Sinh tổng hợp mới (De Novo) liên tục và chuyển hoá nhanh thành bilirubin của haem là cần thiết đối với cơ chế bảo vệ tế bào

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> <br /> SINH TỔNG HỢP MỚI (DE NOVO) LIÊN TỤC<br /> VÀ CHUYỂN HOÁ NHANH THÀNH BILIRUBIN CỦA HAEM<br /> LÀ CẦN THIẾT ĐỐI VỚI CƠ CHẾ BẢO VỆ TẾ BÀO<br /> Trần Tiến Tài*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Haem đóng vai trò một thành phần cấu tạo của nhiều protein tham gia vào quá trình vận chuyển<br /> oxy, chuỗi hô hấp và chuyển hoá thuốc. Tuy vậy, quá trình dị hoá của haem ở tế bào động vật vẫn còn nhiều điều<br /> chưa sáng tỏ. Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) và biliverdin, chất sau đó được chuyển hoá thành<br /> bilirubin. Do việc định lượng bilirubin tương đối phức tạp, dù có quan trọng về mặt lâm sàng lâm sàng,quá trình<br /> sản xuất và vận chuyển sản phẩm này còn nhiều điều chưa được làm rõ.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu:Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng UnaG, một loại protein<br /> huỳnh quang gắn bilirubin được tìm thấy gần đây, vào việc khảo sát bilirubin trên nhiều dòng tế bào người.<br /> Kết quả:Chúng tôi tìm thấy một lượng bilirubin đáng kể được tạo ra ở nhiều dòng tế bào không phải huyết<br /> cầu. Những kết quả thu được cho thấy có sự tổng hợp haem ở mức cơ sở và sự chuyển hoá tiếp tục thành<br /> bilirubin. Đáng chú ý, nhiều biến đổi quan trọng được ghi nhận với bilirubin khi tế bào ở trạng thái tress.<br /> Kết luận: Do tổn thương tế bào khi stress bị thúc đẩy bởi sự phong toả chuyển hoá haem nhưng lại được cải<br /> thiện bởi việc bổ sung biliverdin và bilirubin, có khả năng sự tổng hợp mới haem và chuyển hoá thành bilirubin<br /> theo sau đó đóng vai trò không thể thiếu trong bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương.<br /> Từ khoá: bilirubin, haem, bảo vệ tế bào<br /> ABSTRACT<br /> CONTINUOUS DE NOVO BIOSYNTHESIS OF HAEM AND ITS RAPID TURNOVER TO<br /> BILIRUBIN ARE NECESSARY FOR CYTOPROTECTION AGAINST CELL DAMAGE<br /> Tran Tien Tai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 42 - 51<br /> <br /> Background: It is well known that haem serves as the prosthetic group of various haemoproteins that<br /> function in oxygen transport, respiratory chain, and drug metabolism. However, much less is known about the<br /> functions of the catabolites of haem in mammalian cells. Haem is enzymatically degraded to iron, carbon<br /> monoxide (CO), and biliverdin, which is then converted to bilirubin. Owing to difficulties in measuring bilirubin,<br /> however, the generation and transport of this product remain unclear despite its clinical importance.<br /> Objectives-Method: We used UnaG, the recently identified bilirubin-binding fluorescent protein, to<br /> analyses bilirubin production in a variety of human cell lines.<br /> Results:We detected a significant amount of bilirubin with many non-blood cell types, which was sensitive<br /> to inhibitors of haem metabolism. These results suggest that there is a basal level of haem synthesis and its<br /> conversion into bilirubin. Remarkably, substantial changes were observed in the bilirubin generation when cells<br /> were exposed to stress insults.<br /> Conclusion: Since the stress-induced cell damage was exacerbated by the pharmacological blockade of haem<br /> metabolism but was ameliorated by the addition of biliverdin and bilirubin, it is likely that the de novo synthesis of<br /> haem and subsequent conversion to bilirubin play indispensable cytoprotective roles against cell damage.<br /> <br /> *Bộ môn Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch học, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Trần Tiến Tài ĐT: 0908610974 Email: trantientai@pnt.edu.vn<br /> 42 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Key worlds: bilirubin, haem, against cell damage<br /> MỞ ĐẦU qua chất cảm ứng với stress HO-1(34,13). Vì vậy, sự<br /> cảm ứng HO-1 sinh lý có khả năngbảo toàn mô<br /> Haem cần 8 men trong quá trình sinh tổng trước các stress oxy hoá, góp phần vào sự điều<br /> hợp và 3 men cho sự giáng hoá nó. Ba bước khởi<br /> hoà các đáp ứng viêm in vivo, và hoạt động như<br /> đầu và kết thúc của tổng hợp hợp haem diễn ra<br /> một cơ chế tự vệ của mô(34,13,19). Tuy nhiên, cơ chế<br /> trong ty thể. Trongphản ứng đầu tiên, 5-<br /> chính xác của phản ứng HO-1 đối với chức năng<br /> aminolevulenic acid (ALA) synthase xúc tác sự<br /> bảo vệ này vẫn còn chưa rõ.