109 3,7.109 3,2.109

2,8.109 2,8.109 3,2.109 3,2.109 3,8.109 3,1.109

1,7.109 2,8.109 1,6.109 2,9.109 3,5.109 3,1.109

BRB2.1 2,0.109 1,8.109 2,3.109 2,3.109 3,7.109 2,9.109

2,8.109 2,4.109 3,4.109 2,5.109 3,4.109 3,2.109

Bảng A7: Ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h

Bacillus Mật số vi khuẩn (cfu/mL)

4 5 6 7 8

1,1.109 1,4.109 1,6.109 2,3.109 1,1.109

1,3.109 1,2.109 1,7.109 1,9.109 1,4.109 BĐK2.3

1,4.109 1,5.109 1,5.109 2,2.109 1,7.109

1,7.109 1,6.109 1,7.109 2,5.109 1,3.109

1,4.109 1,3.109 1,9.109 2,2.109 1,2.109 BRB2.1

1,9.109 2,0.109 1,8.109 2,2.109 1,5.109

Bảng A8: Ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus

134

Mật số vi khuẩn (cfu/mL) Bacillus 0% 5‰ 20‰ 40‰

1,0.109 6,02.108 8,32.108 1,02.109

1,1.109 8,32.108 1,07.109 1,10.109 BĐK2.3

1,1.109 1,32.109 1,17.109 1,23.109

1,5.109 1,05.109 1,32.109 1,15.109

1,0.109 1,17.109 1,38.109 1,44.109 BRB2.1

1,5.109 1,32.109 1,51.109 1,74.109

Bảng A9: Ảnh hưởng của 5 chủng vi khuẩn Vibrio đến tỉ lệ tôm chết theo thời

gian

Tỉ lệ tôm chết theo thời gian (%) STT Chủng Vibrio

12h 24h 36h 48h

BĐB 1.3v (1) 0 0 0 0 1

BĐB 1.3v (2) 10 10 10 10 2

BĐB 1.3v (3) 0 0 0 0 3

BĐB 1.4v (1) 30 70 100 100 4

BĐB 1.4v (2) 36,67 63,33 100 100 5

BĐB 1.4v (3) 23,33 63,33 100 100 6

BNB 3.1v (1) 0 0 0 3,33 7

3,33 3,33 3,33 8 BNB 3.1v (2) 3,33

6,67 6,67 6,67 9 BNB 3.1v (3) 3,33

3,33 3,33 3,33 10 BRB 1.1v (1) 3,33

10 16,67 16,67 11 BRB 1.1v (2) 10

0 0 0 12 BRB 1.1v (3) 0

3,33 3,33 3,33 13 CĐB 6v (1) 0

3,33 3,33 3,33 14 CĐB 6v (2) 0

0 0 3,33 15 CĐB 6v (3) 0

0 0 0 16 ĐC1 0

0 0 0 17 ĐC2 0

135

0 0 0 18 ĐC3 0

Bảng A10: Độc tính của V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm

Số tôm chết

Số tôm ban đầu

Mật độ cảm nhiễm (cfu/mL)

Lặp lần 1

Lặp lần 2

Lặp lần 3

30

0

30

4

3

4

30

12

13

30

16

17

18

30

19

23

21 Không cảm nhiễm 103 3,2×103 104 3,2×104 105

30 Bảng A11: Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước nuôi tôm

Mật số vi khuẩn sau thời gian theo dõi (cfu/mL)

STT

Nghiệm thức

24h

48h

Bacillus

-

Vibrio 1,8 x107

-

Vibrio 8,6 x106

BĐB 1.4v

1 -

0,5 x107

-

7,0 x106

(không có Bacillus)

-

2,3 x107

-

6,8 x106

136

2,9 x108

1,3 x106

4,7 x109

0,9 x107

1,2 x108

1,4 x106

5,2 x109

2,5 x107

2 BRB2.15-BĐB1.4v4

2,5 x108

1,3 x106

6,0 x109

2,3 x107

2,5 x108

1,0 x102

4,0 x109

-

2,0 x108

-

1,2 x109

-

3 BRB2.16-BĐB1.4v4

2,7 x108

-

1,4 x109

-

5,2 x108

2,0 x102

3,3 x109

-

BRB2.17-BĐB1.4v4

4 4,1 x108

-

4,0 x109

-

2,7 x108

-

1,4 x109

-

1,9 x108

0,5 x106

1,4 x109

0,2 x106

1,0 x106

1,3 x108

3,3 x109

0,5 x106

5 BĐK2.35-BĐB1.4v4

1,6 x108 2,7 x106

2,5 x109

1,8 x106

12 x107

2 x102

5,5 x108

-

5,8 x107

8,2 x108

-

6 BĐK2.36-BĐB1.4v4

6,5 x107

-

1,9 x108

-

3,2 x108

-

0,7 x109

-

2,2 x108

2,2 x109

-

7 BĐK2.37-BĐB1.4v4

1,2 x108

2,1 x102

1,0 x109

-

Bảng A12: Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm

STT Bacillus-Vibrio Số tôm sống (/30) Tỉ lệ tôm sống (%)

