Sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn FITC

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ CHỐNG Fcγ NGƯỜI GẮN FITC<br /> Nguyễn Lê Trang*, Phạm Hoàng Phiệt*, Lê Thị Thanh,<br /> Nguyễn Thị Huyền Ngọc, Âu Thị Chi Lan, Nguyễn Thị Nguyệt Thu<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Việc trang bị phòng thí nghiệm ngày một tốt hơn kèm với đội ngũ những người làm<br /> chuyên về hóa miễn dịch hiện có trong phạm vi Tp Hồ chí Minh, chúng tôi tin rằng mình có thể sản xuất<br /> được một số sinh phẩm miễn dịch có chất lượng dùng trong phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này<br /> chúng tôi đặt mục tiêu là sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn FITC dùng trong miễn dịch huỳnh<br /> quang tổ chức.<br /> Vật liệu, phương pháp và kết quả: Sơ chế IgG người được thực hiện bằng việc cho tủa tập họp<br /> huyết thanh người bình thường trong Ammonium Sulfate 45% bão hòa. IgG sơ chế này được xử ly với<br /> Papain để cắt làm Fcγ và Fab. Dùng cột SKAL Agarose-Protein A để thu hồi Fcγ tinh khiết. Kháng<br /> nguyên Fcγ người được gây miễn dịch cho thỏ để thu hồi kháng thể thỏ chống Fcγ. Phân lập kháng thể đặc<br /> hiệu khỏi globuline miễn dịch chung của thỏ bằng cột SKAL- Fcγ người. Kháng thể thỏ đặc hiệu này được<br /> cộng hợp với FITC để có kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Kháng thể huỳnh quang tự sản xuất của chúng<br /> tôi có hệ số F/P là 1,8 và hàm lượng IgG là 7,6mg/ml.<br /> Sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang tổ chức để phát hiện tự kháng thể thì kháng thể huỳnh quang tự chế<br /> của chúng tôi ít nhất cũng tương đương với kháng thể huỳnh quang mà chúng tôi mua từ công ty DAKO.<br /> <br /> Từ khóa: sắc ký ái lực, miễn dịch huỳnh quang, globuline miễn dịch, Fcγ<br /> <br /> ABSTRACT<br /> PRODUCTION OF FITC CONJUGATED RABBIT ANTI HUMAN FCΓ<br /> Nguyen Le Trang, Nguyen Thi Huyen Ngoc, Le Thi Thanh, Au Thi Chi Lan, Nguyen Thi Nguyet Thu,<br /> Pham Hoang Phiet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 42 - 46<br /> Background: With the improvement of Laboratory equipments and our team Immunochemical experts<br /> available now in HCM city we believe that we are able to produce many immuno reagents commonly used<br /> in our laboratory. In this study,we aim to produce the FITC conjugated Rabbit anti human Fcγ.<br /> Materials, methods and results: For production of purified human Fcγ, we precipitate a pooled<br /> human serum with 45% SAS then digeste the precipitated human IgG with Papain. The purified human<br /> Fcγ was obtained from digested IgG by using the Agarose-Protein A Column. Rabbits were immunized<br /> with this purified human Fcγ to get antiserum. Then specific Rabbit antibody against human Fcγ were<br /> collected by using human Fcγ affinity column. The specific Rabbit antibody was conjugated with FITC to<br /> produce fluorescent specific Rabbit antibody anti human Fcγ. Our fluorescent antiserum has the F/P ratio<br /> of 1.8 and the IgG concentration of 7.6mg/ml.