So sánh phương pháp sinh học phân tử MTBDRplus với phương pháp kháng sinh đồ trong việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid và Rifampicin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ MTBDRplus<br /> VỚI PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRONG VIỆC PHÁT HIỆN<br /> MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KHÁNG ISONIAZID VÀ RIFAMPICIN<br /> Trương Thiên Phú*, Trần Thị Thanh Nga*, Ngô Minh Quân*, Nguyễn Đào Ngọc Lan*,<br /> Phan Thanh Tùng*, Lê Thị Kiều*, Huỳnh Thị Mỹ Nga*, Phạm Thị Phương Mai*,<br /> Nguyễn Thị Xuân Hỷ*, Lê Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Ngọc Thảo*, Lê Nguyễn Hoàng Vũ*,<br /> Nguyễn Phong Phú*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Đánh giá tính chính xác của phương pháp sinh học phân tử MTBDRplus trong việc xác định<br /> tính kháng thuốc ở bệnh nhân nghi ngờ lao trong năm 2015 - 2016 trên cở sở phương pháp tham chiếu là kháng<br /> sinh đồ trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960 và khảo sát tần suất của các loại đột biến kháng thuốc<br /> Rifampicin và Isoniazid.<br /> Vật liệu và phương pháp: Tổng số 17.158 bệnh phẩm bao gồm: đàm, dịch dạ dày, dịch rửa phế quản…<br /> được gửi đến phòng Xét nghiệm Lao, Khoa Vi sinh Lâm sàng, bệnh viện Chợ Rẫy trong năm 2015 và 2016 theo<br /> quy trình chẩn đoán thường qui. Quy trình xét nghiệm bao gồm soi AFB, cấy và định danh những cụm khuẩn<br /> mọc trên môi trường lỏng MGIT và môi trường đặc LJ bằng phương pháp sinh học phân tử assay. Mẫu cấy<br /> MTB dương tính được thực hiện kháng sinh đồ hàng 1 trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960. Kết quả xác<br /> định tính kháng thuốc của phương pháp sinh học phân tử được đối chiếu với phương pháp chuẩn kháng sinh đồ.<br /> Kết quả: Trong tổng số 17.158 bệnh phẩm có 1819 mẫu bệnh phẩm (10,6%) (gồm mẫu trực tiếp (n = 71) và<br /> mẫu cấy (n = 1748)) được thực hiện với phương pháp MTBDRplus. Có 681 mẫu cấy dương tính MTB được<br /> thực hiện kháng sinh đồ hàng 1. Độ tương đồng giữa kết quả của phương pháp MTBDRplus và phương pháp<br /> kháng sinh đồ trong việc phát hiện lao đa kháng thuốc (MDR-TB), kháng Rifampicin (RIF) và Isoniazid (INH) là<br /> 98,8%; 99,0% và 97,1%. Độ nhạy và độ đặc hiệu của MTBDRplus trong việc xác định tính kháng RIF là 96,6%<br /> và 99,1%, xác định tính kháng INH là 92,1% và 98,2%. Đột biến thường xuất hiện ở gene rpoB (kháng thuốc<br /> RIF) là S531L (58,8%); ở gene katG (kháng thuốc INH) là S315T1 (75,4%). Sự khác biệt giữa phương pháp<br /> kháng sinh đồ và phương pháp sinh học phân tử có thể giải thích bởi sự hiện diện của một số đột biến hiếm ở<br /> quần thể hỗn hợp vi khuẩn nhạy và kháng thuốc.<br /> Kết luận: Phương pháp sinh học phân tử Genotype MTBDRplus là phương pháp sàng lọc nhanh số lượng<br /> lớn bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thời gian thực hiện ngắn. Kết quả từ nghiên cứu này góp phần<br /> vào chính sách phát triển của Tổ chức y tế thế giới (TCYTTG - WHO) trong việc sử dụng phương pháp sinh học<br /> phân tử sàng lọc nhanh lao đa kháng thuốc (MDR-TB) cũng như góp phần vào dữ liệu dịch tễ học về tần suất<br /> gen kháng thuốc của vi khuẩn lao.