Tăng hệ số nhân nhanh chồi cây hoa Salem tím (Limonium sinuatum L. Mill) bằng cách sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và Adenine trong nuôi cấy in vitro

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM<br /> (Limonium sinuatum L. Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU<br /> HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO<br /> <br /> Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên<br /> Trường Đại học bách khoa, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, nguyenthihuyentrang171@gmail.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím<br /> (Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích<br /> hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân<br /> chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l<br /> sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng<br /> 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6<br /> tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4<br /> mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa<br /> kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo<br /> chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine<br /> giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10<br /> mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt<br /> là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA<br /> <br /> MỞ ĐẦU số yếu tố lên sự nhân chồi của cây salem in<br /> Salem có tên khoa học là Limonium vitro, là giai đoạn quan trọng trong công tác vi<br /> sinuatum L. Mill, thuộc họ Bạch hoa đan nhân giống.<br /> (Plumbaginaceae). Chi Limonium có khoảng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 150 loài hoang dã [3]. Salem xuất xứ từ Địa Vật liệu<br /> Trung Hải và đã có mặt ở Đà Lạt từ trước năm<br /> 1975. Vùng trồng hoa salem phổ biến tại Đà Lạt Chồi của cây con in vitro được sử dụng để<br /> là Đa Thiện, Thái Phiên và nhiều nơi khác. Trên làm vật liệu thí nghiệm. Hạt giống tạo cây con<br /> thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên là hạt giống hoa salem thương mại được cung<br /> cứu đối tượng này như nuôi cấy tế bào để khảo cấp bởi công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt<br /> sát khả năng tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue,<br /> sinh gây hoại tử ở lá trong vi nhân giống [9] hay Hoa Kỳ.<br /> tạo cây lai giữa 2 loại Limonium perezii và Phương pháp<br /> Limonium sinuatum [5]. Trong vài năm gần đây, Môi trường nhân chồi là môi trường<br /> một bộ phận nông dân tại Đà Lạt sử dụng các Murashige và Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung<br /> giống hoa đã bị thoái hóa, trong đó có salem, 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, 6 g/l agar<br /> dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc và độ bền kém. và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác<br /> Bên cạnh đó, nguồn giống chưa được chủ động, nhau. Các môi trường này được chỉnh về pH 5,8<br /> cho nên, khi thị trường cần số lượng lớn thì sản trước khi hấp tiệt trùng ở 121ºC, 1 atm trong<br /> xuất không đáp ứng được [8]. Phương pháp vi thời gian 15 phút.<br /> nhân giống là phương pháp hiệu quả không<br /> những tạo số lượng cây giống lớn, không những Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện<br /> ổn định về mặt di truyền, mà còn nâng cao chất chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng<br /> lượng cây giống. Xuất phát từ yêu cầu thực tế 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC.<br /> nhằm sản xuất một lượng lớn cây giống salem Khử trùng hạt<br /> có chất lượng cao và ổn định, đề tài được thực Hạt được khử trùng với dung dịch Javel<br /> hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của một thương mại 50% trong thời gian 7 phút. Môi<br /> <br /> <br /> 219<br />  Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> trường gieo hạt là môi trường MS bổ sung 100 chất được khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 7 và 10<br /> mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar. mg/l và Adenine nồng độ 5; 10; 15 và 20 mg/l.