Sự đa dạng của kiểu gen Muc5ac không ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm H.Pylori

Tạp chí Khoa học & Công nghệ - số 2(50)/năm 2009<br /> <br /> SỰ ĐA DẠNG CỦA KIỂU GEN MUC5AC KHÔNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN<br /> TRẠNG NHIỄM H. PYLORI<br /> <br /> Y- Dược học<br /> <br /> TÌNH<br /> <br /> Nguyễn Văn Thái - Phạm Hùng Lực (Trường Đại học Y Dược Cần Thơ)<br /> <br /> 1. Phần giới thiệu<br /> Lớp nhày ở dạ dày bảo vệ lớp tế bào biểu bì chống lại acid dạ dày, các men phân hủy<br /> protein, các chấn thương lí hóa và vi sinh vật gây bệnh. Thành phần chính của lớp nhày là những<br /> glycoprotein lớn có tên là mucin. Có nhiều loại mucin khác nhau, nhưng ở dạ dày chỉ có các loại<br /> mucin1, mucin5AC và mucin6[1]. Tất cả các loại mucin này bao gồm khung polypeptide gắn<br /> chuỗi oligosaccharide bên cạnh, chuỗi này có vai trò quyết định khả năng bảo vệ của mucin đối<br /> với các tác nhân lí hóa[2].<br /> Một điều đáng quan tâm là có một sự khác biệt giữa các cá thể về số các chuỗi bên. Điều<br /> này xảy ra bởi sự đa dạng của VNTR ở gen mã hóa mucin. Các VNTR bao gồm hệ quả sự lập lại<br /> của các DNA và số lần lập lại này có sự khác biệt khá cao. Kết quả là có sự lập lại các trình tự<br /> amino acid ở phần trung tâm của khung polypeptide, khung để các oligosaccharide gắn vào. Vì<br /> vậy, sự đa dạng này dẫn tới việc tạo ra các polypeptide của mucin có sự khác biệt cả chiều dài và<br /> sự glycosyl hóa[4-5]. Do vậy, sự đa dạng này có thể ảnh hưởng đến khả năng bảo vệ của mucin.<br /> Do hệ quả về mặt cấu trúc có ý nghĩa của sự đa dạng VNTR, một số nghiên cứu đã tìm ra<br /> những hệ quả về mặt sinh lí bệnh của nó. Trong nghiên cứu so sánh bệnh nhân ung thư dạ dày và<br /> nhóm tình nguyện, các đoạn VNTR ngắn hơn có liên quan đến ung thư dạ dày ở MUC1[7] và<br /> MUC6[6]. Ảnh hưởng này có thể phần nào đó là do sự thay đổi về mức độ nhạy cảm với tình<br /> trạng nhiễm H. pylori, vì H. pylori là yếu tố quan trọng trong nguyên nhân ung thư dạ dày[8].<br /> Vinall và cộng sự[9] đã chứng minh rằng cặp allele ngắn của MUC1 có liên quan đến nhiễm H.<br /> pylori, và gần đây một kết quả tương tự đã được báo cáo cho MUC6[10].<br /> Tuy nhiên, chưa có công bố nào về ảnh hưởng của sự đa dạng VNTR của gen MUC5AC<br /> trên tình trạng nhiễm H. pylori. MUC5AC có thể là quan trọng bởi vì Van den Brink và cộng sự<br /> đã cho thấy rằng H. pylori dễ định vị trên MUC5AC[11]. Hơn nữa, MUC5AC là thụ thể chính<br /> của H. pylori[12-13]. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là tìm hiểu ảnh hưởng của sự đa dạng<br /> VNTR của MUC5AC đối với tình trạng nhiễm H. pylori.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Từ tháng 9 đến tháng 12/2003 tất cả bệnh nhân có triệu chứng tiêu hóa trên đến khám tại<br /> phòng khám tiêu hóa bệnh viện Đa khoa Cần Thơ và có chỉ định nội soi được mời tham gia nghiên<br /> cứu. Chẩn đoán chỉ dựa vào quan sát nội soi. Bệnh nhân không có điều trị tiệt trừ H. pylori trước<br /> đó và đồng ý viết tờ tự nguyện tham gia nghiên cứu được đưa vào trong nhóm nghiên cứu. Bảng<br /> thu thập số liệu ban đầu gồm có tuổi, giới, nghề nghiệp, thói quen hút thuốc, uống rượu.