Phát hiện đồng thời virus cúm A và Human Metapneumovirus (hMPV) trên mẫu phết ở họng mũi bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VIRUS CÚM A<br /> VÀ HUMAN METAPNEUMOVIRUS (hMPV)<br /> TRÊN MẪU PHẾT Ở HỌNG MŨI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR<br /> Nguyễn Đại Thức*, Dương Ngọc Anh Trang**, Nguyễn Ngọc Tấn**, Nguyễn Thu Ngọc***<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Virus cúm A và human Metapneumovirus (hMPV) là hai trong số các virus gây ra bệnh nhiễm<br /> trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến nhất. Bệnh do 2 loại virus này có triệu chứng tương tự nhau như ho, hắt<br /> hơi, sốt cao kéo dài, mệt mỏi, thường không gây nguy hiểm nhưng trong một số trường hợp phát hiện và điều trị<br /> muộn vẫn có thể gây tử vong ở người, như virus cúm A/H5. Chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục đích xây<br /> dựng quy trình chẩn đoán đồng thời hai loại virus nói trên trong cùng một phản ứng PCR.<br /> Phương pháp: Khảo sát hoạt động của primer trên phản ứng RT – PCR làm tiền đề xây dựng và tối ưu hóa<br /> quy trình multiplex RT - PCR phát hiện đồng thời virus cúm A và hMPV từ dịch phết họng mũi bệnh nhân.<br /> Khảo sát trên mẫu dịch phết họng mũi lâm sàng của bệnh nhân ghi ngờ nhiễm bệnh.<br /> Kết quả: Chọn được nhiệt độ bắt cặp tối ưu của hệ primer là 55oC; nồng độ tối ưu cả hệ primer lần lượt cho<br /> virus cúm A và hMPV là 0,48 µM và 0,56 µM. Sự đặc hiệu của hệ primer được khẳng định khi kết quả phản<br /> ứng PCR chỉ cho kết quả dương tính với RNA khuôn mẫu của hai virus nói trên trong khi âm tính với các virus<br /> cúm B, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV) cũng gây bệnh<br /> về đường hô hấp có các triệu chứng tương tự hai loại virus mục tiêu. Quy trình multiplex RT - PCR có độ đặc<br /> hiệu cao và độ nhạy đạt 0,002 pg/µl. Kết quả kiểm tra thực nghiệm trên 14 mẫu thu từ bệnh nhân cho thấy có 3<br /> mẫu phết họng-mũi cho kết quả dương tính với virus cúm A, 1 mẫu phết họng-mũi dương tính với virus hMPV,<br /> nhưng chưa phát hiện thấy mẫu đồng nhiễm cả hai loại virus.<br /> Kết luận: Đã xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời hai loại<br /> virus hô hấp đang lưu hành.<br /> Từ khóa: virus cúm A, human metapneumovirus (hMPV)<br /> ABSTRACT<br /> DETECTION INFLUENZA A VIRUS AND HUMAN PNEUMOVIRUS (hMPV)<br /> ON NASOPHARYNGEAL SPECIMEN BY USING MUTIPLEX RT-PCR<br /> Nguyen Dai Thuc,Duong Ngoc Anh Trang, Nguyen Ngoc Tan, Nguyen Thu Ngoc<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 251 – 258<br /> Background: Influenza A virus and human Metapneumovirus (hMPV) are two of the most common acute<br /> respiratory infections. Diseases caused by these two viruses have similar symptoms such as coughing, sneezing,<br /> prolonged high fever, fatigue, in most case, they do not cause serious illness but sometime ca cause death, such as<br /> influenza A/H5 virus. We carried out this project with the aim of building a concurrent diagnostic procedure for<br /> the two viruses mentioned in the same PCR reaction.<br /> Methods: Investigation of primers activity on RT-PCR reaction is a premise to build and optimize multiplex<br /> RT - PCR process to simultaneously detect influenza A virus and hMPV from patient's nasal throat swab.<br /> Experimental results on 14 samples from patients showed that 3 clinical specimens tested positive for influenza A<br /> virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected specimens were found.