26 86.67

1 BRB2.1-BĐB1.4v 26 86.67

137

25 83.33

70 21

2 BĐK23-BĐB1.4v 83.33 25

76.67 23

60.00 18 BRB2.1 + BĐK2.3 3 63.33 19 – BĐB1.4v 70 21

93.33 28

4 ĐC 100 30

100 30

0 0

5 BĐB1.4v 0 0

0 0

Bảng A13: Theo dõi chỉ tiêu nhiệt độ buổi sáng trong 31 ngày

NT1 NT2 NT3

Buổi sáng 2 1 3 1 2 3 2 1 3

1 30.3 30.5 30.0 30.6 30.6 30.1 30.2 29.9 30.2

2 30.3 30.5 29.9 30.1 30.1 30.0 30.0 30.0 30.0

3 30.4 30.5 30.0 30.1 30.1 30.1 30.1 29.9 30.2

4 30.4 30.2 29.8 30.0 30.3 29.9 30.0 29.8 30.0

5 30.1 30.1 29.9 - - 29.9 29.7 29.9 -

6 30.0 30.1 30.0 - - 30.0 30.0 30.1 -

7 30.1 30.1 30.2 - - 29.8 29.9 29.9 -

8 30.1 30.1 30.0 - - 29.7 29.8 29.8 -

9 29.9 30.4 29.6 - - 29.9 30.0 30.1 -

10 30.6 30.5 30.5 - - 30.3 30.5 30.3 -

11 30.4 30.4 30.2 - - 30.1 30.2 30.1 -

12 30.1 30.0 30.2 - - 30.0 30.1 29.9 -

13 30.0 30.1 30.1 - - 30.1 29.9 30.1 -

14 30.3 30.4 30.4 - - 30.2 30.3 30.5 -

138

15 30.3 30.2 30.2 - - 30.4 30.3 30.4 -

NT1 NT2 NT3

Buổi sáng 2 1 2 3 1 3 1 2 3

16 30.4 30.4 30.5 - - - 30.2 30.2 30.1

17 30.4 30.3 30.3 - - - 30.0 30.0 30.0

18 30.4 30.2 30.1 - - - 30.2 30.1 30.0

19 30.0 30.1 30.1 - - - 30.0 30.0 29.9

20 30.1 30.1 30.0 - - - 29.9 29.9 30.0

21 30.1 30.2 30.1 - - - 30.1 30.0 29.9

22 29.9 29.8 29.9 - - - 29.9 29.8 29.8

23 30.1 29.8 29.9 - - - 29.8 29.7 29.7

24 29.9 30.1 30.0 - - - 30.1 29.9 30.0

25 30.2 30.1 30.2 - - - 30.0 30.0 29.9

26 30.0 30.0 30.0 - - - 29.9 29.8 29.8

27 29.7 29.7 29.6 - - - 29.5 29.5 29.6

28 29.5 29.5 29.6 - - - 29.5 29.4 29.5

29 29.4 29.4 29.5 - - - 29.4 29.3 29.3

30 27.7 27.7 27.8 - - - 27.8 27.9 27.9

31 28.2 28.1 28.1 - - - 27.9 27.9 28.0

Bảng A14: Theo dõi chỉ tiêu nhiệt độ buổi chiều trong 31 ngày

NT3 NT1 NT2

Buổi chiều 1 2 3 1 2 3 2 1 3

1 32.5 31.9 32.1 31.9 32.0 32.0 31.9 32.2 32.0

2 31.8 31.9 32.0 31.7 31.4 32.1 32.3 32.3 31.9

3 32.2 32.3 32.1 31.8 31.6 31.8 32.1 32.2 32.0

4 32.1 32.1 32.1 31.8 31.9 31.7 32.1 32.3 31.8

5 32.2 32.2 32.3 - - - 32.0 31.7 31.5

6 32.1 32.1 32.0 - - - 31.9 32.1 31.6

7 32.1 32.0 31.7 - - - 32.0 31.7 29.8

8 32.4 32.1 31.6 - - - 31.8 31.8 30.0

9 32.2 32.1 31.6 - - - 32.0 31.8 31.7

10 31.6 32.1 31.5 - - - 31.2 31.1 32.1

139

11 32.4 32.3 32.3 - - - 31.6 31.7 31.6

NT1 NT2 NT3

Buổi chiều 2 1 2 3 1 2 3 1 3

12 32.5 32.4 32.3 32.2 32.0 31.9 - - -

13 31.8 31.9 31.9 31.5 31.4 31.4 - - -

14 31.9 32.1 31.8 31.7 31.6 31.7 - - -

15 32.3 32.1 32.2 32.0 31.9 32.1 - - -

16 32.1 32.3 32.4 31.9 31.7 31.7 - - -

17 32.1 32.3 32.2 31.9 31.8 31.8 - - -

18 31.9 32.1 32.1 31.9 31.8 31.8 - - -

19 32.3 32.4 32.4 32.1 32.0 32.1 - - -

20 32.1 32.2 32.2 32.0 31.9 31.9 - - -

21 32.3 32.3 32.1 32.0 32.0 32.0 - - -

22 32.1 32.1 32.0 31.9 31.8 31.8 - - -

23 32.2 32.1 32.1 32.0 32.0 29.9 - - -

24 32.2 32.2 32.1 32.0 31.9 32.0 - - -

25 32.2 32.3 32.3 32.1 32.0 32.0 - - -

26 32.2 32.1 32.0 31.8 31.8 31.8 - - -

27 31.7 31.7 31.7 31.7 31.6 31.6 - - -

28 31.6 31.7 31.6 31.5 31.3 31.3 - - -

29 31.6 31.7 31.6 31.6 31.5 31.4 - - -

30 30.1 29.9 29.8 29.8 29.7 29.7 - - -

31 30.1 30.2 30.1 30.0 29.9 29.9 - - -

Bảng A15: Theo dõi chỉ tiêu pH buổi sáng trong 31 ngày

NT1 NT2 NT3

Buổi sáng 1 2 3 1 2 3 1 2 3

1 7.94 8.02 8.01 7.97 8.01 7.97 7.91 7.95 7.96

2 8.01 7.98 8.02 7.95 7.94 8.02 7.94 7.97 7.98

3 8.01 8.01 8.01 7.97 8.01 8.02 7.98 8.02 8.11

4 7.95 8.01 7.95 8.01 8.02 7.95 8.11 8.14 8.16

5 8.02 7.91 8.01 7.92 7.97 8.01 - - -

140

6 7.96 7.94 8.01 7.94 8.03 7.95 - - -

7 8.05 8.04 8.07 - - - 8.02 8.11 7.99

8 8.16 8.11 8.16 - - - 8.14 8.16 8.11

9 8.22 8.15 8.19 - - - 8.19 8.19 8.18

10 8.25 8.23 8.23 - - - 8.25 8.22 8.22

11 8.28 8.18 8.22 - - - 8.17 8.26 8.25

12 8.14 8.20 8.21 - - - 8.12 8.12 8.14

13 8.20 8.18 8.20 - - - 8.17 8.21 8.17

14 8.23 8.17 8.21 - - - 8.16 8.18 8.16

15 8.20 8.15 8.22 - - - 8.23 8.19 8.20

16 8.02 7.98 8.01 - - - 8.02 8.04 8.05

17 7.98 7.95 8.01 - - - 8.01 8.02 8.01

18 8.01 7.97 7.95 - - - 8.04 8.04 8.02

19 8.01 8.01 8.01 - - - 7.96 7.96 7.98

20 7.91 7.92 7.97 - - - 7.95 7.91 7.93

21 7.94 7.94 8.02 - - - 7.92 7.94 7.97

22 7.98 7.95 8.02 - - - 7.97 7.98 7.98

23 7.96 7.94 7.95 - - - 7.98 7.98 7.97

24 7.97 7.99 8.01 - - - 8.01 8.02 8.01

25 7.96 7.96 7.95 - - - 7.97 7.97 7.96

26 7.98 7.97 7.99 - - - 7.99 8.00 8.01

27 7.95 7.97 7.97 - - - 7.98 7.98 7.97

28 7.96 7.99 7.98 - - - 8.02 8.02 8.03

29 7.98 8.01 8.01 - - - 8.02 8.03 8.03

30 7.98 7.96 7.95 - - - 7.99 7.98 7.98

31 7.96 7.96 7.96 - - - 7.98 7.99 7.99

Bảng A16: Theo dõi chỉ tiêu pH buổi chiều trong 31 ngày

NT1 NT2 NT3

Buổi chiều 2 1 3 1 2 3 1 2 3

1 8.01 8.01 8.03 7.93 7.96 7.96 8.02 8.01 7.98

2 8.02 7.91 8.04 8.03 8.03 8.03 8.01 7.98 7.98

3 8.02 7.97 8.03 8.01 8.05 8.01 7.97 8.02 8.01

141

4 8.01 7.95 8.02 8.11 8.12 8.09 8.02 8.01 8.01

5 7.95 7.94 7.94 - - - 8.02 7.93 7.94

6 7.97 7.97 8.05 - - - 7.95 8.03 7.93

7 8.01 8.01 8.09 - - - 8.05 8.01 7.96

8 8.17 8.11 8.11 - - - 8.12 8.09 8.11

9 8.19 8.18 8.18 - - - 8.24 8.17 8.23

10 8.24 8.25 8.22 - - - 8.29 8.24 8.27

11 8.28 8.24 8.31 - - - 8.29 8.27 8.26