<br /> Từ khóa: Genotype MTBDRplus, MDR-TB, isoniazid, rifampicin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> *Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Trương Thiên Phú, ĐT: 0906355534, Email: truongthienphu78@yahoo.com.<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 155<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> ABSTRACT<br /> COMPARISION OF GENOTYPE MTBDRplus MOLECULAR ASSAY WITH CONVENTIONAL DRUG<br /> SUSCEPTIBILITY TESTING METHOD FOR ISONIAZID AND RIFAMPICIN RESISTANCE IN<br /> TUBERCULOSIS PATIENTS<br /> Truong Thien Phu, Tran Thi Thanh Nga, Ngo Minh Quan, Nguyen Đao Ngoc Lan, Phan Thanh Tung,<br /> Le Thi Kieu, Huynh Thi My Nga, Pham Thi Phuong Mai, Nguyen Thi Xuan Hy, Le Thi Kim Cuc,<br /> Nguyen Thi Ngoc Thao, Le Nguyen Hoang Vu, Nguyen Phong Phu<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 22 - No 5- 2018: 155 – 161<br /> Objectives: To evaluate the Genotype MTBDRplus kit with the conventional standard drug susceptibility<br /> testing of isoniazid and rifampicin by BACTEC MGIT 960 method.<br /> Materials and methods: A total of 17,158 diagnosis clinical specimens (sputum samples, gastric aspirate,<br /> bronchoscopy aspirate…) sent to Mycobacteriology Laboratory, Department of Clinical Microbiology of Cho Ray<br /> Hospital in 2015 and 2016 during the clinical routine. Laboratory algorithms included AFB smear, culture, and<br /> commercial Genotype MTBDRplus assay was implemented on MTB identification of positive growth on MGIT<br /> and Lowenstein-Jensen media. The performance of Genotype molecular assay was compared to phenotypic DST<br /> method and analyzed the genetic of drug resistance patterns.<br /> Results: Overall 1819 valid results were obtained for 17,158 clinical specimens (10.6%) with MTBDRplus.<br /> 681 MTB positive cultures have been made drug susceptibility testing row 1. The overall of concordance between<br /> the results of MTBDRplus assay and those of the drug susceptibility testing for the assessment of MDR-TB, RIF<br /> and INH resistance were 98.8%, 99.0% and 97.1%, respectively. For specimens positive for M. tuberculosis by<br /> MTBDRplus, this assay’s sensitivity and specificity for rifampin resistance were 96.6%, 99.1%. For isoniazid<br /> resistance, they were 92.1% and 98.2%. The frequency of rpoB mutations in RIF resistance strains were S531L<br /> (58.8%). Of INH resistant strains, the most prevalence resistance mutation was S315T1 (75.4%) in the katG<br /> gene. Disagreement between phenotypical and molecular test results could be explained by the presence of rare<br /> mutations in strains caused the presence of mixed bacterial populations.<br /> Conclusion: The Genotype MTBDRplus assay is a useful tool for screening large numbers of specimens<br /> rapidly with high sensitivity, specificity and short turnaround time. Data of this study contributed to the<br /> development of WHO policy on the utility of this molecular assay for MDR-TB screening and the important of<br /> mutant distribution in epidemiology data.<br /> Keywords: Genotype MTBDRplus, MDR-TB, isoniazid, rifampicin.