Phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng taqman probe cải tiến để phát hiện HPV nguy cơ thấp type 6 và 11 với độ đặc hiệu và độ nhạy cao

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR SỬ DỤNG<br /> TAQMAN PROBE CẢI TIẾN ĐỂ PHÁT HIỆN HPV NGUY CƠ THẤP<br /> TYPE 6 VÀ 11 VỚI ĐỘ ĐẶC HIỆU VÀ ĐỘ NHẠY CAO<br /> Trần Thị Ngọc Ánh1,2#, Ngô Thị Hồng1,2,3#, Chu Văn Sơn1,<br /> Trần Dụ Chi4,5, Bùi Thị Việt Hà1,2, Nguyễn Thị Vân Anh1*<br /> *Tác giả liên hệ; #:Đồng tác giả thứ nhất<br /> Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,<br /> <br /> 1<br /> <br /> Đại học Quốc gia Hà Nội; 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội<br /> 3<br /> Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, Thành phố Bắc Ninh<br /> 4<br /> Bệnh viện Da liễu Trung ương; 5Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec<br /> Human papillomavirus (HPV) là tác nhân gây bệnh phổ biến lây nhiễm qua đường tình dục, gồm nhiều<br /> sub-type được phân thành nhóm nguy cơ cao gây ung thư và nhóm nguy cơ thấp gây các bệnh lý về da và<br /> niêm mạc với tỷ lệ nhiễm và khả năng tái phát cao. Trên thị trường đã có sinh phẩm nhập ngoại để phát hiện<br /> một số type Human papillomavirus nguy cơ thấp, tuy nhiên giá thành cao nên khó triển khai thành kít sàng<br /> lọc trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúp<br /> phát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Human<br /> papillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng<br /> Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiện<br /> gen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe. Kết quả so sánh trên 30 mẫu dịch âm đạo với sinh<br /> phẩm thương mại có uy tín cho kết quả tương đồng về tỷ lệ mẫu dương tính và chu kỳ ngưỡng phát hiện<br /> Human papillomavirus 6/11.<br /> Từ khoá: HPV, nguy cơ thấp, real time PCR Taqman, dịch âm đạo<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Human papiloma virus (HPV) là một trong<br /> những tác nhân gây bệnh quan trọng lây<br /> nhiễm qua đường tình dục ở cả nam và nữ<br /> trên toàn thế giới và được cho là bệnh truyền<br /> nhiễm qua đường tình dục phổ biến nhất ở<br /> Hoa Kỳ [1]. Các type Human papillomavirus<br /> 16 và 18 và 12 type khác như 31, 33, 35, 39,<br /> 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 đã được nghiên<br /> cứu và chứng minh có nguy cơ cao gây bệnh<br /> ung thư cổ tử cung [2,3,4]. Ngoài các type có<br /> nguy cơ cao, một số type nguy cơ thấp được<br /> Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Vân Anh, Trường Đại học<br /> Khoa học Tự nhiên<br /> <br /> công nhận là nguyên nhân gây ra các tổn<br /> thương lành tính trên da (mụn cơm, mụn cóc<br /> thông thường, mụn cơm phẳng). Hai type<br /> HPV nguy cơ thấp 6 và 11 là nguyên nhân<br /> của 90% các bệnh lý về da [5]. Nhiễm trùng<br /> papillomatosis chủ yếu gặp ở trẻ nhỏ được<br /> sinh ra từ những bà mẹ có tiền sử nhiễm HPV<br /> trong giai đoạn chu sinh [6 - 8]. Những tổn<br /> thương này có thể chuyển đổi thành ác tính<br /> [9]. Nhiễm trùng HPV thường không biểu hiện<br /> lâm sàng nên không thể có thống kê chính xác<br /> số lượng người nhiễm trên toàn thế giới. Ước<br /> tính trên thế giới, hàng năm, HPV gây ra mụn<br /> cóc sinh dục cho 0,1 - 0,2% dân số, chủ yếu ở<br /> <br /> Email: vananhbiolab@gmail.com<br /> <br /> tuổi vị thành niên, thanh thiếu niên [10]. Các<br /> <br /> Ngày nhận: 30/7/2018<br /> <br /> type này rất dễ lây truyền qua tiếp xúc (da,<br /> <br /> Ngày được chấp thuận: 04/9/2018<br /> <br /> niêm mạc, dịch tiết có virus). Do đó, việc chẩn<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> 61<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> đoán sàng lọc tại cộng đồng HPV 6 và 11<br /> <br /> VNĐ/ phản ứng) nên khó khăn khi triển khai<br /> <br /> cũng góp phần quan trọng để phòng tránh lây<br /> <br /> thành xét nghiệm sàng lọc tại cộng đồng. Ở<br /> <br /> nhiễm, đặc biệt là cho trẻ sơ sinh. Hiện nay,<br /> <br /> trong nước, chúng tôi chưa tìm thấy thông tin<br /> <br /> phương pháp hiệu quả nhất để chẩn đoán<br /> <br /> về nghiên cứu phát triển phương pháp hay bộ<br /> <br /> HPV là dựa vào vật liệu di truyền (kỹ thuật<br /> <br /> sinh phẩm phát hiện các type HPV nguy cơ<br /> <br /> PCR/real time PCR). Trên thế giới, đã có công<br /> <br /> thấp mà mới chỉ có thông tin về các bộ sinh<br /> <br /> bố của một vài tác giả về phát triển kỹ thuật<br /> <br /> phẩm phát hiện các type HPV nguy cơ cao.<br /> <br /> multiplex real time PCR để phát hiện đồng<br /> <br /> Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt<br /> <br /> thời một số type nguy cơ cao và nguy cơ thấp<br /> <br /> mục tiêu bước đầu phát triển phương pháp<br /> <br /> trong sàng lọc HPV ở các mẫu dịch âm đạo.<br /> <br /> multiplex real time PCR sử dụng Taqman<br /> <br /> Điển hình là công bố của tác giả Lindh và<br /> <br /> probe cải tiến gắn thêm ZEN quencher để<br /> <br /> cộng sự (2007) về phát hiện 12 type HPV<br /> <br /> phát hiện 2 type HPV nguy cơ thấp thường<br /> <br /> nguy cơ cao và 2 type nguy cơ thấp HPV 6/11<br /> <br /> gặp nhất là HPV 6 và HPV 11 có độ đặc hiệu<br /> <br /> đồng thời trên cùng một chu trình nhiệt [11].<br /> <br /> 100% và độ nhạy đạt tới ≤ 5 copy phản ứng<br /> <br /> Tuy nhiên, hạn chế của nghiên cứu là sử<br /> <br /> 25 µL. Kết quả của nghiên cứu là tiền đề cho<br /> <br /> dụng Taqman probe thông thường có huỳnh<br /> <br /> việc phát triển phương pháp phát hiện đồng<br /> <br /> quang TAMRA ở đầu 3’ nên tín hiệu nền còn<br /> <br /> thời các type HPV nguy cơ cao và nguy cơ<br /> <br /> cao và chưa tối ưu được master mix để phát<br /> <br /> thấp trong tương lai, hướng tới việc chế tạo<br /> <br /> hiện của 14 type trong cùng 1 ống phản ứng<br /> <br /> bộ sinh phẩm có chất lượng tương đương và<br /> <br /> mà vẫn phải thực hiện 14 ống phản ứng riêng<br /> <br /> giá thành cạnh tranh so với bộ sinh phẩm<br /> <br /> rẽ cho mỗi mẫu. Một hạn chế khác là chưa có<br /> <br /> thương mại có uy tín trên thị trường. Nhờ đó,<br /> <br /> thông tin tối ưu về độ nhạy và độ đặc hiệu của<br /> <br /> góp phần tầm soát tỷ lệ nhiễm HPV và đánh<br /> <br /> phản ứng. Nghiên cứu của tác giả Seaman và<br /> <br /> giá hiệu quả vacxin.