12 8.15 8.24 8.25 - - - 8.17 8.15 8.14

13 8.20 8.24 8.20 - - - 8.25 8.25 8.21

14 8.22 8.19 8.23 - - - 8.21 8.20 8.20

15 8.20 8.15 8.12 - - - 8.22 8.18 8.21

16 8.01 8.01 8.01 - - - 8.03 8.07 8.05

17 7.98 7.94 7.98 - - - 8.04 8.04 8.03

18 8.02 8.01 8.01 - - - 8.03 8.04 8.02

19 8.01 8.02 8.01 - - - 8.02 8.01 8.01

20 7.93 7.97 9.97 - - - 7.94 7.95 7.95

21 8.03 8.03 8.03 - - - 8.05 8.03 8.03

22 8.01 8.01 8.01 - - - 8.03 8.03 8.02

23 7.99 7.97 7.98 - - - 8.02 8.03 8.02

24 8.01 8.01 8.00 - - - 8.02 8.03 8.03

25 7.96 7.97 7.97 - - - 7.98 7.99 7.99

26 8.01 8.01 8.01 - - - 8.02 8.01 8.01

27 7.95 7.96 7.98 - - - 7.99 7.99 7.98

28 7.98 8.02 8.02 - - - 8.03 8.02 8.03

29 7.98 8.02 8.01 - - - 8.03 8.02 8.04

30 7.98 7.97 7.97 - - - 7.98 7.98 7.99

31 7.97 7.97 7.98 - - - 7.99 8.00 8.00

Bảng A17: Theo dõi chỉ tiêu oxy buổi sáng trong 31 ngày

NT1 NT2 NT3

Buổi sáng 2 1 3 1 2 3 1 2 3

1 9.20 9.00 9.20 8.70 8.80 8.90 8.90 9.10 9.00

142

2 9.00 9.00 9.20 9.00 9.10 8.90 8.90 9.30 8.40

NT1 NT2 NT3

Buổi sáng 2 1 3 1 2 3 2 1 3

3 8.90 8.80 8.90 8.50 9.20 9.10 9.30 8.90 9.20

4 9.00 8.90 8.90 9.10 8.80 9.30 9.20 9.10 9.20

5 8.90 9.00 9.30 - - - 9.00 9.10 9.10

6 8.90 8.90 9.20 - - - 9.00 9.20 8.80

7 8.90 8.30 9.00 - - - 9.10 8.60 9.20

8 9.10 8.80 9.00 - - - 9.10 9.00 8.70

9 9.10 9.00 9.10 - - - 9.00 8.90 8.70

10 9.20 9.00 9.10 - - - 9.20 9.20 9.00

11 8.60 8.70 8.90 - - - 8.60 8.80 8.70

12 9.00 8.90 8.70 - - - 8.80 8.90 9.00

13 8.90 8.90 8.90 - - - 9.10 9.00 9.10

14 8.70 8.70 8.40 - - - 8.80 8.90 9.00

15 8.90 9.10 9.10 - - - 9.20 9.20 9.10

16 9.00 9.10 9.00 - - - 9.20 9.20 9.20

17 8.80 8.90 9.00 - - - 9.10 9.20 9.10

18 8.80 8.90 8.90 - - - 9.00 9.00 9.10

19 9.00 9.00 8.90 - - - 9.10 9.00 9.10

20 9.10 9.00 8.90 - - - 9.10 9.10 9.10

21 9.00 9.00 8.90 - - - 9.10 9.00 9.10

22 8.50 8.60 8.60 - - - 9.00 8.90 9.00

23 8.70 8.50 8.80 - - - 9.00 8.90 9.00

24 8.60 8.70 8.70 - - - 9.10 9.00 9.00

25 8.50 8.60 8.60 - - - 8.80 8.90 8.80

26 8.60 8.60 8.50 - - - 8.90 8.80 8.80

27 8.40 8.30 8.40 - - - 8.70 8.60 8.70

28 8.40 8.40 8.50 - - - 8.70 8.60 8.60

29 8.50 8.60 8.50 - - - 8.80 8.80 8.90

30 8.60 8.60 8.50 - - - 8.80 8.70 8.70

31 8.60 8.50 8.50 - - - 8.90 8.90 8.90

Bảng A18: Theo dõi chỉ tiêu oxy buổi chiều trong 31 ngày

143

NT1 NT2 NT5

Buổi chiều 2 1 3 2 1 3 1 2 3

1 8.80 8.90 9.00 8.80 8.80 9.30 8.90 9.20 9.10

2 9.00 9.00 8.90 9.00 9.00 9.30 8.40 8.90 9.20

3 9.10 9.20 8.90 9.10 9.00 9.20 9.00 9.00 9.10

4 9.10 9.10 9.10 9.00 8.70 9.00 8.90 9.00 9.10

5 8.80 8.90 9.10 - 8.80 8.40 9.10 - -

6 8.90 8.90 8.90 - 8.80 9.20 9.10 - -

7 9.00 8.70 8.90 - 8.90 9.20 9.10 - -

8 8.70 9.10 9.00 - 9.00 9.10 9.00 - -

9 9.00 9.10 8.90 - 8.90 9.00 9.00 - -

10 9.30 8.90 9.10 - 9.10 9.00 9.40 - -

11 8.90 8.90 8.80 - 8.80 8.90 8.90 - -

12 9.30 9.20 9.10 - 9.20 9.20 8.80 - -

13 9.10 9.20 9.00 - 8.70 8.80 9.00 - -

14 9.00 9.10 9.10 - 8.70 8.60 8.50 - -

15 9.20 9.30 9.20 - 9.00 9.10 9.20 - -

16 9.10 9.30 9.20 - 9.00 9.00 9.10 - -

17 9.20 9.20 9.00 - 9.00 8.90 8.90 - -

18 9.00 9.00 9.00 - 8.90 8.80 8.90 - -

19 9.10 9.00 9.10 - 8.90 9.00 9.00 - -

20 9.10 9.10 9.20 - 9.10 9.10 8.90 - -

21 9.10 9.10 9.10 - 9.00 9.00 9.10 - -

22 9.10 9.10 9.00 - 8.50 8.70 8.60 - -

23 9.10 9.00 9.10 - 8.80 8.70 9.00 - -

24 9.10 9.10 9.00 - 8.70 8.80 8.70 - -

25 8.80 8.90 8.90 - 8.60 8.60 8.60 - -

26 8.90 8.90 8.80 - 8.60 8.50 8.50 - -

27 8.80 8.80 8.70 - 8.60 8.50 8.50 - -

28 8.60 8.60 8.70 - 8.40 8.50 8.50 - -

29 8.90 8.80 9.00 - 8.60 8.60 8.60 - -

30 8.80 8.60 8.60 - 8.60 8.50 8.50 - -

144

31 8.90 8.90 8.90 - 8.50 8.50 8.50 - -

Bảng A19: Theo dõi chỉ tiêu NH3

NT1 NT3 NT2 Ngày 3 1 2 3 1 2 2 3 1

0.08 15-4 0.10 0.08 0.08 0.08 0.08 0.10 0.08 0.10

0.01 18-4 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 - - -

0.15 21-4 0.15 0.15 0.30 0.30 0.30 - - -

0.30 27-4 0.30 0.30 0.03 0.03 0.03 - - -

0.03 4-5 0.03 0.08 0.27 0.27 0.01 - - -

0.08 8-5 0.08 0.08 0.03 0.03 0.03 - - -

0.08 12-5 0.08 0.08 0.03 0.08 0.03 - - -

Bảng A20: Theo dõi chỉ tiêu NO2

NT1 NT5 NT2 Ngày 2 2 1 3 1 3 1 3 2

15-4 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10

18-4 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 - - -

21-4 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 - - -

27-4 0.50 0.50 0.10 0.50 0.10 0.10 - - -

4-5 1.00 1.00 0.50 0.10 0.10 0.50 - - -

8-5 2.00 2.00 1.00 1.00 0.50 1.00 - - -

12-5 1.00 1.00 1.00 0.50 0.50 0.50 - - -

Bảng A21: Tỉ lệ sống của tôm theo thời gian thả nuôi

NT1 NT2 NT3 Ngày 2 2 1 3 1 3 1 3 2

145

1 200 200 200 200 200 200 200 200 200

NT1 NT2 NT3 Ngày 2 3 1 1 2 3 2 3 1

2 200 198 199 200 198 199 197 198 200

3 100 100 60 196 192 194 196 198 198

4 10 (5%) 10 (5%) 10 (5%) 189 183 179 196 195 198

5 2 2 2 172 171 161 192 195 198

6 0 0 0 159 165 147 192 195 198

7 147 159 139 - - 192 192 198 -

8 137 144 137 - - 191 192 195 -

9 129 133 131 - - 191 191 195 -

10 125 129 129 - - 188 191 195 -

11 123 126 129 - - 188 191 195 -

12 122 123 128 - - 188 191 195 -

13 119 116 128 - - 188 187 193 -

