Sàng lọc và thử nghiệm tạo chế phẩm gây tan huyết khối từ vi khuẩn Bacillus sp.

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm sàng lọc khả năng sinh enzyme nattokinase của các chủng Bacillus mới được phân lập trong tự nhiên và thử nghiệm tạo sản phẩm gây tan huyết khối từ chủng chọn lọc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sàng lọc và thử nghiệm tạo chế phẩm gây tan huyết khối từ vi khuẩn Bacillus sp.

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.000108 SÀNG LỌC VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM GÂY TAN HUYẾT KHỐI TỪ VI KHUẨN Bacillus sp. *Trần Ngọc Hùng Tóm tắt: Huyết khối là một trong những nguyên nhân chính gây ra đột quỵ. Các loại sản phẩm chứa enzyme nattokinase được xem là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để phòng ngừa căn bệnh này. Trong số 11 chủng Bacillus được khảo sát, chủng Ba 07 và Ba 10 nuôi cấy bán rắn 48 giờ cho hiệu quả gây tan huyết khối cao nhất, đạt lần lượt 99,3 và 98,6% ở tỉ lệ pha loãng 25 lần, cao hơn đáng kể so với khi nuôi cấy trên môi trường lỏng. Sản phẩm thử nghiệm từ chủng Bacillus Ba 10 có hiệu suất tan huyết đạt 82% ở tỉ lệ pha loãng 50 lần, cao hơn sản phẩm cùng loại trên thị trường và có hoạt tính ổn định sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ 5 oC. Từ khóa: Tan huyết khối lợn, nattokinase, Bacillus sp. 1. MỞ ĐẦU Đột quỵ là căn bệnh nguy hiểm, có tỉ lệ tử vong và biến chứng rất cao nếu không được cấp cứu kịp thời. Một trong những nguyên nhân gây nên đột quỵ là huyết khối. Huyết khối có thể hình thành ngay cả khi mạch máu không bị tổn thương, làm gián đoạn dòng chảy và cắt đứt nguồn cung cấp oxy cho cơ thể. Các yếu tố như tổn thương thành mạch, thay đổi về tính chất dòng chảy, tính chất của máu có thể làm gia tăng nguy cơ hình thành huyết khối (Trương Thị Minh Hạnh và nnk., 2016). Vai trò làm tan huyết khối của nattokinase đã được các nhà khoa học chứng minh bằng nhiều thử nghiệm trên động vật thực nghiệm và trên người. Thêm vào đó, enzyme nattokinase an toàn ở liều rất cao và không gây ra bất kỳ tác dụng phụ nào nghiêm trọng. Đây là lợi thế vượt trội so với các thuốc hóa dược chống đông máu khác như aspirin và warfarin. Nguồn enzyme nattokinase thu nhận chủ yếu từ Bacillus subtilis (Haritha & Meena, 2011). Ở Nhật Bản, nhiều nghiên cứu đã cho ra đời các sản phẩm phục vụ cho việc điều trị bệnh tai biến và đột quỵ như: Nattokinase Orihiro, Ginkgo Natto, DHA Natto Q10, NattoEnzyme, NattoKan… Hầu hết các sản phẩm trên đều dựa trên việc nuôi cấy từ chủng Bacillus subtilis. Sản phẩm của các công ty dược trong nước chủ yếu sử dụng nguồn nhiên liệu ngoại nhập, điển hình như Công ty CP Dược Hậu Giang nhập nguyên liệu nattokinase từ Công ty JBSL của Nhật để sản xuất sản phẩm. Những nghiên cứu trong nước trong khoảng gần mười năm trở lại đây rất đa dạng về nội dung, từ các nghiên cứu phân lập, sàng lọc, định danh cho đến các đề tài tạo dòng và thử nghiệm sản xuất. Nổi bật trong đó có thể kể tới các nghiên cứu của Lê Thị Bích Phượng (2012); Trần Quốc Tuấn (2014); Trương Thị Minh Hạnh (2016) hay Dương Thị Minh Phụng (2016) với đề tài nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất enzyme nattokinase từ đậu nành và sản xuất viên thực phẩm chức năng nattokinase... Nghiên cứu Trường Đại học Thủ Dầu Một Email: hungtngoc@tdmu.edu.vn