<br /> <br /> cộng sự (2010) có cải tiến hơn trong việc phát<br /> triển được kỹ thuật multiplex real time PCR<br /> phát hiện đồng thời HPV 16, 18 và 2 type HPV<br /> nguy cơ thấp 6, 11 [12]. Tuy nhiên, độ nhạy<br /> của ngưỡng phát hiện chỉ đạt 103 copy/phản<br /> ứng 25 µL, một phần do sử dụng Taqman<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> Mẫu tham chiếu dùng để xây dựng<br /> phương pháp:<br /> <br /> probe thông thường có BHQ1 quencher ở đầu<br /> <br /> + Mẫu HPV: các mẫu DNA được tinh sạch<br /> <br /> 3’. Tác giả Yu và cộng sự (năm 2012) đã sử<br /> <br /> và xác định dương tính với các HPV<br /> <br /> dụng probe huỳnh quang AllGlo để phát hiện<br /> <br /> genotypes khác nhau. Trong đó có 14 type<br /> <br /> đồng thời 4 type HPV 6, 11, 16, 18 với độ<br /> <br /> HPV nguy cơ cao phổ biến (HPV 16, 18, 31,<br /> <br /> nhạy 10 copy/phản ứng 25 µL [13]. Trên thị<br /> <br /> 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do<br /> <br /> trường có bộ kít phát hiện HPV type 6 và 11<br /> <br /> bệnh viện Phụ Sản Trung ương cung cấp đã<br /> <br /> nguy cơ thấp HPV 6/11 Real-TM (Sacace<br /> <br /> được xác định đồng thời bằng kit thương mại<br /> <br /> Biotechnologies, Ý) có độ nhạy đạt tới 2,5<br /> <br /> Real time Cobas®HPV test của hãng Roche<br /> <br /> copy/phản ứng 25 µL nhưng thành phần và<br /> <br /> Diagnostics - Thuỵ Sỹ và GenoFlow human<br /> <br /> công thức chưa được công bố. Ngoài ra, giá<br /> <br /> papillomavirus array test (GF test) của hãng<br /> <br /> thành sinh phẩm nhập ngoại cao (178.000<br /> <br /> Diagcor - Hồng Kông và có 2 type nguy cơ<br /> <br /> 62<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung<br /> <br /> Mẫu thử nghiệm: Mẫu bệnh phẩm (n = 95)<br /> <br /> ương cung cấp đã được xác định đồng thời<br /> <br /> được lấy từ dịch âm đạo của bệnh nhân và<br /> <br /> GF test (Diagcor – Hồng Kông) và HPV 6/11<br /> <br /> được bảo quản trong dung dịch nước muối<br /> <br /> Real-TM của hãng Saccase – Ý. Các mẫu<br /> <br /> sinh lý đã khử trùng. Mẫu được sử dụng ngay<br /> <br /> được lựa chọn có giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)<br /> <br /> để tách chiết DNA tổng số và DNA được sử<br /> <br /> ≤ 32 để đảm bảo nồng độ DNA ≥ 10 copies/µ<br /> <br /> dụng ngay hoặc được bảo quản ở -80oC trước<br /> <br /> l, tương đương với nồng độ chuẩn dương hay<br /> <br /> khi tiến hành real time PCR. Mẫu được thu<br /> <br /> được sử dụng trong các kit thương mai. DNA<br /> <br /> thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện,<br /> <br /> của các mẫu tham chiếu được sử dụng làm<br /> <br /> tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh<br /> <br /> khuôn để nhân bản trình tự đặc hiệu bằng<br /> <br /> từ năm 2017 đến 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn<br /> <br /> PCR sử dụng cặp mồi GP5+/6+ (theo khuyến<br /> <br /> bệnh nhân là phụ nữ trong độ tuổi từ 18 - 65<br /> <br /> cáo của CDC) và giải trình tự DNA để khẳng<br /> <br /> tuổi, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên<br /> <br /> định type.<br /> <br /> cứu; tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân<br /> <br /> 3<br /> <br /> + Mẫu nhiễm các vi sinh vật gây bệnh<br /> khác: các mẫu DNA dương tính với các tác<br /> nhân gây bệnh bao gồm: Hepatitis B virus<br /> (HBV), Hepatitis C virus (HCV), Human<br /> Simplex<br /> <br /> virus<br /> <br /> cytomegalovirus<br /> <br /> type<br /> <br /> 1<br /> <br /> (CMV),<br /> <br /> -<br /> <br /> 2<br /> <br /> (HSV),<br /> <br /> Mycobacterium<br /> <br /> tuberculosis (MTB), Epstein - Barr virus (EBV),<br /> Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium<br /> do Bệnh