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ 100.000 dân. Tỉ lệ lao đa kháng thuốc trong<br /> Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis - nhóm bệnh nhân mới là 4,1% và trong nhóm<br /> MTB) là một trong những nguyên nhân gây nên bệnh nhân lao đã điều trị là 25%(12). Thêm vào<br /> số tử vong cao nhất trong những bệnh truyền đó, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn khi<br /> nhiễm trên toàn cầu. Việt Nam đứng thứ 12 việc điều trị lao đa kháng thuốc và kháng thuốc<br /> trong 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao cao trên thế giới, phổ rộng (Extensively Drug Resistance –XDR)<br /> với hơn 100.000 ca mới được phát hiện hàng gặp nhiều khó khăn do việc điều trị tốn kém<br /> năm; và đứng thứ 14 trên tổng số 27 nước có tỉ lệ trong thời gian dài cùng với việc điều trị thất bại<br /> lao đa kháng thuốc (MDR-TB, kháng đồng thời 2 và tái nhiễm.<br /> loại thuốc hàng 1 là Isoniazid (INH) và Hiện nay, việc chẩn đoán lao và lao đa<br /> Rifampicin (RIF)). Theo báo cáo của TCYTTG kháng thuốc dựa trên phương pháp xác định<br /> năm 2015, tỉ lệ nhiễm lao ở Việt Nam là 137 trên kiểu hình là nuôi cấy vi khuẩn và thực hiện<br /> <br /> 156 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> kháng sinh đồ trong thời gian từ 4 – 8 tuần. Hơn phương pháp kháng sinh đồ để đánh giá độ<br /> nữa để đạt được qui trình tối ưu cho kỹ thuật tương đồng, độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên<br /> nuôi cấy và kháng sinh đồ phòng xét nghiệm đóan kháng và nhạy của hai phương pháp chẩn<br /> cần có đủ trang thiết bị và đào tạo nhân lực đạt đoán. Đồng thời, tần suất xuất hiện của các đột<br /> chuẩn. Do đó, các nước có kinh tế kém và đang biến được phân tích để phản ánh mối tương<br /> phát triển gặp nhiều khó khăn trong việc tầm quan giữa kiểu gen và sự đa kháng thuốc thể<br /> soát bệnh lao. Vì vậy, việc chẩn đoán sớm lao đa hiện ở kiểu hình vi khuẩn trong kháng sinh đồ.<br /> kháng thuốc và kháng thuốc phổ rộng từ bệnh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> phẩm lâm sàng là việc có ý nghĩa lớn và cấp thiết<br /> Quy trình xét nghiệm và bệnh phẩm lâm sàng<br /> cho việc rút ngắn thời gian chẩn đoán và điều trị<br /> lao sớm, đúng hướng, góp phần giảm tỉ lệ tử Tất cả xét nghiệm chẩn đóan bệnh lao được<br /> vong cũng như việc giảm tỉ lệ truyền nhiễm của thực hiện tại Phòng xét nghiệm lao, khoa Vi sinh<br /> Lâm sàng, bệnh viện Chợ Rẫy. Nghiên cứu được<br /> vi khuẩn lao kháng thuốc.<br /> phân tích dựa trên dữ liệu xét nghiệm thực hiện<br /> Trong những năm gần đây, một số phương<br /> từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 12 năm 2016.<br /> pháp sinh học phân tử đã được phát triển và<br /> Tổng số 17.158 bệnh phẩm bao gồm mẫu đàm,<br /> ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện vi khuẩn<br /> mẫu dịch dạ dày, dịch rửa phế quản… đã được<br /> lao và xác định kiểu gene kháng thuốc bao gồm<br /> gửi đến phòng xét nghiệm thực hiện cấy và định<br /> Line probe assays (Genotype MTBDRplus; Hain<br /> danh trực tiếp.