Phát hiện đột biến gen BRCA1 trên phụ nữ Việt Nam thuộc nhóm nguy cơ cao bị ung thư vú

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 TRÊN PHỤ NỮ VIỆT NAM THUỘC NHÓM NGUY CƠ CAO BỊ<br /> UNG THƯ VÚ<br /> Hoàng Anh Vũ*, Lê Phương Thảo*, Phan Thị Xinh*, Đoàn Thị Phương Thảo*,<br /> Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Đột biến gen BRCA1 ñã ñược khẳng ñịnh là yếu tố nguy cơ ung thư vú. Nghiên cứu này nhằm phát<br /> hiện ñột biến gen BRCA1 trên bệnh nhân Việt Nam bị ung thư vú và người chưa phát bệnh thuộc nhóm nguy cơ cao<br /> bị ung thư vú.<br /> Đối tượng, phương pháp: Chúng tôi giải trình tự chuỗi DNA toàn bộ vùng mã hóa của gen BRCA1 cho 50<br /> trường hợp bao gồm 26 bệnh nhân (khởi phát ung thư vú trước 40 tuổi hoặc có ít nhất một người quan hệ bậc I cũng<br /> bị ung thư vú và 24 người chưa phát hiện bệnh thuộc 2 gia ñình ung thư vú.<br /> Kết quả: Có tất cả 18 kiểu thay ñổi của gen BRCA1 ñược phát hiện trong nghiên cứu này, với 2 kiểu ñột biến ñã<br /> ñược chứng minh gây ung thư vú là R1751X và 1792X gặp trên 10 người (20%) ñều thuộc gia ñình có nhiều người<br /> ung thư vú. Các kiểu ñột biến chưa rõ chức năng gồm có Glu143Lys, Glu149Ala, Tyr856His và Val1247Ile gặp trên<br /> 5 bệnh nhân khác, trong ñó ñột biến Glu149Ala trên exon 8 là ñột biến lần ñầu tiên ñược phát hiện và chưa ñược<br /> báo cáo trong cơ sở dữ liệu của BIC. Đột biến Tyr856His gặp trên 3 người trong cùng một gia ñình, trong khi ñó ñột<br /> biến 1792X ñược phát hiện trên 9 trong tổng số 24 người thuộc một gia ñình khác.<br /> Kết luận: Đột biến gen BRCA1 ñóng vai trò quan trọng gây ung thư vú gia ñình ở Việt Nam. Khảo sát ñột biến<br /> gen BRCA1 nên ñược thực hiện cho những người ung thư vú sớm và có yếu tố gia ñình.<br /> Từ khóa: Đột biến gen BRCA1, ung thư vú.<br /> ABSTRACT<br /> DETECTION OF BRCA1 MUTATIONS IN VIETNAMESE WOMEN<br /> AT HIGH RISK FOR BREAST CANCER<br /> Hoang Anh Vu, Le Phuong Thao, Phan Thi Xinh, Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha,<br /> Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh – Vol.14 - Supplement of No 4 – 2010: 674 - 681<br /> Purpose: It is well established that mutations in BRCA1 gene significantly increase the risk of breast cancer.<br /> This study was conducted to determine BRCA1 mutations in Vietnamese patients and relatives at high-risk for breast<br /> cancer.<br /> Materials and methods: The whole coding region of BRCA1 were sequenced in 50 individuals including 26<br /> patients with early-onset disease (diagnosed with breast cancer before 40 years old) or with family history, and 24<br /> predictive cases from 2 high risk families who did not have breast cancer.<br /> Results: Here we report a total of 18 BRCA1 sequence alterations, of which two are deleterious mutations<br /> (R1751X and 1792X) found in 10 individuals (20%) from families with multiple breast cancer. Mutations of<br /> uncertain significance such as Glu143Lys, Glu149Ala, Tyr856His, and Val1247Ile were detected in 5 patients, of<br /> which the Glu149Ala in exon 8 has not been reported previously in BIC database. The Tyr856His mutation was<br /> present in 3 individuals from one family, while the 1792X mutation in 9 of 23 individuals tested from another family.<br /> Conclusion: This study confirmed the relevance of BRCA1 mutations in Vietnamese patients with breast cancer.<br /> Women with early-onset and familial breast cancer are candidates for detection of BRCA1 mutations.