Đỗ Mạnh Cƣờng và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
83(07): 55 - 58<br />
<br />
Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn Xuân Vũ*, Dương<br />
Văn Cường<br />
<br />
TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH<br />
TỰ CỦA GENE CRTY<br />
MÃ HÓA CHO LYCOPENE CYCLASE<br />
TỪ PANTOEA ANANATIS<br />
<br />
Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
ß-carotene, một hợp chất carotenoid, có vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cƣờng hệ miễn dịch và chống<br />
một số bệnh ung thƣ ở đƣờng tiêu hóa. ß-carotene đƣợc sử dụng nhiều trong y tế, công nghiệp thực<br />
phẩm, dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Việc cung cấp ß-carotene từ các nguồn tự nhiên có một số yếu điểm nhƣ<br />
thiếu tính chủ động phụ thuộc vào thời vụ và chi phí cao. Do vậy, nhu cầu đặt ra là cần xây dựng nguồn<br />
cung cấp ß-carotene nhân tạo. Trong con đƣờng sinh tổng hợp ß-carotene, enzyme lycopene cyclase,<br />
đƣợc mã hóa bởi gene crtY, xúc tác phản ứng chuyển hóa lycopene thành ß-carotene. Nghiên cứu này<br />
của chúng tôi là tách dòng và xác định trình tự của gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis. Gene crtY<br />
đƣợc tách dòng có chiều dài 1161 bp với trình tự tƣơng đồng 100% với trình tự gene crtY phân lập từ vi<br />
khuẩn Pantoea ananatis đã công bố trên ngân hàng gene NCBI mã số D90087.2 . Kết quả của nghiên<br />
cứu này là tiền đề cho mục tiêu tạo chủng E. coli có khả sản xuất ß-carotene.<br />
Từ khóa: ß-carotene, pro-vitamin A, crtY, Lycopene cyclase<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ*<br />
Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên đƣợc tổng<br />
hợp chủ yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn và<br />
nấm [9]. Carotenoid có vai trò trong hình thành<br />
màu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành một<br />
số hormone [10]. Trong công nghiệp<br />
carotenoid đƣợc dùng làm dƣợc phẩm, thực<br />
phẩm dinh dƣỡng, chất phụ gia thức ăn cho<br />
động vật, phẩm màu làm mỹ phẩm và thực<br />
phẩm [5]. Do khả năng chống oxi hóa,<br />
carotenoid mang lại lợi ích cho sức khỏe con<br />
<br />
*<br />
<br />
ngƣời, bảo vệ da dƣới tác động của ánh nắng<br />
mặt trời, tăng cƣờng chức năng hệ miễn dịch,<br />
ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnh<br />
của các bệnh mãn tính có tác dụng trong<br />
điều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thƣ<br />
[3,5,6].<br />
ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A,<br />
tăng cƣờng hệ miễn dịch và chống một số<br />
bệnh ung thƣ [1] đã trở thành một trong<br />
những chất đƣợc quan tâm nhất trong nhóm<br />
carotenoid. Cơ thể con ngƣời không tự tổng<br />
hợp đƣợc ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức<br />
ăn [2].<br />
<br />
Tel: 0915565282; Email: vubio@yahoo.com<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
55<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Đỗ Mạnh Cƣờng và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
83(07): 55 - 58<br />
<br />
tổng hợp bởi hãng Alpha DNA. Các hoá chất<br />
sử dụng trong các thí nghiệm đƣợc cung cấp từ<br />
các hãng Merk, Sigma và Invitrogen.<br />
Bảng 1. Cặp mồi sử dụng nhân gene CrtY.<br />
Tên mồi<br />
CrtY-F<br />
<br />