14 119 116 127 - - 186 187 193 -

15 119 114 127 - - 185 184 193 -

16 116 114 127 - - 185 184 193 -

17 116 114 126 - - 185 184 193 -

18 116 114 124 - - 183 182 192 -

19 114 112 124 - - 179 180 192 -

20 114 111 124 - - 179 180 192 -

21 114 111 123 - - 179 180 191 -

22 114 111 123 - - 179 180 191 -

23 112 109 123 - - 177 177 191 -

24 111 109 122 - - 174 177 191 -

25 111 109 122 - - 174 177 188 -

26 111 108 122 - - 174 177 188 -

27 111 108 122 - - 174 176 188 -

28 111 118 122 - - 170 175 188 -

29 108 105 120 - - 170 175 186 -

30 108 105 120 - - 170 175 186 -

31 108 105 119 - - 171 173 186 -

146

32 107 105 119 - - 171 173 185 -

NT1 NT2 NT3 Ngày 2 1 3 1 2 3 1 2 3

33 104 107 119 - - - 185 172 173

34 104 107 119 - - - 185 170 172

35 104 107 119 - - - 185 170 172

TLS

53.5 52.0 59.5 0.0 0.0 0.0 92.5 85.0 86.0

35 ngày (%)

Bảng A22: Khối lượng (g) tôm thẻ thay đổi sau thời gian nuôi

NT3 NT2 NT1 Ngày 1 2 3 1 2 3 1 2 3

0.47 0.55 0.37 0.27 0.64 0.37 0.28 0.61 0.36

0.29 0.65 0.34 0.28 0.54 0.42 0.27 0.52 0.33

0.32 0.24 0.35 0.31 0.25 0.33 0.31 0.22 0.42

0.60 0.27 0.41 0.59 0.21 0.21 0.50 0.29 0.25

0.45 0.28 0.31 0.45 0.29 0.31 0.44 0.29 0.31 Ban đầu 0.49 0.70 0.74 0.49 0.74 0.63 0.49 0.63 0.55

0.27 0.22 0.28 0.48 0.19 0.22 0.28 0.26 0.24

0.28 0.37 0.35 0.29 0.35 0.35 0.38 0.35 0.34

0.23 0.45 0.50 0.23 0.48 0.47 0.53 0.48 0.49

0.42 0.22 0.25 0.41 0.31 0.45 0.39 0.24 0.48

TB 0.38 0.40 0.39 0.38 0.40 0.38 0.39 0.39 0.38

2.03 2.22 3.23 - - - 2.26 2.13 1.6

2.75 1.57 2.69 - - - 1.27 2.15 1.22

1.54 2.54 1.57 - - - 0.66 0.6 0.92

2.92 2.68 3.02 - - - 1.82 2.3 1.1

1.44 1.88 2.23 - - - 0.95 1.54 1.5 Sau 15 ngày

1.05 2.98 1.43 - - - 1.63 1.25 0.64

1.72 2.35 2.60 - - - 1.69 1.65 1.26

1.96 2.14 1.94 - - - 1.34 1.73 1.14

1.87 2.23 2.41 - - - 1.42 1.34 1.08

147

2.31 2.36 2.45 - - - 1.27 1.85 1.09

NT3 NT2 NT1 Ngày 1 2 3 1 2 3 1 2 3

TB 1.96 2.30 2.36 1.43 1.65 1.16

7.05 6.88 6.22 - - - 6.03 6.21 5.89

6.24 6.21 6.47 - - - 6.11 6.33 5.72

6.33 6.76 6.42 - - - 5.75 6.07 6.11

5.91 7.25 6.11 - - - 5.66 5.86 5.47

6.43 6.79 7.03 - - - 6.00 6.12 5.65 Sau 35 ngày 6.66 6.61 6.13 - - - 6.23 6.49 5.94

6.45 6.43 6.14 - - - 5.89 6.81 5.90

7.11 6.57 6.04 - - - 5.76 6.01 5.78

6.77 7.12 5.98 - - - 6.02 5.44 6.05

6.01 6.33 6.32 - - - 6.04 6.20 5.44

148

TB 6.50 6.70 6.29 5.95 6.15 5.80

PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1. Khối lượng gia tăng = khối lượng cuối - khối lượng đầu 2. FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) = thức ăn sử dụng / khối lượng gia tăng 3. Tỉ lệ sống = (số lượng cuối / số lượng đầu)x 100

4. Tỉ lệ tôm sống

Tỉ lệ sống (%) = tổng số tôm thu hoạch x 100/tổng số tôm thả ban đẩu

5. Môi trường sử dụng trong thí nghiệm

 Môi trường LB (Luria Bertani): Pepton : 10g

Yeast : 5g NaCl : 10g pH : 7.0÷0.2 Nước cất : 1000 mL

 Môi trường NA (Nutrient Agar) Agar : 15g

Pepton : 5g NaCl : 5g Beef extract: 1.5g Yeast : 1.5g Nước cất : 1000 mL pH : 7.4÷0.2

 Môi trường PGA (Plate count agar): Pepton : 5g

Yeast : 2.5g D-Glucose : 1g Agar : 15g Nước cất : 1000 mL pH : 7.2÷0.2

 Môi trường TCBS (Thiosulfate-Citrate Bile Salts): Thạch TCBS: 89g

Nước cất : 1000 ml

149

PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN LẬP

Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA

Hình dạng STT Mã số mẫu Màu sắc khuẩn lạc Độ nổi Dạng bìa Tâm Nhớt Kích thước (mm)

Lài Không Không Có 7 1 BNK2.1 Trắng đục đều Không đều, bề mặt khô nhăn

Lài Không Không Có 1.5 2 BNK2.2 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô đều nhăn

1.0 3 BNK2.3 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô Lài Nguyên Không Có

Lài Không Không Có 1.8 4 BNB1.1 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô đều nhăn

Lồi Răng cưa Không Có 1.0 5 BNB1.2 Trắng đục Dị hình, có vòng rìa nhô lên

Không Có 6.0 6 BNB1.3 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô Lài Không đều

Lồi Không Không Có 3.0 7 BNB4 đều Trắng hơi trong Dị hình, có núm lồi xung quanh

Tròn, bề mặt khô nhẵn Lồi Nguyên Không Có 4.5 8 BNB5.1 Trắng hơi trong

Lài Nguyên Không Có 1.5 9 BNB5.2 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô nhăn

2.5 10 BNK6.1 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô Lài Nguyên Không Có

Lồi Không Có 4.5 11 BNK6.2 Trắng đục Dị hình, có núm lồi đều Vùng tâm xung quanh, khô nhăn ở giữa khuẩn lạc

Lài Nguyên Không Có 1.0 12 BNK7.1 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô nhăn

Có 2.5 13 BNK7.2 Trắng hơi Dị hình, có núm lồi xung quanh Lồi Gợn sóng Vùng tâm trong

Tròn, bề mặt khô nhẵn Lồi Nguyên Không Có 3.0 14 BNK8 Trắng hơi trong

Có 2.5 15 BNK9 Dị hình, có núm lồi xung quanh Lồi Không đều Vùng tâm Trắng hơi trong

Dị hình Lồi Không Có 3.5 16 BNK10 Trắng hơi Vùng tâm đều trong

150

Trắng đục Dị hình, có núm lồi Lồi Không Có Có 4.0 17 BNB11 đều xung quanh

Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS

Dạng bìa Tâm Nhớt STT Mã số mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Độ nổi Kích thước (mm)

