zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Phân lập và sàng lọc vi sinh vật có khả năng làm giảm khí methane – gây hiệu ứng nhà kính

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Báo xấu

44
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày tiến hành phân lập và mô tả vi khuẩn oxi hóa methane từ nhiều nguồn có sinh phát thải khí methane như nước sông, hầm biogas, ruộng lúa, dạ cỏ bò. Qua kết quả định lượng, chủng S15b có khả năng làm giảm methane cao nhất. Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng S15b là Dyadobacter sediminis.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập và sàng lọc vi sinh vật có khả năng làm giảm khí methane – gây hiệu ứng nhà kính

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÀM GIẢM KHÍ METHANE – GÂY HIỆU ỨNG NHÀ KÍNH Nguyễn Văn Minh*, Lê Huỳnh Nhật Giao, Ngô Lập Vinh, Phạm Lê Minh, Đinh Thị Mai Anh, Nguyễn Hoài Linh Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh *Tác giải liên lạc: minhvisinh@gmail.com TÓM TẮT Từ cuối thế kỷ 19, sự nóng lên toàn cầu đã được phát hiện với sự gia tăng nhiệt độ trung bình của đại dương và bầu khí quyển trái đất. CO2 chiếm khoảng 77% tổng lượng khí nhà kính, trong khi CH4 với lượng phát thải thấp hơn nhưng có khả năng giữ nhiệt cao gấp 25 lần so với CO2 và đang tăng lên trong không khí mỗi năm 0,6% (IPCC, 2013). Trong tự nhiên, Methanotroph (MOB) là nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng methane như là nguồn năng lượng và carbon duy nhất. MOBs thuộc phân lớp α và γ của nhóm Protobacteria, dựa trên hình thái, đặc tính sinh lí như sự sắp xếp màng trong tế bào chất, các con đường chuyển hóa carbon, khả năng cố định N2, nang hoặc túi bào tử, màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, Methanotroph được chia thành 5 chi Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter và Methylococcus (Whittenbury et al., 1970) Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập vi khuẩn oxi hóa khí methane (MOB) từ nước thải hầm biogas, nước sông, bùn lúa, dạ cỏ bò trên môi trường NMS có bổ sung khí CH4 là nguồn carbon duy nhất. Kết quả phân lập thu được 87 chủng vi khuẩn phát triển được trên môi trường NMS agar, trong đó có 4 chủng là S15b, DC3a, MO2 và BĐ41 có khả năng làm giảm methane. Qua kết quả định lượng, chủng S15b có khả năng làm giảm methane cao nhất. Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng S15b là Dyadobacter sediminis. Từ khóa: 16S rDNA, Dyadobacter sediminis, MOB, methane. ISOLATION AND SCREENING OF MICROORGANISMS POTENTIAL FORDECREASE METHANE – GREENHOUSE EFFECT Nguyen Van Minh*, Le Huynh Nhat Giao, Ngo Lap Vinh, Pham Le Minh, Dinh Thi Mai Anh, Nguyen Hoai Linh Ho Chi Minh City Open University *Corresponding Author: minhvisinh@gmail.com ABSTRACT Since the late 19th century, global warming has been detected with the rise in the average temperature of Earth's atmosphere and oceans. CO2 accounted for 77% of greenhouse gases, while methane emissions are lower but have the ability to keep the heat higher 25 times than CO2 and increased 0.6% in the air each year (IPCC, 2013). In nature, Methanotrophic (MOB) bacteria are ability to utilize methane as a sole carbon and energy source. In this study, we isolated Methane oxidation bacteria (MOB) from biogas digesters, river water, rice mud and rumen in NMS medium with CH4 as the sole carbon source. MOBs belong to the α and γ-subclass of Protobacteria. Based on morphology, physiological properties the arrangement of intra-cytoplasmic membranes, pathways of carbon 569