<br /> Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy Phân tích và xử lý số liệu<br /> cho sự tạo chồi Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số<br /> Chồi của cây con 4; 6 và 8 tuần tuổi được lượng chồi hình thành và hình thái chồi sau 4; 6<br /> nuôi cấy trên môi trường nhân chồi là môi và 8 tuần nuôi cấy.<br /> trường MS bổ sung 4 mg/l kinetin, 100 mg/l Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 5 bình,<br /> myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Kết mỗi bình chứa 3 mẫu cấy.<br /> quả về độ tuổi sinh lý thích hợp nhất cho sự tạo<br /> chồi sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần<br /> khảo sát nhân chồi trong báo cáo này. mềm SPSS theo phương pháp Duncan ở mức ý<br /> nghĩa 0,05.<br /> Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi<br /> Mẫu cấy là chồi của cây con có tuổi sinh lý KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> thích hợp là kết quả ở thí nghiệm trước được<br /> Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu<br /> nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA (0; 0,2;<br /> cấy cho sự tạo chồi<br /> 0,5; 1; 2; 3; 4 mg/l) hoặc kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4;<br /> 5 mg/l) nhằm tìm ra loại và nồng độ cytokinin Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân<br /> thích hợp cho việc nhân chồi cây salem. Kết quả giống in vitro thường được nhắc đến như thành<br /> cytokinin thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy.<br /> cây salem sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm Trong đó, yếu tố mẫu cấy có thể chia làm hai<br /> tiếp theo. nhóm: lựa chọn mẫu cấy và xử lý mẫu cấy. Các<br /> nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ<br /> Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và<br /> quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn<br /> auxin lên sự tạo chồi<br /> sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.<br /> Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực Trong báo cáo này, chúng tôi tiến hành khảo sát<br /> vật được sử dụng trong thí nghiệm này là IBA; trên nguồn mẫu là hạt, do đó độ tuổi sinh lý của<br /> 2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mẫu cấy có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả nhân<br /> mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm chồi khi nuôi cấy.<br /> ứng tạo chồi hiệu quả nhất thu được từ thí<br /> nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cytokinin. So Ba độ tuổi sinh lý khác nhau được khảo sát<br /> sánh hiệu quả tạo chồi trên các môi trường khảo và ghi nhận kết quả sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy<br /> trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin được<br /> sát với môi trường chỉ bổ sung cytokinin riêng<br /> trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy, có sự<br /> lẻ. Môi trường có kết quả tạo chồi cao nhất sẽ<br /> khác biệt rõ rệt về khả năng tạo chồi giữa những<br /> được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.<br /> mẫu cấy có độ tuổi khác nhau. Mẫu cấy 6 tuần<br /> Ảnh hưởng của GA3, adenine lên sự tạo chồi tuổi có khả năng tạo chồi cao nhất với số lượng<br /> GA3 và adenine được bổ sung riêng lẻ vào chồi trên một mẫu cấy ban đầu là 5,87 chồi sau<br /> môi trường MS có sự hiện diện của chất điều hòa 8 tuần nuôi cấy (hình 1b). Tỷ lệ tạo chồi của<br /> sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu quả mẫu cấy 6 tuần tuổi cũng cao hơn so với mẫu<br /> nhất từ các thí nghiệm trước. Nồng độ của các cấy 4 và 8 tuần tuổi.