intTypePromotion=1
ADSENSE

Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker

Chia sẻ: ViBandar2711 ViBandar2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

18
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Mục tiêu: Xác định đột biến trên gene Dystrophin.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker

  1. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GENE DYSTROPHIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRÊN BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Phương Mai*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Thị Tuyết Nhung*, Ngô Diễm Ngọc*, Nguyễn Ngọc Khánh**, Bùi Phương Thảo**, Vũ Chí Dũng** * Khoa Di truyền và SHPT, Bệnh viện Nhi TW Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh viện Nhi TW ** TÓM TẮT Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Mục tiêu: Xác định đột biến trên gene Dystrophin. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 564 bệnh nhân được chẩn đoán nghi ngờ mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne từ năm 2005 đến 12-2014 tại Bệnh Viện Nhi Trung ương. Phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin bằng kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification). Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện được 172/564 (30.5%) trường hợp bị đột biến mất đoạn và lặp đoạn, trong đó 157/564 (27.8%) trường hợp đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Những trường hợp không phát hiện thấy đột biến, được thực hiện tiếp kỹ thuật MLPA phát hiện 6 trường hợp đột biến mất đoạn và 9 trường hợp đột biến lặp đoạn. Vị trí đột biến mất đoạn tập trung ở vùng hotspot của gene Dystrophin, gồm các đột biến trong vùng trung tâm (exon 45-52) chiếm 61,1% và vùng đầu 5’ (exon 1-19) chiếm 29,3%, đột biến trên các vùng còn lại chiếm 9.63% (không đặc hiệu). Kết luận: Kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hiệu quả trong chẩn đoán di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Từ khóa: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR). 1. ĐẶT VẤN ĐỀ và gây suy yếu cơ một cách tuần tiến dẫn đến tàn tật và tử vong do suy tim và bội nhiễm phổi. Các Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD)/ Loạn dưỡng dấu hiệu lâm sàng của bệnh được nhận biết ở giai cơ Becker (BMD) là nhóm bệnh di truyền lặn liên đoạn trẻ từ 2 đến 3 tuổi. Các bệnh nhân được coi kết giới tính do đột biến trên gene Dystrophin như mắc thể nặng nếu phải ngồi xe lăn, mất khả (DMD). DMD là một trong những bệnh thần kinh năng tự đi lại trước tuổi 12 (1). Bệnh loạn dưỡng cơ phổ biến ở trẻ em với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai cơ Becker (BMD) là thể trung gian của bệnh DMD đẻ sống (1). Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hoá với thời kỳ khởi phát bệnh muộn hơn và có tiến 62
  2. PHẦN NGHIÊN CỨU triển lâm sàng chậm hơn. Tỷ lệ mắc bệnh BMD Nghiên cứu sử dụng phương pháp hồi cứu, khoảng 1/18,500 trẻ trai đẻ sống (2). thực hiện trên 564 bệnh nhân nam từ 5 tháng đến Gene Dystrophin (DMD) là một trong những 19 tuổi mắc DMD được điều trị tại Bệnh viện Nhi gene lớn nhất trong bộ gene người, nằm trên cánh trung ương từ 12/2005 đến 01/2015. ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp21) có độ lớn 2.4Mb. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân dựa trên các tiêu Gene DMD gồm 79 exon, mã hóa cho protein chuẩn cổ điển của Duchenne đã mô tả bao gồm: dystrophin có độ lớn 427kDa. Đây là loại protein trẻ trai; giảm vận động, yếu cơ gốc chi (dấu hiệu màng bao cơ, chủ yếu tập trung ở cơ xương và cơ Gowers), teo cơ gốc chi nhiều vị trí, đối xứng hai tim. Một lượng nhỏ protein Dystrophin tập trung bên, bắp chân phì đại đối xứng hai bên, điện cơ ở các tế bào thần kinh của não. Ở những bệnh đồ có hình ảnh tổn thương nguồn gốc sợi cơ; men nhân DMD, protein dystrophin thường không creatine kinase huyết thanh tăng cao trên 20 lần biểu hiện, trong khi đó bệnh nhân BMD thường so với trị số bình thường (13). có khoảng 10-40% lượng protein dystrophin. Các 2.2. Phương pháp đột biến có thể xảy ra trên gene là đột biến mất đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn và mất đoạn 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống nhỏ. Mất đoạn và lặp đoạn là loại đột biến hay đông EDTA vô trùng. gặp nhất, chiếm khoảng 65% trong số các đột 2.2.2. