intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

72
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746- 750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ÂY DỰNG QUY TRÌNH PH T HI N KI U GEN<br /> VEGF V KI U<br /> T IẾN GEN EGFR ỨNG D NG TRONG IỀU<br /> TRỊ ÍCH UNG THƢ PHỔI<br /> Ngô Tất Trung*; Định Ngọc S ** Ng<br /> Đặ g ă Khiêm**; ũ X â Phú** Ng<br /> <br /> iết Nhung**<br /> Chi Lă g**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không<br /> tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định<br /> tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR. Xác định đột biến<br /> gen EGFR bằng PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS và kiểm tra lại<br /> bằng giải trình tự gen. Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phương pháp bằng cách pha<br /> loãng nồng độ TB theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100, sau đó tiến hành tách ADN<br /> làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả: đã hoàn thiện kỹ thuật động học alen đặc hiệu RT-PCR cho<br /> phép phát hiện đồng thời hai thể đa hình Rs833061 và Rs3025039 của gen VGFR. Công nghệ PCR<br /> đặc hiệu hai hướng alen cũng cho phép xác định được đột biến gen EGFR tại exon 19, exon 21 với<br /> ngưỡng phát hiện 0,1%. Độ đặc hiệu kỹ thuật 100%. Giải trình tự gen đã khẳng định kết quả của<br /> PCR đa mồi. PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS có ngưỡng phát hiện<br /> thấp hơn so với giải trình tự gen (0,1% so với 25%).<br /> * Từ khóa: Ung thư phổi; Ung thư phổi không tế bào nhỏ; EGFR; VEGF; PCR đa mồi.<br /> <br /> ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND<br /> IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR<br /> TARGET THERAPY OF LUNG CANCER<br /> SUMMARY<br /> The aims of study are to set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19<br /> (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and<br /> geneotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061. Cell lines carrying mutation of EGFR were<br /> cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays. Mutations of<br /> EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory<br /> mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to<br /> mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100. On the other<br /> hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger<br /> sequencing. Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at<br /> exon 19, exon 21 with sensitivity is 0.1%; 1% and 1%, respectively. Sequencing had confirmed the<br /> results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (> 5%). The concordance was<br /> also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing.<br /> * Từ khóa: Lung cancer; Non-small cell lung cancer; EGFR; VEGF; Multiplex-PCR.<br /> <br /> * Bệnh viện TWQĐ 108<br /> ** Bệnh viện Phổi TW<br /> Người phả hồi (Corresponding): Ng<br /> Tất Tr g ( tatr g@ ahoo.com)<br /> Ngà hậ bài: 25/12/2013 Ngà phản biện đá h giá bài báo: 20/1/2014<br /> Ngà bài báo được đă g: 21/1/2014<br /> <br /> 48<br /> <br /> t¹p chÝ y d-îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch-¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15<br /> <br /> ẶT VẤN<br /> <br /> Ề<br /> <br /> Ung thư phổi (UTP) là bệnh gây tử vong<br /> cao nhất trong số các bệnh ung thư. Dựa<br /> trên hình thái TB, chia UTP thành UTP TB<br /> nhỏ (UTPTBN) và UTPKTBN. UTPTBN chiếm<br /> 15 - 20%, còn lại 80 - 85% số ca UTP là<br /> UTPKTBN. Do phác đồ hóa trị hoặc xạ trị<br /> tương đối có hiệu quả đối với UTPTBN, nên<br /> các nghiên cứu lâm sàng tập trung nhiều<br /> vào việc chữa trị cho bệnh nhân (BN)<br /> UTPKTBN.