Lồi Nguyên Có Không 1.0 1 BNB1.1v Vàng nghệ Tròn, bề mặt nhẵn bóng

Lồi Nguyên Không Không 3.5 2 BNB3.1v Xanh nhạt, Tròn, bề mặt nhẵn bóng hơi ngả vàng

Lồi Nguyên Không Không 3.0 3 BNB3.2v Xanh Tròn, bề mặt nhẵn bóng

Lồi Không đều Không Không 2.0 4 BNB3.3v Vàng

Hơi tròn, có núm lồi hai bên

Tròn Lài Nguyên Không Không 2.0 5 BNK7v Vàng nghệ

Tròn Vàng Lài Nguyên Không Không 1.0 6 BNK10v

Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu)

STT Mẫu Màu sắc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Nhớt Kích thước (mm)

1 BĐB1.1 Trắng Tròn Nổi nguyên Có 4

2 BĐB1.2 Trắng đục Tròn không đều Mô Răng cưa 2,5 Có

3 BĐB1.3 Trắng đục Tròn không đều Lài Răng cưa Có 3

4 BĐB1.4 Trắng trong Hình trứng vỡ Nổi nguyên Có 4

5 BĐK2.1 Trắng đục Tròn nguyên Có 2 Mô

6 BĐK2.2 Trắng Tròn không đều Chia thùy Không 6 Lài

7 BĐK2.3 Trắng đục Tròn Răng cưa Có 5 Lài

8 BĐK2.4 Vàng nâu Tròn không đều mô Không 3 Bìa răng cưa

9 BĐB3.1 Trắng trong Tròn mô nguyên Có 4

10 BĐB3.2 Trắng đục Hoa tuyết lài Không 2

Chia thùy có nhiều rảnh nhỏ, sâu

Có 11 BĐB3.3 Trắng đục Tròn 3 lài Chia thùy có nhiều rảnh

Không 12 BĐB3.4 Trắng đục Bầu dục 6 lài Chia thùy không đều

151

13 BĐB3.5 Trắng Tròn Nổi nguyên Có 3

STT Mẫu Màu sắc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Nhớt Kích thước (mm)

14 BĐB3.6 Trắng trong Hình trứng vỡ nguyên Có mô 2

15 BĐB4.1 Trắng đục Tròn Nguyên Không Mô 3

Trắng 16 BĐB5.1 Trứng vỡ Nổi Có 5 Chia thùy lớn trong

17 BĐB5.2 Nổi Nguyên Trắng Tròn Có 2

4 18 BĐB5.3 Trắng mô Răng cưa Có Tròn

2,5 19 BĐB6.1 Trắng Bầu dục mô Nguyên Không

Trắng 5 20 BĐB6.2 Trứng vỡ Mô Chia thùy Có

Tròn Có Nổi Nguyên 21 BĐK7.1 Trắng 3

Tròn Có Mô Răng cưa 22 BĐK8.1 Trắng ngà 1,5

Tròn Có lài Răng cưa 23 BĐK8.2 Trắng ngà 2

Tròn Có Mô Răng cưa 24 BĐK8.3 Trắng ngà 3

Tròn Có Lài Nguyên 25 BĐK9.1 Trắng đục 2

Tròn Có Mô Nguyên 26 BĐK9.2 Trắng 3

Tròn Có lài Nguyên 27 BĐB11.1 Trắng đục 4

Có mô Chia thùy 28 BĐB11.2 Trắng Dị hình 4

Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu)

STT Mẫu Màu sắc Nhớt Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Kích thước (mm)

Tròn Nổi nguyên Không 2 1 BĐB1.1v Xanh lá cây đậm

tròn mô Không 4 2 BĐB1.2v Xanh lá cây đậm Răng cưa

Xanh lá tròn mô nguyên Không 3 3 BĐB1.3v

tròn mô nguyên Không 4 4 BĐB1.4v Xanh lá cây đậm

Vàng Tròn Mô Không 1,5 5 BĐB5.1v Chia thùy

Vàng Nổi Nguyên Không Tròn 2 6 BĐB6.1v

Mô Nguyên Không Tròn 3 7 BĐB6.2v Xanh lá cây

152

Vàng Mô Nguyên Không 2 8 BĐB6.4v Hơi tròn

STT Mẫu Màu sắc Nhớt Dạng bìa Kích thước (mm) Độ nổi Hình dạng

vàng Nguyên Không Mô 2 9 BĐK7.2v Hơi tròn

Mô Nguyên Không 3 10 BĐK8.2v Xanh lá cây đậm Hơi tròn

Vàng Nổi Nguyên Không Tròn 4 11 BĐB11.1v

Nổi Không Tròn 4 12 BĐB11.2v Xanh lá cây Chia thùy

Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu)

STT Độ nổi Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Dạng bìa Kích thước (mm)

Nâu Mô Có 1 BRK4.1 5 Chia thùy Dị hình

Trắng Mô Có 2 BRK4.2 5 Chia thùy Dị hình trong

Trắng đục Lài Nguyên Có 3 BRK4.3 3 Hơi tròn

6 Trắng đục Lài Nguyên Có 4 BRK4.4 Hơi tròn

3.5 Trắng đục Tròn Phẳng Có 5 BRK4.5 Răng cưa

Trắng 5 Mô Có 6 BRK5.1 Chia thùy Dị hình trong

Trắng đục Mô Nguyên Có 7 BRK5.2 4 Hơi tròn

Vàng nhạt Phẳng Không 8 BRK5.3 4 Răng cưa Hơi tròn

Trắng đục Tròn Phẳng Có 9 BRK5.4 3 Răng cưa

Mô Có 10 BRK5.5 4 Trắng trong Chia thùy Dị hình

Trắng đục Lài Nguyên Có 11 BRK6.1 5 Hơi tròn

Trắng đục Tròn Phẳng Nguyên Có 12 BRK6.2 3

Mô Có 13 BRK6.3 3 Trắng trong Chia thùy Dị hình

Vàng nhạt Phẳng Không 14 BRK7.1 5 Gợn sóng Dị hình

153

Vàng nhạt Phẳng Gợn Không Dị 15 BRK7.2 8

STT Độ nổi Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Dạng bìa Hình dạng Kích thước (mm) sóng hình

Trắng đục Lài Nguyên Có 16 BRK7.3 5 Hơi tròn

Trắng đục Nguyên Có 17 BRB1.1 3 Hơi tròn Lài, nhăn

Trắng đục Phẳng Nguyên Có tròn 18 BRB2.1 3

Có Tròn 6 19 BRB2.2 Răng cưa Trắng trong Lồi ở giữa tâm, nhăn

Có Mô Trắng đục 2 20 BRB2.3 Chia thùy Dị hình

Trắng đục Lài Nguyên Không 21 BRB3 7 Hơi tròn

Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu)

STT Nhớt Dạng bìa Độ nổi Hình dạng Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Kích thước (mm)

Nguyên Có Lài Tròn Xanh lá cây 2 1 BRK4.1v

Nguyên Có Lài Tròn Vàng 1,5 2 BRK5.1v

3 Có Lài Dị hình Vàng 2 BRK6.1v Gợn sóng

Nguyên Có Lài Hơi tròn Vàng 2 4 BRK7.1v

Nguyên Có Mô Xanh lá cây Hơi tròn 3 5 BRK7.2v

6 Có Hơi tròn Mô Nguyên 4 BRB1.1v Xanh lá cây đậm

Nguyên Có Lài Tròn Vàng 1.5 7 BRB1.2v

Nguyên Có Mô Tròn Xanh lá cây 3 8 BRB2.1v

Nguyên Không Mô Tròn Xanh lá cây 3 9 BRB3v

Nguyên Không Mô Tròn Xanh lá cây 4 10 BRB4v

Nguyên Không Mô Tròn Xanh lá cây 4 11 BRB5.1v

154

Nguyên Không Lài Tròn Vàng 1-1,5 12 BRB5.2v

Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)