viện Bạch Mai, Học Viện Quân Y và<br /> Bệnh viện Da liễu Trung ương cung cấp. Mẫu<br /> HBV, HCV và HSV type 1 - 2 được xác định<br /> bằng các kít thương mại (Real time PCR<br /> Cobas®HBV test, Real time PCR Cobas®HCV<br /> test, Cobas®HSV 1 and 2 test của hãng Roche<br /> Diagnostics - Thuỵ Sỹ; mẫu CMV được xác<br /> định bởi Real time PCR ANAPURE® CMV<br /> <br /> đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời<br /> kỳ kinh nguyệt, viêm nhiễm nặng và đang đặt<br /> thuốc. Nghiên cứu được phê duyệt bởi hội<br /> đồng khoa học, trên cơ sở quyết định số<br /> 1124/QĐ-ĐHKHTN của Trường Đại học Khoa<br /> học Tự nhiên, và được thực hiện theo đúng<br /> đạo đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân<br /> được cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên<br /> cứu, được bảo mật thông tin cá nhân và ký<br /> vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Thiết kế primer và probe cho phản<br /> ứng real time PCR phát hiện đồng thời type<br /> HPV 6 và HPV 11<br /> Hai cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên<br /> <br /> bởi<br /> <br /> cứu này được thiết kế sử dụng IDT’s<br /> <br /> ANAPURE MTB qPCR, mẫu EBV được xác<br /> <br /> PrimerQuest kết hợp với phần mềm SnapGen<br /> <br /> qPCR,<br /> <br /> mẫu<br /> <br /> MTB<br /> <br /> được<br /> <br /> xác<br /> <br /> định<br /> <br /> ®<br /> <br /> định bởi ANAPURE EBV qPCR, ANAPURE ,<br /> <br /> version 4.1.3 dựa vào trình tự vùng gen E6-E7<br /> <br /> mẫu M. hominis và M. genitalium được xác<br /> <br /> đặc<br /> <br /> định đồng thời bởi Mycoplasma homi-geni<br /> <br /> HG793938.1), trình tự vùng gen E1 đặc hiệu<br /> <br /> qPCR của hãng ANABIO R&D - Vietnam, và<br /> <br /> cho HPV 11 (Acession No. JQ773411.1) được<br /> <br /> Diagcor STD array test - Hồng Kông). Các<br /> <br /> công bố trên ngân hàng gen NCBI. Hai trình<br /> <br /> mẫu được lựa có giá trị Ct thấp nhất có thể và<br /> <br /> tự probe đặc hiệu cho HPV 6 và HPV 11 được<br /> <br /> đạt yêu cầu Ct ≤ 32, để đảm bảo nồng độ DNA<br /> <br /> cải tiến gắn thêm ZEN quencher dye tại<br /> <br /> của các vi sinh vật nhiễm được sử dụng là<br /> <br /> oligonucleotide thứ 9 gần đầu 5’-huỳnh quang<br /> <br /> khá cao, tối thiểu là 103 copies/µl.<br /> <br /> HEX để tăng khả năng hấp thụ hay dập tắt tín<br /> <br /> ®<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> ®<br /> <br /> hiệu<br /> <br /> cho<br /> <br /> HPV<br /> <br /> 6<br /> <br /> (Acession<br /> <br /> No.<br /> <br /> 63<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> hiệu của HEX khi probe chưa gắn vào khuôn,<br /> <br /> theo công bố của Nguyen và cộng sự [14].<br /> <br /> nhờ đó tín hiệu nền giảm và độ nhạy của phản<br /> <br /> Mồi và probe được tổng hợp bởi hãng IDT<br /> <br /> ứng được tăng lên. Cặp mồi và probe đặc<br /> <br /> (Hoa Kỳ) và được trình bày ở bảng 1.