<br /> Key words: BRCA1 mutations, breast cancer.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trên thế giới, ung thư vú là loại ung thư thường<br /> gặp nhất ở phụ nữ, với nguy cơ trọn ñời khoảng 10%(9)<br /> và ước tính có trên 1 triệu trường hợp mới ñược chẩn<br /> ñoán hằng năm(4,12). Tần suất ung thư vú ñang có<br /> khuynh hướng gia tăng hằng năm ở cả các nước phát<br /> <br /> triển cũng như các nước ñang phát triển. Tại Việt Nam,<br /> tần suất ung thư vú là 12,2/100.000 tại TPHCM và<br /> 26,7/100.000 tại Hà Nội(2). Đây là hai ñịa phương có tỷ<br /> lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất nước, trong ñó hầu<br /> hết là những trường hợp ngẫu nhiên. Tuy nhiên, khoảng<br /> 5% trường hợp ung thư vú có mang yếu tố tiền ñịnh<br /> ung thư di truyền, chủ yếu là do các ñột biến mầm của<br /> <br /> *<br /> <br /> Đại học Y Dược TPHCM<br /> Địa chỉ liên lạc: BS. Hoàng Anh Vũ. Email: hoangvuxinh@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên ñề Ung Bướu<br /> <br /> 674<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br /> <br /> một số gen mẫn cảm ung thư. Đột biến gen BRCA1 là<br /> rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường hay<br /> gặp nhất trong ung thư vú, chiếm 45% những gia ñình<br /> ung thư vú di truyền, với nguy cơ trọn ñời ñối với<br /> người mang gen ñột biến lên ñến 80%(9). Đối với phụ<br /> nữ có ñột biến làm tăng nguy cơ, các biện pháp có thể<br /> thực hiện bao gồm tăng cường tầm soát phát hiện sớm,<br /> hóa trị liệu dự phòng và phẫu thuật dự phòng.<br /> Có nhiều kỹ thuật dùng ñể phát hiện ñột biến<br /> BRCA1, như SSCP (single strand conformation<br /> polymorphism), TPP (protein truncation test), HD<br /> (heteroduplex analysis), DGGE (denaturing gradient<br /> gel electrophoresis), DHPLC (denaturing highperformance liquid chromatography) và giải trình tự<br /> chuỗi DNA. Đây ñều là những kỹ thuật tốn kém và mất<br /> nhiều thời gian thực hiện vì BRCA1 là một gen chứa<br /> nhiều exon lớn. Giải trình tự chuỗi DNA ñược coi là<br /> tiêu chuẩn vàng ñể chẩn ñoán ñột biến BRCA1 vì kỹ<br /> thuật này có thể phát hiện ñược tất cả các thay ñổi nhỏ<br /> của trình tự chuỗi DNA(1).<br /> Trong một thời gian dài bệnh ung thư vú tại Việt<br /> Nam chủ yếu ñược nghiên cứu ở góc ñộ hình thái học<br /> thuộc nhóm tiên lượng kinh ñiển như kích thước, tình<br /> trạng di căn hạch nách, loại mô học, ñộ mô học. Tại<br /> Việt Nam chưa có nghiên cứu nào khảo sát ñột biến<br /> BRCA1 trên bệnh nhân ung thư vú cũng như những<br /> người có nguy cao bị ung thư này dựa vào yếu tố gia<br /> ñình. Việc xác ñịnh ñược ñột biến của BRCA1 sẽ giúp<br /> có kế hoạch phòng ngừa ung thư vú hiệu quả trên<br /> những nhóm người có nguy cơ cao.<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác lập và ứng<br /> dụng ñược quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA<br /> toàn bộ vùng mã hóa của BRCA1 ñể chẩn ñoán và ñịnh<br /> danh các loại ñột biến gặp ở bệnh nhân cũng như<br /> những người có nguy cơ cao bị ung thư vú tại Việt<br /> Nam.