Hình dạng Tâm Nhớt STT Mã số mẫu Màu sắc khuẩn lạc Độ nổi Dạng bìa Kích thước (mm)

Lồi Nguyên Không Có 5.0 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô, hơi nhăn 1 CNK 1.1

Lồi Không Không Có 4.0 Trắng hơi trong Dị hình, có núm lồi xung quanh đều 2 CNK 1.2

Lồi Có 4.0 Gợn sóng Vùng tâm 3 CNK 1.3

Trắng đục Dị hình, có núm lồi xung quanh, bề mặt hơi khô nhăn

Lồi Có Có 5.0 Gợn sóng 4 CNK 2.1 Dị hình, có núm lồi xung quanh, tâm khô nhăn Trắng đục, tâm hơi ngả màu nâu

Không Không 6.5 Hơi ngả nâu Hơi tròn, có núm lồi hai bên Phẳng Răng cưa 5 CNK 2.2

Lồi Có 6.0 Gợn sóng Vùng tâm Trắng hơi trong 6 CNK 2.3 Dị hình, có núm lồi xung quanh, tâm khô nhăn

Lồi Không Có 5.0 7 CNK3 Trắng hơi trong Dị hình, có núm lồi xung quanh đều Vùng tâm

Lài Không Có 3.5 8 CNK4 Trắng đục Dị hình, có vòng rìa nhô lên Gợn sóng

Lồi Có 4.0 9 CNB8 Trắng đục Dị hình, có núm lồi xung quanh Gợn sóng Vùng tâm

Trắng đục Hơi tròn, bề mặt Lài Nguyên Không Có 2.5 10 CNB khô nhăn 9.1

Lồi Không Có 4.0 11 CNB Trắng hơi trong Dị hình, có núm lồi xung quanh đều Vùng tâm 9.2

Có 3.5 12 CNB Trắng đục Hơi tròn, ở giữa có vòng nhô lên Lài Nguyên Vùng tâm 9.3

Trắng đục Hơi tròn, bề mặt Lồi Không Có 2.0 khô nhăn Răng cưa 13 CNB 10.1

155

Trắng đục Hơi tròn, bề mặt Lài Không Không Có 1.5 đều 14 CNB 10.2 khô nhăn, có vòng rìa

Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong nước sau 24h cấy trên môi trường TCBS

Tâm STT Mã số mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Nhớt Kích thước (mm)

Xanh lá Tròn Lồi Nguyên Không Không 3.0 1 CNK1v

Tròn Lài Nguyên Không Không 2.0 2 CNK2v Vàng nghệ

Tròn Lài Nguyên Không Không 2.0 3 CNK3.1v Vàng nghệ

Vàng Tròn Lồi Nguyên Không Không 2.5 4 CNK3.2v

Lài Không Không Không 2.0 5 CNK4v Vàng nghệ Dị hình, có núm lồi đều

Tròn Lài Nguyên Vùng tâm Không 3.5 6 CNB5v Xanh nhạt

Tròn Lài Nguyên Vùng tâm Không 3.5 7 CNB6v Xanh nhạt

Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)

STT Mẫu Độ nổi Nhớt Hình dạng Dạng bìa Màu sắc Kích thước (mm)

Tròn Nguyên Có Mô 1 CĐK1.1 4 Trắng đục

Dị hình nguyên Không mô Trắng 2 CĐK1.2 3

Trắng Dị hình Không Mô 3 CĐK2.1 2,5 Chia thùy

2 Lài Có Trắng Tròn 4 CĐK2.2 Răng cưa

4 Tròn Nổi Nguyên Có 5 CĐK3.1 Trắng đục

Trắng Có Dị hình Nổi 6 CĐK3.2 Chia thùy 5

Có Trắng Mô Nguyên Tròn 7 5 CĐK3.3

Nổi Có Trắng Tròn 8 1 CĐK4.1 Răng cưa

Mô Nguyên Có Tròn 9 4 CĐB5.1 Trắng đục

Mô Nguyên Có Tròn Trắng 10 5 CĐB6.1

Mô Nguyên Có Tròn Trắng 11 4 CĐK7.1

Lài Nguyên Không Tròn Trắng 12 2 CĐK7.2

Lài Có Trắng Tròn 13 2 CĐK7.3 Răng cưa

156

Mô Nguyên Có Trắng Dị hình 14 3 CĐB8.1

STT Mẫu Độ nổi Nhớt Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Kích thước (mm)

Tròn mô Có 3 15 CĐB8.2 Trắng đục Răng cưa

Tròn Lài Có 2 16 CĐB8.3 Trắng đục Chia thùy

Trắng Nổi Nguyên Có 4 17 CĐB9.1 Tròn không đều

Có Trắng Dị hình Nổi 4 18 CĐB9.2 Răng cưa

Trắng Tròn Lài Nguyên Có 19 CĐB10.1 2

Trắng Dị hình Nổi Có 2 20 CĐB10.2 Răng cua

Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau)

STT Mẫu Màu sắc Nhớt Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Kích thước (mm)

Xanh lá cây Tròn Nổi nguyên Không 2,5 1 CĐK1.1v

Xanh lá cây Tròn Mô Nguyên Không 3 2 CĐK1.2v

Vàng Tròn Mô Nguyên Không 2 3 CĐK1.3v

Xanh lá cây Tròn Nổi Nguyên Không 3 4 CĐK2.1v

Xanh lá cây tròn Mô Nguyên Không 2,5 5 CĐK3.2v

Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)

STT Độ nổi Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Dạng bìa Kích thước (mm)

Trắng đục Tròn Nguyên Không lài CRK1.1 3 1

lài Trắng đục Hơi tròn Không 2 CRK1.2 2-3 Răng cưa

Trắng đục Hơi tròn Lài Không 3 CRK2.1 2-3 Răng cưa

Trắng đục Hình tròn Phẳng Không 4 CRK2.2 3-4 Răng cưa

Mô Không 5 CRK3.1 3-4 Trắng trong Hình trứng vỡ Lượn sóng

157

Trắng đục Hình tròn Phẳng Không 6 CRK2.3 2-3 Răng cưa

STT Độ nổi Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Dạng bìa Kích thước (mm)

Trắng đục Hình tròn Lài Nguyên Không CRB1 3 7

Mô Không 8 CRB2 2-5 Trắng trong Hình trứng vỡ Lượn sóng

Trắng đục mô Không 9 CRB3.1 2-5 Không xác định Chia thùy

Nâu nhạt Mô Không 10 CRB3.2 3-5 Không xác định Chia thùy

Trắng đục Hình tròn Phẳng Không 11 CRB3.3 2-3 Răng cưa

Mô Không 12 CRB3.4 3-4 Trắng trong Hình trứng vỡ Lượn sóng

Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau)

STT Độ nổi Dạng bìa Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Kích thước (mm)

Hơi tròn, Gợn sóng Không Vàng Lài 3 1 CRK1.1v

Nguyên Không Vàng Tròn Lài 2 2 CRK1.2v

Nguyên Không Vàng Tròn Lài 3 3 CRK2.1v

Nguyên Không Xanh lá cây Tròn Lài 4 4 CRK2.2v

Nguyên Không Vàng Tròn Lài 1-1.5 5 CRK3v

Nguyên Không Vàng nhạt Tròn Phẳng 2 6 CRB1.1v

Nguyên Không Xanh Tròn Phẳng 1-1.5 7 CRB1.2v

Nguyên Không Xanh Tròn Lài 2-3 8 CRB3.1v

Nguyên Không Vàng Tròn Lài 3-4 9 CRB3.2v

Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng)

