intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCR

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

48
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2 trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCR

Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> PHÁT HIỆN HAI NHÓM ESCHERICHIA COLI EPEC VÀ EIEC<br /> GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR<br /> Nguyễn Phú Hùng1*, Phạm Thị Nhàn1<br /> Lê Thị Thu Hà1, Lê Thành Công1<br /> Phùng Đắc Cam2<br /> 1<br /> Trường Đại học Khoa Học – ĐH Thái Nguyên<br /> 2<br /> Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương)<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Escherichia coli là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Đây là đối<br /> tƣợng gây viêm ruột theo nhiều cơ chế khác nhau. Dựa trên cơ sở này, E.coli gây tiêu chảy đƣợc<br /> phân thành các nhóm khác nhau là ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC, mỗi nhóm có một cơ chế<br /> sinh bệnh đặc trƣng. Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên<br /> cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2<br /> trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC. Đây là<br /> tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành tối ƣu hoá và phát triển thành bộ sinh phẩm phát hiện<br /> nhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở ngƣời. Ƣu điểm của kỹ thuật là này cho phép phát hiện<br /> tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu gần nhƣ 100%.<br /> Từ khóa: Tương đồng di truyền, tiêu chảy, PCR, nhiễm trùng bệnh viện, Ecoli.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tiêu chảy là một bệnh phổ biến trên toàn cầu,<br /> đặc biệt là ở các đang phát triển. Việt Nam là<br /> nƣớc nằm trong vùng nhiệt đới, điều kiện vệ<br /> sinh kém, vì vậy bệnh tiêu chảy khá phổ biến.<br /> Theo các nghiên cứu mới đây, bệnh tiêu chảy<br /> ở nƣớc ta đứng thứ nhất trong 10 bệnh phổ<br /> biến nhất và đứng hang thứ tƣ trong 10 bệnh<br /> có tỉ lệ tử vong cao nhất. Trẻ em là đối tƣợng<br /> dễ mắc tiêu chảy nhất, trung bình trẻ dƣới 5<br /> tuổi mỗi năm mắc tiêu chảy 2 – 2,2 lần [2],<br /> [3]. Có nhiều tác nhân sinh học khác nhau dẫn<br /> tới tiêu chảy ở ngƣời nhƣ: tác nhân là virus<br /> (ví dụ: virus rota, virus adeno, virus<br /> Norwalk…), kí sinh trùng (ví dụ: giun tròn,<br /> sán dây, sán lá, các loại đơn bào (protozoa) và<br /> vi khuẩn (Escherichia coli, Shigella, Vibrio<br /> cholera…). Để kiểm soát dịch tiêu chảy, công<br /> tác chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh giữ<br /> một vai trò đặc biệt quan trọng. Trong số các<br /> tác nhân kể trên, E.coli là đối tƣợng đƣợc<br /> quan tâm và nghiên cứu nhiều. Các E.coli<br /> gây tiêu chảy đƣợc chia làm 5 nhóm là: E.coli<br /> gây bệnh đƣờng ruột(Enteropathology E.coli<br /> *<br /> <br /> *<br /> <br /> – EPEC); E.coli<br /> sinh độc tố ruột<br /> (Enterotoxigenic E.coli – ETEC); E.coli xâm<br /> nhập ruột (Enteroinvasive E.coli – EIEC),<br /> E.coli<br /> gây<br /> xuất<br /> huyết<br /> ruột<br /> (Enterohaemorrhagic E.coli – EHEC) và<br /> E.coli<br /> bám<br /> dính<br /> đƣờng<br /> ruột<br /> (Enteroaggregative E.coli – EAEC). Hiện đã<br /> có nhiều công trình nghiên cứu về chẩn đoán<br /> phân biệt các nhóm E.coli gây bệnh khác<br /> nhau đã đƣợc thực hiện[1], [4],[5], [10]. Trong<br /> báo này, chúng tôi đã tiến hành áp dụng kĩ<br /> thuật PCR đặc hiệu để xác định chính xác hai<br /> nhóm E.coli là EPEC và EIEC trong 5 nhóm<br /> nêu trên. Đây là một phần trong nghiên cứu<br /> của chúng tôi về ứng dụng kỹ thuật PCR để<br /> xác định 5 nhóm E.coli gây tiêu chảy ở ngƣời.