<br /> Một đặc điểm nổi bật của UTPKTBN là<br /> sự gia tăng mức độ biểu hiện của thụ thể<br /> biểu mô (epithelial growth factor receptor EGFR), thụ thể này mang hoạt tính tyrosine<br /> kinase. Hoạt động của enzym này lại phụ<br /> thuộc nhiều vào tương tác giữa EGFR với<br /> các phân tử ATP tự do trong bào tương.<br /> Một khi EGFR thu nhận được ATP, nó sẽ<br /> chuyển sang trạng thái bị kích hoạt và<br /> truyền tín hiệu sống sót tới nhân bào, hỗ trợ<br /> cho quá trình tăng sinh của TB đồng thời<br /> tăng khả năng di căn của TB ung thư tới<br /> các mô lân cận. Hiện nay, trên thị trường<br /> dược phẩm tồn tại hai hợp chất có khả<br /> năng ức chế EGFR đã được Cơ quan Quản<br /> lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)<br /> cho phép sử dụng trong điều trị UTPKTBN<br /> giai đoạn muộn là gefitinib, erlotinib. Việc chỉ<br /> định sử dụng các dược phẩm này phụ thuộc<br /> vào trạng thái đột biến của gen EGFR.<br /> Nhiều nghiên cứu cho thấy, tăng sinh<br /> mạch là một trong những tính chất bệnh<br /> sinh ác tính điển hình ở UTP: do nhu cầu<br /> dinh dưỡng và nhu cầu trao đổi chất cao<br /> hơn mức bình thường, do đó đòi hỏi sự<br /> hình thành nhiều hệ thống mạch máu mới,<br /> vì thế TB ác tính bài tiết ra tác nhân tăng<br /> sinh mạch (Vascular endothelial growth factor VEGF). Tuy nhiên, VEGF không bộc lộ trên<br /> <br /> bề mặt TB ác tính mà tuần hoàn trong môi<br /> trường và tác động lên thụ thể đặc hiệu trên<br /> TB biểu mô đích, từ đó cảm ứng TB biểu<br /> mô biệt hoá thành các TB mạch máu mới.<br /> Việc loại bỏ VEGF bằng kháng thể đặc hiệu<br /> benvacizumab sẽ gián tiếp ức chế TB ung<br /> thư thông qua việc ức chế quá trình tạo<br /> mạch mới, nhờ đó một mặt “gây ngạt” cho<br /> khối u, mặt khác cắt nguồn dinh dưỡng nuôi<br /> khối u, gây hoại tử khối u.<br /> Một đặc điểm nổi bật của liệu pháp ức<br /> chế VGFR trong điều trị ung thư là không<br /> phải tất cả BN có biểu hiện VGFR đều<br /> đáp ứng tốt với phác đồ điều trị sử dụng<br /> bevacizumab: các thể đa hình khác nhau sẽ<br /> định hình kiểu gen VGFR khác nhau với<br /> mức tiên lượng đáp ứng điều trị khác nhau.<br /> Đến nay, người ta đã biết có ít nhất 8 thể<br /> đa hình khác nhau trên khu vực mã hóa gen<br /> VGFR. Tùy từng cộng đồng dân cư khác<br /> nhau mà tần suất kiểu gen VGFR sẽ khác<br /> nhau, đồng thời đáp ứng của thể mang kiểu<br /> gen tương ứng với phác đồ bevacizumab<br /> cũng khác nhau.<br /> Để xác định đột biến gen EGFR cũng<br /> như VGFR, chủ yếu dựa vào công nghệ<br /> giải trình tự gen hoặc mua kít thương mại<br /> dựa trên nguyên lý RT-PCR hoặc PCR kết<br /> hợp ELISA. Do tính chất phức tạp của<br /> những đột biến gen EGFR và VGFR, nên<br /> các phương pháp trên có nhiều hạn chế<br /> như: (1) giải trình tự gen phải nhân nhiều<br /> đoạn gen, độ nhạy kỹ thuật thấp (yêu cầu<br /> tối thiểu phải có > 25% gen mang đột biến<br /> mới phát hiện được); (2) các kít thương mại<br /> có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị phù<br /> hợp, phụ thuộc nhập ngoại và có hạn sử<br /> dụng ngắn. Do đó, việc tìm hiểu và thiết lập<br /> một phương pháp phát hiện kiểu gen VEGF<br /> và xác định đột biến gen EGFR không sử<br /> 50<br /> <br /> t¹p chÝ y d-îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch-¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15<br /> <br /> dụng phản ứng sequencing là điều cần thiết.