intTypePromotion=1
ADSENSE

Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết từ hoàng liên giải độc thang

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

70
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết hoàng liên giải độc thang bằng phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng berberin - hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết từ hoàng liên giải độc thang

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT<br /> TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG<br /> Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hoàng liên giải độc thang (HLGĐ) là bài thuốc thanh nhiệt giải độc có<br /> xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường). Bài<br /> thuốc được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết<br /> lỵ…. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm<br /> đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư…. trên thực nghiệm. Để tiện lợi trong việc sử dụng bài<br /> thuốc trong nghiên cứu và điều trị, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết HLGĐ bằng phương pháp<br /> phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng<br /> Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.<br /> Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu được khoa Dược- Cơ sở 3 Bệnh viện Đại<br /> học Y Dược TP. HCM cung cấp. Áp dụng các phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật bằng các phản<br /> ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật quang phổ.<br /> Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46%. Xác định sự<br /> hiện diện alkaloid và flavonoid trong cao HLGĐ. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định được cao HLGĐ có đủ 4<br /> dược liệu cấu thành bài thuốc. Hàm lượng Berberin trong cao là 0,852%.<br /> Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin đã<br /> góp phần xây dụng tiêu chuẩn cơ sở cao HLGĐ.<br /> Từ khóa: Hoàng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hoá, sắc ký lớp mỏng<br /> <br /> ABSTRACT<br /> PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR<br /> “HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT<br /> Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 203 - 208<br /> Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China,<br /> that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao. It is used widely to treat some infectious diseases such as<br /> pneumonia, furuncles, dysentery…Many studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes,<br /> enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation. In order to make HLJDT more convenient in<br /> research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction<br /> method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination. As well,<br /> berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined.<br /> Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical<br /> Center HoChiMinh City. Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the<br /> chemical components. Berberin was determined by means of the spectral methods.<br /> <br /> ∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh<br /> Địa chỉ liên hệ: Bs. Trần Thu Nga<br /> ĐT: 0989231241<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Email: thunga149@yahoo.com<br /> <br /> 203<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46%. There<br /> are alkaloid and flavonoid in the product. TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs. Berberin<br /> concentration in the product is 0.852%.<br /> Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method<br /> and berberin determination to standardize the HLJDT extract.<br /> Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography.<br /> định về kiểm tra chất lượng thuốc của Dược<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> điển Việt Nam 4.<br /> Hoàng liên giải độc thang (gồm 4 vị thuốc:<br /> Phương pháp<br /> Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix<br /> Điều chế cao chiết bài thuốc.<br /> Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và<br /> Chi tử (Fructus Gardeniae)) là bài thuốc cổ<br /> Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp sắc<br /> phương có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Bài<br /> trong dung môi nước. Sau khi thu được dịch<br /> thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong<br /> chiết, tiến hành lọc và cô cách thủy để thu được<br /> tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương<br /> cao HLGĐ.<br /> (1)<br /> Đảo (Nhà Đường) . Công dụng bài thuốc được<br /> Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài<br /> ghi trên một số tài liệu ứng dụng điều trị một số<br /> thuốc(2).<br /> bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết<br /> Độ ẩm<br /> lỵ…(1, 7). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng<br /> Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một<br /> minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái<br /> chén<br /> cân, đem sấy ở 1050C trong tủ sấy dưới<br /> tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer,<br /> áp suất thường đến khối lượng không đổi.<br /> xơ vữa động mạch…trên thực nghiệm (3,5,8,9). Một<br /> Tính độ ẩm:<br /> nghiên cứu gần đây kết luận tác dụng bài thuốc<br /> gây ra sự chết theo chương trình và sự ngừng<br /> chu kỳ tế bào ở dòng tế bào ung thư gan in vitro<br /> và in vivo (4).. Ngoài ra, trên mô hình gây độc<br /> bằng cyclophosphamid, cao chiết Hoàng liên giải<br /> độc thang đã cho thấy có tác dụng bảo vệ gan,<br /> chống oxy hóa, giải độc (6). Để thuận lợi cho việc<br /> nghiên cứu và sử dụng bài thuốc trong điều trị,<br /> chúng tôi áp dụng phương pháp phân tích hóa<br /> học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và<br /> định lượng hoạt chất berberin chính trong cao<br /> HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết<br /> bài thuốc.