<br /> In Fluorescent Immuno histo chemistry technique to detectect auto antibodies, our fluorescent<br /> antiserum is at least as good as those bought from DAKO company.<br /> <br /> <br /> Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh<br /> Bệnh viện Nhi đồng 2 TP Hồ Chí Minh<br /> <br /> Bộ môn Miễn dịch, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh<br /> <br /> Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh<br /> Địa chỉ liên hệ: CN. Lê Thị Thanh<br /> ĐT: 0908421927.<br /> <br /> <br /> 42<br /> <br /> Email: lethanh_9999@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Key words: affinity chromatography, immunofluorescent, immunoglobulin.<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> Phát hiện sự có mặt của globuline miễn<br /> dịch người được sử dụng để chẩn đoán trong<br /> nhiều bệnh lý nhiễm khuẩn và bệnh tự miễn.<br /> Cho đến nay chúng ta vẫn phải nhập thuốc<br /> thử của ngước ngoài với giá không rẻ và phải<br /> chờ đợi sau khi đặt hàng. Với việc trang bị<br /> máy móc về hóa miễn dịch hiện nay của các<br /> phòng nghiên cứu, các bệnh viện cùng với đội<br /> ngũ cán bộ chuyên ngành hóa miễn dịch sẵn<br /> có vv…chúng tôi nghĩ rằng chúng ta hoàn<br /> toàn có khả năng tự sản xuất được một số sản<br /> phẩm sinh học thông dụng cho chẩn đoán<br /> miễn dịch với chất lượng không thua kém các<br /> sản phẩm mua từ nước ngoài. Trong nghiên<br /> cứu này chúng tôi đặt mục đích là sản xuất<br /> được kháng thể đa dòng của thỏ gắn FITC<br /> chống Fcγ người là thí điểm ban đầu.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Các hóa chất và vật liệu chuyên biệt<br /> dung trong nghiên cứu này bao gồm:<br /> - Cột sắc ký ái lực Agarose – Protein A của<br /> hãng BioRad.<br /> - Tá dược FCA và FIA của hãng Sigma.<br /> - CNBr – Sepharose hoạt tác dạng khô của<br /> hãng Amersham.<br /> - Papaine (Mercuripapain) hãng Sigma.<br /> - FITC của hãng Sigma (mã P3125).<br /> - Kháng thể thỏ chống chuỗi nặng gamma<br /> người cộng hợp FITC của hãng DAKO (có hệ<br /> số F/P = 2,65 và hàm lượng IgG là 3mg/ml)<br /> dùng để so sánh.<br /> Các hóa chất thông thường để pha đệm<br /> các loại mua của hãng Amersham, Sigma.<br /> Tập hợp huyết thanh người bình thường<br /> được tích lại từ các đối tượng kiểm tra sức<br /> khỏe mà kết quả bình thường và âm tính với<br /> HBsAg, anti HCV và anti HIV được giữ trong<br /> tủ lạnh sâu – 20oC đến lúc sử dụng.<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản<br /> <br /> Các công đoạn của quá trình sản xuất Fcγ<br /> người được thực hiện như sau:<br /> - Sơ chế IgG người: huyết thanh người sau<br /> khi đã rã đông được tập hợp lại và ly tâm<br /> 6000 vòng/30 phút. Hút phần trong và loại bỏ<br /> cặn. Phần huyết thanh này được pha loãng ½<br /> trong đệm Sodium Phosphate 0,1M – pH 7.2.