<br /> Vì thế, chúng tôi nghiên cứu đề tài này với<br /> mục tiêu: Thiết lập quy trình phát hiện kiểu<br /> gen VEGR và kiểu đột biến gen EGFR ứng<br /> dụng trong điều trị BN UTPKTBN.<br /> <br /> Germer đề xướng (Germer, Holland và CS,<br /> 2000 [3]; O'Brien, Everhart và CS, 2011 [9]):<br /> đầu 3’ của mồi xuôi bắt cặp chính xác với<br /> nucleotid tại vị trí SNP.<br /> <br /> VẬT LI U V PHƢƠNG PH P<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> mỗi vị trí SNP, thực hiện đồng thời hai phản<br /> <br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> Các dòng TB UTPKTBN mang đột biến<br /> EGFR: PC9, NCI-1650, HCC827 (delE746A750), H1975 (L858R). Các hóa chất chuẩn<br /> dùng trong RT-PCR, gel-PCR do Hãng<br /> Invitrogene inc cung cấp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp xác định đột biến gen<br /> EGFR:<br /> Nuôi cấy các dòng TB theo phương pháp<br /> chuẩn, sau 4 - 7 ngày, kiểm tra đạt mật độ<br /> đạt khoảng 5 - 8 x 105 TB/ml. Toàn bộ TB,<br /> ADN tổng số được tách chiết và dùng làm<br /> khuôn cho phản ứng multiplex-PCR với bộ<br /> mồi đặc hiệu cho thể hoang dại (wild type =<br /> WT) hoặc đột biến mất đoạn trên exon 19<br /> (delE746-A750) và đột biến điểm trên exon<br /> 21 tại vị trí L858R. Trình tự mồi do chúng tôi<br /> tự thiết kế.<br /> <br /> Hình 1: Cở sở lý thuyết của phương pháp<br /> động học alen đặc hiệu RT-PCR do Søren<br /> 51<br /> <br /> Để kiểm tra sự có mặt của một alen tại<br /> ứng hai RT-PCR (tương ứng với hai bộ mồi<br /> alen 1 specific primer, alen 2 specific primer và<br /> nhận được hai đường tín hiệu huỳnh quang).<br /> Trường hợp đồng hợp tử, sẽ xuất hiện hai<br /> phổ huỳnh quang riêng biệt: đường sớm<br /> mô tả tín hiệu đặc hiệu, đường muộn mô tả<br /> tín hiệu bắt cặp lệch primer. Trường hợp dị<br /> hợp tử hai đường cong, tín hiệu huỳnh quang<br /> sẽ gần như trùng khít lên nhau.<br /> * Phương pháp phát hiện kiểu gen VEGF:<br /> Xác định tính đa hình của gen VEGF<br /> theo nguyên lý động học alen đặc hiệu RTPCR. Phương pháp này do Søren Germer<br /> (Germer, Holland và CS, 2000 [3]) thiết lập<br /> lần đầu tiên năm 2000. Nguyên lý của<br /> phương pháp này được tóm tắt như sau:<br /> hai bộ mồi đặc hiệu cho từng alen được<br /> thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi bắt cặp<br /> chính xác với hai alen riêng biệt tại vị trí có<br /> SNP, trong khi đó, mồi ngược sẽ được<br /> dùng chung cho cả hai alen. Tại mỗi một vị<br /> trí SNP, sẽ tồn tại một trong ba trình tự<br /> nucleotid như sau: đồng hợp tử alen trội,<br /> dị hợp tử và đồng hợp tử alen hiếm. Khi<br /> chẩn đoán SNP, tiến hành đồng thời hai<br /> phản ứng RT-PCR (sử dụng Sybr green I<br /> để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tương<br /> ứng với hai alen tại vị trí nghi ngờ có SNP.