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đến hiệu quả nhân chồi<br /> Tuổi của Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần<br /> mẫu cấy Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng<br /> (tuần) chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu<br /> 4 tuần 13,33a* 1,13a 66,67a 2,53a 80,00a 5,27a<br /> 6 tuần 80,00b 2,67b 93,33b 4,20b 100,00b 5,87a<br /> 8 tuần 6,67a 1,07a 13,33c 1,33c 40,00c 2,13b<br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> 220<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> <br /> <br /> Quan sát hình thái mẫu cấy sau 4 tuần nuôi này hiện tượng ưu tính ngọn của chồi ban đầu<br /> cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin, không bị ức chế hoàn toàn, chồi mới hình thành<br /> chúng tôi nhận thấy mẫu cấy ban đầu không có chủ yếu ở nách lá. Đây có lẽ là nguyên nhân<br /> sự gia tăng kích thước, các lá mới hình thành có làm cho số lượng chồi mới hình thành thấp hơn<br /> kích thước đều nhau, chiều dài dưới 1 cm. Chồi so với mẫu cấy 4 và 6 tuần tuổi.<br /> mới xuất hiện ở nách lá và gốc của chồi ban đầu Như vậy, mẫu cấy chồi từ cây con 6 tuần<br /> (hình 1a). Điều này chứng minh sự hiện diện tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi<br /> của kinetin trong môi trường nuôi cấy có tác mới hình thành cũng cao hơn mẫu cấy 4 tuần và<br /> động ức chế hiện tượng ưu tính ngọn để kích 8 tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên được lựa chọn để<br /> thích sự hình thành và tăng trưởng của các chồi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra<br /> mới, tạo cụm chồi. môi trường hiệu quả cho việc nhân giống cây<br /> Ở các mẫu cấy 8 tuần tuổi sau 8 tuần nuôi hoa salem.<br /> cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao và<br /> tạo lá mới (hình 1c). Như vậy, ở nhóm mẫu cấy Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Cytokinin Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần<br /> BA Kinetin Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng<br /> (mg/l) (mg/l) chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu<br /> - - 0,00a* 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a<br /> 0,2 - 20,00b 1,20a 20,00b 1,27a 20,00c 1,27a<br /> 0,5 - 6,67a 1,07a 20,00b 1,20a 20,00c 1,20a<br /> 1 - 0,00a 1,00a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a<br /> 2 - 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a<br /> 3 - 6,67a 1,07a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a<br /> 4 - 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a<br /> - 0,2 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a<br /> - 0,5 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a<br /> - 1 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 13,33bc 1,13a<br /> - 2 46,67de 2,13b 66,67c 3,00b 93,33d 3,93b<br /> - 3 53,33e 2,13b 73,33c 3,07b 93,33d 4,80bc<br /> - 4 86,67f 2,27b 86,67d 3,73b 100,00d 5,60c<br /> - 5 33,33c 2,07b 93,33d 3,60b 100,00d 5,73c<br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> Sau 8 tuần khảo sát trên môi trường bổ sung dần khi nồng độ kinetin tăng, đặc biệt trong<br /> chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA cảm khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Nghiệm thức bổ<br /> ứng tạo chồi không hiệu quả. Tỷ lệ mẫu cấy tạo sung 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo chồi thấp và<br /> chồi và số lượng chồi trên một mẫu cấy cao tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi chỉ đạt 13,33%. Các nồng<br /> nhất ở các môi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA độ còn lại có hiệu quả tạo chồi cao hơn đặc biệt<br /> nhưng với tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi trung là kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và<br /> bình đều thấp (20,00% và 1,27 chồi/mẫu cấy), tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau 8 tuần nuôi cấy.<br /> không có sự khác biệt về mặt thống kê so với Tuy nhiên nồng độ kinetin 5 mg/l là nồng độ cao,<br /> mẫu đối chứng (hình 1i). có thể gây ra những biến dị không mong muốn,<br /> Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, kinetin khi quan sát mẫu cấy cũng phát hiện có những<br /> có hiệu quả cao trong sự tạo chồi cây hoa salem. biểu hiện bất thường về hình thái. Ở nghiệm thức<br /> Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi tăng sử dụng 4 mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành<br /> <br /> <br /> 221<br />  Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> trên một mẫu cấy ban đầu là 5,60 chồi/mẫu cấy, số cytokinin riêng lẻ và kết hợp với auxin lên