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học assimilation nitrogen fixation ability, the presence of cysts or spores, colony color and motility, the methanotrophs were initially classified into five genera Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter and Methylococcus. Isolated results showed 87 bacterial strains grown on NMS agar, of which four strains S15b, DC3a, MO2 and BD41, were able to reduce methane. Quantitative results showed that the S15b strain has the highest methane reduction potential. Identification by molecular biology technique based on the 16S rDNA gene sequence showed that the S15b strain is Dyadobacter sediminis. Keywords: 16S rDNA, Dyadobacter sediminis, MOB, methane. TỔNG QUAN (Smith et al.,1997), bãi rác (Wise et Hiệu ứng nhà kính là kết quả của sự al.,1999), nước ngầm (Fliermans et trao đổi không cân bằng về năng lượng al.,1988), nước biển (Holmes et al., giữa trái đất với không gian xung 1995), than bùn (Dedysh et al., 2000). quanh, dẫn đến sự gia tăng nhiệt độ của Dựa trên các đặc tính sinh lý cũng như khí quyển trái đất. Các khí nhà kính di truyền của MOB các hướng nghiên chủ yếu: hơi nước, CO2, CH4, N2O, O3, cứu ứng dụng đối với nhóm vi sinh vật các khí CFC. Methane được phát thải này đã được tiến hành. Vai trò hàng từ các quá trình phân hủy kỵ khí chất đầu của MOB trong hệ sinh thái là oxy hữu cơ diễn ra ở nhiều điều kiện môi hóa methane được tạo ra từ quá trình trường khác nhau như đất canh tác, đất phân hủy kỵ khí các hợp chất hữu cơ rừng, đất ngập nước đến trầm tích các trước khi khí này thoát vào khí quyển, thủy vực, trầm tích biển,… Bên cạnh từ đó giảm thiểu tác động của methane đó, con người cũng đóng góp vào trong sự nóng lên toàn cầu. Trong nguồn phát thải khí methane vào khí nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành quyển như sản xuất công nghiệp phân lập và mô tả vi khuẩn oxi hóa (chưng cất than đá, khai thác dầu mỏ), methane từ nhiều nguồn có sinh phát nông nghiệp (chất thải chăn nuôi, dạ thải khí methane như nước sông, hầm dày của các loài nhai lại, canh tác lúa biogas, ruộng lúa, dạ cỏ bò. nước,…). Hiện nay, việc giảm thiểu CH4 bằng phương pháp vật lí, hóa học NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG như hấp thụ bằng carbon hoạt tính hoặc PHÁP NGHIÊN CỨU đốt là các biện pháp có hiệu quả không Nguyên liệu cao (Melse et al.,2005). Vì vậy, công Các chủng vi khuẩn có khả năng oxi nghệ sinh học trở thành biện pháp vừa hóa methane được phân lập từ các mẫu thân thiện với môi trường vừa tiết kiệm nước sông, ao; nước thải hầm biogas; chi phí. Trong đó, vi khuẩn oxi hóa khí bùn lúa; dạ cỏ bò, trâu; ruột con mối tại methane là một mắc xích quan trọng thị xã Bến Cát tỉnh Bình Dương, huyện trong việc giải quyết vấn đề này. Năm Củ Chi, Nhà Bè, tỉnh Cà Mau. 1906, nhà vi sinh vật học người Hà Lan Môi trường phân lập và giữ giống là Nicolaas Söhngen lần đầu tiên mô tả môi trường Nitrate – Mineral – Salts một sinh vật phát triển bằng methane (NMS) có bổ sung 1,5% agar được phân lập từ nước ao và vật liệu (Whittenbury et al., 1970). Môi trường trồng cây thủy sinh. Cho đến nay, chứa KNO3 1.0 g; MgSO4.7H2O 1.0g; nhóm vi khuẩn MOB đã được tìm thấy CaCl2.H2O 0.2 g; 3.8% (w/v); Fe - trong tự nhiên bao gồm đất EDTA 0,1 ml; 0,1% (w/v) (Whittenburyet al.,1970), trầm tích NaMo.4H2O 0.5 ml; 1 lit H2O; 1 ml 570