<br /> Khuấy nhẹ trên máy khuấy từ ở nhiệt độ<br /> phòng và từ từ nhỏ vào trong huyết thanh<br /> dung dịch Ammonium Sulfate bão hòa một<br /> thể tích để có độ bão hòa là 45% - Huyết<br /> thanh sẽ hình thành tủa lắng xuống. Để dung<br /> dịch qua đêm ở 4 oC.<br /> - Hôm sau loại bỏ nước trong và rửa lại<br /> tủa trong dung dịch Ammonium Sulfate 45%<br /> và ly tâm loại bỏ nước trong giữ tủa. Tiếp đến<br /> ta cho tan tủa với đệm Sodium Phosphate<br /> 0,05M – pH 7,2 với một thể tích bằng hoặc<br /> nhỏ hơn thể tích huyết thanh ban đầu. Chú ý<br /> cần cho đệm vào từ từ và lắc nhẹ để tủa tan<br /> dần và hoàn toàn. Ly tâm bỏ cặn và lấy nước<br /> trong. Để loại sạch muối Ammonium Sulfate<br /> ta thẩm tích trong đệm Phosphate qua đêm ở<br /> 4 oC ( cũng có thể loại trừ muối Ammonium<br /> Sulfate bằng cách cho dung dịch đi qua cột<br /> sắc ký lọc Sephadex G25 Superfine). Tiếp theo<br /> ta ly tâm lấy nước trong. Đây chính là IgG sơ<br /> chế để thực hiện giai đoạn tiếp theo. Kiểm tra<br /> mức tinh khiết của IgG trên điện di SDS –<br /> PAGE và xác định hàm lượng IgG bằng đo ở<br /> bước song 280nm.<br /> - Tinh chế Fcγ người: Dung dịch IgG<br /> người sơ chế được cân bằng trong đệm<br /> Sodium Phosphate 0,1M – pH 7,0 có 0,01M<br /> Cystein và 2mM Na2EDTA. Tính hàm lượng<br /> IgG trong dung dịch để cho Papain với tỷ lệ<br /> Papain/IgG = 1/100. Ủ dung dịch ở 37 oC trong<br /> 4 giờ, môi trường này thuận lợi cho xúc tác<br /> phản ứng cắt phân tử của papain để cho 1 Fcγ<br /> và 2 Fab. Ngưng phản ứng bằng cách cho<br /> thêm vào dung dịch các tinh thể<br /> iodoacetamide để đạt nồng độ 0,1 mg/ml.<br /> Tiếp theo ta thẩm tích dung dịch này trong<br /> <br /> 43<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> đệm Sodium phosphate 0,1M – pH 7,0 ở 4 oC<br /> qua đêm.<br /> - Thu hồi Fcγ tinh chế với cột sắc ký ái lực<br /> (SKAL) Agarose-Protein A. Rửa cột SKAL<br /> Agarose Protein A với 25ml đệm gắn (Sodium<br /> phosphate 0,02M – pH 7,4 tiếp đến cho dần<br /> dung dịch IgG người đã xử lý Papain đi qua<br /> cột và rửa tiếp với đệm gắn. Theo dõi sắc ký<br /> đồ về lượng protein đi ra từ cột đến khi sạch<br /> thì chuẩn bị cho thì giải hấp Fcγ tinh chế.<br /> - Đệm giải glycin 1M – pH 3,0: dưới tác<br /> dụng của pH thấp và nồng độ phân tử cao,<br /> các lực liên kết yếu giữa Fcγ và Protein A bị<br /> tách ra và Fcγ theo đệm giải ra ngoài cột. Để<br /> Fcγ không bị phân hủy bởi pH thấp của đệm<br /> giải ta chuẩn bị sẵn ở ống hứng mỗi ống 1ml<br /> đệm trung hòa TRIS 1M – pH 9,0. Thẩm tích<br /> dung dịch thu hồi Fcγ trong đệm Sodium<br /> phosphate 0,05M – pH7,2 qua đêm ở 4oC. Đo<br /> độ protein được giải ra ở bước song 280nm và<br /> kiểm tra mức tinh khiết với điện di SDS –<br /> PAGE.<br /> <br /> Gây miễn dịch trên thỏ với kháng<br /> nguyên Fcγ người:<br /> Thỏ 1 năm tuổi có trọng lượng trên 2kg<br /> được sử dụng để gây miễn dịch.