Hình 1. Con đƣờng sinh tổng hợp các chất<br />
carotenoid<br />
<br />
CrtY-R<br />
<br />
Trình tự<br />
5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTA<br />
AATGGGAGCGGCTAT3’<br />
5’GCAAGCTTTTAACGATGAGT<br />
CGTCATAATGG3’<br />
<br />
Tất cả carotenoid đều đƣợc xây dựng từ đơn<br />
phân Isopentenyl diphosphate (IPP) và<br />
dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Hiện nay<br />
đã có hơn 20 gene crt chịu trách nhiệm tổng<br />
hợp nên các enzyme xúc tác quá trình tổng<br />
hợp carotenoids đƣợc tách dòng từ các loại<br />
sinh vật nhƣ vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảo<br />
cho đến thực vật bậc cao [4]. Một trong những<br />
vi khuẩn có thể cung cấp các gene enzyme để<br />
tổng hợp carotenoid là vi khuẩn Pantoea<br />
ananatis (trƣớc đây gọi là Erwinia uredevora)<br />
[8]. ß-carotene đƣợc tổng hợp từ lycopene nhờ<br />
enzyme lycopene cyclase đƣợc mã hóa bởi<br />
gene crtY (Hình 1).<br />
Với mục tiêu tạo chủng E. coli có khả năng sản<br />
xuất β-carotene, chúng tôi tiến hành tách dòng<br />
và xác định trình tự gene crtY từ Pantoea<br />
ananatis.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN<br />
CỨU<br />
Vi khuẩn Pantoea ananatis (có DNA đƣợc sử<br />
dụng làm khuôn cho phản ứng PCR) đƣợc mua<br />
từ hãng DSMZ (Deutsche Sammlung von<br />
Mikroorganismen Zellkulturen GmbH). Vi<br />
khuẩn E.coli DH5α đƣợc cung cấp bởi Viện<br />
Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công<br />
nghệ Việt Nam dùng làm vật chủ cho quá trình<br />
biến nạp. Chúng tôi sử dụng vector tách dòng<br />
pLUG® TA-cloning và các bộ KIT DNAspinTM Plasmid DNA Puification, MEGAspinTM Agarose Gel Extraction mua từ hãng<br />
iNtRON BiotechnologyTM cho các bƣớc thí<br />
nghiệm. Cặp mồi dùng trong PCR (bảng 1)<br />
đƣợc thiết kế dựa trên trình tự các nucleotid ở<br />
2 đầu gene CrtY đã đƣợc công bố trên ngân<br />
hàng gene NCBI mã số D90087.2 và đƣợc<br />
<br />
Vi khuẩn Pantoea ananatis dạng đông khô<br />
đƣợc nuôi phục hồi theo hƣớng dẫn của nhà<br />
cung cấp, sau đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng<br />
Nutrient Broth ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ<br />
250C, lắc 120 vòng/phút trong 16h. Dịch vi<br />
khuẩn đƣợc ly tâm 4000 vòng/phút trong 8<br />
phút để thu cặn tế bào. 2 µl cặn tế bào đã pha<br />
loãng 10 lần đƣợc sử dụng làm khuôn cho<br />
PCR. Chƣơng trình PCR đƣợc thiết lập 25 chu<br />
kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm 3 bƣớc biến tính 950C<br />
45 giây, gắn nối 550C 45 giây, và kéo dài 720C<br />
90 giây. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel<br />
agarose 1% sau đó chiết lại sử dụng bộ KIT<br />
MEGA- spinTM Agarose Gel Extraction theo<br />
hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng gắn nối<br />
TA giữa sản phẩm PCR với vector pLUG ở<br />
nhiệt độ 160C qua đêm, thành phần phản ứng<br />
pLUG 1μl, sản phẩm PCR 2μl, H2O 4μl, dung<br />
dịch đệm 10X của T4 2μl, enzyme T4 DNA<br />
ligase 1μl. Sản phẩm phản ứng gắn nối đƣợc<br />
biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng<br />
DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 420C trong<br />
90 giây, sau đó cấy trải trên môi trƣờng LB<br />
đặc có bổ sung ampicilin 100µg/ml, 16µl Xgal<br />
và 4µl IPTG để chọn lọc. Những khuẩn lạc<br />