sự<br /> khác biệt không có ý nghĩa với kinetin nồng độ 5 tạo chồi của cây Limonium sinuatum cũng cho<br /> mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ tạo chồi cũng thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt hơn ở nồng độ<br /> đạt 100%. thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) và giảm<br /> Trong nghiên cứu về nhân giống cây dần khi tăng nồng độ BA lên. Ở nồng độ 8,88<br /> Limonium cavanillesii Erben của Amo-Marco et µM BA (tương ứng 2 mg/l) thì không có chồi<br /> al. (1998) [1], kinetin là loại cytokinin có kết mới được hình thành. Báo cáo này cũng cho<br /> quả nhân chồi tốt nhất với khoảng nồng độ từ 2 thấy BA không hiệu quả trong cảm ứng sự nhân<br /> đến 5 mg/l. Trong báo cáo này, tác giả cũng chồi trên đối tượng này.<br /> khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi Như vậy các báo cáo trên đều cho thấy với<br /> của mẫu cấy và cho kết quả cao nhất trong đối tượng là Limonium sinuatum thì BA riêng lẻ<br /> khoảng nồng độ BA là 0,1 đến 0,5 mg/l nhưng chỉ có thể cảm ứng tạo chồi ở nồng độ thấp<br /> kết quả này thấp hơn trên môi trường bổ sung nhưng không hiệu quả vì tỷ lệ tạo chồi và số<br /> kinetin nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Ở các nồng độ lượng chồi hình thành đều ít và thấp hơn các<br /> BA cao hơn mà tác giả khảo sát (1; 2; 5 mg/l) chất cảm ứng khác cùng khảo sát. Điều này phù<br /> cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trung bình giảm. hợp với số liệu mà chúng tôi đã thu nhận được<br /> Tomoko Igawa et al. (2002) [3] cũng sử dụng là BA không thích hợp để cảm ứng với đối<br /> BA trong nghiên cứu tái sinh cây từ nuôi cấy tế tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu quả ở<br /> bào cây Limonium sinuatum Mill ở nồng độ 0,1 nồng độ 4 và 5 mg/l. Do đó chúng tôi chọn<br /> và 1,0 mg/l nhưng chồi chỉ hình thành mới trên kinetin nồng độ 4 mg/l để tiếp tục các thí<br /> môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo nghiệm tiếp theo.<br /> chồi chỉ đạt 3,3% và số chồi mới hình thành<br /> trung bình là 0,3 chồi. Trong kết quả của Jeong Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và<br /> et al. (2001) [4] khi khảo sát ảnh hưởng của một auxin lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa auxin và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là<br /> chồi từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Auxin (mg/l) Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần<br /> Kinetin Số Số Số<br /> Tỉ lệ tạo<br /> (mg/l) lượng Tỉ lệ tạo lượng Tỉ lệ tạo lượng<br /> IBA 2,4-D NAA chồi<br /> chồi/ chồi (%) chồi/ chồi (%) chồi/<br /> (%)<br /> mẫu mẫu mẫu<br /> 4 - - - 86,67a* 2,27ab 86,67bc 3,73c 100,00a 5,60d<br /> 4 0,05 - - 66,67b 2,67a 100,00a 4,07c 100,00a 5,27d<br /> 4 0,1 - - 66,67b 1,93ab 86,67bc 3,33c 100,00a 5,07d<br /> 4 0,2 - - 60,00bc 2,20ab 86,67bc 3,73c 93,33ab 4,93d<br /> 4 - 0,05 - 53,33cd 1,80ab 80,00cd 3,47c 93,33ab 5,20d<br /> 4 - 0,1 - 40,00ef 1,53b 73,33d 2,80c 86,67b 4,67d<br /> 4 - 0,2 - 33,33f 1,47b 80,00cd 2,80c 86,67b 4,53d<br /> 4 - - 0,05 46,67de 1,67b 86,67bc 3,87c 86,67b 4,20d<br /> 4 - - 0,1 53,33cd 1,87ab 93,33ab 3,40c 100,00a 4,73d<br /> 4 - - 0,2 60,00bc 2,20ab 80,00cd 3,40c 100,00a 4,47d<br /> <br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> <br /> 222<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> <br /> Auxin khi kết hợp với cytokinin sẽ giúp sự khoảng thời gian này IBA có thể đã bị giảm<br /> tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới hoạt tính nên tác động của IBA đến mẫu cấy<br /> mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Gaspar et không rõ rệt.