Hình dạng Dạng bìa STT Mã số mẫu Độ nổi Màu sắc khuẩn lạc Tâm Nhớt Kích thước (mm)

Lài Răng cưa Vùng tâm Có 4.0 1 SNB1 Trắng đục Hơi tròn, có vòng rìa nhô lên

158

Lài Răng cưa Vùng tâm Có 2.0 2 SNB2 Trắng đục Hơi tròn, bề mặt khô, có vòng rìa nhô lên

Lồi Gợn sóng Vùng tâm Có 5.0 3 SNK4.1 Trắng Dị hình, có núm lồi xung quanh hơi trong

Lồi Gợn sóng Vùng tâm Có 4.0 4 SNK4.2 Trắng Dị hình, có núm lồi xung quanh hơi trong

Phẳng Răng cưa 4.0 5 SNK4.3 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô Không Khôn g

Dị hình Lồi Không Vùng tâm Có 4.0 6 SNK5.1 Trắng đều hơi trong

Phẳng Răng cưa 0.3 7 SNK5.2 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô Không Khôn g

Lồi Dị hình Không Có 3.0 8 SNK5.3 Trắng đục Dị hình, có núm lồi xung quanh

Lồi Không Có 3.0 9 SNK6.1 Trắng Dị hình, có núm lồi xung quanh Không đều hơi trong

Phẳng Răng cưa 3.0 10 SNK6.2 Trắng đục Dị hình, bề mặt khô Không Khôn g

Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng)

STT Mẫu Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Nhớt Độ nổi Kích thước (mm)

Trắng Dị hình Nổi Chia thùy Có SĐK1.1 1 3

Trắng đục lài Răng cưa Có SĐK1.2 2 4 Tròn không đều

Trắng mô Nguyên Không 3 SĐK2.1 5 Tròn không đều

Trắng Dị hình mô Chia thùy Có 4 SĐK2.2 2

Trắng Dị hình lài Chia thùy Có 5 SĐK2.3 5

Trắng Tròn mô Răng cưa Có 6 SĐK3.1 2

Trắng lài Chia thùy Có Dị hình 7 SĐK3.2 5

Trắng Nổi Chia thùy Có Trứng vỡ 8 SĐK3.3 5

Trắng Nổi Chia thùy Có Dị hình 9 SĐB4.1 5

Trắng đục lài Chia thùy Có 10 SĐB4.2 4 Tròn không đều

159

Trắng Dị hình mô Chia thùy Có 11 SĐB4.3 5

Trắng Mô Răng cưa Có 12 SĐB5.1 2 Tròn không đều

Trắng Dị hình Nổi Chia thùy Có 13 SĐB6.1 5

Trắng Mô Nguyên Không 14 SĐB6.2 3 Tròn không đều

Trắng ngà Dị hình lài Răng cưa Có 15 SĐB6.3 4

Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng)

STT Nhớt Kí hiệu mẫu Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Kích thước (mm)

Trắng đục Hơi Tròn Phẳng Không 1 SRK1.1 2-3 Răng cưa

Vàng nhạt Hình tròn Phẳng Nguyên Không 2 SRK1.2 4-5

Vàng Hơi tròn Phẳng Không 3 SRK1.3 3-4 Răng cưa

Trắng đục Hình tròn Lài Nguyên Không 4 SRK1.4 2-3

Trắng đục Hơi tròn Phẳng Không 5 SRK2.1 2-3 Răng cưa

Vàng nhạt Hình tròn Phẳng Nguyên Không 6 SRK2.2 4

Vàng nhạt Hơi tròn Phẳng Không 7 SRK2.3 4 Răng cưa

Trắng đục Dị hình Lài Không 8 SRK3.1 3 Chia thùy

Vàng nhạt Hình tròn Lài Nguyên Không 9 SRK3.2 4-5

Trắng đục Hơi tròn Lài Không 10 SRK3.3 4-5 Lượn sóng

Mô Không 11 SRK3.4 5-7 Trắng trong Hình trứng vỡ Lượn sóng

160

Vàng nhạt Hình tròn Phẳng Không 12 SRK3.5 4-5 Lượn sóng

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA

Chủng

Loài xác định được

Độ tương đồng

BRB 2.1

B. subtilis

NR_112686.1

Kí hiệu GenBank 100.0%

B. mojavensis

NR_118290.1

99.9%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.9%

BRB 2.2

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BRB 6.3

B. licheniformis

NR_118996.1

99.8%

B. haynesii

NR_157609.1

99.6%

B. sonorensis

NR_113993.1

99.4%

B. aerius

NR_042338.1

99.2%

BDB 1.1

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.9%

B. velezensis

NR_116240.1

99.9%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. siamensis

NR_117274.1

99.7%

BDB 1.2

B. subtilis

NR_104873.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. mojavensis

NR_118290.1

99.9%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.9%

BDB 11.1

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BDB 3.1

B. subtilis

NR_102783.2

99.9%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.7%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.7%

B. halotolerans

NR_115063.1

BDB 3.2

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

99.9%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.8%

B. mojavensis

NR_118290.1

99.8%

B. halotolerans

NR_115063.1

161

BDB 3.4

B. subtilis

NR_104873.1

100.0%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.9%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.9%

B. nakamurai

NR_151897.1

99.8%

BDB 3.5

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. velezensis

NR_116240.1

99.7%

B. subtilis

NR_117274.1

99.7%

B. siamensis

NR_102783.2

99.6%

BDB 6.1

B. licheniformis

NR_118996.1

99.9%

B. haynesii

NR_157609.1

99.7%

B. sonorensis

NR_113993.1

99.6%

B. aerius

NR_042338.1

99.4%

BNB 1.1

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BNB 1.2

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BNB 5.2

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BNB 9.3

B. subtilis

NR_112686.1

99.9%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.9%

B. mojavensis

NR_118290.1

99.9%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

BRK 1.1

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. vallismortis

NR_113994.1

99.7%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.7%

BRK 4.4

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.8%

162

B. halotolerans

NR_115063.1

99.8%

BRK 5.4

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.6%

BRK 6.1

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.8%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.8%

BRK 7.3

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. mojavensis

NR_112725.1

99.8%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.8%

BDK 2.3

B. velezensis

NR_075005.2

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.9%

B. subtilis

NR_102783.2

99.8%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.7%

BDK 9.2

B. subtilis

NR_113265.1

100.0%

B. tequilensis

NR_104919.1

99.9%

B. mojavensis

NR_118290.1

99.8%

B. halotolerans

NR_115063.1

99.8%

BNK 2.2

B. velezensis

NR_075005.2

99.8%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.7%

B. subtilis

NR_102783.2

99.6%

B. nakamurai

NR_151897.1

99.5%

BNK 2.3

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.8%

B. velezensis

NR_116240.1

99.7%

B. siamensis

NR_117274.1

99.7%

B. subtilis

NR_102783.2

99.6%

BNK 7.1

B. velezensis

NR_116240.1

99.9%

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.9%

B. subtilis

NR_102783.2

99.8%

B. vallismortis

NR_024696.1

99.7%

BNK 8.1

B. amyloliquefaciens

NR_117946.1

99.9%

B. velezensis

NR_116240.1

99.9%

163

B. subtilis

NR_102783.2

99.7%

B. siamensis

NR_117274.1

99.7%

PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ

E1: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Vibrio

Bảng E1.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 243.206

48.6412

2084.13

0.0000

Within groups 0.280067

0.0233389

Total (Corr.)

243.486

Bảng E1.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

Nhiet do

Count

Mean

Homogeneous Groups

1.17

8.23

8.21

8.55333

8.39

Bảng E1.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 247.43

49.4859

1877.63 0.0000

Within groups

0.316267

0.0263556

Total (Corr.)

