Tạo chủng vi khuẩn Escherichia coli biểu hiện tái tổ hợp cis-Prenyltransferase 1 có khả năng tổng hợp neryl pyrophosphate

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 224­230<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TẠO CHỦNG VI KHUẨN Escherichia coli BIỂU HIỆN TÁI TỔ HỢP <br /> cis­PRENYLTRANSFERASE 1 CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP <br /> NERYL PYROPHOSPHATE <br /> <br /> La Ngọc Thùy Vân1, Lê Thị Kim Lan1, Khuất Lê Uyên Vy1, Đinh Minh Hiệp2, Eran <br /> Pichersky3, Nguyễn Thị Hồng Thương1*<br /> 1<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG HCM, *nththuong@hcmus.edu.vn <br /> 2<br /> Ban quản lý Khu nông nghiệp công nghệ cao, TP.HCM<br /> 3<br /> Trường Đại học Michigan, Ann Arbor, USA<br /> <br /> TÓM TẮT: Neryl pyrophosphate (NPP), còn gọi là neryl diphosphate (NDP), là dạng đồng phân  <br /> cấu hình cis của genaryl pyrophosphate (GPP). Trước đây, các monoterpene synthase ở đa số các  <br /> loài thực vật được chứng minh sử dụng GPP làm cơ  chất để  tổng hợp các monoterpene và dẫn <br /> xuất monoterpenoid. Tuy nhiên, năm 2009, Schilmiller và cộng sự đã xác định được một gen mới <br /> mã hóa cho phellandrene synthase (PHS), enzym này biểu hiện ở lông tiết của cà chua Solanum <br /> lycopersicum và xúc tác tổng hợp β­phellandrene từ cơ chất NPP. Nhóm nghiên cứu này cũng đã  <br /> xác định được gen mã hóa cis­prenyltransferase 1 (CPT1) có khả năng xúc tác tổng hợp NPP từ <br /> dimethylallyl diphosphate (DMAPP) và isopentenyl diphosphate (IPP). Bởi vì tế  bào  E. coli  có <br /> khả năng tổng hợp GPP nhưng không tổng hợp được NPP, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến  <br /> hành tạo dòng và biểu hiện gen CPT1 trong tế bào E. coli nhằm thu nhận chủng E. coli có khả <br /> năng tạo ra NPP. Khi biểu hiện đồng thời hai enzym CPT1 và PHS trong tế bào E. coli, cơ chất <br /> NPP được tổng hợp bởi CPT1 đã được sử dụng hiệu quả bởi phelandrene synthase PHS cho sự <br /> sinh tổng hợp  β­phelandrene   de novo. Những nghiên cứu sâu hơn về  khả  năng cải biến con  <br /> đường trao đổi chất ở dòng tế bào E. coli biểu hiện tái tổ hợp CPT1 và các điều kiện để tối ưu <br /> hóa việc thu nhận sản phẩm sẽ  mở ra hướng tiếp cận mới cho các nghiên cứu  tổng hợp các <br /> monoterpene và dẫn xuất monoterpenoid có giá trị từ cơ chất mới NPP. <br /> Từ khóa: neryl pyrophosphate, cis­prenyltransferase 1, monoterpene synthase.<br /> <br /> MỞ ĐẦU GDP synthase (còn gọi là GPP synthase) dẫn <br /> Terpenoid   bao   gồm   nhóm   hợp   chất   tự  tới   sự   hình   thành   GPP,   tiền   chất   tổng   hợp <br /> nhiên đa dạng về mặt cấu trúc, được tổng hợp   monoterpene. Sự  kết hợp của DMAPP với 2  <br /> từ những đơn vị  có 5 nguyên tử  carbon là IPP   đơn vị  IPP sẽ  tạo ra FPP, tiền chất để  tổng  <br /> và DMAPP thông qua con đường 2­C­methyl­ hợp sesquiterpene; với 3 đơn vị  IPP sẽ  tạo ra <br /> D­erythritol 4­phosphate (MEP) thường gặp  ở  GGPP, tiền chất để  tổng hợp diterpene. GPP,  <br /> vi   khuẩn   và   thực   vật   hoặc   con   đường  FPP, và GGPP là những prenyldiphosphate có <br /> mevalonate (MEV) phổ biến trong các sinh vật  cấu   hình  trans.  