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên liệu nghiên cứu là các chủng E.coli<br /> chuẩn quốc tế do Giáo sƣ Phùng Đắc Cam,<br /> Phòng Vi khuẩn đƣờng ruột - Viện vệ sinh<br /> dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.<br /> Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số và<br /> các loại hóa chất chuyên dụng dùng cho các<br /> kỹ thuật sinh học phân tử có chất lƣợng tốt,<br /> do các hãng có uy tín cung cấp.<br /> <br /> Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com<br /> <br /> 155<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu bao gồm phƣơng<br /> pháp tách chiết DNA tổng số từ các chủng vi<br /> khuẩn làm nguyên liệu cung cấp cho các phản<br /> ứng PCR. Phƣơng pháp khuếch đại gen đích<br /> bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Kết quả tách DNA tổng của vi khuẩn E.coli<br /> Từ các chủng E.coli chuẩn quốc tế: EPEC,<br /> EIEC và chủng đối chứng EC đƣợc giữ trong<br /> ống thạch nghiêng, chúng tôi lấy một vài<br /> khuẩn lạc đem nuôi cấy trong môi trƣờng LB<br /> lỏng ở nhiệt độ 370C qua đêm. Dịch nuôi cấy<br /> đƣợc li tâm, thu sinh khối để tiến hành tách<br /> chiết và tinh sạch DNA tổng số. E.coli là vi<br /> khuẩn gram âm, do đó trong nghiên cứu này<br /> chúng tôi đã tiến hành tách chiết theo phƣơng<br /> pháp của Sambrock và cộng sự. DNA thu<br /> đƣợc trong quá trình tách chiết đƣợc kiểm tra<br /> bằng phƣơng pháp điện di và phƣơng pháp đo<br /> mật độ quang bằng máy quang phổ. Kết quả<br /> điện di DNA tổng số đƣợc trình bày trong<br /> hình 2.1. Từ kết quả điện di cho thấy, các<br /> phân tử DNA thu đƣợc ít bị đứt gãy, có một<br /> băng gọn duy nhất. Các băng xuất hiện với độ<br /> đậm khi nhuộm bằng ethidium bromide đã<br /> chứng tỏ phƣơng pháp tách chiết cho phép thu<br /> đƣợc một lƣợng DNA lớn. Tiếp theo chúng<br /> tôi tiến hành xác định nồng độ DNA bằng<br /> phƣơng pháp quang phổ làm cơ sở để pha<br /> loãng DNA đến nồng độ cuối cùng cho phản<br /> ứng PCR đặc hiệu. Kết quả điện di DNA tổng<br /> số đƣợc trình bày trong hình 1.<br /> <br /> Hìnhquả<br /> 1. DNA<br /> tổng số<br /> củagen<br /> đối tƣợng<br /> nghiênnhóm<br /> cứu:<br /> Kết<br /> khuếch<br /> đại<br /> đặc hiệu<br /> EPEC<br /> 1. Chủng EPEC; 2 Chủng EIEC<br /> Cơ chế gây bệnh của nhóm này liên quan mật<br /> thiết tới khả năng bám dính, khu trú, truyền<br /> tín hiệu vào trong tế bào làm thoái hoá các vi<br /> nhung mao, làm rối loạn quá trình hấp thu<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> nƣớc và điện giải. Sự truyền tín hiệu vào tế<br /> bào do các protein mã hoá bởi các gen eae,<br /> esp B, espA, esp D, sep, esp nằm trên nhiễm<br /> sắc thể quy định. Trong đó protein đƣợc gọi<br /> là intimin có trọng lƣợng phân tử 97 kDa mã<br /> hoá bởi gen eae liên quan tới cơ chế gắn mật<br /> thiết đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế gây<br /> bệnh của nhóm này. Trên cơ sở đó, chúng tôi<br /> đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen eae có kí<br /> hiệu và trình tự là:<br /> eae<br /> F:<br /> CACACGAATAAACTGACTAAAATG và<br /> eae<br /> R:<br /> AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT.<br /> Theo lý thuyết thiết kế, cặp mồi này cho<br /> phép khuếch đại một phân đoạn của gen eae<br /> có kích thƣớc 376 cặp nucleotide. Nhiệt độ<br /> bắt cặp mồi là 520C. Sản phẩm của phản ứng<br /> PCR đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp điện<br /> di trên gel agarose 1%.