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi biến (3-5). Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra DNA đước tách chiết theo QiaAmp DNA blood trong vùng “hot spots” của gen, chủ yếu từ exon mini kit (QiAgen). Nồng độ và độ tinh sạch DNA 44 đến exon 52 và từ exon 2 đến exon 19 (6). được xác định trên máy Biophotometter plus Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai (Eppendorf), các mẫu đạt độ tinh sạch OD (bước phương pháp Multiplex PCR và MLPA để phát sóng 260/280) 1,8-2.0 sẽ được sử dụng làm các hiện các đột biến gene DMD trên 564 bệnh nhân phản ứng tiếp theo. nghi ngờ mắc bệnh DMD/BMD đến khám và điều 2.2.3. Phản ứng Multiplex PCR trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương trong từ năm Kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện sự mất đoạn 2005 đến năm 2015. của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng “hotspots” của gene. 25 exon này được chia thành 3 bộ 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Multiplex A, B, C. Trình tự mồi được thiết kế theo 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chamberlain và cộng sự (7). 63
  3. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 Bảng 1. Các exon của Multiplex A, B, C Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) 45 547 Pm 535 49 439 48 506 3 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 8 360 6 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 4 196 52 113 Chu trình nhiệt được tiến hành với các điều được trộn kỹ với 30µL PCR buffer và mồi, sau đó kiện sau: 950C, 3 phút; [950C, 30s; 500C, 30s; 720C, phản ứng PCR được thực hiện ở điều kiện luân 1 phút] x 30 chu kỳ. nhiệt PCR. Các đầu dò nếu không được ghép nối Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose với nhau thì chỉ mang 1 primer cho nên không 3%, nhuộm bằng Ethidium và nhận định kết quả được khuếch đại. Sản phẩm sau khuếch đại được dưới đèn UV. điện di phân tách đoạn trên hệ thống ABI 3130. 2.2.4. Phản ứng MLPA Dữ liệu được phân tích trên phần mềm Coffalyser. Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU hiện bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại P034 và P035. 50-200ng DNA của mẫu pha loãng 3.1. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật Multiplex trong 5µL buffer AE được biến tính ở 98oC trong 5 PCR phút, trộn với 3µL hỗn hợp probe và MLPA buffer. Nhóm nghiên cứu sàng lọc đột biến mất đoạn Phản ứng lai: hỗn hợp DNA và probe này sau đó trên 564 trường hợp bằng kỹ thuật Multiplex được ủ tại 95oC trong 1 phút và 60oC trong 12 giờ PCR đã phát hiện 157/564 (27.8%) bệnh nhân có hoặc qua đêm. Phản ứng nối: hỗn hợp DNA và đột biến mất đoạn. Trong đó có 96/157 (61.1%) probe được cho thêm với 32µL hỗn hợp Ligase-65 bệnh nhân mất đoạn vùng hot spot trung tâm (từ và buffer ở 54oC trong 15 phút và bất hoạt ở 980C exon 45-52); 46/157 (29.3%) bệnh nhân mất đoạn trong 5 phút. Phản ứng PCR: sản phẩm sau nối vùng exon 3-19. 64
  4. PHẦN NGHIÊN CỨU Bảng 2. Tỷ lệ mất đoạn vùng hot spots Stt Vị trí của gene có mất đoạn N (%) 1 Exon 3 – 19 46 (29.3) 2 Exon 32 – 44 15 (9.6) 3 Exon 45 – 52 (vùng hospot) 96 (61.1) Tổng số 157 (100) Hình 1. Kết quả điện di multiplex PCR trên agarose Giếng 1: marker 100bp; Giếng 2a, 2b, 2c: mẫu chứng mất đoạn exon 3-44; Giếng 3a, 3b, 3c: mẫu chứng không mất đoạn; Giếng 4a, 4b, 4c: bệnh nhân mất đoạn exon 41, 42, 43; Giếng 5a, 5b, 5c: bệnh nhân không mất đoạn; Giếng 6a, 6b, 6c: bệnh nhân mất đoạn exon 12, 13; Giếng 7a, 7b, 7c: mẫu không chứa DNA. 3.2. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật MLPA đoạn, trong đó có 3 trường hợp bị đột biến 61 bệnh nhân không tìm thấy đột biến mất mất đoạn 1 exon, 1 trường hợp đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex PCR được thực đoạn ngoài vùng hotspots (exon 65-74), và hiện tiếp kỹ thuật MLPA để phát hiện các đột 09/61 (14.75%) bệnh nhân có đột biến lặp biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn. Kết quả đoạn, trong đó có 4 trường hợp chỉ có đột có 06/61 (9.84%) bệnh nhân bị đột biến mất biến lặp đoạn 1 exon. 65
