Phân lập vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý amonium trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm

Chia sẻ: Sunshine_2 Sunshine_2 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

144
lượt xem 27
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thu thập 36 mẫu đất ở ĐBSCL để phân lập vi khuẩn (VK) Pseudomonas stutzeri và nhận diện chúng bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy dòng P8 xác định là P. stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S-rDNA và một dòng P2a được xác định có mang gen cd1-nirD. Sử dụng riêng rẻ dòng P8, P2a, P10, dòng đối chứng dương ATCC 14405 và hỗn hợp 2 dòng phối trộn P8-P2a, P10-P8 để khử ammonia và nitrat dưới mức an toàn từ 2 đến 4 ngày sau khi cho các dòng VK này vào trong môi trường nước...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý amonium trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm

PHÂN L P VI KHU N PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG ð T ð NG B NG SÔNG C U LONG VÀ NG D NG X LÝ AMONIUM TRONG NƯ C ðI U KI N PHÒNG THÍ NGHI M Ths. Phan Trư ng Khanh∗ TÓM T T Thu th p 36 m u ñ t ðBSCL ñ phân l p vi khu n (VK) Pseudomonas stutzeri và nh n di n chúng b ng k thu t PCR. K t qu cho th y dòng P8 xác ñ nh là P. stutzeri b ng c p m i ñ c trưng 16S-rDNA và m t dòng P2a ñư c xác ñ nh có mang gen cd1-nirD. S d ng riêng r dòng P8, P2a, P10, dòng ñ i ch ng dương ATCC 14405 và h n h p 2 dòng ph i tr n P8-P2a, P10-P8 ñ kh ammonia và nitrat dư i m c an toàn t 2 ñ n 4 ngày sau khi cho các dòng VK này vào trong môi trư ng nư c bi n nhân t o hay nư c ao nuôi tôm b nhi m ammonia. K t qu là h u h t các dòng VK ñ u có kh năng kh NH4+ kho ng 80%. Tuy nhiên, hi u su t x lý NH4+ c a dòng ATCC 14405 không cao. ABSTRACT Thirty six soil samples were taken from the Mekong Delta to identify Pseudomonas stutzeri by PCR technology. Results indicated that, P8 strain was identified Pseudomonas stutzeri with specific primers 16S-rDNA and that one strain P2a has carried cd1-nirD gene. Using alone bacteria strains P8, P10, P2a, ATCC 14405 and a mixture of P8-P2a, P10-P8 reduced ammonia and nitrate concentration to below safety level from 2 to 4 days after inoculating this bacteria into ammonia-wastewater of artificial seawater and shrimp-pond water. As a result, most of bacteria strains reduced about 80% ammonia and nitrate. However, ammonia reducible efficiency of ATCC 14405 was not high. Key words: Pseudomonas stutzeri 1. ð T V N ð V n ñ ô nhi m các h p ch t nitơ vô cơ trong nư c có th gây nên m t s b nh nguy hi m cho ngư i s d ng, nitrat t o ra ch ng thi u vitamin và có th k t h p v i các amin ñ t o nên nitrosamin là nguyên nhân gây ung thư ngư i, n ng ñ NH4+ cao gây ra hi n tư ng phú dư ng làm cho môi trư ng nư c b ô nhi m n ng. Nitơ amon có m t trong nư c cũng làm gi m hi u qu c a khâu kh trùng b ng clo, ngay c trong môi trư ng ñ t khi lư ng nitơ vô cơ quá nhi u ñ t s b chay c ng… Vì v y, vi c nghiên c u, tìm ki m và phân l p dòng VK Pseudomonas stutzeri ñ x lý nitơ vô cơ trong nư c là r t c n thi t. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U - Phân l p VK này trên môi trư ng Pseudomonas isolation agar. Sau ñó xác ñ nh các dòng VK kh ñ m b ng môi trư ng SW-LB, môi trư ng Minimal. - Quan sát hình d ng và ño kích thư c t bào VK P. Stutzeri dư i kính hi n vi v i ñ phóng ñ i 400 l n. - Ly trích DNA và ki m tra các dòng P. Stutzeri ñã phân l p b ng k thu t PCR - Ch y ñi n di trên Gel Agarose - Xác ñ nh kh năng kh nitơ vô cơ c a vi khu n Pseudomonas stutzeri - Xác ñ nh lư ng NH4+ và NO3- ñư c x lý b i VK P.stutzeri trong nư c ao nuôi tôm. 3. K T QU TH O LU N 3.1 Hình thái, màu s c, kích thư c dòng Pseudomonas K t qu phân l p ñư c 20 dòng VK Pseudomonas, trong ñó có 5 dòng VK ñư c phân l p t nhóm ñ t nhi m m n, 5 dòng t nhóm ñ t phèn, 10 dòng ñư c phân l p t nhóm ñ t phù sa. Trong s 20 dòng VK Pseudomonas ch có 1 dòng P. stutzeri là P8. Dòng P8 ñư c phân l p t m u ñ t phù sa xã An Th nh Trung, huy n Ch M i, An Giang. H u h t các khu n l c ñ u có hình que, màu tr ng ñ c, tr ng s a hay màu vàng, b m t khu n l c mô ho c trơn, có chi u dài t 0,4 m–2,5 m; chi u ngang t 0,5 m–0,8 m. B ng 1. K t qu phân l p các dòng vi khu n t ñ t ð a ñi m thu m u Lo i ñ t S m u S dòng phân l p Ch M i Phù sa 6 6 Ô môn Phù sa 6 4 ∗ Gi ng viên BM. Môi trư ng - PTBV. Email: ptkhanh@agu.edu.vn Báo cáo Khoa h c S 32, 05/2008 27
Vĩnh L i ð tm n 6 2 Vĩnh Châu ð tm n 6 3 Tam Nông ð t phèn 6 2 Th nh Hoá ð t phèn 6 3 3.2 Ki m tra các dòng vi khu n b ng k thu t PCR S n ph m ADN sau khi ki m tra ñư c khu ch ñ i b ng k thu t PCR, ti p t c ki m tra b ng phương pháp ñi n di trên gel agarose 1,2% và ñư c ch p hình dư i tia UV. K t qu ñi n di v i c p m i F (5’ AGT CAC ACT GGA ACT GAG ACA -3’); R (5’-TGT CAG TAT TAG CCC AGG TG-3’), chúng tôi phát hi n ñư c m t loài VK cho band ADN v trí 625bp là ch ng P. stutzeri P8 (Hình 1) phù h p v i v trí band c a VK ñ i ch ng dương ATCC 14405. Nh ng dòng còn l i không cho band tương ng ch ng t chúng không ph i là Pseudomonas stutzeri. Thang chu n 100bp 900 bp 1200 bp 900 bp 600 bp 600 bp 300 bp 300 bp 100 bp 100 bp Ch ng vi khu n 1 ch ng vi 1 ch ng vi khu n P2a kh ñ i ch ng dương khu n P8 ñ m mang gen cd1-nirD ATCC 14405 P. stutzeri Hình 1. Vi khu n P8 Hình 2. Vi khu n P2a K t qu ñi n di nh n di n dòng VK mang gen nir t ng h p cd1 v i c p m i F1 (5’ -GAA TAC CAC CCC GAG CCG CGC GT-3’); R4 (5’-AC CCG ACC GGT AAG TTC AAC GTG -3’), chúng tôi cũng phát hi n ñư c m t loài VK cho band ADN v trí 785bp là ch ng VK P2a (Hình 2) nhưng không ph i là Pseudomonas stutzeri Hình 3. ðo n gen c a P. stutzeri mang gen nos, nir, nor. Hình 4. P2a t ng h p cd1-nirD t hem D1 3.3 Xác ñ nh kh năng kh nitơ vô cơ c a vi khu n Pseudomonas stutzeri Thí nghi m ñư c b trí v i 7 nghi m th c bao g m: 4 dòng VK ñơn l P10, P8, P2a, ñ i ch ng dương ATCC 14405; 2 dòng ph i tr n P10-P8, P8-P2a và m t nghi m th c ñ i ch ng âm. M i dòng VK ti n hành l p l i 3 l n trong 3 bình tam giác khác nhau. M u ñ i ch ng âm ñư c chu n b gi ng như m u th t nhưng không có ch ng VK. Báo cáo Khoa h c S 32, 05/2008 28
Thí nghi m ñư c ti n hành trên môi trư ng nư c bi n nhân t o v i hai n ng ñ NH4+ khác nhau (n ng ñ NH4+ ban ñ u 10ppm và 30ppm) và nư c ao nuôi tôm b nhi m ammonia (n ng ñ NH4+ ban ñ u 5ppm) . B trí thí nghi m xong chúng tôi ti n hành ño pH, ñ m m t s VK và xác ñ nh lư ng NH4+, NO3- còn l i. B ng 2. Hi u su t x lý NH4+ c a các nghi m th c sau 4 ngày thí nghi m v i NH4+ban ñ u 10ppm (thí nghi m 1), 30ppm (thí nghi m 2), ao nuôi tôm 5ppm (thí nghi m 3). Hi u Su t (%) Hi u Su t (%) Hi u Su t (%) STT Nghi m Th c (thí nghi m 1) (thí nghi m 2) (thí nghi m 3) 1 ð i ch ng -- - -- 2 Dòng P8 80,78 98,36 80,78% 3 Dòng P2a 59,92 65,39 59,92% 4 Dòng ATCC 14405 55,78 97,40 55,78% 5 Dòng P10 79,96 76,16 79,96% 