<br /> Dung dịch kháng nguyên Fcγ trong PBS có<br /> thể tích 0,5ml được làm thành nhũ tương<br /> nước trong dầu (water in oil) với 0,5ml tá<br /> được Freund và tiêm vào trong da dọc theo 2<br /> bên cột sống, mỗi bên 2 dãy và mỗi dãy 10<br /> điểm ( mỗi điểm 25l). Mỗi lần tiêm cách<br /> nhau 4 tuần với tổng số 7 lần tiêm gồm 1 lần<br /> gây mẫn cảm và 6 lần tiêm nhắc. Lượng<br /> kháng nguyên tiêm được giảm dần theo thứ<br /> tự liều tiêm như sau 100g, 100g, 50g, 25g,<br /> 20g, 20g và 20g. Với tá dược lần đầu là<br /> Freund hoàn chỉnh (FCA)và sau đó là Freund<br /> không hoàn chỉnh(FIA). Sau lần tiêm nhắc thứ<br /> hai 2 tuần lấy máu thử hiệu giá kháng thể<br /> chống Fcγ bằng kỹ thuật Ouchterlony. Chỉ sử<br /> dụng các thỏ có hiệu giá kháng thể từ 1/16 trở<br /> lên mà thôi. Sau lần tiêm nhắc 3, 4, 5 ba tuần<br /> lấy máu mỗi thỏ khoảng 50ml và tiếp tục nuôi<br /> <br /> 44<br /> <br /> dưỡng và sau lần tiêm nhắc thứ sáu 3 tuần thì<br /> lấy máu toàn bộ. Máu lấy được ly trích huyết<br /> thanh và cho tủa trong Ammonium Sulfate<br /> như trên để sơ chế IgG thỏ.<br /> - Để thu được IgG thỏ đặc hiệu chống Fcγ<br /> người chúng tôi dùng dung dịch IgG thỏ sơ<br /> chế trong đệm Sodium phosphate đi qua cột<br /> SKAL- Fcγ do chúng tôi tự tạo ra(1). Kháng<br /> thể thỏ đặc hiệu được giữ lại và chỉ thoát ra<br /> khi sử dụng đệm giải. Cách tiến hành như khi<br /> thực hiện với cột Agarose - Protein A đã trình<br /> bày ở trên.<br /> <br /> Cộng hợp FITC lên kháng thể đặc hiệu<br /> thỏ:<br /> Dung dịch IgG thỏ đặc hiệu (đậm độ<br /> protein<br /> 8,8mg/ml) được khuấy nhẹ rồi từ<br /> từ cho đệm Sodium Bicarbonate 0,5M – pH 9,0<br /> vào để pH đạt đến 8,5. Tiếp theo từ từ cho<br /> dung dịch FITC trong cồn tuyệt đối<br /> (50mg/500ml) để đạt đậm độ FITC 2mg/ml và<br /> để khuấy từ 4 oC qua đêm. Hôm sau đem thẩm<br /> tích dung dịch trong đêm PBS pH 7,2 ở 4 oC<br /> một ngày và cho qua cột Sephadex G25. Phân<br /> khúc chảy ra trước là IgG thỏ cộng hợp với<br /> FITC còn FITC tự do (không cộng hợp với<br /> protein) ra sau.<br /> Dung dịch IgG thỏ cộng hợp FITC được<br /> quét trên máy quang phổ với bước sóng từ<br /> 250 nm đến 600nm. Từ kết quả này tính được<br /> tỷ lệ F/P (phân tử FITC/phân tử IgG) và nồng<br /> độ IgG.<br /> F/P = (2,77 x Abs 495) / [Abs 280 – (0,35<br /> x Abs 495)]<br /> Và IgG (mg/ml) = [Abs280 – (0,35 x Abs<br /> 495)] / 1,4<br /> Các hệ số 2,77 và 0,35 được sử dụng<br /> theo khuyến cáo của nhà sản xuất FITC<br /> (Sigma) mà chúng tôi sử dụng.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Từ 100ml tập hợp huyết thanh người bình<br /> thường qua tủa trong Ammonium Sulfate<br /> chúng tôi thu được khoảng 430mg IgG người<br /> sơ chế. Kỹ thuật tủa này là đơn giản, không<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> đòi hỏi máy móc và thiết bị phức tạp mà lại<br /> cho phép tiến hành với một số lượng lớn<br /> huyết thanh (2). Tuy nhiên IgG sơ chế có độ<br /> tinh khiết không cao như chúng ta thấy trên<br /> kiểm tra qua điện di SDS – PAGE cả trước và<br /> sau xử lý với β-mercaptoethanol. Tuy nhiên<br /> nguyên liệu IgG sơ chế này đủ để tiến hành<br /> phân cắt với papain và từ đó thu hồi Fcγ<br /> người tinh khiết vì chúng tôi còn sử dụng cột<br /> SKAL Agarose – Protein A để tinh chế sau đó.