  5. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến gene DMD bằng kỹ thuật MLPA Stt Dạng đột biến N (%) 1 Mất đoạn 6 (9.84%) 2 Lặp đoạn 9 (14.75%) 3 Không phát hiện đột biến 46 (75.41%) Tổng số 61 (100%) Hình 2. Điện di mao quản bộ P034 - DMD 2a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 2b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 44-50 66
  6. PHẦN NGHIÊN CỨU Hình 3. Điện di mao quản bộ P035 - DMD 3a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 3b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 51-60 4. BÀN LUẬN một phản ứng có độ đặc hiệu cao và ít tốn kém. Nhận biết đột biến mất đoạn của 25 exon đặc Có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gene hiệu trong vùng “hotspots” có thể phát hiện được Dystrophin như PCR, Southern blot, PCR định 98% trong tổng số đột biến mất đoạn của gene lượng, FISH (fluorescence in situ hybridization) Dystrophin (6). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã và giải trình tự xác định đột biến điểm… Tuy nhiên, có hai phương pháp phổ biến và hiệu quả phát hiện 157/564 (27,8%) bệnh nhân có đột biến thường được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn, trong đó 96/157 (61,1%) bệnh nhân chủ mất đoạn và lặp đoạn trên gene DMD là phương yếu mất đoạn ở vùng hotspots (Exon 45-52). pháp Multiplex PCR và MLPA. Phương pháp MLPA (Multiplex ligation- Phương pháp Multiplex PCR là phương pháp dependent probe amplification) là phương pháp sàng lọc mất đoạn 25 exon vùng hot spot. Đây là cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác nhau phương pháp nhân đoạn nhiều exon trong cùng với chỉ một cặp mồi duy nhất. Mỗi một đầu dò 67
  7. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 (probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này 5. KẾT LUẬN sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gene quan tâm, - Sự kết hợp giữa hai phương pháp Multiplex sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau PCR và MLPA đã phát hiện được 172/564 (30.5%) thành một trình tự đích hoàn chỉnh. Phương pháp bệnh nhân DMD/BMD có đột biến mất đoạn hoặc MLPA là phương pháp cho phép sàng lọc sự mất lặp đoạn. Các đột biến xảy ra chủ yếu nằm ở vùng đoạn và lặp đoạn của 79 exon được chia làm hai hot spots. bộ P034-P035 (8). Với những bệnh nhân có triệu - Kỹ thuật Multiplex PCR và MLPA là các kỹ chứng lâm sàng điển hình nhưng không phát thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, làm tăng tỷ hiện đột biến trên 25 exon vùng hot spots, chúng lệ phát hiện đột biến trên gene DMD. tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật MLPA để phân tích gene DMD, kết quả phát hiện thêm 06/61 (9,84%) TÀI LIỆU THAM KHẢO bệnh nhân bị đột biến mất đoạn và và 09/61 (14,75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn. 1. Emery AE. Population frequencies of Theo nghiên cứu của Prior và cộng sự thì tỷ lệ inherited neuromuscular diseases--a world đột biến mất đoạn của gene Dystrophin là 70% survey. Neuromuscul Disord. 1991;1(1): 19-29. (306 ca DMD và 55 ca BMD có đột biến mất đoạn) 2. Bushby KM, Thambyayah M, Gardner - và đột biến chủ yếu tập trung ở vùng “hos pots” , Medwin D. Prevalence and incidence of Becker chiếm tỷ lệ khoảng 80% (9). Yuge và cộng sự (10) muscular dystrophy. Lancet. 1991;337(8748): đã nghiên cứu trên 138 bệnh nhân DMD với kết 1022-4. quả có 62% bệnh nhân bị mất đoạn, trong đó có 3. Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco 68% bệnh nhân mất đoạn ở vùng hospot. Nhờ AP, Feener C, Kunkel LM. Complete cloning of the sử dụng kết hợp các phương pháp MultiplexPCR Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and và MLPA, Janssen và cộng sự đã phát hiện 53% preliminary genomic organization of the DMD tổng số bệnh nhân có đột biến mất đoạn và lặp gene in normal and affected individuals. Cell. đoạn (11). Nghiên cứu của Zimowski và cộng sự 1987;50(3): 509-17. (12) phát hiện 134/180 bệnh nhân (73.9%) bệnh 4. Forrest SM, Cross GS, Flint T, Speer A, nhân có mất đoạn gene DMD bằng phương Robson KJ, Davies KE. Further studies of gene pháp MLPA. Trong nghiên cứu của chúng tôi, deletions that cause Duchenne and Becker kết hợp giữa haiphương pháp Multiplex PCR và muscular dystrophies. Genomics. 1988;2(2): 109- MLPA đã tăng tỷ lệ phát hiện đột biến từ 27.8% 14. lên 30.5% và làm đa dạng khả năng phát hiện 5. Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker các loại đột biến như mất đoạn lớn, mất đoạn E, Blonden LA, Ginjaar HB, Wapenaar MC, et al. nhỏ, lặp đoạn… Sự khác nhau về tỷ lệ mất đoạn Topography of the Duchenne muscular dystrophy của gene Dystrophin có thể phụ thuộc vào số (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases lượng các exon được phân tích và số lượng mẫu reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J nghiên cứu. Hum Genet. 1989;45(6): 835-47. 68