<br /> Lifescience GmbH, Germany, INNO LIPA<br /> Rif.TB, Belgium) và real-time PCR (Xpert; Bệnh phẩm lâm sàng được khử nhiễm và cô<br /> Cepheid, USA). Với phương pháp xác định kiểu đặc bằng phương pháp sử dụng N-acetyl-L-<br /> gene, Genotype MTBDRplus được ứng dụng xác cystein (NALC) và NaOH. Đối với bệnh phẩm<br /> định gene kháng RIF và INH trong mẫu bệnh có chỉ định cấy, cặn lắng sau khi li tâm được<br /> phẩm cấy và bệnh phẩm lâm sàng đã được đánh huyền phù trong 2 ml nước cất. 500 µL dịch<br /> giá có độ tương đồng cao với phương pháp huyền phù được cấy vào môi trường lỏng MGIT<br /> kháng sinh đồ(3,5,13). Một nghiên cứu hồi cứu về và cấy 4 - 5 giọt lên ống môi trường đặc LJ. Bệnh<br /> dữ liệu của các bài nghiên cứu cho thấy độ nhạy phẩm trực tiếp cũng được xử lý như trên và<br /> và độ đặc hiệu của Genotype MTBDRplus trong phần huyền phù 2 ml được chứa vào tube để trữ<br /> việc phát hiện gene kháng RIF là 99% (95% đông -20oC dùng cho việc tách DNA.<br /> confidence interval (CI), 96% - 100%) và 99% Định danh vi khuẩn lao từ môi trường cấy và<br /> (95% CI, 98% - 100%); đối với kháng INH là 96% kháng sinh đồ<br /> (93 - 98%) và 100% (99 - 100%). Vì vậy, TCYTTG<br /> Vi khuẩn nghi ngờ lao mọc trên môi trường<br /> hướng đến việc sử dụng rộng rãi phương pháp<br /> cấy sẽ được định danh bằng Genotype<br /> sinh học phân tử trong việc tầm soát lao đa<br /> MTBDRplus assay (Version 2.0). Kháng sinh đồ<br /> kháng thuốc từ tháng 6 năm 2008, và Genotype<br /> được thực hiện theo chỉ định trên chủng vi<br /> MTBDRplus assay đã được ứng dụng trong chẩn<br /> khuẩn MTB đã được định danh.<br /> đoán thường qui ở nhiều nơi trên thế<br /> Kháng sinh đồ hàng 1 được thực hiện trên<br /> giới(2,6,9,10,13).<br /> môi trường lỏng bằng máy BACTEC MGIT 960<br /> Mục tiêu hướng đến của nghiên cứu này là<br /> theo hướng dẫn của nhà sản xuất(7,8). Nồng độ<br /> đánh giá việc ứng dụng Genotype MTBDRplus<br /> thuốc INH và RIF được sử dụng lần lượt là 0,1<br /> assay trong việc chẩn đoán nhanh bệnh lao và<br /> µg/ml và 1,0 µg/ml. Kết quả được trả là kháng<br /> các gene kháng thuốc trong bệnh phẩm lâm sàng<br /> thuốc khi có hơn 1% vi khuẩn mọc trong ống<br /> và mẫu nuôi cấy. Kết quả của Genotype<br /> chứa thuốc so sánh với ống chuẩn.<br /> MTBDRplus assay sẽ được so sánh với kết quả từ<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 157<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> Xét nghiệm Genotype MTBDRplus assay phẩm trực tiếp (n = 71) và mẫu bệnh phẩm cấy<br /> Xét nghiệm Genotype MTBDRplus assay (n = 1.748). Bên cạnh những mẫu phân lập được<br /> được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản trên môi trường MGIT và LJ, có tổng 71 mẫu<br /> xuất để định danh MTB và xác định các đột trực tiếp nghi ngờ lao phổi (84,5%) và lao ngoài<br /> biến trên các gene rpoB, katG, và inhA tương phổi (15,5%) được gửi đến phòng xét nghiệm để<br /> ứng với kháng thuốc RIF và INH ở nồng độ xác định. Tỉ lệ phát hiện dương tính MTB là<br /> cao và nồng độ thấp. Tóm tắt phương pháp là 11,3% đối với mẫu bệnh phẩm trực tiếp và 1 ca<br /> DNA được tách chiết bằng Genolyse kit (Hain MDR-TB được phát hiện từ bệnh phẩm đàm.<br /> Lifesciences, Germany) từ 1 ml bệnh phẩm Trong tổng số 1,748 mẫu cấy cần định danh<br /> trực tiếp đã xử lý hoặc 1 ml mẫu cấy. Phản bằng kít Genotype MTBDRplus, kết quả dương<br /> ứng khuếch đại PCR được thực hiện trên 50 tính MTB là 906 (51,8%), 842 mẫu không phát<br /> µL phản ứng bao gồm 45 µL master-mix do hiện phức hợp MTB sau khi định danh (48,2%).