Phân nhóm mãng cầu dai (annona squamosa l.) vùng núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh dựa trên gene matK và hình thái hoa

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN LANG<br /> <br /> Trƣơng Thế Quang<br /> <br /> PHÂN NHÓM MÃNG CẦU DAI (ANNONA SQUAMOSA L.)<br /> VÙNG NÚI BÀ ĐEN, TỈNH TÂY NINH<br /> DỰA TRÊN GENE matK VÀ HÌNH THÁI HOA<br /> CLASSIFICATION OF CUSTARD APPLE (ANNONA SQUAMOSA L.)<br /> IN BA DEN MOUNTAIN AREA, TAY NINH PROVINCE<br /> BASED ON GENE MATK AND SHAPE FLOWER<br /> TRƯƠNG THẾ QUANG<br /> <br /> T<br /> T T Giải trình tự gene matK của mười mẫu lá non mãng cầu dai (Annona<br /> squamosa L.) ở vùng núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh. Ứng dụng kỹ thuật dấu phân tử matK<br /> thuộc hệ gene lục lạp để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài mãng cầu dai Bà<br /> Đen. Xây dựng cây phát sinh loài, phân loại các nhóm loài mãng cầu dai Bà Đen dựa trên<br /> trình tự gene matK và đặc điểm hình thái hoa.<br /> Từ khóa mãng cầu dai, matK, núi Bà Đen.<br /> ABSTRACT: Gene matK of ten custard apple young leaves (Annona squamosa L.) in Ba<br /> Den mountain area, Tay Ninh province have been sequenced. Application molecular<br /> markers gene matK of chloroplast genome, genetic relationship between species of custard<br /> apple Ba Den have been defined. Based on gene matK and shape flower, phylogenetic tree<br /> and classification species of custard apple Ba Den have been developed.<br /> Keywords: Custard apple, matK, Ba Đen mountain.<br /> và khoáng chất. Ngoài ra, mãng cầu còn có<br /> một hương vị đặc biệt khiến nhiều người ưa<br /> thích, có độ ngọt cao, vị chua không lạt, có<br /> hương thơm.<br /> Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền<br /> vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh<br /> giá quỹ gene là công đoạn vô cùng quan<br /> trọng, không chỉ phục vụ cho việc xác định<br /> các giống, loài khác nhau mà còn nhằm tìm<br /> hiểu mối quan hệ về di truyền giữa các giống,<br /> loài để bảo tồn đa dạng nguồn gene. Sự phát<br /> triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ<br /> thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã tạo<br /> ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng<br /> <br /> Đ T VẤN ĐỀ<br /> Cây mãng cầu có nguồn gốc từ Châu<br /> Mỹ. Mãng cầu ta (Annona squamosa L.) có<br /> tên tiếng Anh: Custard apple, Sugar apple;<br /> tên tiếng Pháp: Pomme cannelle. Từ thế kỷ<br /> XVI, cây mãng cầu đã được du nhập vào<br /> nhiều nước nhiệt đới do tính thích nghi ở<br /> các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và đã mang<br /> lại nhiều giá trị kinh tế. Mãng cầu ta ở phía<br /> nam nước ta thường có hai loại là mãng cầu<br /> dai và mãng cầu bở. Tuy nhiên, mãng cầu<br /> bở không có nhiều ưu điểm về phẩm chất<br /> và giá trị kinh tế nên phần lớn người dân<br /> trồng mãng cầu dai, là loại quả giàu sinh tố<br /> <br /> <br /> TS. Trường Đại học Văn Lang, Email: truongthequang@vanlanguni.edu.vn<br /> 119<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN LANG<br /> <br /> Số 08/2018<br /> <br /> được ứng dụng trong