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma<br /> Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae),<br /> Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử<br /> (Fructus Gardeniae) được cung cấp bởi khoa<br /> Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP.<br /> HCM. Mỗi dược liệu được chuẩn hoá theo quy<br /> <br /> 204<br /> <br /> H% =<br /> <br /> a−b<br /> × 100<br /> a<br /> <br /> a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g); b: khối lượng<br /> bột dược liệu sau khi sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl)<br /> <br /> Độ tro toàn phần<br /> Cân chính xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén<br /> nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn<br /> thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy<br /> hoàn toàn và chén không còn bốc khói.<br /> Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở<br /> 500- 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro<br /> không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén<br /> nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút<br /> ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.<br /> Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp<br /> tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy<br /> chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình<br /> hút ẩm. Cân.<br /> Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần<br /> cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> lệch không quá 0,5 mg. Tro toàn phần tính trên<br /> dược liệu khô kiệt theo công thức:<br /> <br /> A=<br /> <br /> (a − b )× 100 %<br /> c − (c × h )<br /> <br /> A%: tro toàn phần (%) của dược liệu; a: khối lượng chén có<br /> tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng;<br /> h: độ ẩm (%) của dược liệu<br /> <br /> Định tính<br /> Phương pháp hóa học:<br /> Hợp chất alkaloid:<br /> Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với<br /> H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc<br /> H2SO4 5% chia vào 3 ống nghiệm để làm phản<br /> ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat và<br /> quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng.<br /> Hợp chất flavonoid:<br /> Lấy 1 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml<br /> MeOH, lọc. Dịch lọc được cô đến cắn. Hoà cắn<br /> với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc.<br /> Dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm làm phản ứng<br /> với NaOH 10%, FeCl3 3% trong cồn và thuốc thử<br /> chì acetat. Quan sát màu của ống nghiệm sau<br /> phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng<br /> với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản<br /> ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm<br /> và với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu<br /> trắng đục.<br /> Phương pháp sắc kí lớp mỏng:<br /> Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản<br /> mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck). Lấy<br /> khoảng 0,1 g mỗi dược liệu, cho vào cốc có mỏ<br /> 50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút,<br /> lọc. Tập trung lọc cô còn 1ml làm dung dịch<br /> chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu<br /> làm đối chiếu trên sắc ký lớp mỏng với các hệ<br /> dung môi tương thích được tham khảo trong<br /> các dược điển.<br /> <br /> Định lượng<br /> Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ được<br /> xác định dựa vào đường cong chuẩn độ của<br /> berberin chuẩn trong methanol trên máy quang<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic<br /> HEλIOS.<br /> Xác định đỉnh hấp thu cực đại:<br /> Đỉnh hấp thu cực đại của berberin chuẩn<br /> trong methanol là λmax = 266 nm.<br /> Xây đựng đường chuẩn berberin.<br /> Thiết lập giai mẫu<br /> Cân chính xác 2 mg berberin chuẩn, hòa tan<br /> trong 10 ml methanol và cho vào bình định mức<br /> 10 ml (dung dịch chuẩn A). Dùng micro pipette<br /> lấy chính xác dung dịch chuẩn A có thể tích lần<br /> lượt là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400<br /> µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol<br /> tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy<br /> quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic<br /> HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.<br /> Mẫu thử<br /> Cân chính xác khoảng 100 mg cao, cho vào<br /> bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm<br /> nhiều lần bằng methanol cho đến khi dịch chiết<br /> methanol không còn phản ứng của chất berberin.<br /> Dịch chiết cô còn khoảng 10 ml và cho vào bình<br /> định mức 10 ml, lắc đều. Dùng micro pipet hút<br /> chính xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định<br /> mức 10 ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều,<br /> tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử<br /> ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại<br /> đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.<br /> Bảng 1. Mật độ quang của giai mẫu berberin chuẩn.