<br /> al. (2003) [2] cho rằng các thí nghiệm tạo chồi Trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D,<br /> bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng có sự hình thành các mô sẹo nhỏ ở cuống lá, nơi<br /> cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ từ thấp tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (hình 1e). Mô<br /> đến trung bình. Do đó, các auxin trong thí sẹo khi mới xuất hiện có màu trắng, sau đó bị<br /> nghiệm này được sử dụng ở nồng độ thấp nhằm nâu hóa. 2,4-D là một loại auxin mạnh, có vai<br /> khảo sát tác động của sự phối hợp giữa auxin và trò quan trọng trong sự kích thích sự phân chia<br /> kinetin trên sự tạo chồi cây hoa salem. của tế bào tạo mô sẹo. Tuy vậy, số lượng mô<br /> Sau 8 tuần khảo sát trên các môi trường bổ sẹo hình thành trong thí nghiệm này ít do 2,4-D<br /> sung auxin với loại và nồng độ khác nhau, hiệu chỉ được sử dụng với nồng độ thấp.<br /> quả tạo chồi cao nhất lần lượt ở các nghiệm Về hình thái mẫu cấy, các chồi mới tạo thành<br /> thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy), ở tất cả các môi trường bổ sung auxin đều có<br /> 0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) và 0,1 kích thước lớn hơn các chồi được tạo thành trên<br /> mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3). Tuy môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Trong đó,<br /> nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình trên chiều cao của chồi mới hình thành trên môi<br /> một mẫu cấy ban đầu ở các môi trường này đều trường bổ sung NAA lớn hơn chồi trên môi<br /> thấp hơn môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f).<br /> và các sự khác biệt này là không có ý nghĩa. Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin ở nồng<br /> Như vậy, khi kết hợp với 4 mg/l kinetin thì sự độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu quả tạo<br /> hiện diện của auxin không giúp nâng cao hiệu chồi. Nhưng trong nghiên cứu này, với cả 3 loại<br /> quả tạo chồi của cây hoa salem. auxin đã được tiến hành khảo sát là 2,4-D, NAA<br /> IBA là loại auxin có độ bền không cao, sau và IBA thì kết quả đều không có sự khác biệt<br /> 30 ngày ngoài sáng nồng độ IBA có thể giảm đi hoặc thấp hơn so với khi sử dụng kinetin riêng lẻ.<br /> 60% [7]. Trong khi đó, khi quan sát nhận thấy Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với<br /> mẫu cấy chồi cây salem có biểu hiện đáp ứng kinetin giúp các chồi mới hình thành có kích<br /> tạo chồi dưới tác động của chất điều hòa sinh thước lớn, dễ tách ra thành từng chồi riêng biệt<br /> trưởng thực vật sau 3 tuần nuôi cấy. Như vậy, để chuyển sang môi trường tạo rễ.<br /> mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài và trong Ảnh hưởng của GA3 lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa GA3 và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi<br /> từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần<br /> Kinetin GA3<br /> Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng<br /> (mg/l) (mg/l)<br /> chồi (%) chồi/ mẫu chồi (%) chồi/ mẫu chồi (%) chồi/ mẫu<br /> 4 - 86,67a* 2,27a 86,67a 3,73c 100,00a 5,60d<br /> 4 3 26,67b 1,40b 100,00b 4,13c 100,00a 5,87d<br /> 4 5 33,33bc 1,53b 100,00b 4,27c 100,00a 6,27de<br /> 4 7 53,33d 1,73ab 93,33ab 4,00c 100,00a 6,53de<br /> 4 10 40,00cd 1,60ab 100,00b 4,73c 100,00a 7,80e<br /> Các chữ cái a,b,c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> Có nhiều kết quả khác nhau về tác động của trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, sự tăng<br /> GA3 trên các đối tượng mẫu cấy khác nhau. trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi bên<br /> Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát cũng có thể gia tăng khi bổ sung thêm<br /> triển không cần đến sự hiện diện của gibberellin gibberellin. Ở một số loài thực vật, acid<br /> <br /> <br /> 223<br />  Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> gibberellic riêng lẻ cũng có thể cảm ứng sự tạo Từ những kết quả thu được trong nghiên<br /> chồi bất định như ở mô sẹo Ranunculus cứu này, chúng tôi nhận thấy sự kết hợp giữa 4<br /> scleratus hay thay thế cho vai trò của auxin mg/l kinetin và GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi<br /> trong quá trình cảm ứng tạo chồi [7]. Trong thí của cây hoa salem. Số lượng chồi mới hình<br /> nghiệm này, GA3 được bổ sung vào môi trường thành tăng theo sự gia tăng nồng độ của GA3.