6 Dòng P10-P8 80,78 99,28 80,78% 7 Dòng P8-P2a 80,58 99,35 80,58% K t qu cho th y, t t c các dòng VK ñ u kh ñư c NH4+, nghĩa là t t c các dòng VK trên ñ u có mang gen nir, tuy nhiên m c ñ kh NH4+ c a m i dòng khác nhau là còn tuỳ thu c vào dòng VK ñó có mang các gen ñ c hi u nào khác không? Dòng P8 là dòng P. stutzeri có mang t h p các gen nir, nor, nos kh ñư c NH4+ qua các giai ño n NH4+ --->NO3 --> NO2 ---> NO --> N2O--> N2 và cũng có kh năng kh ñư c NH4+ ->NO3 --> NO2 --->NH3. Vì v y, hi u su t kh NH4+ c a dòng P8 cao nh t trong t t c các dòng VK. Trong khi ñó, dòng P2a là dòng Pseudomonas có mang gen cd1-nirD kh ñư c nitơ vô cơ m nh nh t giai ño n NO2 -->NO--> N2O--> N2. Còn giai ño n kh NH4+ sang NO3 sang NO2 x y ra nhưng r t ch m. Vì v y, hi u su t kh NH4+ dòng P2a th p hơn so v i dòng VK P8. Khi ng d ng VK vào x lý các m u nư c ao nuôi tôm b nhi m amonium thì h u h t chúng làm gi m n ng ñ NH4+ kho ng 80% sau b n ngày thí nghi m. Tuy nhiên, hi u su t x lý th p hơn so v i thí nghi m 1 và thí nghi m 2. Bi u ñ 2 cũng cho th y n ng ñ NO3- còn l i sau b n ngày thí nghi m r t th p dao ñ ng trong kho ng 0,042-0,087 ppm, rõ ràng khi có s tham gia c a các dòng VK thì h u h t n ng ñ NH4+ chuy n hoá thành NO3-, sau công ño n nitrat hoá amoni là khâu kh nitrat sinh hoá nh các dòng vi sinh v t trong ñi u ki n thi u khí. Nitrit và nitrat s chuy n thành d ng khí N2. Vì v y n ng ñ NO3- gi m m t cách ñáng k h u h t các nghi m th c và m t s VK có xu hư ng gi m theo th i gian thí nghi m. ði u này cho th y, trong m u nư c ao nuôi tôm các h p ch t h u cơ ch a cacbon ñã c n ki t do ñó m t s VK có xu hư ng gi m xu ng nh ng ngày thí nghi m cu i cùng. ði u này có th gi i thích VK thu năng lư ng ñ tăng trư ng t quá trình chuy n hoá NO3- thành khí N2 và c n có ngu n cacbon ñ t ng h p t bào. 6 4.185 5 4 N ng ñ NH4 ppm 3 ðC P8 2 P2a ATCC P10 1 P10-P8 0.087 0.048 0.061 0.042 0.045 0.046 P8-P2a 0 ðC P8 P 2a ATCC14405 P 10 P 10-P 8 P 8-P 2a Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 nghi m th c Bi u ñ 1. S bi n ñ ng NH4+ trong m u nư c ao Bi u ñ 2. N ng ñ NO3- còn l i trong nư c ao nuôi tôm sau x lý. nuôi tôm sau khi x lý Báo cáo Khoa h c S 32, 05/2008 29
4. K T LU N - B ng k thu t PCR k t qu nh n di n ñư c m t dòng VK P.stutzeri ñó là dòng P8 ñư c phân l p t m u ñ t phù sa, huy n Ch M i, t nh An Giang. Dòng P2a không ph i là VK P. stutzeri nhưng có gen cd1-nirD kh ñư c oxyt nitơ t NO sang N2O ñ n N2 và ñư c phân l p t m u ñ t phù sa huy n Ô Môn, C n Thơ. - T t c các dòng VK P8, ATCC14405, P2a, P10 h ph i tr n P8-P2a, P8-P10 ñ u có kh năng kh ñư c nitrat và ñ m amon trong m u nư c ao nuôi tôm. Dòng P8, P8-P2a, P10-P8 hi u su t x lý NH4+ ñ t kho ng 80%. Dòng P10 không ph i là VK P.stutzeri nhưng kh năng x lý NH4+ ñ t 79,96%. Dòng P2a kh năng x lý ñ m amon không n ñ nh và hi u su t x lý th p ch ñ t 59,92%. Dòng ñ i ch ng dương ATCC 14405 là dòng VK P.stutzeri l y t nư c ngoài nên kh năng thích nghi kém trong ñi u ki n c a nư c ta vì v y hi u su t x lý cũng không cao. 5. KI N NGH - C n ph i ng d ng các dòng VK này ngoài ñ ng ñ có k t lu n chính xác hơn. - C n nghiên c u sâu hơn n a các dòng VK này ñ s n xu t ch ph m sinh h c trong x lý môi trư ng nư c ao tôm b nhi m ñ m amon và nitrat. - Chúng ta nên phân l p, tìm ki m và ng d ng nh ng dòng VK có t i ñ a phương ñ x lý nư c b nhi m amonium và nitrat s cho k t qu t t hơn. Báo cáo Khoa h c S 32, 05/2008 30