<br /> Sử dụng 87mg IgG người sơ chế xử lý với<br /> papain trong môi trường thích hợp và dùng<br /> cột SKAL Agarose – Protein A để thu hồi Fcγ<br /> người tinh khiết (1). Kết quả thu hồi của chúng<br /> tôi là 29mg Fcγ. So sánh với lượng đưa vào<br /> chúng tôi thu lại 29/87= 33,3%; tỷ lệ này rất<br /> phù hợp với lý thuyết vì khi phân cắt phân tử<br /> IgG sẽ cho 1/3 là Fcγ còn 2/3 là ở dạng Fab(8).<br /> Chính nhờ liên kết đặc hiệu của Protein A với<br /> thụ thể Fc nên đã cho phép bước chuẩn bị IgG<br /> người không bắt buộc có độ tinh khiết cao.<br /> Trong quá trình gây miễn dịch trên thỏ.<br /> Thoạt đầu chúng tôi nuôi 4 thỏ ở 6 tháng tuổi<br /> có trọng lương trên 1kg song sau 6 tháng chỉ<br /> 3 thỏ đạt trên 2 kg và được sử dụng để gây<br /> miễn dịch. Tiêm kháng nguyên trong tá dược<br /> Freund phải được chuẩn bị ở dạng nước trong<br /> đầu mới gây được áp ứng miễn dịch tốt. Đặc<br /> điểm khi tiêm chúng tôi sử dụng nhiều mũi<br /> tiêm (40 mũi tiêm mỗi lần) với thể tích tiêm<br /> chỉ 25ul mỗi mũi.Thể tích nhỏ để tránh gây<br /> hoại tử tại chỗ nhất là ở mũi đầu khi dùng tá<br /> dược là FCA. Mặt khác việc tiêm lặp lại nhiều<br /> lần với lượng kháng nguyên giảm dần tạo<br /> điều kiện để có các dòng kháng thể có đặc<br /> hiệu cao và ái lực tốt. Sau 2 lần tiêm nhắc cả 3<br /> thỏ đều đạt hiệu giá kháng thể từ 1/32 đến<br /> 1/64 nên đều được sử dụng để bào chế IgG<br /> thỏ đặc hiệu chống Fcγ người bằng cột SKAL<br /> Sepharose- Fcγ người (3). Kết quả số máu lấy<br /> được từ 3 thỏ là 577ml và chiết ra được 300ml<br /> huyết thanh. Tổng lượng IgG thỏ sơ chế ước<br /> tính là 2800mg. Sử dụng 117mg IgG thỏ sơ chế<br /> để chiết ra IgG thỏ đặc hiệu chúng tôi thu<br /> được 36,5mg IgG thỏ đặc hiệu (31,2%). Đây là<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> một tỷ lệ cao chứng tỏ đáp ứng miễn dịch trên<br /> thỏ rất tốt.Tiến hành cộng hợp FITC vào<br /> kháng thể chúng tôi sử dụng trong đệm<br /> Sodium Bicarbonate ở độ kiềm cao đã được<br /> nhiều tác giả áp dụng(4).<br /> Sau khi tiến hành cộng hợp IgG đặc hiệu<br /> với FITC và qua cột SKL Sephadex G25,từ<br /> hàm lượng IgG ban đầu là 8,8 mg/L ta thu<br /> được IgG cộng hợp có hàm lượng IgG là 7,6<br /> mg/ml (tỷ lệ thu hồi 86%) và có hệ số F/p là<br /> 1,8.<br /> Tiến hành song song kỹ thuật miễn dịch<br /> huỳnh quang tổ chức để phát hiện kháng thể<br /> tự miễn lớp IgG bằng kháng thể huỳnh quang<br /> của hang DAKO và của chúng tôi trên các<br /> bệnh Lupus đỏ hệ thống, bệnh Graves(6,7,9). Có<br /> 3 mẫu âm tính và 15 mẫu dương tính đều phù<br /> hợp. Độ pha loãng của kháng thể DAKO là<br /> 1/40 và của chúng tôi là 1/120 (có độ sáng<br /> tương đương hoặc của chúng tôi còn sáng<br /> hơn). Tuy nhiên do hàm lượng IgG thỏ trong<br /> kháng thể huỳnh quang của chúng tôi cao<br /> hơn (7,6 mg/ml so với 3 mg/ml) nên tính đậm<br /> độ kháng thể ở thức pha loãng sử dụng thì 2<br /> loại là tương đương: của DAKO là 0,075<br /> mg/ml và của chúng tôi là 0,063 mg/ml.