<br /> nhà sản xuất cung cấp cùng 5 µL DNA tách Trong số những kết quả này, có một số mẫu gặp<br /> chiết. Sau đó, sản phẩm PCR được lai với khó khăn trong việc phân tích kết quả (1,5%) và<br /> DNA trên que lai và phân tích kết quả trực xét nghiệm được lặp lại để đạt được kết quả phân<br /> tiếp trên que lai ghi nhận vào file thống kê dữ tích cuối cùng.<br /> liệu excel. So sánh độ tương đồng của phương pháp<br /> KẾT QUẢ kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay<br /> Nuôi cấy vi khuẩn và định danh MTB Trong tổng số 906 mẫu cấy dương tính MTB<br /> thì có 681 mẫu được thực hiện kháng sinh đồ<br /> Tổng số 17.158 đã được gửi đến phòng xét<br /> hàng 1 bằng phương pháp phương pháp<br /> nghiệm lao, trong đó có 17.087 mẫu bệnh phẩm<br /> BACTEC MGIT 960, 225 mẫu còn lại không có<br /> được chỉ định thực hiện soi AFB, cấy, định danh<br /> chỉ định thực hiện.<br /> và 71 mẫu trực tiếp làm xét nghiệm MTBDRplus<br /> (hình 1). Có 1748 mẫu cấy có cụm khuẩn soi Kết quả kháng sinh đồ của tổng 681 mẫu có<br /> dương tính dưới dạng cuộn thừng được định 29 ca MDR-TB (4,3%), 36 ca kháng một loại<br /> danh MTBDRplus, trong đó 906 mẫu dương tính thuốc Isoniazid (5,3%) và không có chủng nào<br /> với MTB nhưng chỉ có 681 mẫu được chỉ định chỉ kháng một loại Rifampicin. Những chủng<br /> làm kháng sinh đồ. còn lại bao gồm nhạy với 5 loại thuốc và kháng<br /> nhiều loại thuốc. Dựa trên kết quả của phương<br /> Bảng 1: Các loại mẫu được chẩn đoán bằng kít<br /> pháp chuẩn là kháng sinh đồ, kết quả Genotype<br /> Genotype MTBDRplus assay trong năm 2015 – 2016.<br /> MTBDRplus cho thấy có độ tương đồng cao<br /> Mẫu nghi ngờ lao phổi Mẫu nghi ngờ lao<br /> (phức hợp MTB dương ngoài phổi (phức trong việc phát hiện MDR-TB là 28 trên 29 ca.<br /> Loại mẫu tính/ tổng số mẫu thực hợp MTB dương Kết quả phân tích về độ nhạy, độ đặc hiệu, giá<br /> hiện) tính/ tổng số mẫu<br /> thực hiện) trị tiên đoán kháng và giá trị tiên đoán nhạy<br /> Mẫu bệnh Đàm (5/53) Mủ (0/1) được trình bày trong Bảng 2. Kết quả cho thấy có<br /> phẩm lâm Dịch rửa phế quản (1/4) Nước tiểu (0/3) sự khác biệt ở 1 ca là MTBDRplus thể hiện nhạy<br /> sàng trực tiếp Dịch màng phổi (1/3) Khác (1/7) RIF do không phát hiện vạch đột biến nhưng kết<br /> Đàm (855/1,697) Mủ (0/0) quả kháng sinh đồ là kháng RIF. Vì thế, so sánh<br /> Mẫu nuôi cấy Dịch rửa phế quản Nước tiểu (2/2)<br /> (41/41)<br /> độ tương đồng chung giữa 2 phương pháp về sự<br /> từ bệnh phẩm<br /> lâm sàng Dịch màng phổi (1/1) Mô (4/4) kháng RIF và INH lần lượt là 99,0% và 97,1%.<br /> Khác (3/3) Kết quả độ nhạy của INH có sự khác biệt do có<br /> Có 1.819 mẫu được định danh với kít 10 mẫu thể hiện kháng INH ở MTBDRplus<br /> Genotype MTBDRplus trong năm 2015 – 2016 nhưng kháng sinh đồ thể hiện nhạy thuốc INH.<br /> được thể hiện trong Bảng 1 bao gồm mẫu bệnh Tỉ lệ được tính dựa trên phương pháp chuẩn<br /> 158 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> kháng sinh đồ; NPV- Negative predictive value (Giá trị tiên<br /> PPV-Positive predictive value (Giá trị tiên đoán nhạy).