<br /> M<br /> <br /> 603<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 360<br /> <br /> 310<br /> Hình 2. Sản phẩm khuếch đại gen eae<br /> M. quả<br /> Macker<br /> cắt2,<br /> bằng<br /> Từ kết<br /> điện X<br /> di174<br /> hình<br /> cănHind<br /> cứ III<br /> vào kích<br /> Đối chứng<br /> EC,cho<br /> 2. EPEC<br /> thƣớc của 1.macker<br /> chuẩn<br /> thấy phân đoạn<br /> <br /> DNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi eae F và<br /> eae R có kích thƣớc khoảng 370 cặp<br /> nucleotide. Kích thƣớc này phù hợp với tính<br /> toán lý thuyết trong quá trình thiết kế mồi.<br /> Sản phẩm đƣợc nhân lên có tính đặc hiệu cao,<br /> không có sản phẩm phụ. Mặt khác tại đƣờng<br /> chạy số 1, chủng EC đƣợc sử dụng làm đối<br /> chứng âm đã cho kết quả âm tính. Nhƣ vậy,<br /> có thể khẳng định chúng tôi đã khuếch đại<br /> thành công gen eae đặc hiệu cho nhóm EPEC.<br /> Kết quả này của chúng tôi hoàn toàn phù hợp<br /> với các nghiên cứu trƣớc đó [5], [7].<br /> Kết quả khuếch đại gen đặc hiệu nhóm<br /> EIEC<br /> <br /> 156<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập vào các<br /> tế bào biểu mô đại tràng.<br /> Các gen mã hoá các protein liên quan đến<br /> quá trình xâm nhập nằm trên cả plasmid và<br /> nhiễm sắc thể. Plasmid của nhóm này đƣợc<br /> ký hiệu là pInv có trọng lƣợng phân tử là 140<br /> mDa chứa các gen mxi và ipa mã hoá cho các<br /> protein cần thiết cho quá trình xâm nhập gồm<br /> IpaA, IpaB, IpaC, IpaD, IpaH. Trong nghiên<br /> cứu này chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc cho<br /> nhóm EIEC dựa trên đặc hiệu của nhóm là<br /> IpaH. Trình tự của cặp mồi là:<br /> <br /> cộng sự, chúng tôi đã thu đƣợc DNA tổng số<br /> từ các đối tƣợng nghiên cứu với độ tinh sạch<br /> cao, không đứt gãy, phục vụ tốt cho quá trình<br /> PCR. Kết quả PCR đã nhân lên đƣợc hai băng<br /> với kích thƣớc khoảng 360 cặp nucleotide đặc<br /> hiệu cho gen eae của nhóm EPEC và phân<br /> đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 620 cặp<br /> nucleotide đặc hiệu cho gen ipH của nhóm<br /> EPEC. Kết quả này là tiền đề quan trọng để<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tạo bộ sinh<br /> phẩm chẩn đoán E.coli gây tiêu chảy trong<br /> nghiên cứu tiếp theo.<br /> <br /> IpaH F: GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA<br /> TAC CGT C và IpaH R: GCC GGT CAG CCA<br /> CCC TCT GAG AGT AC<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> M 1 2<br /> <br /> 873<br /> 603<br /> <br /> 620<br /> <br /> Hình 3. Sản phẩm khuếch đại gen ipaH<br /> M. Macker X 174 cắt bằng Hind III<br /> 1. Đối chứng EC<br /> 2. EPEC<br /> <br /> Phân tích hình ảnh điện di sản sản phẩm PCR<br /> (hình 3) cho thấy, mẫu đối chứng âm (EC) đã<br /> không có sản phẩm đƣợc khuếch đại với cặp<br /> mồi ipHF và ipHR mà chúng tôi thiết kế đặc<br /> hiệu cho nhóm EIEC. Tuy nhiên, tại đƣờng<br /> chạy số 2 của mẫu chuẩn EIEC, chúng tôi đã<br /> nhận đƣợc kết quả dƣơng tính, đã có một<br /> băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng<br /> 620 cặp nucleotit, tƣơng ứng với kích thƣớc<br /> lý thuyết khi thiết mồi. Có thể khẳng định kết<br /> quả của chúng tôi thu đƣợc là hoàn toàn phù<br /> hợp với nhiều công bố của các tác giả khác<br /> trên thế giới [4], [8], [9].<br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng phƣơng pháp tách DNA tổng số trên đối<br /> tƣợng vi khuẩn gram âm của Sambrock và<br /> <br /> [1].Adrienne W. Paton and James C. Paton (1998),<br /> “Detection and Characterization of Shiga Toxigenic<br /> Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays<br /> for stx1, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli<br /> hlyA, rfbO111, and rfbO157”, J Clin Microbiol,<br /> Vol. 36, Pp: 598-602.<br /> [2].Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb<br /> Y học.