<br /> ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu ñược tiến hành<br /> tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong năm<br /> 2009 và 2010. Đối tượng nghiên cứu là phụ nữ Việt<br /> Nam có một trong những yếu tố sau ñây: 1) bản thân bị<br /> ung thư vú trước 40 tuổi; 2) có ít nhất 01 người quan hệ<br /> bậc I (mẹ ruột, con gái ruột, chị em gái ruột) bị ung thư<br /> vú trước 40 tuổi; 3) có ít nhất 01 người quan hệ bậc I<br /> hoặc quan hệ bậc II (bà nội/ngoại ruột, cô/dì ruột, cháu<br /> gái ruột) bị ung thư vú 2 bên hoặc ung thư vú kèm ung<br /> thư buồng trứng; 4) có từ 02 người quan hệ bậc I hoặc<br /> quan hệ bậc II bị ung thư vú và/hoặc ung thư buồng<br /> trứng (không cần tính tuổi khởi phát và 5) có từ 01<br /> người nam quan hệ bậc I (cha ruột, con trai ruột, anh<br /> em trai ruột) hoặc quan hệ bậc II (ông nội/ngoại ruột,<br /> chú/bác trai ruột, cháu trai ruột) bị ung thư vú. Người<br /> <br /> Chuyên ñề Ung Bướu<br /> <br /> tham gia nghiên cứu có giấy ñồng ý tham gia tự<br /> nguyện.<br /> Tách chiết genomic DNA: Chúng tôi dùng<br /> QIAamp DNA Kit (Qiagen, Hoa Kỳ) ñể tách chiết<br /> genomic DNA từ máu ngoại vi theo hướng dẫn của nhà<br /> sản xuất.<br /> Thiết kế mồi cho PCR và sequencing: Toàn bộ các<br /> ñoạn mồi ñược thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa<br /> trên trình tự chuẩn của BRCA1 mang accession number<br /> NG005905 trong GenBank. Thông tin về các ñoạn mồi<br /> sẽ ñược cung cấp nếu ñộc giả có yêu cầu.<br /> Thực hiện PCR: Trong mỗi tube PCR có tổng thể<br /> tích 50 µL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP<br /> (250 µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5<br /> µM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase<br /> (1,25 unit) và 20 ng genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt<br /> ñược thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700<br /> (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) bao gồm giai ñoạn biến<br /> tính ban ñầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu<br /> kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 580C<br /> hoặc 600C (tùy nhiệt ñộ bắt cặp mồi) trong 15 giây,<br /> tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 1 – 3 phút (tùy chiều<br /> dài sản phẩm PCR) và kết thúc bằng giai ñoạn kéo dài<br /> sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR ñược<br /> phát hiện bằng ñiện di trên thạch agarose 1,2% có<br /> nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel<br /> Pringraph (Atto, Nhật Bản). Sản phẩm PCR ñược tinh<br /> sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và ñược kiểm<br /> tra lại bằng ñiện di trên thạch agarose 1,2%.<br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA: Sản phẩm<br /> PCR ñã ñược tinh sạch sẽ ñược thực hiện phản ứng<br /> cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied<br /> Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon.<br /> Sản phẩm sau ñó ñược kết tủa bằng ethanol, hòa tan<br /> trong Hi-Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút<br /> trước khi làm lạnh ñột ngột. Trình tự DNA ñược ñọc<br /> bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7<br /> polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Hoa<br /> Kỳ). Kết quả ñược phân tích bằng phần mềm<br /> SeqScape. Số thứ tự của các nucleotide ñược tính theo<br /> chuỗi cDNA bình thường của BRCA1 với accession<br /> number U14860 trong GenBank.<br /> KẾT QUẢ<br /> Chúng tôi dùng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA<br /> ñể khảo sát ñột biến gen BRCA1 cho 50 phụ nữ thuộc<br /> nhóm nguy cơ cao bị ung thư vú, trong ñó có 26 bệnh<br /> nhân và 24 người chưa bị bệnh. Trong số 26 bệnh nhân<br /> có 15 bệnh nhân khởi phát sớm trước 40 tuổi không<br /> kèm yếu tố gia ñình, 5 bệnh nhân khởi phát sớm và có<br /> kèm thêm yếu tố gia ñình, 6 bệnh nhân có yếu tố gia<br /> ñình nhưng phát hiện ung thư vú sau 40 tuổi.