<br /> *Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Đại học Nông Lâm ***Viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Đại Thức ĐT: 0916347616 Email: nguyendaithuctb@gmail.com<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 251<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> Results: In order to determine the PCR conditions, the results showed that the optimal pairing temperature<br /> of the primer set was at 55°C; the optimal primers concentration of influenza A virus and hMPV were 0.48 µM<br /> and 0.56 µM, respectively. Specificity of the primer system was confirmed when the PCR results were positive for<br /> the RNA template of the two viruses while negative for the other viruses, which also causes respiratory illnesses<br /> with similar symptoms to the two target viruses, such as influenza B virus, Respiratory syncytial virus (RSV),<br /> Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV). The multiplex RT - PCR has high specificity and<br /> sensitivity at 0.002 pg/µl. Experimental results on 14 samples from patients showed that 3 clinical specimens<br /> tested positive for influenza A virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected<br /> specimens were found.<br /> Conclusion: Successfully developed and optimized multiplex RT-PCR process for simultaneous detection of<br /> two circulating respiratory viruses.<br /> Keywords: influenza A virus, human metapneumovirus (hMPV)<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ dịch phết họng - mũi nghi ngờ nhiễm virus cúm<br /> A và hMPV do bệnh viện Nhi Đồng 1 và Bệnh<br /> Virus cúm A và human Metapneumovirus<br /> viện Bệnh Nhiệt Đới gửi đến.<br /> (hMPV) là hai trong số các virus gây ra bệnh<br /> nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến Sử dụng đối chứng dương của virus cúm A<br /> nhất trên người(2,3). Virus cúm A dễ lây lan thành và hMPV và các mẫu đối chứng âm là các mẫu<br /> dịch nên sau khi thu mẫu từ bệnh nhân bị nghi dương tính Adeno virus, virus cúm B, RSV,<br /> ngờ nhiễm virus hô hấp, nếu cúm A dương tính Rhino virus, PIV 1, 2, 3 do Trung tâm cúm Quốc<br /> sẽ không kiểm tra tiếp virus hMPV. Như vậy sẽ gia cung cấp. Primer sử dụng có trình tự do Tổ<br /> bỏ sót các trường hợp mẫu đồng nhiễm cả hai chức Y tế Thế giới (WHO) công bố và tổng hợp<br /> loại virus này. Mặc dù phương pháp qRT - PCR bởi công ty Intergrated DNA Technology<br /> có khả năng phát hiện virus trong khoảng thời (IDT)(5,7).<br /> gian ngắn nhưng sinh phẩm hóa chất khá đắt Phương pháp nghiên cứu<br /> tiền và khó khăn trong việc thiết kế phản ứng Tách chiết RNA<br /> phát hiện đồng thời các virus trong cùng một Sử dụng kít QIAamp Viral RNA Mini của<br /> phản ứng, dẫn đến việc âm tính giả một trong hãng QIAGEN - Mỹ. Thực hiện tách chiết mẫu<br /> hai loại virus khi có sự đồng nhiễm. Từ những dịch phết họng, mũi theo hướng dẫn đính<br /> hạn chế trên “Phát hiện đồng thời virus cúm A kèm(5,6).<br /> và human Metapneumovirus (hMPV) trên mẫu<br /> Kiểm tra primer bằng phần mềm<br /> bệnh phẩm người bằng kỹ thuật multiplex RT-<br /> Sử dụng các phần mềm sinh tin học kiểm tra<br /> PCR” được thực hiện nhằm xây dựng kỹ thuật<br /> các thông số và đặc tính vật lý của các cặp<br /> multiplex RT-PCR trên nền tảng của kỹ thuật<br /> primer sử dụng (Bảng 1, 2).