Enzym   sử   dụng   cơ   chất <br /> eukaryote [1, 3]. IPP và DMAPP được kết hợp  prenyldiphosphate  để  tổng hợp terpene thuộc <br /> với nhau, với sự  loại đi một nhóm phosphate,  họ enzym terpene synthase [1].<br /> hình thành các chất trung gian có số nguyên tử  Hiện nay, các dự  án giải mã trình tự  bộ <br /> carbon   lớn   hơn   là   geranyl   diphosphate   GPP   gen của một số  loài thực vật quan trọng  ứng  <br /> (C10),   farnesyl   diphosphate   FPP   (C15),  dụng trong nông nghiệp và y dược đang được <br /> geranylgeranyl   diphosphate   GGPP   (C20).  triển khai trên thế giới. Sự sẵn sàng của cơ sở <br /> Enzym   xúc   tác   phản   ứng   này   thuộc   họ  dữ liệu trình tự bộ gen ở các loài này tạo điều  <br /> prenyltransferase.   Sự   kết   nối   đầu­đuôi   của  kiện   thuận   lợi   cho   các   nhà   nghiên   cứu   tìm <br /> DMAPP  với   1  đơn  vị   IPP được   xúc tác   bởi  kiếm, phân lập và khảo sát chức năng của các <br /> <br /> <br /> 224<br /> gen mới, đặc biệt các gen tham gia trong sự  nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng <br /> chuyển   hóa   hợp   chất   thứ   cấp   nói   chung   và  và biểu hiện gen mã hóa cis­prenyltransferase 1 <br /> hợp chất nhóm terpenoid nói riêng [4]. (CPT1)   phân   lập   từ   cà   chua  S.   lycopersicum <br /> Trước đây, các terpene synthase được tìm  trong tế  bào  E. coli  nhằm thu nhận chủng  E.  <br /> thấy   ở   đa   số   các   loài   được   chứng   minh   sử  coli có khả năng tạo ra NPP. Đây là cơ sở   cho <br /> dụng  trans­prenyldiphosphate   làm   cơ   chất.  việc   mở   rộng   các   nghiên   cứu   ứng   dụng  <br /> Đến năm 2009, Schilmiller và cộng sự  đã tìm  monoterpene   synthase   TPS   để  tổng   hợp   các <br /> thấy  ở  lông tiết cà chua  S. lycopersicum  một  monoterpene khác nhau từ  cơ  chất mới NPP  <br /> gen mới mã hóa cho một monoterpene synthase  thông qua kỹ  thuật cải biến con  đường trao <br /> chủ yếu sử dụng NPP, đồng phân cấu hình cis  đổi chất ở tế bào vi khuẩn.<br /> của   GPP,   làm   cơ   chất   tổng   hợp   nên   β­ <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> phellandrene   và   enzym   được   đặt   tên   là <br /> phellandrene synthase (PHS). Cũng chính nhóm  Chủng vi sinh vật và vector<br /> nghiên   cứu   này   đã   tìm   ra   gen  cis­<br /> Vector   pACYCDuet­1   thuộc   hệ   thống <br /> prenyltransferase  1 (CPT1) mã hóa cho enzym <br /> vector Duet (Novagen) mang gen kháng kháng <br /> tổng hợp cơ chất NPP từ DMAPP và IPP [5]. <br /> sinh   chloramphenicol.  