nghiên cứu bảo tồn đa<br /> dạng sinh học. Ưu thế của các kỹ thuật phân<br /> tử là có khả năng xác định được sự đa dạng ở<br /> mức độ gene, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị<br /> bảo tồn của loài và quần thể. Trong đó, mã<br /> vạch dựa trên trình tự DNA (DNA Barcode)<br /> ra đời đã hứa hẹn một tương lai mới, nơi mà<br /> con người có thể cập nhật nhanh chóng các<br /> thông tin như tên, thuộc tính sinh học,… của<br /> bất cứ loài sinh vật nào trên trái đất. Một<br /> công cụ hữu hiệu trong việc định danh thực<br /> vật khi các dữ liệu hình thái bị thiếu hoặc bất<br /> lực trong việc so sánh để phân biệt các loài<br /> trong cùng một giống. Chính vì vậy, việc tạo<br /> lập cơ sở dữ liệu DNA của các giống, loài để<br /> đăng ký ở ngân hàng gene thế giới về tài<br /> nguyên di truyền thực vật đặc hữu của Việt<br /> Nam nói chung và mãng cầu nói riêng đang<br /> là vấn đề rất quan trọng, mang tính khoa học<br /> và thực tiễn cao. Trong những năm gần đây,<br /> người dân chuộng trồng các giống cây mới<br /> được lai tạo hoặc du nhập từ nước ngoài vào.<br /> Chính những vấn đề này đã và đang làm<br /> giảm sút một số giống quý, đặc hữu của địa<br /> phương, trong đó có cây mãng cầu dai vùng<br /> núi Bà Đen thuộc tỉnh Tây Ninh. Do đó, việc<br /> xác định mối quan hệ di truyền và phân định<br /> các nhóm loài mãng cầu dai đang trồng tại<br /> vùng núi Bà Đen thuộc tỉnh Tây Ninh dựa<br /> trên trình tự gene matK và đặc điểm hình thái<br /> hoa là cần thiết, đây là cơ sở khoa học ban<br /> đầu để xây dựng bản đồ gene cho giống<br /> mãng cầu dai (Annona squamosa L.) đặc hữu<br /> tại địa phương này trong việc bảo tồn nguồn<br /> gene, xây dựng thương hiệu sản phẩm thông<br /> qua chỉ dẫn địa lý và bảo hộ thương hiệu của<br /> sản phẩm, cũng như ứng dụng trong nghiên<br /> cứu chọn giống, lai tạo giống mới kháng<br /> bệnh và có chất lượng cao.<br /> <br /> Hình 1. Cây mãng cầu dai trồng tại vùng núi Bà<br /> Đen, tỉnh Tây Ninh [8]<br /> <br /> Trong hệ thống học thực vật gần đây,<br /> gene matK nổi lên như là một gene vô giá<br /> bởi dấu hiệu phát sinh chủng loài của nó<br /> cao so với các gene khác được dùng trong<br /> lĩnh vực này. Gene matK (mã hóa cho<br /> maturase K) được phát hiện đầu tiên trên<br /> cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum) khi giải<br /> trình tự gene trnK mã hóa cho tRNALys<br /> (UUU) của lục lạp [2], [6].<br /> Gene matK của Annona squamosa dài<br /> khoảng 802 bp, tương ứng với khoảng 267<br /> amino acid trong protein [5]. Nằm giữa hai<br /> exon ở đầu 5’ và 3’ của trnK, tRNALys<br /> trong vùng bản sao đơn lớn của bộ gene lục<br /> lạp ở hầu hết các loài thực vật đất (Hình 2).