<br /> RT-PCR đơn để hỗ trợ công tác chẩn đoán và<br /> điều trị. Kiểm tra primer về mặt thực nghiệm: phản ứng<br /> Mục tiêu nghiên cứu RT-PCR đơn<br /> Tối ưu quy trình multiplex RT-PCR phát Thành phần phản ứng RT - PCR với tổng thể<br /> hiện đồng thời virus cúm A và hMPV từ dịch tích là 22,5 µl, trong đó: Nước không chứa<br /> phết họng-mũi bệnh nhân. RNase: 13,6 µl; RT - PCR Buffer 5X:5 µl; Primer F<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU và primer R: 2,4 µl; dNTPs: 0,5 µl ; Enzyme: 1 µl<br /> và RNA mẫu: 2,5 µl(4). Điện di sản phẩm RT-PCR<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> trên gel agarose 2% ở 150V- 50 phút, quan sát kết<br /> Nghiên cứu cắt ngang với phương pháp<br /> chọn mẫu thuận tiện được thực hiện trên 14 mẫu quả dưới tia UV trong máy chụp gel (UVP)(4,6).<br /> <br /> <br /> 252 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự primer phát hiện virus cúm A<br /> Tên primer Gen đích Trình tự Vị trí bắt cặp Sản phẩm PCR (bp)<br /> A/M30F 5’ - TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG - 3’ 18 - 37<br /> M1, M2<br /> A/M264R2 5’ - ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG - 3’ 230 - 249 232 bp<br /> A/M30F: primer xuôi A/M264R2: primer ngược (WHO - SOP 2008)<br /> Bảng 2. Trình tự primer phát hiện hMPV<br /> Tên primer Gen đích Trình tự Vị trí bắt cặp Sản phẩm PCR (bp)<br /> MPV/M1a 5’ - GGA GTC CTA CCT AGT AGA C - 3’ 3 - 21<br /> MPV/M2 M 5’ - GCA GCT TCA ACA GTA GCT G - 3’ 521 - 539 537 bp<br /> MPV/M1a: primer xuôi MPV/M2: primer ngược (WHO - SOP 2008)<br /> Khảo sát hoạt động của các primer đơn tích kết quả chọn nồng độ các primer tối ưu cho<br /> Thực hiện phản ứng RT - PCR đơn nhằm cả quá trình.<br /> kiểm tra sự hoạt động của các primer với RNA Khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer<br /> của hai mẫu đối chứng (+) đại diện cho hai cặp Nhằm kiểm tra sự bắt cặp đặc hiệu của hệ<br /> primer là virus cúm A và hMPV. Điện di sản primer khi khảo sát với các virus khác. Sử dụng<br /> phẩm RT – PCR. các virus cúm B, Adeno virus, RSV, Rhino virus,<br /> Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các primer đơn PIV 1, 2, 3 như là đối chứng âm.<br /> Bảng 3. Thí nghiệm về nhiệt độ bắt cặp trong phản Khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex<br /> ứng RT – PCR RT - PCR phát hiện virus cúm A và hMPV<br /> Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Trộn lẫn RNA tổng số của virus cúm A và<br /> Phản ứng phiên mã hMPV theo tỷ lệ 1:1, pha loãng thành các độ pha<br /> 50 30 phút 1<br /> ngược loãng cách nhau 10 lần, nồng độ RNA tổng số<br /> Hoạt hóa phản ứng<br /> PCR<br /> 94 15 phút 1<br /> ban đầu 10-1. Ghi nhận nồng độ RNA thấp nhất<br /> Biến tính 94 30 giây mà cả hai loại virus vẫn cho kết quả dương tính.<br /> Bắt cặp 50, 53, 55, 57, 60 30 giây<br /> Kéo dài 72 1 phút 40 KẾT QUẢ<br /> Hậu kéo dài 72 10 phút 1 Kiểm tra sự phù hợp của các primer trên phần<br /> Khảo sát hoạt động của hệ primer mềm sinh tin học<br /> Tiến hành phản ứng multiplex RT - PCR với Kết quả khảo sát các điều kiện của phản ứng<br /> mẫu RNA đối chứng dương (theo tỷ lệ 1:1). Điện multiplex RT - PCR Kết quả khảo sát khả năng<br /> di sản phẩm RT - PCR nhằm kiểm tra kích thước hoạt động của các primer đơn (Bảng 4).<br /> vạch sẵn. Sản phẩm RT - PCR đơn cho thấy ở cả hai<br /> Khảo sát nồng độ hệ primer giếng chứa RNA virus A và hMPV xuất hiện<br /> vạch kích thước như dự đoán, lần lượt là: 232 bp<br /> Khảo sát nồng độ từ 0,36 µM đến 0,56 µM.