<br /> Lúc đó sẽ xảy ra hai khả năng: (1) nếu mẫu<br /> ADN là đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh<br /> quang (trên lý thuyết) chỉ được ghi nhận<br /> <br /> t¹p chÝ y d-îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch-¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15<br /> <br /> duy nhất một alen tương ứng. Tuy nhiên,<br /> trong thực hành sẽ xảy ra hiện tượng bắt<br /> cặp lệch của primer, do đó, ngay cả khi<br /> mẫu ADN là đồng hợp tử thì tín hiệu huỳnh<br /> quang vẫn xuất hiện ở cả hai alen, trong đó,<br /> tín hiệu giả sẽ chậm hơn tín hiệu thật<br /> khoảng từ 3 - 15 chu kỳ (hình 1, panel trái)<br /> (Germer, Holland và CS, 2000 [3]; O'Brien,<br /> Everhart và CS, 2011 [9]). (2) trường hợp<br /> mẫu ADN là dị hợp tử, tín hiệu huỳnh<br /> quang sẽ có mặt đồng đều ở cả hai alen,<br /> đường cong phổ huỳnh quang của hai alen<br /> sẽ gần trùng khít nhau hoặc chỉ khác nhau<br /> nhá h¬n một chu kỳ (∆Ct ≤ 1) (hình 1)<br /> (Germer, Holland và CS, 2000 [3]; O'Brien,<br /> Everhart và CS, 2011 [9]).<br /> <br /> * Phương pháp đánh giá ngưỡng phát<br /> hiện (độ nhạy) và độ đặc hiệu kỹ thuật:<br /> Để xác định mật độ tối thiểu TB ác tính mà<br /> tại đó xét nghiệm có khả năng phát hiện được<br /> đột biến gen EGFR, chúng tôi tiến hành pha<br /> loãng dòng TB mang đột biến gen vào mẫu<br /> TB thể hoang dại theo tỷ lệ: 0:100, 0.1:100,<br /> 1:100, 10:100 và 100:100. Sau đó, tách ADN<br /> tống số làm khuôn cho phản ứng PCR.<br /> * Giải trình tự gen:<br /> Các đột biến gen sau khi được phát hiện<br /> bằng phương pháp trên sẽ được giải trình<br /> tự theo phương pháp Sanger trên hệ thống<br /> CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) để khẳng<br /> định kết quả và so sánh độ nhạy kỹ thuật.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả phát hiện đột biến gen EGFR trên exon 19 và 21.<br /> <br /> Exon 19 deletion<br /> <br /> Exon 21 mutation<br /> <br /> Hình 2: Kết quả sau khi chạy PCR đa mồi và<br /> điện di phát hiện đột biến gen EGFR tại exon 19 và 21.<br /> Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gen EGFR tại vị trí exon 19 (băng có<br /> mũi tên đỏ hình bên trái) và vị trí exon 21 (băng có mũi tên đỏ hình bên phải). Negative<br /> control: chứng âm, WT: thể dại, mutant: đột biến. ADN ladder: thang chuẩn.<br /> 52<br /> <br /> t¹p chÝ y d-îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch-¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15<br /> <br /> 2. ộ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR tại exon 19 bằng<br /> PCR đa mồi (delE746-A750).<br /> <br /> M<br /> <br /> 50%<br /> <br /> 25%<br /> <br /> 5%<br /> <br /> 1%<br /> <br /> 0.5%<br /> <br /> 0.1%<br /> <br /> 0%<br /> <br /> BT<br /> §B<br /> <br /> Hình 3: Kết quả minh họa phát hiện đột biến gen EGFR theo nồng độ.<br /> Mật độ băng điện di của thể đột biến giảm dần theo nồng độ từ cao đến thấp. Nồng độ<br /> cuối cùng 0,1% TB đột biến vẫn có thể nhìn thấy rõ băng điện di. Kết quả cũng chứng<br /> minh, ở nồng độ 0% TB mang gen đột biến, không nhìn thấy băng điện di. Chứng tỏ độ<br /> nhạy của phương pháp là một TB mang gen đột biến trong 1.000 TB bình thường và độ<br /> đặc hiệu là 100%, không có kết quả dương tính giả.<br /> 3. Khẳng định kết quả của phƣơng pháp bằng giải trình tự gen.<br /> <br /> Hình 4: Kết quả giải trình tự gen EGFR theo nồng độ gen mang đột biến.<br /> Khi có 25% gen đột biến trong tổng số gen không đột biến thì giải trình tự gen có thể<br /> phát hiện được. Tuy nhiên, khi nồng độ gen đột biến giảm chỉ còn 5%, bằng giải trình tự<br /> không phát hiện được.<br /> 52<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2