<br /> <br /> 675<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br /> <br /> Điều kiện PCR ñã ñược xác lập ñể khuếch ñại 24<br /> exon của gen BRCA1 bằng 15 phản ứng (H.1). Các<br /> exon 4, 8, 13, 16, 17 và 20 ñược khuếch ñại riêng biệt,<br /> trong khi các exon 1 – 3, 5 – 7, 9 – 10, 14 – 15, 18 –<br /> 19, 21 – 22 và 23 – 24 ñược khuếch ñại chung. Riêng<br /> <br /> exon 11 rất dài, phần ñầu ñược khuếch ñại riêng, phần<br /> sau ñược khuếch ñại cùng với exon 12. Các phản ứng<br /> PCR cho băng ñặc hiệu tương ứng với các sản phẩm có<br /> kích thước từ 294 bp ñến 2640 bp.<br /> <br /> A<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> PC R 1<br /> <br /> 5<br /> <br /> PC R 2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> PC R 3<br /> <br /> 9<br /> <br /> PC R 4<br /> <br /> 10<br /> PC R 5<br /> <br /> 11<br /> <br /> 12<br /> <br /> P CR 6<br /> P CR 7<br /> <br /> 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> P CR 8<br /> <br /> 18<br /> <br /> 15<br /> <br /> 16<br /> <br /> PC R 9<br /> <br /> 19<br /> <br /> PC R 10<br /> <br /> 20<br /> <br /> P CR 1 2<br /> <br /> 17<br /> PC R 1 1<br /> <br /> 21<br /> <br /> P CR 1 3<br /> <br /> 22<br /> <br /> P CR 1 4<br /> <br /> 23<br /> <br /> 24<br /> <br /> PC R 1 5<br /> <br /> B<br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10 11 12 13 14 15<br /> <br /> 2000<br /> 1000<br /> <br /> 100<br /> Hình 1. Khuếch ñại toàn bộ vùng mã hóa của gen BRCA1 bằng PCR. (A) Vị trí các ñoạn mồi sử dụng trong 15 phản<br /> ứng. Exon ñược biểu hiện bằng các hình hộp chữ nhật, intron là những ñoạn thẳng xen giữa (B) Hình ảnh minh họa<br /> kết quả ñiện di các sản phẩm PCR. M: 1 Kb Plus marker.<br /> Kết quả giải trình tự chuỗi DNA phát hiện 18 kiểu thay ñổi của BRCA1 trên cả exon và intron (H.2). Trong ñó 2<br /> ñột biến có ý nghĩa lâm sàng ñã ñược báo cáo trong cơ sở dữ liệu BIC (Breast Cancer Information Core:<br /> http://research.nhgri.nih.gov/bic/) là Arg1751X và 1792X. Đột biến vô nghĩa thay arginine tại codon 1751 bằng 1 mã<br /> dừng sớm (Arg1751X) gặp trên bệnh nhân BC-17, là một trường hợp bị ung thư vú trước 40 tuổi có bà ngoại và cô<br /> ruột cũng bị ung thư vú (H.3A). Đột biến có ý nghĩa lâm sàng thứ hai làm lệch khung ñọc ñể tạo mã dừng sớm tại<br /> codon 1792 gặp trên 2 bệnh nhân là chị em ruột, cùng khởi phát trước 40 tuổi (BC-20 và BC-21). Bản chất của ñột<br /> biến này là sự mất ñi của 1 nucleotide (cytosine) tại codon 1779 làm lệch khung ñọc với sự tạo thành 13 acid amin lạ<br /> và một mã dừng sớm tại vị trí 1792 (H.3B). Khảo sát ñột biến trên 22 thành viên chưa phát hiện ung thư của gia ñình<br /> này chúng tôi phát hiện thêm 7 trường hợp có mang cùng ñột biến 1792X, trong ñó có 2 chị em song sinh (H.3C).<br /> Một trong 2 người này (BC-46) vừa ñược phát hiện có khối u ở vú phải.<br /> <br /> Chuyên ñề Ung Bướu<br /> <br /> 676<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thay ñổi intron<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Đột biến nhầm nghĩa<br /> <br /> Lys38 Lys<br /> <br /> Glu143Lys<br /> <br /> IVS7+36delCTT<br /> <br /> Glu149Ala<br /> IVS8-58delT<br /> Ser265Ser<br /> Ser694Ser<br /> Leu771Leu<br /> Pro871Leu<br /> Glu1038Gly<br /> Lys1183Arg<br /> Ser1436Ser<br /> <br /> Ser1613Gly<br /> <br /> IVS18+66G>A<br /> <br /> Đột biến mã dừng sớm<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> <br /> 11<br /> Tyr856His<br /> Val1247Ile<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> 16<br /> 17<br /> 18<br /> 19<br /> 20<br /> 21<br /> 22<br /> 23<br /> 24<br /> <br /> Arg1751X<br /> Stop 1792<br /> <br /> Hình 2. Vị trí phân bố các thay ñổi của gen BRCA1 ñược tìm thấy trong nghiên cứu. Các exon ñược ñánh số thứ tự<br /> từ 1 – 24, vùng xen kẽ tượng trưng cho intron (IVS: intervening sequence).