<br /> và 537 bp, không xuất hiện vạch sản phẩm phụ<br /> Thu sản phẩm RT - PCR, tiến hành điện di, phân<br /> (Hình 1).<br /> Bảng 4. Các đặc tính của hệ primer<br /> ΔG Hairpin ΔG Seft ΔG Hetero - Dimer (kcal/ mole)<br /> Oligonucleotide % GC Tm (oC) (kcal/mole) Dimer (kcal/mole) A/ M30F A/ M264R2 MPV/M1a MPV/ M2<br /> A/ M30F 50 54,5 -1,3 -6,76 - -4,95 -6,01 -3,52<br /> A/ M264R2 55 58,1 -3,97 -10,24 -4,95 - -6,82 -9,83<br /> MPV/ M1a 52,6 52,6 -1,04 -4,64 -6,01 -6,82 - -3,9<br /> MPV/ M2 52,6 53,9 -2,98 -8,29 -3,52 -9,83 -3,9 -<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 253<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các<br /> 1 2 3 4 M<br /> primer đơn<br /> Khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp<br /> 537 bp primer trên dãy nhiệt độ 50-60oC. Chọn được<br /> 500 bp nhiệt độ 55oC cho vạch sản phẩm có cường độ<br /> 232 bp<br /> sáng, rõ, không có vạch sản phẩm phụ ở cả hai<br /> 200 bp<br /> loại virus (Hình 2).<br /> Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của hệ primer<br /> Phản ứng multiplex RT - PCR sử dụng đồng<br /> thời hai cặp primer với mẫu RNA của hai loại<br /> virus trộn theo tỷ lệ 1:1. Kết quả điện di cho kích<br /> Hình 1. Kết quả điện di RT - PCR đơn. thước sản phẩm ở giếng chứa mẫu trộn lẫn virus<br /> cúm A và hMPV xuất hiên đồng thời 2 vạch sản<br /> (1)-(2) đối chứng âm của virus cúm A, hMPV;<br /> (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A,hMPV; phẩm và có kích thước tương tự mẫu RNA từng<br /> (M) thang chuẩn 100 bp loại virus (Hình 3).<br /> <br /> Virus cúm A hMPV<br /> <br /> M<br /> (oC)<br /> 50 53 55 57 60 50 53 55 57 60<br /> <br /> 500 bp 537 bp<br /> <br /> 232 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các primer. (M) thang chuẩn 100 bp;(-) đối chứng âm RT-PCR<br /> <br /> 1 2 3 4 5 M<br /> <br /> <br /> <br /> 537 bp<br /> 500 bp<br /> 232 bp<br /> 200 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di multiplex RT – PCR<br /> (1)-(2) đối chứng âm; (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A, hMPV; (5) multiplex RT-PCR; (M) thang chuẩn 100 bp.<br /> <br /> <br /> <br /> 254 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Kết quả khảo sát nồng độ của hệ primer<br /> Bảng 5. Các giá trị nồng độ hệ primer (µM)<br /> Primer Nồng độ primer (µM)<br /> Virus cúm A 0,36 0,36 0,36 0,48 0,48 0,48 0,56 0,56 0,56<br /> hMPV 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56<br /> <br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (-) M<br /> <br /> <br /> <br /> 537 bp 500 bp<br /> <br /> 232 bp 200 bp<br /> <br /> 11<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di khảo sát nồng độ primer<br /> Từ (1) đến (9) multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA tách chiết từ hai virus cúm A và hMVP có nồng độ hệ primer thay<br /> đổi; (-): đối chứng âm multiplex RT - PCR; (M): thang chuẩn 100 bp<br /> Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer<br /> M 1 2 3 4 5 6 7 8<br /> <br /> <br /> 537<br /> bp<br /> 400<br /> bp<br /> 232<br /> bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Kết quả điện di khảo sát độ đặc hiệu.