Plasmid   pEXP5­NT­<br /> Để xây dựng một danh mục các gen/enzym  TOPO   mang   cDNA   mã   hóa   phellandrene <br /> đáng tin cậy, các nhà nghiên cứu cần khảo sát   synthase (PHS) từ  S. lycopersicum  và plasmid <br /> đặc tính sinh hóa của các enzym được mã hóa  pGEM­T   mang   cDNA   mã   hóa  cis­<br /> bởi các cDNA, đa số được liệt kê trong các cơ  prenyltransferase 1 (CPT1) từ   S. lycopersicum  <br /> sở   dữ   liệu   bộ   gen   và   sản   phẩm   phiên   mã  được   cung   cấp   bởi  Giáo   sư   Eran   Pichersky <br /> nhưng chưa được chú thích chính xác. Mặc dù  (Trường Đại học Michigan, Hoa Kỳ).<br /> các kỹ thuật phân tử và sinh hóa sử dụng trong  <br /> Chủng  E.   coli  TOP10  (Invitrogen)   được <br /> khảo sát chức năng của các enzym tái tổ  hợp  <br /> dùng   để   nhân   bản   plasmid.  Chủng  E.   coli  <br /> được mã hóa bởi các cDNA tương ứng đã phát <br /> BL21(DE3)  (Invitrogen)   được   dùng   để   tạo <br /> triển, những nghiên cứu này đôi khi bị hạn chế <br /> dòng và biểu hiện protein mục tiêu với sự cảm <br /> do chi phí cao của cơ  chất và các chất chuẩn <br /> ứng của IPTG. <br /> cần   sử   dụng   để   khảo   sát   hoạt   tính   terpene  <br /> synthase.   Ngoài   ra,   hầu   hết   các   hợp   chất  Tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa <br /> terpenoid chỉ  được tích lũy tự  nhiên  ở  lượng  CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI<br /> rất nhỏ  trong thực vật khiến cho việc chiết   Đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có <br /> xuất các hợp chất terpenoid từ thực vật có giá  hai đầu so le tương hợp với hai đầu so le của  <br /> thành   cao,   năng   suất   thấp,   tiêu   tốn   nhiều  vector   pACYCDuet­1   (đã   được   cắt   với   hai  <br /> nguồn vật liệu tự nhiên. Sự tổng hợp các hợp  enzym cắt giới hạn  NdeI và  XhoI) được tổng <br /> chất   nhóm   terpenoid   bằng   con   đường   tổng  hợp theo phương pháp “sticky­end PCR”  [6]. <br /> hợp hóa học thường không dễ  dàng do chúng  Plasmid pGEM­T chứa trình tự  cDNA mã hóa <br /> có nhiều tâm bất đối và tính chất đặc hiệu lập  CPT1 được sử  dụng làm khuôn và   các mồi <br /> thể. Sự  sinh tổng hợp terpenoid thông qua các  được sử dụng có trình tự như sau:  <br /> phản   ứng  in  vitro  sử   dụng   enzym   tinh  sạch  <br /> NdeI­CPT1­F (mồi xuôi 1):  5’­TATGGGT <br /> cũng rất tốn kém. Do đó, kỹ  thuật cải biến <br /> GCATTCAAAGGTATTC­3’;   CPT1­R   (mồi <br /> con đường trao đổi chất nhằm tạo các tế  bào <br /> ngược   1):   5’­TCAATATGTGTGTCCACCAA <br /> vi sinh vật có khả  năng tổng hợp một lượng <br /> AAC­3’;   CPT1­F   (mồi   xuôi   2):   5’­<br /> lớn terpenoid là một phương án thay thế  tiềm <br /> TGGGTGCATTCAAAGGTATTC­3’;  XhoI­<br /> năng. <br /> CPT1­R (mồi ngược 2): 5’­TCGATCAATATG  <br /> Tế  bào E. coli có khả  năng tổng hợp GPP   TGTGTCCAC­3’.<br /> nhưng   không   tổng   hợp   được   NPP.   Trong <br /> <br /> <br /> 225<br />  Quy trình tổng hợp được sơ đồ  hóa ở hình  sốc   nhiệt.   Các   thể   biến   nạp   E.   coli <br /> 1. TOP10/pACYCDuet­1­CPT1  được   sàng   lọc <br /> Tạo dòng trình tự  mã hóa CPT1 vào vector  bằng phản  ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi  <br /> NdeI­CPT1 và T7 Terminator.