  8. PHẦN NGHIÊN CỨU 6. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Becker muscular dystrophy using CDNA probes Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions and the polymerase chain reaction method. Life by polymerase chain reaction. Hum Genet. Sci. 1999;65(9): 863-9. 1990;86(1): 45-8. 11. Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch 7. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, A, Zschocke J. MLPA analysis for the detection Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of of deletions, duplications and complex the Duchenne muscular dystrophy locus via rearrangements in the dystrophin gene: potential multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. and pitfalls. Neurogenetics. 2005;6(1): 29-35. 1988;16(23): 11141-56. 12. Zimowski JG, Massalska D, Holding M, 8. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Jadczak S, Fidzianska E, Lusakowska A, et al. MLPA Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative based detection of mutations in the dystrophin quantification of 40 nucleic acid sequences by gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002; 30(12): e57. muscular dystrophy. Neurologia i neurochirurgia 9. Prior TW, Bridgeman SJ. Experience and polska. 2014;48(6): 416-22. strategy for the molecular testing of Duchenne 13. Katharine Bushby, Richard Finkel, David muscular dystrophy. J Mol Diagn. 2005;7(3): 317- J Birnkrant, et al. Diagnosis and management 26. of Duchenne muscular dystrophy, part 1: 10. Yuge L, Hui L, Bingdi X. Detection of gene diagnosis, and pharmacological and psychosocial deletions in Chinese patients with Duchenne/ management. Lancet Neurol. 2010 Jan; 9(1): 77-93. ABSTRACT DETECTION MUTATION IN DYSTROPHIN GENE USING MOLECULAR TECHNIQUES IN DUCHENNE/BECKER PATIENTS Ngo Manh Tien*, Nguyen Thi Phuong Mai*, Nguyen Thi Mai Huong*, Ly Thi Thanh Ha*, Ngo Thi Tuyet Nhung*, Ngo Diem Ngoc*, Nguyen Ngoc Khanh**, Bui Phuong Thao**, Vu Chi Dung** * Human Genetics Department, National Hospital of Peadiatrics, Hanoi, Vietnam ** Endocrinology-Metabolic-Genetic Department, National Hospital of Pediatrics, Hanoi, Vietnam Overview: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular diseasesat the rate of 1 out of 3500male live births. Goal: Detecting mutation in Dytrophin gene. Patients and Method: 564 patients suspected of Duchenne muscular dystrophy (DMD) were collected from 2005 to 12-2014 at National Hospital of Pediatrics. The detection of deletion and dulication mutation in Dystrophin gene were identified by Multiplex PCR technique and MLPA technique (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification). Results: In this study, we have discovered 69
  9. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 172/564 (30.5%) cases of deletion and duplication mutations, in which 157/564 (27.8%) cases of deletion mutations by multiplex PCR technique. The remaining cases are 6 cases deletion and 9 cases duplication mutation by MLPA technique. Most of the mutation arelocated in the hotspot of the Dystrophin gene, including mutations in the central genomic region for (exon 45-52) 61.1% and in the 5’ region (exon 3-19) 29.3%, following is the remaining of the gene 9.6% (respectively). Conclusion: Multiplex PCR technique and MLPA technique detect deletions and duplication mutations in the Dystrophin gene, have high sensitivity and specificity and efficiency in diagnosing genetic Duchenne muscular dystrophy díseases. Keywords: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR). 70
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2