<br /> <br /> hiệu cho human β-actin (ACTB) được thiết kế<br /> Bảng 1. Các cặp mồi và probe đặc hiệu cho HPV 6 và HPV 11<br /> Mồi/<br /> <br /> Gen<br /> <br /> Trình tự (5’ - 3’)<br /> <br /> mẫu dò<br /> <br /> đích<br /> <br /> Kích<br /> thước<br /> <br /> Lượng<br /> (pmol/<br /> <br /> (bp)<br /> <br /> pứ)<br /> <br /> 6-Fw<br /> <br /> CCGCTGTGTGAAGTAGAAAAGGTAAA<br /> <br /> 6-Rv<br /> <br /> CTACAGGGTCTGGAGGTTGC<br /> <br /> 6-HEX<br /> probe<br /> <br /> /5HEX/AAGGGTCGC/ZEN/TGCCTACACTGCT<br /> GG/3IABkFQ/<br /> <br /> 1<br /> <br /> 11-Fw<br /> <br /> GCAAGTACAGTTATAGGGGAGG<br /> <br /> 5<br /> <br /> 11-Rv<br /> <br /> GTCAAAGTCTCCACGCTG<br /> <br /> 11-HEX<br /> probe<br /> <br /> /5HEX/CGGAATGG A/ZEN/TAAC GCGCCA<br /> GACCG/3IABkFQ/<br /> <br /> 1<br /> <br /> ACTB-Fw<br /> <br /> GATGTCCACGTCACACTTCA<br /> <br /> 3<br /> <br /> ACTB-Rv<br /> <br /> ATGCCTGAGAGGGAAATGAGGGC<br /> <br /> 3<br /> <br /> ACTBTexas<br /> <br /> /5TexasRed/ATGCCTGAGAGGGAAATGAGG<br /> <br /> probe<br /> <br /> 5<br /> E6, E7<br /> <br /> 165<br /> <br /> 174<br /> <br /> E1<br /> <br /> β-actin<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5<br /> <br /> 115<br /> 2<br /> <br /> GC/3BHQ2/<br /> <br /> 2.2. Tách chiết DNA của HPV và nhân<br /> <br /> HPV 11. Thành phần phản ứng PCR gồm 1X<br /> <br /> dòng tạo chuẩn dương chứa trình tự đặc<br /> hiệu của HPV 6 và HPV 11<br /> <br /> Hot - Taq Buffer; 0,2 mM dNTP; 1U Hot - Taq;<br /> <br /> DNA tổng số của virus được tách chiết từ<br /> <br /> Phản ứng PCR được thực hiện với chế độ<br /> <br /> mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo sử dụng bộ sinh<br /> <br /> nhiệt 950C - 5 phút; 45 chu kỳ gồm các bước:<br /> <br /> phẩm ANAPURE VIRAL DNA/RNA mini kit<br /> <br /> 950C - 30 giây, 600C - 30 giây, 720C - 30 giây;<br /> <br /> (ANABIO R & D, Việt Nam) theo hướng dẫn<br /> <br /> 720C - 5 phút. Các sản phẩm PCR được kiểm<br /> <br /> của nhà sản xuất, sau đó được lưu trữ ở -<br /> <br /> tra bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm<br /> <br /> 20oC cho các phản ứng PCR và real time<br /> <br /> Ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống<br /> <br /> PCR. DNA sau tinh sạch từ mẫu tham chiếu<br /> <br /> Gel Doc XR (Biorad).<br /> <br /> 400 nM 6/11 Rv/Fw và H2O cho thể tích 25 µl.<br /> <br /> dương tính HPV 6 và HPV 11 được sử dụng<br /> <br /> Sản phẩm PCR 165 bp đặc hiệu cho HPV<br /> <br /> làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản trình<br /> <br /> 6 và 174 bp đặc hiệu cho HPV 11 được nhân<br /> <br /> tự gen đặc hiệu E6 - E7 và E1 kích thước<br /> <br /> dòng trực tiếp vào vector pTOP sử dụng bộ<br /> <br /> tương ứng 165 bp và 174 bp của HPV 6 và<br /> <br /> sinh phẩm TOPcloner ™ TA Kit (Enzynomics,<br /> <br /> 64<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Hàn Quốc). Plasmid tái tổ hợp mang đoạn<br /> chèn 165 bp và 174 bp được được biến nạp<br /> vào E. coli DH5 α, sau đó nuôi cấy trên môi<br /> trường LB đặc bổ sung ampicillin 50 mg/L, rồi<br /> tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh-trắng và<br /> sàng lọc bằng colony - PCR sử dụng cặp mồi<br /> vector M13 - Fw/Rv (đi kèm bộ sinh phẩm) và<br /> mồi đặc hiệu 6, 11 - Fw/Rv. Khuẩn lạc tái tổ<br /> hợp được sử dụng để tách plasmid để làm<br /> chuẩn dương cho phản ứng real time PCR<br /> phát hiện HPV 6 và HPV 11 và được đặt tên<br /> tương ứng là pHPV6 - E6/7 và pHPV11 - E1.<br /> <br /> 2.4. Xác định độ đặc hiệu<br /> Độ đặc hiệu của multiplex real time PCR<br /> nêu trên được đánh giá thông qua kết quả<br /> dương tính giả (nếu có) khi sử dụng 5 µl DNA<br /> mỗi khuôn ở nồng độ tối thiểu là 103 copies/µl<br /> của 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến gồm<br /> HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,<br /> 59, 66, 68, và của một số vi sinh vật gây bệnh<br /> truyền nhiễm khác gồm HBV, HCV, HSV,<br /> CMV, MTB, EBV, Mycoplasma hominis, M.