<br /> Gene matK nổi bật lên trong số các<br /> gene lục lạp được dùng trong phân tích hệ<br /> thống học thực vật theo kiểu riêng và nhịp<br /> tiến hóa của nó. Sự biến đổi nucleotide tính<br /> trên mỗi vị trí trong matK cao gấp 3 lần<br /> trong rbcL (tiểu phần lớn của RUBISCO),<br /> và tốc độ thay thế amino acid cao gấp 6 lần<br /> của rbcL. Cùng với tốc độ thay thế amino<br /> 120<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN LANG<br /> <br /> Trƣơng Thế Quang<br /> <br /> acid cao trong matK là tỉ lệ thay thế gần<br /> như bằng nhau giữa cả ba vị trí trong mỗi<br /> codon. Tốc độ thay thế cao làm gia tăng số<br /> điểm parsimony và tín hiệu phát sinh chủng<br /> loài mạnh, nên nó có thể được sử dụng để<br /> phân biệt lịch sử tiến hóa ở các mức phân<br /> loại khác nhau. Giá trị về thông tin phát<br /> sinh chủng loài tạo ra nhờ matK làm cho nó<br /> trở thành gene cực kỳ có giá trị trong các<br /> nghiên cứu hệ thống và tiến hóa nhanh<br /> chóng [1]. Tốc độ thay thế amino acid<br /> nhanh trong gene matK hầu như là do có<br /> tốc độ thay thế phân bố đồng đều cho cả ba<br /> vị trí trong codon trong khi phần lớn các<br /> gene mã hóa protein khác lại có xu hướng<br /> thay thế nucleotide ở vị trí thứ ba. Chẳng<br /> hạn, tốc độ thay thế ở 3 vị trí trong codon<br /> của matK lần lượt là 62%, 57% và 66% khi<br /> <br /> so sánh các bộ thực vật hạt kín với nhau<br /> [3], và lần lượt là 32%, 28% và 39% trong<br /> họ Lan (Orchidaceae) [9]. Các đột biến<br /> chèn hay mất (gọi tắt là xóa chèn – Indel)<br /> thường xảy ra trong matK, mặc dù các xóa<br /> chèn chủ yếu xảy ra với bội số của ba, duy<br /> trì khung đọc mở. Tốc độ thay thế nhanh<br /> cùng với sự hiếm hiện diện các xóa chèn<br /> làm thay đổi khung đọc và một vài trường<br /> hợp codon kết thúc xuất hiện sớm.<br /> Thông tin trình tự từ một mình gene<br /> matK đã có thể tạo ra kết quả phát sinh<br /> chủng loài mạnh như khi dựng bằng các bộ<br /> dữ liệu gồm từ 2 đến 11 gene khác nhau kết<br /> hợp. Hơn nữa, thông tin phân tử từ matK<br /> cũng được sử dụng để phân tích các quan<br /> hệ phát sinh chủng loài ở các nhóm phân<br /> loại từ thấp đến cao [3].<br /> <br /> Hình 2. Gene matK, vùng Reverse Transcriptase (RT) của matK ORF, miền domain X<br /> và hai vùng exon trnK<br /> <br /> Ở nước ta hiện chưa có các nghiên cứu<br /> về quan hệ di truyền của các loài mãng cầu<br /> (Annona squamosa L.) dựa trên các dấu<br /> phân tử thuộc hệ gene lục lạp hoặc hệ gene<br /> trong nhân. Ở nước ngoài đã có các công<br /> trình nghiên cứu về Annona squamosa như<br /> “Mã vạch DNA của một số loài thuộc họ<br /> na (Annona)” của Nerea Larranaga và José<br /> I. Hormaza (2015) [5]; “Đa dạng sinh học<br /> của một số loài thuộc họ Na (Annona) và<br /> hình thái quả dựa theo các kiểu gene đã<br /> chọn” của Hirdayesh Anuragi và cộng sự<br /> (2016) [4].<br /> <br /> 2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN<br /> CỨU<br /> 2 Mục tiêu nghiên cứu<br /> Giải trình tự gene matK của mười<br /> mẫu lá non mãng cầu dai đang trồng ở<br /> vùng núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh. Ứng<br /> dụng kỹ thuật dấu phân tử matK thuộc hệ<br /> gene lục lạp để xác định mối quan hệ di<br /> truyền giữa các loài Annona squamosa L.<br /> Bà Đen. Xây dựng cây phát sinh loài,<br /> phân định các nhóm loài Annona<br /> squamosa L. Bà Đen dựa trên trình tự<br /> gene matK và đặc điểm hình thái hoa.