<br /> đoán kháng),<br /> Bảng 2: Kết quả của Genotype MTBDRplus assay trong việc phát hiện MDR-TB, kháng và nhạy của RIF và<br /> INH<br /> Isoniazid Rifampicin MDR-TB<br /> Độ nhạy 92.1%(116/126) 96.6% (28/29) 96.7% (29/30)<br /> Độ đặc hiệu 98.2%(545/555) 99.1 (646/652) 98.9% (555/561)<br /> Độ tương đồng 97.1 (661/681) 99.0% (674/681) 98.8% (584/591)<br /> Giá trị tiên đoán kháng 92.1% (116/126) 82.4% (28/34) 82.9% (29/35)<br /> Giá trị tiên đoán nhạy 98.2% (545/555) 99.8% (646/647) 99.8% (555/556)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Qui trình xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn và kết quả<br /> Tần suất xuất hiện các đột biến ở gene kháng (58,8%), 2 ca có đột biến H526Y (5,9%), 1 ca có<br /> INH và RIF đột biến D516V (2,9%).<br /> Các đột biến kháng thuốc INH và RIF được Trong tổng số 126 chủng kháng INH, tần<br /> phát hiện bằng kít MTBDRplus (tổng số mẫu xuất xuất hiện đột biến S315T1 là 95 ca (75,4%)<br /> kháng phân tính n = 126) được thể hiện trong trên gene katG, 23 ca có đột biến C15T (18,3%)<br /> Hình 2. Trong tổng số 34 chủng MTB kháng RIF, trên gene inhA.<br /> tần suất xuất hiện các đột biến trên gene rpoB là: Kết quả MTBDRplus phân tích có 5 ca kháng<br /> 11 ca có 1 trong 8 vạch wild type biến mất RIF nhưng kết quả kháng sinh đồ là nhạy cho<br /> (32,4%), 20 ca có xuất hiện đột biến S531L thấy ở những chủng này có vạch wild type biến<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 159<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018<br /> <br /> mất nhưng không phát hiện được vạch đột biến việc phát hiện MDR-TB là 98,9%. Kết quả thực<br /> trên que lai DNA. nghiệm cho thấy 6 ca có sự khác biệt giữa<br /> phương pháp xác định kiểu gene (genotype -<br /> MTBDRplus) và phương pháp xác định kiểu<br /> hình (phenotype – kháng sinh đồ). Qua đó, cho<br /> thấy phương pháp xác định kiểu gene đã phát<br /> hiện hơi quá mức sự kháng thuốc so với phương<br /> pháp chuẩn. Điều này có thể lí giải do sự hiện<br /> diện của quần thể hỗn hợp vi khuẩn nhạy và<br /> kháng thuốc (“heteroresistance”) trong mẫu<br /> bệnh phẩm lâm sàng. Khái niệm<br /> “heteroresistance” đã được báo cáo bởi Rinder<br /> và cộng sự(11) và được xem là yếu tố quan trọng<br /> có thể ảnh hưởng đến độ chính xác và tin cậy<br /> Hình 2. Tần suất xuất hiện đột biến ở chủng vi<br /> của phương pháp kháng sinh đồ. Sự khác biệt có<br /> khuẩn kháng INH và RIF (N=126).<br /> thể được giải thích do hỗn hợp vi khuẩn nhạy và<br /> BÀN LUẬN kháng thuốc cùng tồn tại trong mẫu bệnh phẩm<br /> Kết quả của phương pháp sinh học phân tử lâm sàng; kiểu gene đột biến được phát hiện bởi<br /> Genotype MTBDRplus cho thấy độ nhạy (96,7%) MTBDRplus trong khi đó quần thể vi khuẩn<br /> và độ đặc hiệu (98,9%) cao, độ tương đồng với nhạy thuốc có thể phát triển lấn át trong môi<br /> phương pháp chuẩn kháng sinh đồ là 98,8% trường lỏng và thể hiện kiểu hình “nhạy” trong<br /> trong việc phát hiện lao đa kháng thuốc MDR- kháng sinh đồ.<br /> TB. Kết quả của nghiên cứu này tương đồng với Phương pháp sinh học phân tử thực hiện<br /> một số kết quả đạt được từ các nghiên cứu trước nhanh và có độ chính xác cao có ý nghĩa lớn<br /> được thực hiện ở Việt Nam và một số nước trong việc quản lý bệnh lao được thể hiện trong<br /> khác(2,6,9,10). Thêm vào đó, thời gian thực hiện việc chọn phác đồ điệu trị đúng và sớm trong<br /> phương pháp sinh học phân tử ngắn hơn so với thời kỳ đầu. Việc phát hiện các đột biến cho thấy<br /> phương pháp cấy và kháng sinh đồ truyền xuất hiện khả năng kháng thuốc ở bệnh