trắng đƣợc nhặt nuôi riêng rẽ trong 7 ml môi<br />
trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilin<br />
100µg/ml ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 120<br />
vòng/phút trong khoảng 14-16h. Plasmid đƣợc<br />
tách chiết bằng bộ KIT DNA- spinTM Plasmid<br />
DNA Purification theo hƣớng dẫn của nhà sản<br />
xuất. Các dòng plamid đƣợc cắt kiểm tra bằng<br />
enzyme giới hạn HindIII. Cuối cùng, chúng tôi<br />
tiến hành xác định trình tự nucleotid của đoạn<br />
xen trên máy xác định trình tự tự động của<br />
hãng Applied Biosystems.<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Kết quả nhân gene crtY.<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
56<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Đỗ Mạnh Cƣờng và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose<br />
1% (hình 2). Đƣờng chạy số 1 xuất hiện 2<br />
băng, 1 băng sáng rõ tại vị trí cao hơn băng<br />
1000 bp và thấp hơn băng 1250 bp của thang<br />
DNA chuẩn tƣơng đƣơng kích thƣớc lý thuyết<br />
của gene crtY là 1161 bp. Nhƣ vậy, gene crtY<br />
có thể đã đƣợc khuếch đại đặc hiệu. Băng mờ<br />
phía dƣới thấp hơn băng 100 bp của thang<br />
chuẩn là primer dimers.<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
1250 bp<br />
<br />
83(07): 55 - 58<br />
<br />
Hình 3 cho thấy các dòng 2 và 3 xuất hiện 2<br />
băng khích thƣớc khoảng 3 kb và hơn 1 kb lần<br />
lƣợt tƣơng ứng với vector pLUG mạch thẳng<br />
và gene crtY. Đƣờng chạy số 1 xuất hiện băng<br />
khoảng 1kb có thể là đoạn xen không mong<br />
muốn. Dòng 2 và 3 đƣợc chọn, dòng 1 bị loại<br />
bỏ.<br />
Kết quả xác định trình tự nucleotide dòng<br />
crtY-2<br />
Kết quả giải trình tự dòng crtY-2 thu đƣợc<br />
trình tự trùng khớp 100% với trình tự gene<br />
crtY từ Pantoea ananatis đã công bố trƣớc đó<br />
trên ngân hàng gene NCBI với mã số<br />
D90087.2 (hình 4).<br />
<br />
1000 bp<br />
<br />
Hình2.2 Kết<br />
: Kết<br />
quả<br />
PCR<br />
nhân<br />
Hình<br />
quả<br />
PCR<br />
nhân<br />
genegene<br />
CrtYCrtY<br />
Đường<br />
chạy<br />
PCR<br />
Đƣờng<br />
chạy1:1:Sản<br />
Sản phẩm<br />
phẩm PCR<br />
Đƣờng<br />
chạy<br />
2: Thang<br />
DNA<br />
chuẩn<br />
1Kb 1 kb<br />
Đường<br />
chạy<br />
2: Thang<br />
DNA<br />
chuẩn<br />
<br />
Kết quả tách dòng gene crtY<br />
Kết quả sang lọc dòng thu đƣợc 3 khuẩn lạc<br />
trắng. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng<br />
HindIII, vị trí cắt đƣợc thiết kế ở 2 đầu T của<br />
pLUG và không hiện diện trong trình tự gene<br />
crtY, đƣợc thể hiện ở hình 3.<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
A<br />
<br />
M<br />
<br />
3<br />
<br />
M<br />
<br />
3kb<br />
<br />
3kb<br />
<br />
1kb<br />
<br />
1kb<br />
<br />
B<br />
<br />
Hình 3. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng<br />
HindIII<br />
Đường chạy 1,2(A) và 3(B): Các dòng plasmid tái<br />
tổ hợp có khả năng mang gene crtY<br />
Đường chạy M : Thang chuẩn DNA 1kb<br />
<br />
GTGGGAGCGG<br />
<br />
CTATGCAACC<br />
<br />
GCATTATGAT<br />
<br />
CTGATTCTCG<br />
<br />
TGGGGGCTGG<br />
<br />
ACTCGCGAAT<br />
<br />
GGCCTTATCG<br />
<br />
CCCTGCGTCT<br />
<br />
TCAGCAGCAG<br />
<br />
CAACCTGATA<br />
<br />
TGCGTATTTT<br />
<br />
GCTTATCGAC<br />
<br />
GCCGCACCCC<br />
<br />