<br /> Nghiên cứu được thực hiện vào năm 2017<br /> 121<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN LANG<br /> <br /> Số 08/2018<br /> <br /> tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,<br /> Viện Pháp y Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> 2 2 Nội dung nghiên cứu<br /> Lấy mẫu lá non mãng cầu dai tại các<br /> xã Thạnh Tân, Tân Bình, Phước Bình,<br /> Phước Tân, Suối Đá thuộc khu vực chân<br /> núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh;<br /> Tách chiết và thu nhận DNA tổng số<br /> bằng phương pháp CTAB có hiệu chỉnh;<br /> Thiết kế và tổng hợp cặp mồi 2.1F và<br /> 5R dùng để khuếch đại vùng gene matK;<br /> Khuếch đại vùng gene matK bằng kỹ<br /> thuật PCR với cặp mồi 2.1F và 5R;<br /> Điện di trên gel argarose 1% để đánh<br /> giá sản phẩm PCR;<br /> So sánh trình tự gene matK với cơ sở<br /> dữ liệu GenBank bằng phần mềm trực<br /> tuyến Blastn để định danh loài mãng cầu<br /> dai vùng núi Bà đen là Annona squamosa<br /> L. Bà Đen;<br /> Thiết lập ma trận tỷ lệ tương đồng và<br /> xây dựng cây phát sinh loài của 10 mẫu<br /> <br /> Annona squamosa L. Bà Đen dựa trên trình<br /> tự gene matK và đặc điểm hình thái hoa;<br /> Phân định các nhóm loài Annona<br /> squamosa L. Bà Đen dựa trên trình tự gene<br /> matK và đặc điểm hình thái hoa.<br /> 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 3 Tách chiết DNA tổng số<br /> Các mẫu lá non mãng cầu thu thập sẽ<br /> được tách DNA tổng số bằng bộ kit CTAB<br /> (HiMedia Lab.). Sau đó, DNA tổng số sẽ<br /> được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di<br /> trên gel agarose 1%. Mẫu DNA đạt yêu cầu<br /> sẽ được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu<br /> (- 20 oC) cho các nghiên cứu về sau.<br /> 3 2 Khuếch đại vùng matK<br /> Cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene<br /> matK được thiết kế bằng phần mềm<br /> DNAMAN phiên bản 9 (Lennon<br /> Corporation, 2017) và được tổng hợp tại<br /> Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện<br /> Pháp y Thành phố Hồ Chí Minh (Bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng khuyếch đại vùng matK [8]<br /> <br /> Tm<br /> (oC)<br /> <br /> Trình tự mồi theo chiều 5’- 3’<br /> <br /> Tên<br /> 2.1F<br /> 5R<br /> <br /> CCTATCCATCTGGAAATCTTAG<br /> GTTCTAGCACAAGAAAGTCG<br /> <br /> 58,2<br /> 56,7<br /> <br /> Chiều<br /> phản ứng<br /> <br /> Chiều dài sản<br /> phẩm dự kiến<br /> (bp)<br /> <br /> Xuôi<br /> Ngược<br /> <br /> 800<br /> <br /> Thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại vùng<br /> gene matK sử dụng cặp mồi 2.1F và 5R (Bảng 2, 3).<br /> Bảng 2. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng gene matK [8]<br /> <br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> Thành phần<br /> Taq DNA pol 2x - preMix<br /> Mồi 2.1F (5μM)<br /> Mồi 5R (5μM)<br /> H2O<br /> DNA khuôn<br /> Tổng thể tích<br /> <br /> Thể tích (μl)<br /> 12,5<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 9,5<br /> Điều chỉnh<br /> 25,0<br /> 122<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN LANG<br /> <br /> Trƣơng Thế Quang<br /> <br /> Bảng 3. Chu kỳ nhiệt khuếch đại vùng gene matK [8]<br /> Giai đoạn<br /> Tiền biến tính<br /> Biến tính<br /> Bắt cặp<br /> Kéo dài<br /> Kết thúc<br /> <br /> Nhiệt độ (oC)<br /> 94<br /> 94<br /> 53<br /> 72<br /> 72<br /> <br /> Thời gian<br /> 3 phút<br /> 30 giây<br /> 40 giây<br /> 40 giây<br /> 5 phút<br /> <br /> Chu kỳ<br /> 1<br /> 30<br /> 30<br /> 30<br /> 1<br /> <br /> những tín hiệu không chính xác ở hai đầu<br /> trình tự và kiểm tra các sai lệch giữa hai kết<br /> quả giải trình tự.