247.746

Bảng E1.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

Nhiet do

Count

Mean

Homogeneous Groups

1.30667

8.42667

8.43333

164

8.46

8.58667

Bảng E1.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups

131.741

32.9353

371.79

0.0000

Within groups

0.885867

0.0885867

Total (Corr.)

132.627

Bảng E1.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

Count

Mean

Homogeneous Groups

7.32

7.60667

7.5

7.37

7.32

Bảng E1.7: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups

157.273

39.3183

760.71

0.0000

Within groups

0.516867

0.0516867

Total (Corr.)

157.79

Bảng E1.8: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

Count

Mean

Homogeneous Groups

7.52667

8.12

7.5

8.18

8.42

Bảng E1.9: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

165

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups

274.324

54.8649

1968.05

0.0000

Within groups

0.334533

0.0278778

Total (Corr.)

274.659

Bảng E1.10: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h

NaCl

Count

Mean

Homogeneous Groups

0.3

7.46333

8.11

8.10667

Bảng E1.11: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups

301.481

60.2961

1243.50

0.0000

Within groups

0.581867

0.0484889

Total (Corr.)

302.063

Bảng E1.12: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h

NaCl

Count

Mean

Homogeneous Groups

0.566667

8.39333

8.44667

8.25333

E2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

Bảng E2.1: Phân tích ANOVA về khả năng đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp.

Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 590.667

20.3678

32.73

0.0000

166

Within groups 37.3333

0.622222

Total (Corr.)

628.0

Bảng E2.2: Kiểm định LSD về khả năng đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp.

Nghiem thuc

Count Mean

Homogeneous Groups

BNB11.1-BDB1.4v

4.33333

BNB11.1-CNB6v

4.33333

BNB11.1-BDB1.3v

XXX

5.0

BNB11.1-BNB3.1v

XXX

7.33333

BNB11.1-BDB1.1v

8.33333

BNK6.1-BDB1.3v

4.66667

BNK6.1-BDB1.4v

XXX

5.0

BNK6.1-CNB6v

XXX

5.66667

BNK6.1-BNB3.1v

8.66667

BNK6.1-BDB1.1v

9.66667

BRK4.4-CNB6v

XXX

5.0

BRK4.4-BDB1.3v

XXX

5.33333

BRK4.4-BDB1.4v

XXX

6.0

BRK4.4-BDB1.1v

XXX

6.66667

BRK4.4-BNB3.1v

XXX

7.0

BNK7.1-CNB6v

XXX

6.66667

BNK7.1-BDB1.3v

XXX

7.0

BNK7.1-BNB3.1v

XXX

7.33333

BNK7.1-BDB1.4v

XXX

8.0

BNK7.1-BDB1.1v

8.33333

BRB2.1-CNB6v

8.66667

BRB2.1-BDB1.3v

9.0

BRB2.1-BDB1.1v

XXX

11.3333

BRB2.1-BNB3.1v

11.6667

BRB2.1-BDB1.4v

13.3333

167

Nghiem thuc

Count Mean

Homogeneous Groups

BĐK2.3-BDB1.3v

10.3333

BĐK2.3-BNB3.1v

10.6667

XXX

BĐK2.3-CNB6v

11.0

XXX

BĐK2.3-BDB1.1v

11.6667

BĐK2.3-BDB1.4v

12.0

E3: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Bacillus

Bảng E3.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 0.903533 2.60433 Within groups 3.50787 Total (Corr.)

3 8 11

0.301178 0.325542

0.93

0.4716

Bảng E3.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc Count BĐK 2.3-26oC 3 BĐK 2.3-30oC 3 BĐK 2.3-37oC 3 BĐK 2.3-40oC 3 BRR 2.1-26oC 3 BRR 2.1-30oC 3 BRR 2.1-37oC 3 BRB 2.1-40oC 3

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Mean 9.39 9.46 9.57 9.51 9.32 9.39 9.55 9.49

Bảng E3.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 0.20483

0.0227589

6.50

0.0003

Within groups

0.07

0.0035

Total (Corr.)

0.27483

Bảng E3.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h

NT pH

Count

Mean

Homogeneous Groups

BĐK2.3-4

9.1

BĐK2.3-5

9.13667

BĐK2.3-6

9.20333

168

NT pH

Count

Mean

Homogeneous Groups

BĐK2.3-7

9.32667

BĐK2.3-8

9.14

BRB2.1-4

9.22

BRB2.1-5

9.20333

BRB2.1-6

9.25667

BRB2.1-7

9.36

BRB2.1-8

9.12333

Bảng E3.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Between groups 1.47538 1.73387 Within groups 3.20925 Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.295077 0.144489

0.1443

2.04

7 12 17

Homogeneous Groups X X X X X X X

Mean 9.12 9.07 9.15 9.12 9.03 8.96 9.01

9.05

Bảng E3.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc Count BRB 2.1-0‰ 3 BRB 2.1-5‰ 3 BRB 2.1-20‰ 3 BRB 2.1-40‰ 3 BĐK 2.3-0‰ 3 BĐK 2.3-5‰ 3 3 BĐK 2.3- 20‰ BĐK 2.3- 40‰

E4: Khảo sát ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ theo thời gian

Bảng E4.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h

Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 23538.5

4707.7

224.22

0.0000

Within groups

251.948

12 20.9957

Total (Corr.)

23790.4

Bảng E4.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h

Vibrio

Count Mean

Homogeneous Groups

BĐB 1.3v 3

3.33333

169

BĐB 1.4v 3

100.0

BNB 3.1v 3

3.33333

BRB 1.1v 3

6.66667

CĐB 6v

2.22

E5: Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn

Bảng E5.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36 h

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 17575.1

4393.76

246.00

0.0000

Within groups

178.607

17.8607

Total (Corr.)

17753.7

Bảng E5.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36h

Count Mean

Homogeneous Groups

BĐB1.4v

BRB2.1-BĐK23-BĐB1.4v 3

64.44

BĐK23-BĐB1.4v

76.67

BRB2.1-BĐB1.4v

85.56

97.78

E6: Khả năng át chế của Bacillus sp. đối với Vibrio Parahaemolyticus và ảnh hưởng lên sự phát triển của tôm thẻ.

Bảng E6.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày

Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 11817.7

5908.86

548.24

0.0000

Within groups

64.6667

10.7778

Total (Corr.)

11882.4

Bảng E6.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày

Count

Mean

Homogeneous Groups

170

55.0

87.8333

Bảng E6.3: Phân tích ANOVA về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi

Source

Sum of Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 3.00242

1.50121

1422.20 0.0000

Within groups

0.00633333

0.00105556

Total (Corr.)

3.00876

Bảng E6.4: Kiểm định LSD về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi

Count

Mean

Homogeneous Groups

1.10667

1.31667

PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM

171

Kiểm tra các yếu tố môi trường nước

172

Lấy mẫu gan tụy và ruột tôm kiểm tra mật số vi khuẩn Vibrio ban đầu

Cố định mẫu tôm trong dung dịch cồn và Davidson’s

173

Hệ thống thí nghiệm 100 lít

174

175

Hệ thống thí nghiệm 1000 lít

176

THÔNG TIN TỔNG QUÁT

Họ tên Nghiên cứu sinh: Lê Thế Xuân Giới tính: Nam

Ngày tháng năm sinh: 19/5/1976 Nơi sinh: Thanh Hóa

Điện thoại: 0918039764

Đơn vị công tác: Công ty TNHH SX & TM Trúc Anh

Địa chỉ hiện nay: Công Điền, Vĩnh Trạch, Bạc Liêu

Tốt nghiệp Đại học ngành: Nuôi trồng thủy sản Năm:1999

Tại: Đại học Nha Trang

Tốt nghiệp Thạc sĩ ngành: Công nghệ sinh học Năm: 2012

Tại: Đại học Bách khoa Hà Nội

177