AGGCGGGCGG<br />
<br />
GAATCATACG<br />
<br />
TGGTCATTTC<br />
<br />
ACCACGATGA<br />
<br />
TTTGACTGAG<br />
<br />
AGCCAACATC<br />
<br />
GTTGGATAGC<br />
<br />
TTCGCTGGTG<br />
<br />
GTTCATCACT<br />
<br />
GGCCCGACTA<br />
<br />
TCAGGTACGC<br />
<br />
TTTCCCACAC<br />
<br />
GCCGTCGTAA<br />
<br />
GCTGAACAGC<br />
<br />
GGCTACTTCT<br />
<br />
GTATTACTTC<br />
<br />
TCAGCGTTTC<br />
<br />
GCTGAGGTTT<br />
<br />
TACAGCGACA<br />
<br />
GTTTGGCCCG<br />
<br />
CACTTGTGGA<br />
<br />
TGGATACCGC<br />
<br />
GGTCGCAGAG<br />
<br />
GTTAATGCGG<br />
<br />
AATCTGTTCG<br />
<br />
GTTGAAAAAG<br />
<br />
GGTCAGGTTA<br />
<br />
TCGGTGCCCG<br />
<br />
CGCGGTGATT<br />
<br />
GACGGGCGGG<br />
<br />
GTTATGCGGC<br />
<br />
AAACTCAGCA<br />
<br />
CTGAGCGTGG<br />
<br />
GCTTCCAGGC<br />
<br />
GTTTATTGGC<br />
<br />
CAGGAATGGC<br />
<br />
GATTGAGCCA<br />
<br />
CCCGCATGGT<br />
<br />
TTATCGTCTC<br />
<br />
CCATTATCAT<br />
<br />
GGATGCCACG<br />
<br />
TTAATTGAAG<br />
<br />
ACACGCACTA<br />
<br />
TATCGATAAT<br />
<br />
GCGACATTAG<br />
<br />
ATCCTGAACG<br />
<br />
CGCGCGGCAA<br />
<br />
GTCGATCAGC<br />
<br />
AAAATGGTTA<br />
<br />
TCGCTTCGTG<br />
<br />
TACAGCCTGC<br />
<br />
CGCTCTCGCC<br />
<br />
GACCAGATTG<br />
<br />
AATATTTGCG<br />
<br />
ACTATGCCGC<br />
<br />
GCAACAGGGT<br />
<br />
TGGCAGCTTC<br />
<br />
AGACATTGCT<br />
<br />
GCGTGAAGAA<br />
<br />
CAGGGCGCCT<br />
<br />
TACCCATCAC<br />
<br />
CCTGTCGGGC<br />
<br />
AATGCCGAGG<br />
<br />
CATTCTGGCA<br />
<br />
GCAGCGCCCC<br />
<br />
CTGGCCTGTA<br />
<br />
GTGGATTACG<br />
<br />
TGCCGGTCTG<br />
<br />
TTCCATCCTA<br />
<br />
CCACCGGCTA<br />
<br />
TTCACTGCCG<br />
<br />
CTGGCGGTTG<br />
<br />
CCGTGGCCGA<br />
<br />
CCGCCTGAGC<br />
<br />
GCACTTGATG<br />
<br />
TCTTTACGTC<br />
<br />
GGCCTCAATT<br />
<br />
CACCAGGCTA<br />
<br />
TTAGGCATTT<br />
<br />
TGCCCGCGAG<br />
<br />
CGCTGGCAGC<br />
<br />
AGCAGCGCTT<br />
<br />
TTTCCGCATG<br />
<br />
CTGAATCGCA<br />
<br />
TGCTGTTTTT<br />
<br />
AGCCGGACCC<br />
<br />
GCCGATTCAC<br />
<br />
GCTGGCGGGT<br />
<br />
TATGCAGCGT<br />
<br />
TTTTATGGTT<br />
<br />
TACCTGAAGA<br />
<br />
TTTAATTGCC<br />
<br />
CGTTTTTATG<br />
<br />
CGGGAAAACT<br />
<br />
CACGCTGACC<br />
<br />
GATCGGCTAC<br />
<br />
GTATTCTGAG<br />
<br />
CGGCAAGCCG<br />
<br />
CCTGTTCCGG<br />
<br />
TATTAGCAGC ATTGCAAGCC ATTATGACGA<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
57<br />
<br />
CTCATCGTTA<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
A<br />
<br />
Đỗ Mạnh Cƣờng và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
Hình 4 : Kết quả giải trình tự gene crtY từ<br />
dòng crtY-2<br />
<br />
83(07): 55 - 58<br />
<br />
[5]. Lee P.C., Schmidt-Dannert C. (2002)<br />
Metabolic engineering towards biotechnological<br />
production of carotenoids in microorganisms. Appl<br />
Microbiol<br />
Biotechnol<br />
60:1-11.<br />
DOI:<br />
10.1007/s00253-002-1101-x.<br />
[6]. Lenore Arab, Steck S. (2000) Lycopene and<br />
cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 71:1691S5S; discussion 1696S-7S.<br />
[7]. Lu Q.Y., Hung J.C., Heber D., Go V.L., Reuter<br />
V.E., Cordon-Cardo C., Scher H.I., Marshall J.R.,<br />
Zhang Z.F. (2001) Inverse associations between<br />