<br /> [3].Hoàng Thủy Long (2007), Kỹ thuật xét nghiệm<br /> vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá.<br /> [4].Jaims P. Natoro, Jaims B. Kaper (1998),<br /> “Diarrheagenic Escherichia coli” Cnilical<br /> Microbiology Review, Vol. 11, No. 1. Pp 142–201.<br /> [5].Hornitzky MA, Bettelheim KA, Djordjevic SP<br /> (2001), “The detection of Shiga toxin-producing<br /> Escherichia coli in diagnostic bovine faecal<br /> samples using vancomycin-cefixime-cefsulodin<br /> blood agar and PCR”, FEMS Microbiol Lett, Vol.<br /> 198, No. 1, Pp 17 – 22.<br /> [6].Seker E, Kuyucuoğlu Y, Sareyyüpoğlu B,<br /> Yardımcı H (2009), “PCR Detection of Shiga<br /> Toxins, Enterohaemolysin and Intimin Virulence<br /> Genes of Escherichia coli O157:H7 Strains<br /> Isolated from Faeces of Anatolian Water Buffaloes<br /> in Turkey”, Zoonoses Public Health.<br /> [7]. Ooka T, Terajima J, Kusumoto M, Iguchi A,<br /> Kurokawa K, Ogura Y, Asadulghani M,<br /> Nakayama K, Murase K, Ohnishi M, Iyoda S,<br /> Watanabe H, Hayashi T (2009), “Development of<br /> a multiplex PCR-based rapid typing method for<br /> enterohemorrhagic Escherichia coli O157<br /> strains”, J Clin Microbiol, Vol. 47, No.9, Pp,<br /> 2888-2894.<br /> <br /> 157<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> [8]. S Stacy-Phipps, JJ Mecca and JB Weiss<br /> (1995), “Multiplex PCR assay and simple<br /> preparation method for stool specimens detect<br /> enterotoxigenic Escherichia coli DNA during<br /> course of infection” J Clin Microbiol, Vol. 33, No.<br /> 5, 1054-1059<br /> [9]. Pina M. Fratamico, Connie E. Briggs,<br /> Danielle Needle, Chin-Yi Chen, and Chitrita<br /> DebRoy (2003), “Sequence of the Escherichia coli<br /> O121 O-Antigen Gene Cluster and Detection of<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> Enterohemorrhagic E. coli O121 by PCR<br /> Amplification of the wzx and wzy Genes” J Clin<br /> Microbiol, Vol. 41, Pp: 3379-3383.<br /> [10]. Sensitivities and Specificities of Premier<br /> (1998), “E. coli O157 and Premier EHEC Enzyme<br /> Immunoassays for Diagnosis of Infection with<br /> Verotoxin<br /> (Shiga-Like<br /> Toxin)-Producing<br /> Escherichia coli”, J Clin Microbiol. Vol. 36, Pp:<br /> 1608-1611.<br /> <br /> DETECTION OF TWO GROUP OF DIARRHEAGENIC ESCHERICHIA COLI<br /> IN HUMAN EPEC AND EIEC BY PCR TECHNIQUE<br /> Nguyen Phu Hung12, Pham Thi Nhan1,<br /> Le Thi Thu Ha1, Le Thanh Cong1<br /> 1<br /> College of Science – Thai Nguyen University<br /> Phung Dac Cam2<br /> 2<br /> National Institute of hygiene and epidemiology2<br /> <br /> SUMMARY<br /> Escherichia coli is an underestimated diarrheal pathogen in almost countries in the wold. This<br /> organism may cause gastroenteritis by many different mechanisms, and on the basis of this,<br /> diarrheagenic E. coli has been subdivided into different groups are ETEC, EHEC, EIEC, EPEC,<br /> EAEC. Each of groups has a special pathogenic mechanisms. On the basis of genomic structure of<br /> these every strains, in this this study, has been applied successfully PCR technique with two pairs<br /> of primers to detect 2 of 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli are EPEC and EIEC<br /> from standar samples. This is important prime to deverloping diagnosistic technique for<br /> diarrheagenic E. coli. The advantages of this technique are that it allows to screen and diagnose<br /> these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100%.<br /> Key words:E.coli, PCR, diarohea hopitol Infections, Genetic Similarity<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com<br /> <br /> 158<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
5=>2