<br /> nuôi cấy cùng với 4 mg/l kinetin nhằm khảo sát Không chỉ thu được số lượng chồi lớn hơn trên<br /> tác động hỗ trợ của gibberellin với kinetin trong mỗi mẫu cấy mà kích thước chồi mới hình<br /> sự cảm ứng tạo chồi ở cây hoa salem. thành cũng gia tăng, chồi khỏe, dễ tách thành<br /> Kết quả ghi nhận cho thấy môi trường cảm chồi đơn.<br /> ứng tạo chồi với sự hiện diện của 4 mg/l kinetin Ảnh hưởng của adenine lên sự tạo chồi<br /> và GA3 ở các nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l đều Trong một số trường hợp, người ta thường<br /> cho hiệu quả tạo chồi cao hơn trên môi trường phối hợp cytokinin với adenine để cảm ứng sự<br /> chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ (Bảng 4). Kết quả tạo chồi. Trong các thí nghiệm nuôi cấy<br /> cao nhất trong thí nghiệm này là môi trường bổ Begonia, thuốc lá, cây du, Plumbago indica thì<br /> sung 10 mg/l GA3 (7,80 chồi/mẫu cấy). Các chỉ cần một mình adenine cũng đủ cảm ứng tạo<br /> chồi mới được tạo thành (Hình 1g) có kích chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên,<br /> thước lớn hơn so với chồi trên môi trường chỉ 2006) [7].<br /> có kinetin (số liệu cụ thể không được đưa ra).<br /> <br /> Bảng 5. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa adenine và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là<br /> chồi từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần<br /> Kinetin Adenine Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ<br /> Số lượng Số lượng Số lượng<br /> (mg/l) (mg/l) tạo chồi tạo chồi tạo chồi<br /> chồi/ mẫu chồi/ mẫu chồi/ mẫu<br /> (%) (%) (%)<br /> 4 - 86,67a* 2,27a 86,67a 3,73bc 100,00a 5,60d<br /> 4 5 20,00b 1,60a 100,00b 4,93bc 100,00a 7,73de<br /> 4 10 66,67d 2,20a 100,00b 5,20b 100,00a 9,73e<br /> 4 15 46,67e 1,93a 100,00b 4,67bc 100,00a 7,60de<br /> 4 20 33,33b 1,60a 100,00b 3,53c 100,00a 5,53d<br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp cho kết quả tạo chồi tăng cao có thể được giải<br /> giữa 4 mg/l kinetin với adenine giúp làm tăng thích qua vai trò là tiền chất trong con đường<br /> hiệu quả tạo chồi so với chỉ sử dụng kinetin sinh tổng hợp cytokinin của adenine. Như vậy,<br /> riêng lẻ (Bảng 5). Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp<br /> 100% ở tuần nuôi cấy thứ 6 với tất cả các nồng với kinetin làm tăng hiệu quả tạo chồi.<br /> độ adenine khảo sát. Số lượng chồi được tạo<br /> mới cao hơn so với đối chứng khi kết hợp 4 KẾT LUẬN<br /> mg/l kinetin với adenine nồng độ 5; 10 và 15 Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi<br /> mg/l. Trong đó, nồng độ adenine thích hợp nhất đã xác định được mẫu cấy thích hợp cho mục<br /> là 10 mg/l với số lượng chồi trung bình hình đích nhân chồi là chồi từ cây con in vitro 6 tuần<br /> thành từ một mẫu cấy ban đầu là 9,73 chồi. tuổi. Ở các nồng độ kinetin khảo sát, kinetin<br /> Nồng độ adenine cao hơn 10 mg/l làm giảm khả nồng độ 4 mg/l thích hợp nhất cho sự tạo chồi.<br /> năng tạo chồi của mẫu cấy. Chồi mới hình thành Sự hiện diện của các loại auxin IBA, 2,4-D và<br /> có hình thái bình thường và kích thước lớn hơn NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mg/l đều<br /> so với đối chứng ở tất cả các nồng độ (hình 1h). không làm tăng hiệu quả tạo chồi nhưng giúp<br /> Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin gia tăng kích thước chồi mới tạo thành so với<br /> <br /> <br /> 224<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Adenine Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm<br /> và gibberellin đều có tác động kích thích sự tạo ơn Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Bộ môn<br /> chồi khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa và<br /> kết hợp với 4 mg/l kinetin. Không chỉ giúp nâng Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công<br /> cao số lượng chồi mới, cả 2 chất này đều thúc nghệ Tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới<br /> đẩy sự tăng trưởng của chồi mới. đã hỗ trợ trang thiết bị để hoàn thành đề tài này.