<br /> (1): multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA virus cúm A và hMPV; (2) đối chứng âm của multiplex RT - PCR;<br /> (3)-(9) multiplex RT - PCR với các RNA các virus khác; (M): thang chuẩn 100 bp<br /> Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng<br /> <br /> 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9<br /> (- )<br /> <br /> <br /> 537 500<br /> <br /> 232 200<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Kết quả điện di khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng theo nồng độ RNA giảm dần<br /> Các giếng chứa RNA tách chiết từ hai nguồn RNA từ virus cúm A và hMPV theo nồng độ mẫu giảm dần; (-) đối chứng;<br /> (M) thang chuẩn 100 bp<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 255<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> <br /> Pha loãng bậc 10 liên tiếp thành nhiều nồng multiplex RT - PCR trên 14 mẫu phết họng-<br /> độ khác nhau. Nồng độ đối chứng dương ban mũi, tiến hành thực hiện phản ứng qRT - PCR.<br /> -1 Kết quả trình bày ở Hình 8 và Bảng 6 cho virus<br /> đầu là 10 pha loãng 10 lần cho đến nồng độ<br /> -10 cúm A.<br /> cuối cùng là 10 (Hình 6).<br /> Kết quả phản ứng chẩn đoán phát hiện virus<br /> Kết quả khảo sát trên các mẫu phết họng - mũi cúm A và hMPV trên 14 mẫu phết họng-mũi này<br /> Kiểm tra trên 14 mẫu dịch phết họng-mũi, là chính xác và quy trình multiplex RT-PCR phát<br /> thu được kết quả: 3 mẫu dương tính với virus hiện đồng thời virus cúm A và hMPV đã được<br /> cúm A (chiếm 21,4%), 1 mẫu dương tính với thiết kế và tối ưu thành công các điều kiện của<br /> hMPV (chiếm 7,14%) và chưa phát hiện mẫu phản ứng multiplex RT-PCR và các kết quả xét<br /> đồng nhiễm (Hình 7). nghiệm là tin cậy.<br /> Kết quả phản ứng qRT - PCR trên mẫu phết<br /> họng-mũ<br /> Để khẳng định kết quả của phản ứng<br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M<br /> <br /> <br /> <br /> 537 bp<br /> 500 bp<br /> 232 bp<br /> 200 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7. Kết quả điện di khảo sát các mẫu phết họng-mũi<br /> (-) đối chứng âm; (1)-(14) mẫu phết họng-mũi; (15) đối chứng dương; (M) thang chuẩn 100 bp<br /> Bảng 6. So sánh kết quả phản ứng multiplex RT - PCR và qRT - PCR<br /> Mẫu Virus cúm A hMPV<br /> Mutiplex RT – PCR (Ct) qRT - PCR Mutiplex RT – PCR (Ct) qRT - PCR<br /> Đối chứng âm - - - -<br /> Đối chứng dương 30,82 + 29,00 +<br /> 1 - - - -<br /> 2 - - - -<br /> 3 - - - -<br /> 4 - - - -<br /> 5 - - - -<br /> 6 29,67 + - -<br /> 7 - - - -<br /> 8 - - - -<br /> 9 - - - -<br /> 10 36,84 + - -<br /> 11 - - 31,45 +<br /> 12 - - - -<br /> 13 - - - -<br /> 14 33,57 + - -<br /> (-): âm tính; (+): dương tính<br /> <br /> <br /> 256 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chứng dương<br /> virus cúm A<br /> <br /> <br /> <br /> Chứng dương<br /> hMPV<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 8. Đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang chẩn đoán virus cúm A và hMPV<br /> BÀN LUẬN tương tự khi trộn lẫn RNA tách chiết từ 2 nguồn<br /> virus (Hình 1, 3).<br /> Đánh giá khả năng hoạt động của hệ primer<br /> bằng phần mềm sinh tin học Cả hai cặp primer đều có biên độ nhiệt<br /> hoạt động khá rộng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ<br /> Cả hai cặp primer trên đều đạt yêu cầu về o<br /> chiều dài. Nhiệt độ biến tính của hai cặp primer 55 C cho vạch sản phẩm có cường độ sáng và<br /> chênh lệch trong giới hạn cho phép, đảm bảo rõ nhất; ở các nhiệt độ cao hơn, kết quả không<br /> cho sự nhân bản của primer thành công trong có sự thay đổi. nhiệt độ bắt cặp tối ưu của hai<br /> o<br /> cùng một điều kiện nhiệt độ. Thành phần % GC, cặp primer là 55 C.