nhân lao<br /> thống (2,5 ngày thực hiện MTBDRplus so với 29 đối với các 2 thuốc trọng yếu là Isoniazid và<br /> ngày cấy và 12 ngày làm kháng sinh đồ). Hơn Rifampicin. Sự phát hiện các tần suất đột biến<br /> thế nữa, MTBDRplus còn được sử dụng để phát S315T1 ở gene katG và C15T trên gene inhA giúp<br /> hiện MTB ở những mẫu cấy bị tạp nhiễm hoặc các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị hợp<br /> không mọc bằng cách sử dụng cặn lắng trực tiếp lí hơn. Nếu đột biến xuất hiện ở gene inhA<br /> từ mẫu bệnh phẩm; hoặc những mẫu có lẫn kháng INH nồng độ thấp, nồng độ INH cao có<br /> NTM. Từ những kết quả trên cho thấy phương thể đạt hiệu quả trong quá trình điều trị. Mặt<br /> pháp sinh học phân tử có ứng dụng cao trong khác, nếu thể hiện đột biến ở gene katG kháng<br /> việc phát hiện những ca lao mới và quản lý lao INH ở nồng độ cao, INH sẽ không bao gồm<br /> đa kháng thuốc (MDR-TB) ở những nước có tỉ lệ trong phác đồ điều trị. Ở các ca lao đa kháng<br /> nhiễm lao cao. thuốc, chỉ có đột biến S531L xuất hiện trên gene<br /> Nhìn chung, kết quả MTBDRplus cũng thể rpoB. Kết quả này tương đồng với kết quả từ<br /> hiện độ chính xác cao trong việc tìm chủng những nghiên cứu trước ở quần thể người Việt<br /> kháng INH (độ nhạy 92,1%, độ đặc hiệu 98,2%); Nam(9). Genotype MTBDRplus không phát hiện<br /> đối với chủng kháng RIF (độ nhạy 96,6%, độ đặc được 1 ca lao đa kháng thuốc so với phương<br /> hiệu 99,1%). Tuy nhiên, độ đặc hiệu của kít trong pháp kháng sinh đồ do không phát hiện được<br /> <br /> 160 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> vạch đột biến từ chủng MTB. Kết quả này có thể và hạn chế lây lan các trường hợp lao đa<br /> do một đột biến hiếm mà kít chẩn đoán không kháng thuốc.<br /> thể hiện được được hoặc do một đột biến khác TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> xảy ra trên cùng gene rpoB. 1. Bwanga F, Hoffner S, Haile M, Joloba ML (2009): Direct<br /> Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 8 ca susceptibility testing for multi-drug resistant tuberculosis: a<br /> meta-analysis. BMC Infect Dis, 9:67.<br /> dương tính với MTB trên tổng số 71 mẫu bệnh 2. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I (2005). Evaluation of<br /> phẩm trực tiếp, trong đó có 1 trường hợp lao the Genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and<br /> đa kháng thuốc trong mẫu đàm trực tiếp. Kết isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates. J<br /> Clin Microbiol, 43(8):3699-3703.<br /> quả cho thấy kít MTBDRplus có thể ứng dụng 3. Cavusoglu C, Gursel D, Aktoprak HB (2011). Evaluation of the<br /> để sàng lọc lao đa kháng từ mẫu bệnh phẩm genotype MTBDRplus assay for the diagnosis of tuberculosis<br /> and rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in<br /> trực tiếp để giúp chẩn đoán nhanh, điều trị<br /> clinical specimens. Turk J Med Sci, 41(3):419-425.<br /> sớm và hạn chế lây lan các trường hợp lao đa 4. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E (2006). Appication of<br /> kháng thuốc. the Genptype MTBDRplus assay directly on sputum specimens.<br /> Int. J. Tuberc. Lung Dis, 10: 1057-1059.<br /> Bên cạnh những ứng dụng thuận lợi của kít 5. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E (2007). Evaluation of<br /> MTBDRplus, chúng tôi nhận thấy còn một số hạn the Genotype MTBDRplus assay for rifampicin and isoniazid<br /> susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and<br /> chế khi thực hiện và phân tích kết quả xét<br /> clinical specimens. J Clin Microbiol, 45(8):2635-2640.<br /> nghiệm từ bệnh phẩm lâm sàng trực tiếp. Một số 6. Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann S<br /> que lai không thể phân tích kết quả và phải thực (2005). Use of the genotype MTBDRplus assay for rapid<br /> detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium<br /> hiện lặp lại. Tuy nhiên, tỉ lệ những xét nghiệm tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol, 43(8): 3699-3703.<br /> cần lặp lại (1,5%) của chúng tôi thấp hơn so với 7. Kent PT, Kubica GP et al (1985): Public health<br /> một số nghiên cứu trước trên mẫu đàm trực tiếp mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. Atlanta:<br /> US Department of Health and Human Services; 30329-4027.<br /> (5 - 12%)(4). Kết quả này nhấn mạnh rằng xét 8. Kruuner A, Yates MD, Drobniewski FA (2006). Evaluation of<br /> nghiệm MTBDRplus đòi hỏi sự cẩn trọng từ MGIT 960-based antimicrobial testing and determination of<br /> critical concentrations of first- and second-line antimicrobial<br /> người thực hiện khi phân tích kết quả trên mẫu drugs with drug-resistant clinical strains of Mycobacterium<br /> xét nghiệm trực tiếp để tránh trường hợp âm tuberculosis. J Clin Microbiol, 44(3):811-818.<br /> tính giả hoặc nhiễm chéo DNA gây trường hợp 9. Mai NT Huyen, Edine W Tiemersma, Nguyen TN Lan et. al<br /> (2010). Validation of the Genotype MTBDRplus assay for<br /> dương tính giả. diagnosis of multidrug resistant tuberculosis in South Vietnam.<br /> KẾT LUẬN BMC Infectious Disease, 10:149.<br /> 10. Miotto P, Piana F, Penati V, Canducci F et. al (2006). Use of<br /> Phương pháp sinh học phân tử genotype MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin<br /> and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical<br /> MTBDRplus có độ tương đồng cao so với<br /> strains isolated in Italy. J Clin Microbiol, 44(7):2485-2491.<br /> phương pháp kháng sinh đồ trên môi trường 11. Rinder H, Mieskes KT, Loscher T (2001). Heteroresistance in<br /> lỏng BACTEC MGIT 960 trong việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 5(4):339-345.<br /> 12. Tuberculosis profile. 2015. Tuberculosis report in Vietnam by<br /> lao kháng thuốc INH (97,1%), RIF (99%), WHO. www.who.int/tb/data.<br /> MDR-TB (98,8%). Các đột biến kháng thuốc 13. Vladyslav Nikolayevskyy, Yanina Balabanova, Tatyana Simak<br /> hay gặp của RIF là S531L (58,8%) trên gen et al (2009). Performance of the Genotype MTBDRplus assay in<br /> the diagnosis of tuberculosis and drug resistance in Samara,<br /> rpoB, của INH là S315T1 (75,4%) trên gen katG Russian Federation. BMC Clin Path, 9(2): 1472-6890.<br /> và C15T (18,3%) trên gen inhA. Phương pháp<br /> này còn có thể áp dụng trên bệnh phẩm trực Ngày nhận bài báo: 26/02/2018<br /> tiếp để giúp chân đoán nhanh, điều trị kịp thời Ngày phản biện nhận xét bài báo: 07/03/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 25/09/2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 161<br />