<br /> Bình định mức<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> <br /> Hàm lượng<br /> berberin (µg/ml)<br /> 3 µg<br /> 4 µg<br /> 5 µg<br /> 6 µg<br /> 7 µg<br /> 8 µg<br /> <br /> Mật độ quang<br /> (OD)<br /> 0,262<br /> 0,340<br /> 0,421<br /> 0,491<br /> 0,566<br /> 0,636<br /> <br /> Công thức tính hàm lượng berberin trong<br /> mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x +<br /> 0,0413.<br /> <br /> C(%) =<br /> <br /> At − 0,0413 100 b<br /> ×<br /> × ×10−6<br /> 0,0748<br /> 0,5 p<br /> <br /> 205<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> A t: Độ hấp thu của mẫu thử. b: Khối lượng 100 g<br /> cao HLGĐT khô kiệt (g). p: Khối lượng cao<br /> <br /> HLGĐT đem thử đã trừ ẩm (g).<br /> <br /> y = 0,0748x + 0,0413<br /> <br /> Đường chuẩn BERBERIN<br /> <br /> R 2= 0,9994<br /> <br /> 0.7<br /> 0.6<br /> 0.5<br /> 0.4<br /> 0.3<br /> 0.2<br /> 0.1<br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> HÀM LƯỢNG (µg/ ml)<br /> Biểu đồ 1. Đường chuẩn của dung dịch chuẩn berberin.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Bào chế cao HLGĐ.<br /> 80 0C -1000C<br /> 10 lít nước<br /> 60 phút<br /> <br /> Dược liệu<br /> 2440 g<br /> <br /> Dịch chiết 1<br /> 2500 ml nước<br /> <br /> Bã dược liệu<br /> 800C-1000C<br /> 5000 ml nước<br /> 30 phút<br /> Dịch chiết 2<br /> 1200 ml<br /> <br /> Dịch chiết 1+2<br /> Lọc<br /> Cô cách thủy<br /> Cao HLGĐ (650g)<br /> Sơ đồ 1. Qui trình bào chế cao HLGĐ<br /> Hiệu suất chiết cao: 18,13%<br /> <br /> 206<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> Độ ẩm cao HLGĐ<br /> <br /> Cao<br /> Khối lượng Cao HLGĐT (g)<br /> Tro toàn phần (%)<br /> Trung bình (%)<br /> <br /> Bảng 2. Độ ẩm của cao HLGĐ.<br /> Cao<br /> Khối lượng Cao HLGĐT(g)<br /> Độ ẩm (%)<br /> Trung bình (%)<br /> <br /> Lần 1<br /> 0,5183<br /> 32,22<br /> <br /> Lần 2 Lần 3<br /> 0,4998 0,5078<br /> 31,63 31,88<br /> 31,91<br /> <br /> Tro toàn phần cao HLGĐ<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3<br /> 0,5254 0,5512 0,5390<br /> 8,36 8,31 8,72<br /> 8,46<br /> <br /> Định tính<br /> - Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid<br /> và alkaloid: dương tính.<br /> - Phương pháp sắc kí lớp mỏng:<br /> <br /> Bảng 3. Độ tro toàn phần của cao HLGĐ.<br /> Bảng 4. Sắc ký đồ của cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu.<br /> Nguyên liệu<br /> Hoàng liên<br /> <br /> Hoàng bá<br /> <br /> Hoàng cầm<br /> <br /> Chi tử<br /> <br /> Hệ dung môi khai triển<br /> <br /> Số vết của nguyên Số vết Số vết trùng giữa<br /> liệu đối chiếu của cao nguyên liệu với cao<br /> <br /> Phát hiện<br /> <br /> n-butanol:acid<br /> Phun TT Dragendorff và quan<br /> sát dưới ánh sáng thường và<br /> acetic:nước<br /> đèn UV λ= 366 nm<br /> (7 : 1 : 2)<br /> n-butanol:acid<br /> Phun TT Dragendorff và quan<br /> sát dưới ánh sáng thường và<br /> acetic:nước<br /> đèn UV λ= 366 nm<br /> (7 : 1 : 2)<br /> Toluen : ethyl<br /> Phun FeCl3 và quan sát dưới<br /> ánh sáng thường và đèn UV<br /> acetat : acid formic<br /> λ= 366 nm<br /> (2 : 3 : 2.2)<br /> Ethyl acetat : aceton :<br /> Phun H2SO4 quan sát dưới<br /> ánh sang thường và đèn UV<br /> acid formic : nước<br /> λ=366nm<br /> (5 : 5 : 1 : 1)<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã<br /> chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có<br /> sự hiện diện của các dược liệu: Hoàng liên,<br /> Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử. Chứng tỏ phương<br /> pháp chiết xuất giữ được các thành phần chủ<br /> yếu của công thức cổ truyền.<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu hàm lượng berberin<br /> trong cao HLGĐ thu được là 0,852 % chiếm tỷ lệ<br /> 62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự<br /> đoán. Như vậy, kết quả định lượng cao HLGĐ<br /> cho thấy phương pháp chiết xuất thu được gần<br /> hết thành phần alkaloid có trong dược liệu.<br /> <br /> Định lượng<br /> <br /> Cao HLGĐ đã được xây dựng tiêu chuẩn<br /> chất lượng về độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần<br /> (Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép<br /> đánh giá tính ổn định của chế phẩm, bảo đảm<br /> tính chính xác của các kết quả mà nghiên cứu<br /> thu được. Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1)<br /> đơn giản, có hiệu quả, dễ thực hiện và dễ ứng<br /> dụng trong sản xuất sau này.<br /> <br /> Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.<br /> Bảng 5. Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.<br /> Khối lượng Khối lượng<br /> Hàm lượng<br /> Mật độ<br /> STT Mẫu chưa Mẫu thử đã<br /> berberin trong cao<br /> quang<br /> trừ ẩm (g) trừ ẩm (g)<br /> HLGĐT khô kiệt (%)<br /> 1<br /> 0,1178<br /> 0,0802<br /> 0,282<br /> 0,802<br /> 2<br /> 0,1073<br /> 0.0730<br /> 0,276<br /> 0,858<br /> 3<br /> 0,1187<br /> 0.0808<br /> 0,312<br /> 0,895<br /> Trung bình<br /> 0,852<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Kết quả định tính bằng phương pháp hóa<br /> học cho thấy cao HLGĐ có hiện diện hợp chất<br /> flavonoid, alkaloid và kết quả sắc ký lớp mỏng<br /> (Bảng 4) có sự hiện diện của cả 4 dược liệu cấu<br /> thành bài thuốc giúp khẳng định phương pháp<br /> chiết xuất có hiệu quả.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và<br /> độ tro toàn phần trung bình là 8,46%.<br /> Định tính bằng phương pháp hóa học cho<br /> thấy cao HLGĐ có sự hiện diện của hợp chất<br /> flavonoid và alkaloid. Trên sắc kí đồ của cao<br /> HLGĐ xác định sự hiện diện của 4 dược liệu:<br /> Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử.<br /> <br /> 207<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2