plasma lycopene and other carotenoids and prostate<br />
cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10:74956.<br />
[8]. Misawa N., Nakagawa M., Kobayashi K.,<br />
Yamano S., Izawa Y., Nakamura K., Harashima K.<br />
(1990) Elucidation of the Erwinia uredovora<br />
carotenoid biosynthetic pathway by functional<br />
analysis of gene products expressed in Escherichia<br />
coli. J Bacteriol 172:6704-12.<br />
[9]. Schmidt-Dannert C., Umeno D., Arnold F.H.<br />
(2000) Molecular breeding of carotenoid<br />
biosynthetic pathways. Nat Biotechnol 18:750-3.<br />
DOI: 10.1038/77319.<br />
10. Vershinin A. (1999) Biological functions of<br />
carotenoids--diversity and evolution. Biofactors<br />
10:99-104.<br />
<br />
KẾT LUẬN<br />
Tách dòng và giải trình tự thành công gene<br />
crtY mã hóa enzyme lycopene cyclase từ vi<br />
khuẩn Pantoea ananatis.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
[1]. Bendich A. (2004) From 1989 to 2001: what<br />
have we learned about the "biological actions of<br />
beta-carotene" J Nutr 134:225S-230S.<br />
[2].Fujisawa M., Watanabe M., Choi S.K.,<br />
Teramoto M., Ohyama K., Misawa N. (2008)<br />
Enrichment of carotenoids in flaxseed (Linum<br />
usitatissimum) by metabolic engineering with<br />
introduction of bacterial phytoene synthase gene<br />
crtB. J Biosci Bioeng 105:636-41. DOI: S13891723(08)70121-X [pii]10.1263/jbb.105.636.<br />
[3]. Giovannucci E. (1999) Tomatoes, tomatobased products, lycopene, and cancer: review of the<br />
epidemiologic literature. J Natl Cancer Inst 91:31731.<br />
[4]. Joseph Hirschberg M.C., Mark Harker, Tamar<br />
Lotan, Varda Mann and Iris Pecker. (1997 )<br />
Molecular genetics of the carotenoid biosynthesis<br />
pathway in plants and algae. Pure and Applied<br />
Chemistry 69:10.<br />
<br />
SUMMARY<br />
CLONING AND SEQUENCING OF crtY GENE ENDCODE LYCOPENE CYCLASE<br />
FROM PANTOEA ANANATIS BACTERIA<br />
Do Manh Cuong, Nguyen Xuan Vu*, Duong Van Cuong<br />
College of Agriculture and Forestry, Thai Nguyen University<br />
<br />
ABSTRACT<br />
ß-carotene, a carotenoid compound, plays critical roles in human metabolism including serving as<br />
precursor for vitamin A synthesis, strengthening the immune system, and preventing some digestive<br />
cancers. ß-carotene has been widely used in medicine, food industry, pharmaceuticals, and cosmetics.<br />
The inactive supply of ß-carotene from natural sources has some remarkable weaknesses such as season<br />
dependence and high cost. Therefore, it is necessary to engineer other artificial ß-carotene sources. In<br />
the natural ß-carotene biosynthetic pathway, lycopene cyclase, encoded by the gene crtY, is responsible<br />
for converting lycopene to ß-carotene. In this study we have cloned and sequenced crtY from Pantoea<br />
ananatis. The nucleotide sequence of the cloned 1161 bp crtY is 100% matched with the P. ananatis<br />
crtY previously published on NCBI gene bank (D90087.2). The cloned crtY will subsequently be used<br />
for engineering a ß-carotene producible E. coli strain.<br />
Keywords: ß-carotene, pro-vitamin A, crtY, Lycopene cyclase<br />
<br />
*<br />
<br />
Tel: 0915565282; Email: vubio@yahoo.com<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
58<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