<br /> <br /> Chuyên ñề Ung Bướu<br /> <br /> 677<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br /> <br /> Có 4 kiểu ñột biến chưa rõ ý nghĩa lâm sàng ñược phát hiện: Glu143Lys, Glu149Ala, Tyr856His<br /> và Val1247Ile. Đột biến Glu149Ala do thay thế adenine bằng cytosine tại codon 149 của exon 8 (Hình<br /> 5A), là ñột biến chưa ñược báo cáo trong cơ sở dữ liệu BIC. Đột biến Glu149Ala và ñột biến<br /> Val1247Ile cùng ñược phát hiện trên bệnh nhân BC-13, là bệnh nhân có tuổi khởi phát rất sớm (27<br /> tuổi). Đột biến Tyr856His ñược phát hiện trên 3 người: Bệnh nhân BC-25 (có mẹ và dì ruột cũng bị<br /> ung thư vú) và 2 người khác chưa phát bệnh trong gia ñình này (BC-26: Con của dì bệnh nhân BC-25<br /> và BC-27: Con gái bệnh nhân BC-25). Đột biến Glu143Lys gặp trên 1 bệnh nhân khởi phát sớm<br /> nhưng không có bệnh sử gia ñình ung thư vú.<br /> A<br /> Bình thường<br /> <br /> Đột biến<br /> <br /> B<br /> Bình thường<br /> <br /> Đột biến<br /> <br /> C<br /> <br /> 30<br /> <br /> 32<br /> <br /> 46 33 29<br /> <br /> 20<br /> <br /> 38 43 49 36 37 34 35<br /> <br /> 41<br /> <br /> 21<br /> <br /> 31<br /> 39 42 48<br /> <br /> 44<br /> <br /> 45 47<br /> <br /> 50<br /> <br /> Hình 3. Các ñột biến có ý nghĩa lâm sàng của BRCA1 phát hiện trong nghiên cứu. (A) Mất cytosine<br /> tại codon 1779 gây ra lệch khung ñọc và tạo mã kết thúc tại codon 1792. (B) Đột biến vô nghĩa thay<br /> thế Arginine tại codon 1751 bằng mã kết thúc sớm TGA. (C) Phân tích tính di truyền của ñột biến<br /> 1792X. Các khung có ñánh số chỉ những người ñã ñược khảo sát ñột biến (khung vuông: Nam, hình<br /> tròn: Nữ, tô ñen: Có ñột biến). Mũi tên liền nét chỉ 2 bệnh nhân, mũi tên dứt nét chỉ bệnh nhân mới<br /> xuất hiện khối u trong thời gian ñang tiến hành nghiên cứu.<br /> Ngoài các ñột biến trên, chúng tôi phát hiện 9 kiểu biến ñổi trong vùng exon và 3 kiểu biến ñổi<br /> trên intron. Đây là những thay ñổi ñược coi như vô hại ñối với một số chủng tộc nhất ñịnh. Các biến<br /> ñổi làm thay ñổi acid amin gồm có Pro871Leu, Glu1038Gly, Lys1183Arg và Ser1613Gly. Các biến<br /> ñổi vùng exon nhưng không thay ñổi acid amin là c.114G > A (Lys38Lys), c.795T > C (Ser265Ser),<br /> c.2082C > T (Ser694Ser), c.2311T > C (Leu771Leu) và c.4308T > C (Ser1436Ser). Thay ñổi trên<br /> intron xảy ra ở 3 vùng: Mất CTT trong intron 7 (IVS7+36delCTT), mất thymidine trong intron 8<br /> (IVS8-58delT) và thay thế guanine bằng adenine trong intron 18 (IVS18 + 66G > A).<br /> BÀN LUẬN<br /> Mặc dù giải trình tự chuỗi DNA ñược coi là tiêu chuẩn vàng ñể chẩn ñoán ñột biến BRCA1, các<br /> nghiên cứu trước ñây phải dùng hơn 40 cặp mồi ñể khuếch ñại ñược toàn bộ các exon và vùng intron<br /> lân cận(11,17). Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế 15 cặp mồi ñể khuếch ñại toàn bộ 24 exon và<br /> vùng intron lân cận. Thành công trong bước ñơn giản hóa quy trình khuếch ñại toàn bộ vùng mã hóa<br /> <br /> Chuyên ñề Ung Bướu<br /> <br /> 678<br /> <br />