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 871 này được thực hiện nhằm sàng lọc khả năng sinh enzyme nattokinase của các chủng Bacillus mới được phân lập trong tự nhiên và thử nghiệm tạo sản phẩm gây tan huyết khối từ chủng chọn lọc. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu Các chủng Bacillus: được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống, do Phòng thí nghiệm Bộ môn sinh học, Trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp. Huyết khối: chợ Thủ Dầu Một và chợ Đình ở thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương. Chế phẩm NattoKan do Công ty Sinh học Phương Nam sản suất, hàm lượng enzyme nattokinase đạt 600 FU/g. Chế phẩm NattoEnzyme do Công ty Cổ phần Traphaco sản xuất, mỗi viên chứa nattokinase 500 FU, Coenzym Q10 10 mg, Rutin 20 mg, Magnesoxyd 40 mg. 2.2.Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease Dựa trên khả năng thủy giải casein một cách đặc hiệu của protease. Trong quá trình phát triển, protease do Bacillus sinh ra sẽ thủy giải casein tạo thành vòng phân giải trong suốt. Các chủng vi khuẩn Bacillus thí nghiệm được cấy điểm trên môi trường định tính enzyme protease (casein 4 g, glucose 0,05 g, pepton 0,2 g, NaCl 3 g, K2HPO4 1,5 g, agar 15 g, nước vừa cho đủ 1 L). Ủ ở 37 oC. Sau 3 ngày, 10 mL dung dịch TCA 5% được thêm vào các đĩa cấy để vòng phân giải rõ hơn. Phương pháp đánh giá khả năng tan huyết khối của canh trường nuôi cấy lỏng Dịch chiết canh trường nuôi cấy Bacillus sp. có chứa enzyme nattokinase sẽ làm tan cục huyết khối. Khả năng làm tan huyết khối được đánh giá thông qua lượng máu đông bị tan ra. Trên môi trường lỏng: nuôi cấy các chủng Bacillus sp. trên môi trường có thành phần: bột gạo 5%, bột đậu nành 4%, NH4NO3 0,5%, CaCl2 0,01%, pH 7,0. Sau 72 giờ, dịch chiết được thu nhận bằng cách ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Cho 5 mL dịch chiết canh trường nuôi cấy vào các đĩa petri vô trùng có chứa 2 g huyết lợn đông. Ủ trong 6 giờ ở 37 oC, cân trọng lượng cục huyết lợn còn lại. Lượng huyết tan ra cho thấy khả năng tan huyết khối của các dịch chiết (Lê Thị Bích Phượng và cộng sự, 2012). Trên môi trường bán rắn: Chủng Bacillus sp. đã chọn lọc được cấy vào môi trường tăng sinh (giá đậu 100 g, glucose 50 g, pepton 10 g, nước cất vừa đủ 1 L); sau 24 giờ cấy dịch vào môi trường bán rắn (bắp xay 15 g, đậu nành 15 g, ZnSO4 0,000105 M, NaCl 0,108 M, MgSO4 0,015 M, KCl 0,03 M, (NH4)2HPO4 0,06 M, CaCO3 0,18 M, nước 45 mL). Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày (Trần Ngọc Hùng, 2010). Môi trường lên men dạng bột mịn được pha loãng 50 lần trong nước cất, ly tâm thu dịch ở nhiệt độ 5 oC trong thời gian 10 phút, tốc độ 5.000 vòng/ phút. Hút 5 mL dịch ly tâm cho vào các đĩa petri vô trùng có chứa 2 g huyết khối. Sau 6 giờ, cân lại huyết khối ở các đĩa petri để xác định hiệu suất làm tan huyết. Nghiệm thức (NT) đối chứng cũng tiến