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Sự tạo chồi từ mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy (thang đo 1cm)<br /> a. Mẫu cấy 4 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; b. Mẫu cấy 6 tuần tuổi trên môi trường MS + 4<br /> mg/l kinetin; c. Mẫu cấy 8 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; d. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l IBA;<br /> e. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l 2,4-D; f. 4 mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA; g. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l gibberellin;<br /> h. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l adenine; i. 0,2 mg/l BA.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO cultures of ornamental Statice, Limonium<br /> sinuatum Mill. In Vitro Cell Dev. Pl., 38:<br /> 1. Amo-Marco J. B. and Ibanez M. R., 1998. 157-162.<br /> Micropropagation of Limonium cavanillesii 4. Jeong J. H., Murthy H. N. and Paek K. Y.,<br /> Erben, a threatened statice,from 2001. High frequency adventitious shoot<br /> inflorescence stems. Plant Growth Regul., induction and plant regeneration from<br /> 24: 49-54. leaves of statice. Plant Cell Tiss Org., 65:<br /> 2. Gaspar T., Kevers C., Faivre-Rampant O., 123-128.<br /> Crèvecoeur M., Penel C., Gerppin H. and 5. Morgan E. R., Burge G. K., Seelye J. F.,<br /> Dommes J., 2003. Changing concept in Hopping M. E. and Grant J. E., 1998.<br /> plant hormone action. In Vitro Cell Dev. Pl., Production of interspecific hybrids between<br /> 39(2):85-106. Limonium perezii (Stapf) Hubb. and<br /> 3. Igawa T., Hoshina Y. and Mii M., 2002. Limonium sinuatum (L.) Mill. Euphytica.,<br /> Effcient plant regeneration from cell 102: 109-115.<br /> <br /> 225<br />  Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> 6. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised Đà Lạt - Lâm Đồng: 333-339. Hội nghị<br /> medium for rapid growth and Bio-assays khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong<br /> with tobacco tissue cultures. Phys Plant, 15: công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa.<br /> 473-497. Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội.<br /> 7. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 9. Tsu-Hwie A. L., Nai-Wen H. and Rey-Yuh<br /> 2006. Công nghệ tế bào. Nxb. Đại học quốc W., 2005. Control of leaf-tip necrosis of<br /> gia tp Hồ Chí Minh. micropropagated ornamental Satice by<br /> 8. Phạm S., 2007. Những giải pháp mở rộng elimination of endophytic bacteria. In Vitro<br /> thị trường tiêu thụ sản phẩm hoa cắt cành ở Cell Dev. Pl., 41: 546-549.<br /> <br /> <br /> HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION OF DARK BLUE STATICE<br /> (Limonium sinuatum L. Mill) BY COMBINING PHYTOHORMONES<br /> WITH ADENINE IN IN VITRO CULTURE<br /> <br /> Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> Ho Chi Minh city University of Technology<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> In the purpose of optimizing the micropropagation of dark blue Statice (Limonium sinuatum L. Mill), the<br /> appropriate age of explants, the effects of phytohormones, GA3 and adenine on Statice shooting were studied.<br /> MS medium (Murashige and Skoog, 1962) with 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l saccharose, 6 g/l agar was used<br /> in all experiments. The cultures were in 16h photoperiod, light intensity of 2800 lux and at a temperature of<br /> 25 ± 2ºC. The best suitable explants were shoots from six-week seedlings in vitro. In the influence of<br /> cytokinin, 4 mg/l kinetin was the best result for statice shooting (5.6 shoots per explant) after 8 weeks of<br /> culture. The number of shoots per explant on MS medium supplemented with 4 mg/l kinetin and auxin (IBA,<br /> NAA or 2,4-D) was lower than MS medium with 4 mg/l kinetin but the size of shoots was raised. The<br /> presence of GA3/adenine increased shoot sprouting. The combination of 4 mg/l kinetin with 10 mg/l GA3 or<br /> 10 mg/l adenine raised the number of shoots per explant (7.8 and 9.73 shoots per explant, respectively) after 8<br /> weeks of culture.<br /> Keywords: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 226<br />