<br /> Theo ước tính của chúng tôi việc sản xuất<br /> trong nước giá thành sản phẩm chỉ khoảng<br /> 50% hay thấp hơn so với mua của nước ngoài.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Với đội ngũ cán bộ và máy móc trang bị<br /> hiện có chúng tôi đã bào chế thành công<br /> kháng thễ thỏ đặc hiệu Fcγ người gắn FITC có<br /> chất lượng ít nhất cũng tương đương với sản<br /> phẩm chúng tôi vẫn mua ở nước ngoài để sử<br /> dụng (từ công ty DAKO). Các kỹ thuật hóa<br /> miễn dịch được sử dụng bao gồm tủa IgG<br /> trong Ammonium Sulfate, cắt phân tử IgG với<br /> Papain, SKAL Agorose – Protein A và SKAL<br /> Fcγ để tinh chế Fcγ người và IgG thỏ đặc hiệu<br /> chống Fcγ người. Tiến trình của quá trình<br /> cộng hợp IgG đặc hiệu với FITC không gặp<br /> một trỏ ngại lớn nào.Việc sử dụng kháng thể<br /> huỳnh quang tự chế này trong các kỹ thuật<br /> <br /> 45<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> miễn dịch huỳnh quang mô học được thực<br /> hiện theo quy trình thường quy của phòng thí<br /> nghiệm. Hiện nay chúng tôi đã sử dụng hoàn<br /> toàn kháng thể huỳnh quang tự chế trong xét<br /> nghiệm thường quy về hóa mô miễn dịch<br /> huỳnh quang.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 46<br /> <br /> Fahey J.L. (1967). Chromatographic separation of<br /> immunoglobulins in method of immunology. 321-332,<br /> Chase M & WIlliams C.A . Academic Press inc: Newyork.<br /> Heide K., Schwick H.G. (1973). Salt fractionation of<br /> immunoglobulins in immunochemistry. DM.Weir. Chapter<br /> 6. Blackwell Scientific Publication.<br /> Hermanson G.T., Krishna A., Mallia P.K (1992). Smith<br /> immobilized affinity Ligand Techniques chapter 3.<br /> Academic press.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Hudson L., Hay FiC. (1980). Practical immunology, chapter<br /> 7. Isolation and structure of immunoglobulins. Blackwell<br /> Scientific.<br /> Nguyễn Thị Huyền Ngọc (2010). Thu thập IgG người lành<br /> làm kháng nguyên để tạo kháng thể đặc hiệu. Luận văn thạc<br /> sĩ. Trường Đại học khoa học tự nhiên,Thành phố<br /> Hồ chí Minh.<br /> Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune<br /> Diseases. Chapter 17: Systemic Lupus Erythematosus.<br /> Acadamic Press, Third Edition.<br /> Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune<br /> Diseases. Chapter 22: Autoimmune Thyroid Diseasee.<br /> Acadamic Press, Third Edition.<br /> Stanworth DR., Turner M.W. (1986). Immunochemical<br /> analysis of human and rabbit immunoglobulins and their<br /> subunits in immunochemistry. Chapter 12, D.M. Weir.<br /> Blackwell Scientific Publications.<br /> Stites D.P. , Terr Abba I. , Parslow Tristam G. (1994). Basic<br /> and Clinical Immunology. Chapter 12: Clinical Laboratory<br /> Methods for detection of Antigens and Antibodies.<br /> Appleton & Lange.<br /> <br /> Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> <br />