<br /> genitalium bổ sung vào hỗn hợp 20 µl master<br /> mix có thành phần được mô tả trong mục 2.3.<br /> <br /> 2.3. Xác định ngưỡng phát hiện của<br /> <br /> Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt<br /> <br /> phản ứng và tối ưu nồng độ của chuẩn<br /> <br /> giống như áp dụng cho type HPV 6 và 11,<br /> <br /> dương<br /> <br /> được mô tả trong mục 2.3.<br /> <br /> Plasmid tái tổ hợp pHPV6-E6/7 và pHPV11<br /> <br /> 2.5. Thử nghiệm phát hiện HPV 6 và<br /> <br /> - E1 sau khi tinh sạch được xác định nồng độ<br /> ở bước sóng 260 nm bằng máy quang phổ<br /> <br /> HPV 11 trên mẫu bệnh phẩm và so sánh độ<br /> tương đồng với sinh phẩm thương mại<br /> <br /> Nanodrop. Xác định ngưỡng phát hiện của<br /> <br /> Tổng cộng 95 mẫu được sử dụng để thử<br /> <br /> kỹ thuật multiplex real time PCR bằng cách<br /> <br /> nghiệm phát hiện HPV 6 và HPV 11 bởi<br /> master mix chế tạo và chu trình nhiệt thiết lập<br /> <br /> pha loãng nồng độ khuôn plasmid pHPV6 E6/7, pHPV11 - E1 và hỗn hợp 2 plasmid tỷ lệ<br /> 1: 1 ở dải nồng độ 103, 102, 10, 1 copies/µl.<br /> <br /> trong nghiên cứu này. Trong đó, 30 mẫu gồm<br /> 10 mẫu dương tính và 20 mẫu âm tính với<br /> <br /> 5 µl DNA khuôn được bổ sung vào 20 µl mas-<br /> <br /> HPV 6 và 11 được sử dụng để so sánh tương<br /> <br /> ter mix của multiplex real time PCR gồm: TO-<br /> <br /> đồng (tỷ lệ dương tính/âm tính) và độ nhạy<br /> (Ct) giữa sinh phẩm tạo thành trong nghiên<br /> <br /> Preal<br /> <br /> Taqman<br /> <br /> PCR<br /> <br /> master<br /> <br /> mix<br /> <br /> 1X<br /> <br /> 11- Rv/ Fw; 50 nM 6, 11 - HEX probe; 150 nM<br /> <br /> cứu và sinh phẩm thương mại HPV 6/11<br /> REAL-TM (Sacace Biotechnologies, Ý).<br /> <br /> ACTB Rv/Fw; 100 nM ACTB- probe và H2O để<br /> <br /> Toàn bộ thí nghiệm từ mục 2.1 đến 2.4<br /> <br /> đạt tổng thể tích là 25 µl. Phản ứng được thực<br /> <br /> được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng<br /> <br /> (Enzynomics); 250 nM 6, 11 - Rv/Fw; 250 nM<br /> <br /> 0<br /> <br /> hiện với chu trình nhiệt là 95 C - 10 phút;<br /> o<br /> <br /> 0<br /> <br /> điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường<br /> <br /> 45 chu kỳ gồm 95 C - 10 giây; 60 C - 45 giây<br /> <br /> Đại học Khoa học Tự nhiên từ năm 2017 đến<br /> <br /> trên hệ thống Light Cycler 96 (Roche Diagnos-<br /> <br /> 2018. Thí nghiệm ở mục 2.5 được thực hiện<br /> <br /> tics). Ngưỡng phát hiện là nồng độ thấp nhất<br /> <br /> tại cả Khoa Xét nghiệm - Chẩn đoán hình ảnh<br /> <br /> của chứng dương pHPV6 - E6/7 và pHPV11 -<br /> <br /> - Thăm dò chức năng của Trung tâm Kiểm<br /> <br /> E1 trong ống phản ứng mà vẫn phát hiện<br /> <br /> soát Bệnh tật tỉnh Bắc Ninh và Phòng Thí<br /> <br /> được tín hiệu huỳnh quang với giá trị Ct < 40,<br /> <br /> nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và<br /> <br /> được tính bằng giá trị copies/µl DNA khuôn<br /> <br /> Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên<br /> <br /> đầu vào x 5).<br /> <br /> trong năm 2018.<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> 65<br /> <br />