<br /> Chẩn đoán nhiễm H. pylori<br /> Nhiễm H. pylori được chẩn đoán bằng thử nghiệm qua hơi thở sử dụng 14 C đánh dấu<br /> (Thụy Điển). Bệnh nhân không được phép sử dụng thuốc ức chế bơm proton hoặc thuốc<br /> kháng H2 hoặc kháng sinh 2 tuần trước khi làm xét nghiệm. Sáng bệnh nhân nhịn đói qua<br /> đêm, được uống 1 viên thuốc có urê với 14 C đánh dấu cùng 50ml nước. 10 phút sau đó bệnh<br /> 1<br /> <br /> Tạp chí Khoa học & Công nghệ - số 2(50)/năm 2009<br /> <br /> Y- Dược học<br /> <br /> nhân thổi vào trong 1 cái bọc có sẵn trong bộ thử nghiệm, rồi đưa vào máy phân tích phóng<br /> xạ trong 5 phút. Nếu đo được 50 đơn vị là H. pylori (+), nếu < 25 đơn vị là âm tính, còn nếu<br /> từ 25 - 50 là nghi ngờ.<br /> Xác định chiều dài cặp alelle MUC5AC<br /> Mẫu máu được lấy để ly trích DNA(Bộ kit của Gentra systems, Minneapolis, Mỹ). Chiều<br /> dài của đoạn alelle MUC5AC được đo bằng phân tích Southern blot. Mẫu DNA được cắt bằng<br /> men SacI như đã được mô tả trước bởi Escande và cộng sự[14]. Men này cắt bên ngoài phạm vi<br /> lập lại và bộc lộ rõ sự đa dạng VNTR của MUC5AC. Các đoạn DNA được tách ra bằng thạch<br /> agarose (0.7% agarose in 0.04M Tris, 0.001M EDTA, pH 8.0) ở 35V trong ít nhất 18 giờ. Chúng<br /> tôi dùng -HindIII như một marker của chiều dài đoạn DNA. Sau đó đoạn DNA được đưa vào<br /> màng nylon (Gene Screen PlusTM hybridization transfer membrane, Boston, USA). Sau đó, màng<br /> nylon được xử lí bằng bức xạ tia cực tím và chuẩn bị lại trong môi trường đệm Church. Probe bao<br /> gồm phần giàu cysteine được tạo ra bởi PCR với mồi nhử 5’-ACCAGCACAAGCCATCTTTC-3’<br /> and reverse primer 5’-CAGGGAAGGATACAGAGCATTG-3’ và đánh dấu ngẫu nhiên bằng<br /> a-32PdCTP. Các sản phẩm sau khi làm PCR được xác định theo trình tự. Sau 18 giờ nhân probe<br /> lên trong chất đệm chứa phosphate 0,5M 7% SDS và 0.001M EDTA, dung dịch SSPE/SDS được<br /> dùng loại bỏ probe không chuyên biệt. Sử dụng λ III như tham khảo, chiều dài đoạn allele<br /> MUC5AC riêng biệt được tính toán theo TotallabTM (Nonlinear Dynamics).<br /> Phân tích số liệu<br /> Kết quả ban đầu của nghiên cứu này là có hay không có sự hiện diện của H. pylori.<br /> Những đặc điểm cơ bản của 2 nhóm bệnh nhân nhiễm hay không nhiễm được so sánh với nhau<br /> sử dụng test chi bình phương và t test sau cho phù hợp. Phân bố chiều dài đoạn alelle MUC5AC<br /> được so sánh giữa nhóm nhiễm và không nhiễm H. pylori. Ngoài ra, biểu đồ dạng chấm kết hợp<br /> sự khác biệt (ví dụ kiểu gen) của chiều dài đoạn alelle MUC5AC được cấu trúc để thấy kiểu khác<br /> biệt bằng hình ảnh cho những bệnh nhân nhiễm và không nhiễm H. pylori. Ý nghĩa thống kê xác<br /> định với p < 0.05. Những giá trị mất được loại trừ khi phân tích, toàn bộ phân tích được thực<br /> hiện bằng phần mềm thống kê SAS (Viện SAS, Mỹ).