<br /> đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Sự Chọn được nồng độ primer virus cúm A và<br /> hình thành cấu trúc thứ cấp, ∆G của các cấu trúc hMPV, lần lượt là 0,48 µM - 0,56 µM cho vạch<br /> thứ cấp ở mức cho phép. Vì vậy, trên phương sản phẩm đậm, rõ nét và không tạo sản phẩm<br /> diện lý thuyết, hai cặp primer được sử dụng để phụ (Hình 4).<br /> phát hiện hai loài virus trên có thể nhân bản<br /> Cặp primer trong nghiên cứu này có độ đặc<br /> đúng trình tự đích và có độ đặc hiệu cao, tuy có<br /> hiệu cao: không cho vạch sản phẩm chứng tỏ hệ<br /> tạo thành cấu trúc thứ cấp nhưng giá trị ∆G của<br /> primer bắt cặp đặc hiệu, không cho kết quả<br /> các cấu trúc thứ cấp giữa các primer dao động<br /> dương tính với các loại virus khác (Hình 5).<br /> không đáng kể. Do đó, hai cặp primer trên có thể<br /> Pha loãng nồng độ RNA để xác định độ<br /> trộn chung trong một phản ứng multiplex RT –<br /> nhạy: Phản ứng multiplex RT – PCR cho vạch<br /> PCR (Bảng 4).<br /> sản phẩm khi nồng độ RNA mẫu là 10-7. Đo<br /> Đánh giá về mặt thực nghiệm<br /> Kết quả điện di khảo sát hoạt động các hàm lượng mẫu RNA ở nồng độ 10-1 đạt 2<br /> primer tạo sản phẩm RT-PCR: 232 bp ứng với ng/µl. Như vậy ngưỡng phát hiện của phản ứng<br /> virus cúm A và 537 bp ứng với hMPV, các vạch multiplex RT - PCR nàylà 0,002 pg/µl (Hình 6).<br /> sản phẩm đều là duy nhất, không xuất hiện vạch KẾTLUẬN<br /> sản phẩm phụ và tạo sản phẩm có kích thước Các thông số và đặc tính vật lý của hệ primer<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 257<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> thỏa mãn các yêu cầu trên phương diện bằng TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> phần mềm sinh tin học và hoạt động tốt khi 1. Bellau-Pujol S, Vabret A, Legrand L, et al (2005). Development<br /> khảo sát trên mẫu đối chứng dương. of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12<br /> respiratory RNA viruses. J Virol Methods, 126(1-2):53-63.<br /> Xây dựng được quy trình multiplex RT- 2. Bouvier NM and Palese P (2008). The Biology of Influenza<br /> PCR phát hiện đồng thời hai loại virus hiện Viruses. Vaccine, 26(4):D49 - D53.<br /> 3. Đặng Đức Anh, Phan Thị Ngà và Vũ Thị Quế Hương (2010).<br /> đang lưu hành, ngưỡng phát hiện của phản Virus y học. Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, pp.28 - 45.<br /> ứng là 0,002 pg/µl. 4. Lê Duy Thành (2009). Cơ sở sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo<br /> dục TP. Hồ Chí Minh, pp.134 - 153.<br /> Trên 14 dịch phết họng mũi lâm sàng, đã 5. QIAGEN (2010). QIAamp Viral RNA Mini Handbook,<br /> phát hiện 3/14 mẫu dương tính với virus cúm A rd<br /> 3 edition. URL: HB-0354-<br /> (chiếm 21,4%), 1/14 mẫu dương tính với hMPV 004_1112868_HB_QA_Viral_RNA_Mini_0318_WW.PDF.<br /> (chiếm 7,14%) và chưa phát hiện mẫu đồng 6. QIAGEN (2010). QIAGEN Onestep RT-PCR Kit Handbook.<br /> URL: HB-0660-002%201101184_LL_RT-<br /> nhiễm với hai loại virus nói trên. Các mẫu PCR_OneStep_RTPCR_0316_WW_WEB.pdf.<br /> dương tính ở phản ứng này được kiểm tra bằng 7. WHO (2017). Influenza. URL: https://www.who.int/influenza/.<br /> kỹ thuật qRT - PCR và cho thấy 100% kết quả là<br /> phù hợp. Ngày nhận bài báo: 30/07/2019<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/08/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 10/10/2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 258 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br />