872 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM hành với dịch ly tâm được bất hoạt bằng cách đun cách thủy 30 phút. Hiệu suất tan huyết được đánh giá theo công thức. 𝑚0−𝑚1 Hiệu suất tan huyết (%) = × 100 𝑚0 Với, m0: Khối lượng cục huyết lợn ban đầu (2 g); m1: Khối lượng cục huyết lợn sau khi xử lý. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 5 lần. Xử lý thống kê ANOVA bằng phần mềm Stargraphic Centurion 15. 2.3. Bố trí thí nghiệm Sàng lọc vi khuẩn Bacillus sp. sinh protease trên môi trường thạch đĩa Cấy các chủng Bacillus vào đĩa petri có chứa môi trường định tính. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 oC, sau 3 ngày, xác định đường kính vòng phân giải casein của các chủng. Chọn lọc các chủng có vòng phân giải casein lớn nhất để tiến hành thử nghiệm khả năng tan huyết khối. Đánh giá khả năng tan huyết khối của canh trường nuôi cấy lỏng Nuôi cấy lắc các chủng Bacillus trên môi trường lỏng. Sau 72 giờ, thu nhận dịch chiết bằng cách ly tâm. Cho 5 mL dịch chiết của mỗi chủng vào các đĩa petri có chứa 2 g huyết lợn đông. Ủ trong 6 giờ ở 37 oC, cân trọng lượng cục huyết lợn đông còn lại sau khi ủ. Lượng huyết tan ra cho thấy khả năng tan huyết khối của các dịch chiết. Chọn lọc chủng Bacillus sp. có khả năng làm tan huyết khối tốt nhất để thử nghiệm nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Đánh giá khả năng phân giải khả năng tan huyết khối của canh trường nuôi bán rắn Các chủng Bacillus được tăng sinh trong 24 giờ. Sau đó hút dịch tăng sinh cho vào môi trường bán rắn. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 oC, sau 48 giờ và 72 giờ, thu nhận môi trường lên men và định tính khả năng làm tan huyết khối của sản phẩm ở tỉ lệ pha loãng 25 lần. Chọn lọc chủng Bacillus sp. có khả năng làm tan huyết khối tốt nhất để so sánh các sản phẩm trên thị trường. So sánh khả năng tan huyết khối của chế phẩm bán rắn với một số sản phẩm khác Môi trường nuôi cấy bán rắn chủng Bacillus sp. chọn lọc được pha loãng 25 và 50 lần, ly tâm và thu dịch. Cho vào mỗi đĩa petri có chứa 2 g huyết khối và 5 mL dịch lọc. Mỗi NT lặp lại 3 lần. Đối với các chế phẩm trên thị trường: chế phẩm Nattoenzym được thực hiện ở độ pha loãng 50 và 100 lần; chế phẩm NattoKan mỗi đĩa petri chứa 1 viên con nhộng (0,5 g) được hòa tan trong 5 mL nước cất. NT đối chứng được thực hiện với chế phẩm enzyme bị bất hoạt bằng cách đun sôi cách thủy 30 phút. Sau 6 giờ, cân lại khối lượng huyết khối và đánh giá hiệu suất làm tan huyết khối của các chế phẩm. Bảng 1. Hiệu suất làm tan huyết khối của các sản phẩm sau 6 giờ xử lý
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 873 Nội dung Nghiệm thức Sản phẩm Ba 10 bất hoạt NT đối chứng Sản phẩm Ba 10 pha loãng 25 lần NT1 Sản phẩm Ba 10 pha loãng 50 lần NT2 Nattoenzyme pha loãng 50 lần NT3 Nattoenzyme pha loãng 100 lần NT4 NattoKan pha loãng 10 lần (0,5 g) NT5 Đánh giá hoạt tính gây tan huyết của chế phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm giàu nattokinase được bảo quản ở nhiệt độ 5 oC trong các túi PE hàn kín miệng. Sau 6 tháng và 12 tháng, sản phẩm được đánh giá hiệu quả tan huyết khối sau 6 giờ xử lý và so sánh với trước khi bảo quản. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sàng lọc vi khuẩn Bacillus sp. sinh enzyme protease trên môi trường thạch đĩa. Cấy các chủng Bacillus sp. vào đĩa petri có chứa môi trường định tính protease. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 oC, sau 3 ngày, xác định đường kính vòng phân giải casein của các chủng được thể hiện trong Hình 1. 14.0 Đường kính vòng phân giải b b 12.0 b bd bd casein (mm) 10.0 ac ac 8.0 a a a 6.0 4.0 e 2.0 0.0 Ba01 Ba02 Ba03 Ba04 Ba05 Ba06 Ba07 Ba08 Ba09 Ba10 Ba79 Chủng Bacillus Hình 1. Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của các chủng Bacillus sp. Các ký tự khác nhau trên mỗi cột biểu thị sự sai khác ở độ tin cậy 95% (P
874 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Thu nhận dịch chiết nuôi cấy lỏng của các chủng Bacillus sp. chọn lọc rồi cho vào các đĩa petri có chứa 2 g huyết lợn đông. Ủ trong 6 giờ ở 37 oC, hiệu suất gây tan huyết được thể hiện trong Hình 2. ,30 c Hiệu suất tan huyết ,25 ,20 (%) ab ,15 a a a a ,10 ,05 ,00 Ba03 Ba04 Ba07 Ba10 Ba79 Đ/c Canh trường lỏng Hình 2. Biểu đồ thể hiện hiệu suất tan huyết khối của canh trường lỏng. Các ký tự khác nhau trên mỗi cột biểu thị sự khai khác ở độ tin cậy 95% (P
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 875 chủng còn lại hiệu suất nằm trong khoảng 32,3-78,4%. Sau 72 giờ nuôi cấy, hoạt tính tan huyết của chủng Ba 04 tăng đáng kể, từ 51,5% lên đến 91,7% trong khi các chủng còn lại thay đổi không nhiều. Khả năng tan huyết của các chủng Bacillus Ba 07 và Ba 10 vẫn đạt 100%. Hiệu quả gây tan huyết và thời gian thu nhận chế phẩm cũng tương tự như công bố của tác giả Lê Thị Bích Phượng, tốt nhất từ 40 đến 48 giờ (Lê Thị Bích Phượng và nnk., 2012). So với kết quả của Trương Thị Minh Hạnh (2016) công bố, sản phẩm của chúng tôi có thời gian gây tan huyết nhanh hơn 2 giờ. Bước đầu, chúng tôi chọn chủng Ba 10 để tạo sản phẩm bán rắn và so sánh với một số sản phẩm cùng loại trên thị trường. Song song đó, chủng Bacillus Ba 10 cũng được giải trình tự DNA vùng 16S rRNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy chủng Ba 10 thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens với độ trùng khớp 100% (E value = 0). So với hầu hết các nghiên cứu trước đều cho thấy chủng sinh enzyme nattokinase đều thuộc nhóm Bacillus subtilis (Lê Thị Bích Phượng và nnk., 2012; Trương Thị Minh Hạnh và nnk., 2016; Đỗ Thị Hoàng Tuyến và nnk., 2017), kết quả định danh của chúng tôi bước đầu cho thấy chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả năng gây tan huyết, là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến đặc tính enzyme nattokinase từ chủng này. So sánh khả năng tan huyết khối của sản phẩm bán rắn với một số sản phẩm khác Chế phẩm thử nghiệm được so sánh với hai sản phẩm phổ biến đặc trị tai biến mạch máu não là chế phẩm NattoKan do Công ty Cổ phần Traphaco sản xuất (mỗi viên chứa Nattokinase 500 FU, Coenzym Q10 10 mg, Rutin 20 mg, Magnesoxyd 40 mg) và bán thành phẩm Nattoenzyme do Công ty Sinh học Phương Nam sản xuất, hàm lượng enzyme nattokinase đạt 600 FU/g. 110 b b 100 Hiệu suất tan huyết (%) 90 c 80 70 d 60 a 50 40 e 30 20 10 0 NT ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Hình 4. Biểu đồ thể hiện hiệu suất làm tan huyết khối của các sản phẩm. Các ký tự khác nhau trên mỗi cột biểu thị sự khai khác ở độ tin cậy 95% (P