<br /> ngưng kết glycine và succinyl-CoA tạo thành<br /> Gần đây,protein huỳnh quang tìm thấy trong<br /> ALA(36,30). Ferrochelatase là men tổng hợp cuối<br /> lươn UnaG được phát hiện gắn với bilirubin tự<br /> cùng, xúc tác cho việc gắn sắt vào<br /> do với ái lực cao(18). Việc định lượng bilirubin<br /> protoporphyrin IX (PPIX) để tạo thành haem(29,5).<br /> trong mô và huyết thanh trở thành một ứng<br /> Haem tạo thành được<br /> dụng hữu ích của UnaG. Chúng tôi khảo sát sự<br /> vận chuyển ra khỏi ty thể và sử dụng để tạo<br /> tạo thành bilirubin ở tế bào người bằng UnaG và<br /> nên các protein hoàn chỉnh. Chuỗi chuyển hoá<br /> tìm thấy tất cả các dòng tế bào được khảo sát liên<br /> haem được điều hoà tại một vài bước và còn<br /> tục sản xuất và phóng thích bilirubin, thông qua<br /> chịu sự điều khiển của nhịp sinh học, các<br /> sinh tổng hợp haem. Thêm vào đó, tế bào duy trì<br /> hormones và stress oxi hoá(8,15,14). Tuy vậy, sự liên<br /> dòng chuyển hoá haem, sản xuất và phóng thích<br /> kết giữa haem và các con đường chuyển hoá<br /> sản phẩm đầu cuối bilirubin. Hoạt động trao đổi<br /> khác vẫn còn ít được biết đến.<br /> chất liên tục này của haem cần thiết cho sự bảo<br /> Bilirubin là sản phẩm cuối cùng của sự giáng vệ tế bào khỏi tress và duy trì cân bằng nội môi<br /> hoá haem. Nó được tạo ra từ phản ứng với haem của chúng.<br /> oxygenase (HO), có tác dụng giáng hoá haem<br /> PHƯƠNG PHÁP<br /> thành biliverdin, sắt và carbon monoxide<br /> (CO)(3,1). Cuối cùng, biliverdin reductase trong tế Xây dựng plasmid biểu hiện UnaG<br /> bào chất tạo ra bilirubin, chất được đào thải sau Để xây dựng vector vi khuẩn biểu hiện mang<br /> khi liên hợp với glucoronate trong gan. HO (gồm UnaG, pcDNA3-flag-UnaG(18) được cắt với các<br /> HO-1 và HO-1) đóng vai trò là một chất điều hoà men BamHI và EcoRI, và đoạn chèn được phân<br /> có tác dụng duy trì nồng độ haem nội bào. Sắt lập gắn vào các điểm BamHI và EcoRI của<br /> tạo bởi HO được tái sử dụng vào các protein có pET32a(+). Tiếp theo, pET-UnaG được chuyển<br /> chứa sắt(26,10,25). Bilirubin có đặc tính chống oxy vào BL21. UnaG được cảm ứng với 0.3mM<br /> hoá(24,35). Dạng liên hợp của nó không tan trong isopropyl thiogalactopyranoside (IPTG) và tinh<br /> nước, gắn vào albumin và được chuyển vào tế sạch bằng hạt ion nickel.<br /> bào gan thông qua nhiều hệ thống vận<br /> Nuôi cấy tế bào<br /> chuyển(24,35). Sau khi glucuronin hoá bởi các men<br /> gan, bilirubin liên hợp được tiết vào mật. Sự gián Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa,<br /> đoạn trong vận chuyển gan mật sẽ dẫn đến triệu ung thư gan HepG2, ung thư biểu mô da A431,<br /> chứng vàng da trong nhiều bệnh lý của gan(35,7). ung thư vú MCF7, ung thư gan Alexander<br /> Mặc dù bilirubin trong mật bắt nguồn chủ yếu từ (PLC/PRF/5) và phôi thận HEK293T được nuôi<br /> hemoglobin của tế bào hồng cầu lão hoá qua con trong môi trường Eagle’s điều chỉnh theo<br /> đường chuyển hoá gan(7), sự sản xuất và vận Dulbecco (DMEM) bổ sung 7% FCS, penicillin<br /> chuyển bilirubin ở mô ngoại vi chưa được nhắc (100 đơn vị/ml) và streptomycin (100 ug/ml). Tế<br /> đến.Bên cạnh đó, CO có thể liên quan đến sự bảo bào ung thư ruột DLD-1 và ung thư máu K562<br /> vệ tế bào khỏi những tổn thương oxy hoá thông được nuôi bằng RPMI1640 chứa 7% FCS và<br /> kháng sinh. HEK293T được chuyển pcDNA3-<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 43<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> flag UnaG bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) máy đọc quang 96 giếng. Thí nghiệm được tiến<br /> và ủ 16 giờ. Để tạo ra tế bào chuyển gen ổn định hành với 4-6 lần lặp.<br /> HepG2 và HeLa, pcDNA3-flag UnaG(18) (10ug) Thống kê<br /> được chuyển với calcium phosphate(31). G148 ở<br /> Các kết quả được thể hiện ở dạng trung<br /> nồng độ đích 300 ug/ml được cho vào môi<br /> bình±SD và phân tích bằng Student’s t-test<br /> trường nuôi để chọn lọc. Sau 5 ngày, những<br /> không ghép cặp. Các phân tích thống kê được<br /> dòng tế bào kháng G418 được chuyển nuôi vào<br /> ghi nhận khác biệt tại mức p