<br /> 3 6 So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank<br /> Sau khi hiệu chỉnh các sai lệch, trình tự<br /> liên ứng (Consensus Sequence) được rút ra<br /> từ hai kết quả giải trình tự và kiểm tra các<br /> sai lệch. Trình tự liên ứng là trình tự chính<br /> xác cho đoạn DNA khảo sát. Tuy nhiên, kết<br /> quả này cần được kiểm tra một lần nữa trên<br /> cơ sở dữ liệu nucleotide như GenBank<br /> bằng công cụ BLAST. Nếu có các sai lệch<br /> giữa trình tự trên cơ sở dữ liệu và trình tự<br /> truy vấn thì cần được xem xét và kiểm tra<br /> lần nữa để xác nhận kết quả giải trình tự.<br /> Ngoài ra, việc thực hiện BLAST còn giúp<br /> kiểm tra sự nhiễm mẫu và đánh giá quá<br /> trình thu nhận và bảo quản mẫu.<br /> 3 7 Xây dựng cây phát sinh loài<br /> Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần<br /> mềm DNAMAN phiên bản 9. Sắp hàng<br /> nhiều trình tự bằng thuật toán ClustalW<br /> (Feng - Doolittle and Thompson). Thiết lập<br /> ma trận tương đồng và ma trận khoảng<br /> cách theo mô hình Kimura (Kimura, 1980,<br /> J. Mol. Evol 16: 111-120). Phân tích<br /> bootstrap 10.000 lần cho giá trị độ tin cậy<br /> của cây phát sinh loài.<br /> Cây Phylogenetic được thiết lập từ ma<br /> trận khoảng cách theo thuật toán Neighbor<br /> - Joining (Saitou và Nei, 1987, Mol. Biol,<br /> Ecol.4: 406-425) [7].<br /> <br /> 3 3 Điện di sản phẩm PCR<br /> Mẫu sản phẩm PCR được bổ sung<br /> thuốc nhuộm ethidium bromide, dung dịch<br /> đệm loading buffer và cho chạy điện di trên<br /> gel agarose 1% với hiệu điện thế 120 V,<br /> thời gian từ 30 đến 60 phút. Quan sát các<br /> band DNA trên bàn đọc gel UV với bước<br /> sóng 365 nm.<br /> 3 4 Giải trình tự sản phẩm PCR<br /> Sản phẩm PCR sau khi thu nhận sẽ<br /> được gửi đi giải trình tự theo chiều xuôi và<br /> chiều ngược bằng hệ thống tự động 3130.<br /> Thể tích sản phẩm PCR dùng để giải trình<br /> tự là 10 μl. Cặp mồi 2.1F và 5R được sử<br /> dụng để giải trình tự. Mồi phải được pha<br /> trong nước cất hai lần khử ion, không có<br /> muối, EDTA hay bất kỳ nhiễm tạp khác.<br /> Nồng độ của mỗi mồi là 10 μM với thể tích<br /> tối thiểu là 5 μl cho mỗi mẫu giải trình tự.<br /> 3 5 Hiệu chỉnh trình tự<br /> Trình tự sau khi được xác định bằng hệ<br /> thống tự động 3130 chưa thể sử dụng ngay<br /> cho việc phân tích. Việc đọc base tự động<br /> do hệ thống thực hiện có một tỷ lệ sai sót<br /> nhất định tùy theo phương pháp và loại<br /> máy sử dụng. Sự sai sót này xảy ra bởi<br /> cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được<br /> không phải lúc nào cũng rõ ràng. Khoảng<br /> cách không đồng đều giữa các mũi tín hiệu<br /> cũng như sự chồng lắp các tín hiệu dẫn đến<br /> việc máy tính nhận và hiển thị sai kết quả.<br /> Hiệu chỉnh trình tự bằng cách loại bỏ<br /> 123<br /> <br />