876 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM chức năng ở dạng tinh chế, nguồn gốc ngoại nhập, kết quả thí nghiệm là cơ sở để chúng tôi nâng cao hơn nữa khả năng sinh enzyme nattokinase của chủng, tiến tới việc sản xuất các sản phẩm hỗ trợ điều trị huyết khối trong nước với giá thành rẻ và có thể sử dụng như một loại thức ăn hằng ngày. Đánh giá hoạt tính gây tan huyết của chế phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm thử nghiệm được bảo quản ở 5 oC. Hiệu quả gây tan huyết được đánh giá sau 6 tháng và 12 tháng với nhiều tỉ lệ pha loãng chế phẩm khác nhau. 120 c c Ban đầu Hiệu suất tan huyết khối (%) 100 6 tháng d 12 tháng d d 80 d d e 60 a a b 40 b 20 0 Đối chứng 10 lần 50 lần 100 lần Tỷ lệ pha loãng mẫu Hình 5. Biểu đồ thể hiện hoạt tính gây tan huyết của chế phẩm sau thời gian bảo quản. Các ký tự khác nhau trên mỗi cột biểu thị sự khai khác ở độ tin cậy 95 % (P
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 877 enzyme nattokinase từ natto thương phẩm. Tạp chí Khoa học công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 9(106): 73-77. Trần Ngọc Hùng, 2010. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm. Luận văn thạc sĩ, Chuyên ngành Sinh hóa - Vi sinh, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP. HCM. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương, 2012. Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 99-104. Dương Thị Minh Phụng, 2016. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất enzym nattokinase từ đậu nành và sản xuất viên thực phẩm chức năng nattokinase. Đề tài nghiên cứu khoa học tỉnh Đồng Tháp. Trần Quốc Tuấn, Nguyễn Thị Thu Kiều, Lê Thị Thúy Ái, Đinh Minh Hiệp, Trần Cát Đông, 2014. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men chủng Bacillus subtillis. Tạp chí Sinh học, 36(lSE): 130-137. Đỗ Thị Hoàng Tuyến, Lê Thị Bích Phượng, Lê Trần Nhật Anh, Nguyễn Thị Mỹ Trang, 2017. Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính Nattokinase cao và khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố đối với quá trình lên men thu nhận Nattokinase. Tạp chí Khoa học - Đại học Thủ Dầu Một, 4(35): 55-62. Haritha M., Meena V., 2011. Nattokinase: A review on fibrinolytic enzyme. International of chemichal, enbicronmental and pharmaceutical research, 2(1): 61-66. SCREENING AND TRIAL PRODUCING THE PRODUCT CAUSES DISSOLVING THE BLOOD CLOTS FROM Bacillus sp. *Tran Ngoc Hung Abstract: Blood clots are one of the main causes of stroke. Products containing nattokinase is the most effective method to prevent this disease. Among 11 Bacillus strains, two strains named Ba 07 and Ba 10 were cultured in the semi- solid medium for 48 hours and showed the highest effectivity of dissolving blood clots at 99.3% and 98.6% respectively at the dilution rate of 25 times. This result is significantly higher than when cultured in liquid medium. The trial Ba 10 product has a effectivity of dissolving blood clots of 82% at the dilution rate of 50 times, higher than similar products on market. This product also has a stable activity level for 6 months at 5 oC. Keywords: Bacillus sp., dissolving blood clots, nattokinase. Thu Dau Mot University Email: hungtngoc@tdmu.edu.vn