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học hỗn hợp vi lượng: FeSO4.7H2O 500 2010). mg; ZnSO4.7H2O 400 mg; Đánh giá khả năng oxy hóa methane MnCl2.7H2O 20 mg, CoCl2.6H2O 10 của các chủng vi khuẩn mg, NiCl2.6H2O 10 mg, H3BO3 15 mg, Vi khuẩn oxi hóa khí methane được EDTA 250 mg, 1 lit H2O; 10ml hỗn nuôi trong bình serum thủy tinh 500 hợp vitamin: Biotin 2.0 mg, Folic acid ml, có nắp cao su và kẹp nhôm chứa 2.0 mg, Thiamine HCl 5.0 mg, Ca 100ml NMS và 50 – 70% CH4. Đậy kín patothenate 5.0 mg, Vitamin B12 0.1 nắp lọ, ủ lắc 200 ppm/ 30oC/ 7 ngày. mg, Riboflavin 5.0 mg, Nicotiamide Sau khi bổ sung khí và vi khuẩn, chúng 5.0 mg, 1 lit H2O; pH 6,8 – 7; hấp vô tôi tiến hành lấy mẫu khí gửi đi phân trùng 121oC, 20 phút, 1 atm. tích lần 1 tại Viện công nghệ hóa học số 01 Mạc Đĩnh Chi. Hỗn hợp phản PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ứng được phân tích trên máy phân tích Phân lập và làm thuần sắc ký khí Agilent Technologies 6890 Mẫu con mối được rửa qua ethanol 70 Plus, máy được trang bị phần mềm GC %, cắt bỏ đầu, dùng kẹp tách ruột mối. Chem Station để xử lý số liệu. Phân Sau đó rửa lại với ethanol 70% tích CH4 sử dụng detector ion hóa ngọn (Trinkerl Marion et al., 1990) và lửa FID và cột mao quản DB-624 chuyển vào bình serum 50 ml được đậy (chiều dài 30 m, đường kính trong của kín bằng nắp cao su silicon chứa 10 ml cột 250 μm, độ dày lớp phim 0,32 μm) môi trường NMS có bổ sung CH4 như với chế độ hoạt động: Nhiệt độ lò 60 là nguồn carbon duy nhất. Tương tự o C; Áp suất 20,0 PSI; Tỷ lệ chia dòng với mẫu đất và mẫu nước, ủ lắc ở 30oC 25/1; Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC; trong bình serum chứa môi trường Nhiệt độ đầu dò 250 oC; và khí mang NMS với CH4 là nguồn carbon duy N2. Thể tích mẫu bơm phân tích: 0,2 nhất. Sau 5 - 7 ngày, hút 5 – 10 ml dịch mL. Sau 7 ngày nuôi ủ, chúng tôi tiếp nuôi chuyển vào bình serum chứa môi tục lấy mẫu khí gửi đi phân tích lần 2 trường NMS khác, lặp lại 3 lần. Sau để xác định %CH4 giảm. khoảng 25 ngày, pha loãng dịch nuôi Định danh bằng kỹ thuật sinh học với dung dịch NaCl 0,85% với độ pha phân tử loãng từ cấp số 1 đến cấp số 5. Mẫu vi khuẩn S15b được gửi giải trình Trải 100 µL dịch nuôi ở 3 độ pha loãng tự và định danh tại công ty Nam Khoa, cuối lên môi trường NMS agar, mỗi bằng phương pháp PCR với cặp mồi nồng độ 2 đĩa, ủ ở 30ºC trong hộp kín đặc hiệu cho vùng gen 16S rDNA. Kết có bổ sung 30-50% CH4 . Các khuẩn quả giải trình tự được BLAST để so lạc mọc trên môi trường được tiếp tục sánh trình tự trên ngân hàng cơ sở dữ cấy sang môi trường NMS agar nhiều liệu NCBI. Sau đó tiến hành xây dựng lần đến khi các khuẩn lạc mọc trên cây phát sinh loài bằng phương pháp đường cấy đồng nhất (về màu sắc, kích Maximum likelihood (khả năng tối ưu- thước, hình dạng), rời nhau (Dehysh et ML) với phần mềm MEGA 6. Khoảng al., 2010). cách di truyền được thiết lập dựa trên Nhuộm gram mô hình thuật tóa n tiến hóa Kimura’s Để quan sát hình thái vi thể các chủng two parameter. phân lập được, tiến hành nhuộm Gram các chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ủ trên NMS agar và quan sát dưới kính Kết quả phân lập và làm thuần hiển vi với vật kính 100X (Roy et al., Từ 38 mẫu bao gồm dạ cỏ, nước, đất 571
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học bùn, mối, phân bò thu thập ở Bình Thực hiện phản ứng PCR nhân bản Dương, Củ Chi, Nhà Bè, Bến Cát, 87 vùng gen 16S rDNA của chủng S15b chủng vi khuẩn đã được phân lập trên với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR môi trường NMS với CH4 là nguồn là đoạn gen dài 483 bp. carbon duy nhất trong đó có 45 chủng Từ kết quả giải trình tự vùng gen 16S vi khuẩn Gram (-) và 42 chủng vi rDNA của chủng S15b, chúng tôi tiến khuẩn Gram (+). hành BLAST để so sánh mức độ tương Các dạng khuẩn lạc trên môi trường đồng với các trình tự trên ngân hàng cơ NMS agar hầu hết đều bóng ướt, hình sở dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy tròn, màu trắng đục hoặc trắng ngã chủng S15b có mức độ tương đồng cao vàng, trắng ngã hồng. Quan sát bằng với nhiều