<br /> 3. Kết quả nghiên cứu<br /> Mẫu nghiên cứu<br /> Có 170 bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu (tuổi trung bình 43, 35% nam, 52% bị nhiễm<br /> H. pylori). Bảng 1 cho thấy những bệnh nhân nhiễm và không nhiễm H. pylori có những đặc<br /> điểm cơ bản giống nhau, chỉ có sự khác biệt về tuổi.<br /> Chiều dài đoạn alelle MUC5AC<br /> Hình 1 chỉ ra rằng chiều dài đoạn alelle MUC5AC được cắt bằng men SacI phân bố từ<br /> 6.2 đến 11.2 kbp. Tuy nhiên, chủ yếu (92%) tập trung trong khoảng hẹp từ 7 - 9kbp. Cùng với<br /> hình ảnh này số lần lặp lại có thể ước lượng bằng việc trừ đi phạm vi không VNTR giữa vị trí cắt<br /> (toàn bộ là 2.1kbp) từ chiều dài đoạn alelle và chia cho chiều dài của sự lặp lại đơn (24bp). Có<br /> thể tính ra được số lặp lại ở mức từ 170 - 380 (trung bình 243). Trong nghiên cứu trước đây,<br /> chiều dài đoạn alelle MUC6 được đo chính ở bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.<br /> Hình 2 cho thấy, chiều dài đoạn alelle MUC5AC và chiều dài đoạn alelle MUC6 là độc lập.<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tạp chí Khoa học & Công nghệ - số 2(50)/năm 2009<br /> <br /> Y- Dược học<br /> <br /> Chiều dài đoạn alelle MUC5AC và tình trạng nhiễm H. pylori<br /> Chiều dài trung bình đoạn MUC5AC được xác định ở bệnh nhân nhiễm và không nhiễm<br /> H. pylori (7.9 so với 7.9). Hình 3 cho thấy, sự phân bố chiều dài đoạn MUC5AC là giống nhau ở<br /> cả 2 nhóm (p = 0.7). Hình 4 trình bày biểu đồ chấm của sự kết hợp khác biệt (ví dụ kiểu gen) của<br /> chiều dài đoạn alelle MUC5AC cho những bệnh nhân nhiễm và không nhiễm H. pylori một các<br /> riêng biệt. Chiều dài của đoạn alelle nhỏ hơn (trục) được chấm chống lại với chiều dài đoạn<br /> alelle dài hơn (trục). Vì vậy, vùng khác là trống. Kích thước biểu tượng tương quan cùng với số<br /> bệnh nhân có kiểu gen đặc biệt. Khi so sánh cả 2 hình ảnh cho thấy không có sự khác biệt nào<br /> được phát hiện ở nhóm bệnh nhân nhiễm và không nhiễm H. pylori.<br /> <br /> Hình 1. Sự phân bố chiều dài các cặp allele<br /> MUC5AC SacI<br /> <br /> Hình 2. Sự phân bố chiều dài các cặp allele<br /> MUC5AC ở những bệnh nhân H. pylori (-) và (+)<br /> <br /> Hình 3. Biểu đồ hình chấm về kiểu gene MUC5AC ở bệnh nhân H. pylori (-) và (+)<br /> Bả ng 1. Những đ ặ c đ iể m cơ bả n ở bệ nh nhân có H. pylori (-) và (+)<br /> Tuổi trung bình (SD)*<br /> Nam<br /> Giới<br /> Nữ<br /> Có<br /> Hút thuốc<br /> Không<br /> Có<br /> Uống rượu<br /> Không<br /> <br /> Số (%) H. pylori(+) (n=89)<br /> 46 (12)<br /> 28 (47%)<br /> 61 (55%)<br /> 22 (51%)<br /> 67 (53%)<br /> 17 (53%)<br /> 72 (52%)<br /> *<br /> <br /> Số (%) H. pylori(-)(n=81)<br /> 39 (13)<br /> 31 (53%)<br /> 50 (45%)<br /> 21 (49%)<br /> 60 (47%)<br /> 15 (47%)<br /> 66 (48%)<br /> <br /> p