loài thuộc chi Dyadobacter, kính hiển vi cho thấy chúng có hình chỉ số Query cover đạt 94%. Ngoài ra, trực ngắn, quả lê, cầu đôi hoặc cầu. sau khi dựng cây phả hệ phân tử, chúng Kết quả định lượng %CH4 giảm tôi nhận thấy rằng trình tự của S15b có Từ 87 vi khuẩn phân lập được qua quá mức gần gũi cao với trình tự của loài trình định lượng, xác định được 4 Dyadobacter sediminis, chỉ số chủng: chủng S15b phân lập từ nước bootstrap đạt 97%, cho thấy mức độ sông, chủng MO2 phân lập từ ruột mối, gần gũi giữa S15b và Dyadobacter chủng DC3b phân lập từ dạ cỏ bò, sediminis có độ tin cậy lên đến 97%. chủng BĐ41 phân lập từ bùn lúa có khả Dyadobacter sediminis được mô tả đầu năng làm giảm CH4 và cao nhất là tiên bởi ông Tian M. và cộng sự (2015) chủng S15b có khả năng oxi hóa từ mẫu trầm tích dưới lòng đất, nằm methane. trong lưu vực sông Mohe, phía Đông Theo nghiên cứu của Dayeri Dianou và Bắc Trung Quốc. Chưa có công trình cộng sự (1997) trong số 20 chủng nào nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, vật MOB phân lập được, chủng có khả liệu di truyền của chủng Dyadobacter năng oxi hóa methane cao nhất là 96% sediminis. Vì vậy, để tăng độ tin cậy và thấp nhất là 23%. Như vậy, kết quả cho kết quả tiếp theo chúng tôi sẽ thử của Dayeri Dianou và cộng sự có kết nghiệm khả năng sử dụng và làm giảm quả cao hơn so với kết quả của chúng CH4 của chủng S15b trên mô hình thực tôi (43 - 55%). nghiệm. Đồng thời sẽ tập trung nghiên Theo nghiên cứu của Malashenko và cứu đến ezyme methane cộng sự (2004), nhóm vi khuẩn MOBs monooxygenase và đoạn gen pmoA, có khả năng sinh ra exopolymer (EPS) mmoX trong chủng S15b. như một chất nền cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật dị dưỡng khác. KẾT LUẬN Nghiên cứu của Whittenbury và cộng Thu được 87 chủng vi khuẩn có tiềm sự (1970) cho biết các vi khuẩn không năng giảm CH4 từ 38 mẫu bao gồm dạ sử dụng khí methane phát triển trên cỏ, nước thải biogas, nước sông, mối, môi trường NMS với CH4 là nguồn đất bùn khác nhau trên địa bàn huyện carbon duy nhất là do sử dụng các chất Củ Chi, huyện Nhà Bè, thị xã Bến Cát, hữu cơ hòa tan trong thành phần của tỉnh Bình Dương. Trong đó có 45 agar. Vì vậy trong quá trình phân lập chủng Gram (-) và 42 chủng Gram (+). dễ có sự nhầm lẫn giữa vi sinh vật sử Định lượng phần trăm CH4 giảm của dụng methane và vi sinh vật không sử 31 chủng vi khuẩn. Thu được 8 chủng dụng methane. có khả năng làm giảm CH4. Trong đó, Kết quả định danh chủng S15b chủng S15b được phân lập từ nước 572
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học sông làm giảm CH4 cao nhất. học phân tử cho thấy chủng S15b thu Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh được là loài Dyadobacter sediminis. TÀI LIỆU THAM KHẢO DEDYSH S.N., DUNFIELD P.F. (2010). Facultative and obligate methanotrophs: how to identify and differentiate them. Methods in Enzymology, pp. 31-43. DIANOU D., ESPIRITU B.M., ADACHI K., SENBOKU T., (1997). Isolation and some properties of methane-oxidizing bacteria from a subtropical paddy field., Soil Sci. Plant Nutr., 43, pp. 735-740. FLIERMANS C.B., PHELPS T.J., RINGELBERG D., MIKELL A.T., WHITE D.C. (1988). Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures. Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures. Applied and Environmental Microbiology 54, pp. 1709 – 1714. WISE M.G., MCARTHUR J.V., SHIMKETS LJ (1999). Methanotroph diversity in landfill soil: isolation of novel types I and type II methanotrophs whose presence was suggested by culture-independent 16S ribosomal DNA analysis. Appl Environm Microbiol 65, pp. 4887 - 4897. 573

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.