<br /> pACYCDuet­1 <br /> Dòng tế bào E. coli TOP10/pACYCDuet­1­<br /> Vector pACYCDuet­1  được cắt mở  vòng <br /> CPT1  được   nhân   sinh   khối   và   plasmid <br /> tạo đầu so le bằng hai enzym   NdeI và  XhoI. <br /> pACYCDuet­1­CPT1  được   tách   chiết   bằng <br /> Đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai <br /> StrataPrep   Plasmid   Miniprep   Kit   (Agilent <br /> đầu so le  NdeI và  XhoI được chèn vào vector <br /> Technologies).  Trình   tự   mã   hóa   CPT1  trên <br /> pACYCDuet­1 thông qua phản  ứng nối được <br /> vector pACYCDuet­1­CPT1 được giải mã với <br /> xúc tác bởi T4 DNA ligase trong 2 giờ  ở 22oC. <br /> mồi   T7   Terminator   và   so   sánh   với   trình   tự <br /> Hỗn hợp phản  ứng nối được biến nạp vào tế <br /> CPT1 đã biết để  phát hiện các đột biến điểm <br /> bào khả nạp E. coli TOP10 bằng phương pháp <br /> có thể có trong quá trình PCR.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Quy trình tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI <br /> bằng phương pháp “sticky­end PCR” [6]. Đoạn DNA được khoanh tròn có hai đầu so le tương <br /> hợp với đầu so le được tạo ra khi cắt vector pACYCDuet­1 với hai enzym cắt giới hạn  NdeI và <br /> XhoI.<br /> <br /> Biểu hiện CPT1 và PHS trong tế bào E. coli  được   biến   nạp   vào   tế   bào   khả   nạp  E.   coli <br /> BL21(DE3) BL21(DE3)/pACYCDuet­1­CPT1.  Tế   bào <br /> mang   hai   plasmid   pACYCDuet­1­CPT1  và <br /> Plasmid  pACYCDuet­1­CPT1  được   biến <br /> pEXP5­NT­TOPO­PHS được nuôi cấy lắc 200 <br /> nạp   vào  tế   bào  khả   nạp  E.   coli  BL21(DE3) <br /> vòng/phút   trong   14­16   giờ   ở   37oC   trong   môi <br /> bằng phương  pháp sốc  nhiệt.   Để  biểu  hiện <br /> trường   LB   lỏng   có   bổ   sung   100   µg/µl <br /> đồng thời CPT1 với PHS trong tế  bào  E. coli <br /> ampicillin và 34 µg/µl chloramphenicol đến khi <br /> BL21(DE3),   plasmid   pEXP5­NT­TOPO­PHS <br /> OD600 đạt giá trị 0,8 thì tiếp tục được cảm ứng  <br /> <br /> 226<br /> với 0,4 mM IPTG  ở 22oC trong 5­6 giờ.  Dịch  trong dịch nuôi cấy vi khuẩn biểu hiện tái tổ <br /> nuôi cấy tế  bào  E. coli  BL21(DE3)  chỉ  biểu  hợp   CPT1   và   PHS   được   thu   nhận   bằng   kỹ <br /> hiện PHS được sử dụng làm đối chứng âm. thuật chiết hexan và được phân tích bằng kỹ <br /> Phương pháp xác định NPP gián tiếp thông  thuật sắc ký khí.  Hệ thống GC Agilent 6890N  <br /> qua sự thủy phân với alkaline phosphatase  được sử  dụng với cột HP innowax có chiều <br /> dài 30 m x 250 µm x 0,25 µm (chịu nhiệt độ <br /> Ly tâm 15 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn biểu <br /> cao   nhất   là   250oC)   và   đầu   dò   FID.   Chương  <br /> hiện   pACYCDuet­1­CPT1  5000   vòng/phút <br /> trình   nhiệt   độ   chạy   trong   31   phút   như <br /> trong 5 phút và thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng  <br /> sau: nhiệt độ  tiêm (giải hấp) 250oC, nhiệt độ <br /> 1,5ml   đệm   FastAP   (10  mM   Tris­HCl   pH8;   5 <br /> mM MgCl2; 0,1 M KCl; 0,02% Triton X­100;  đầu dò 250oC. Nhiệt độ đầu 50oC, tăng 15oC/1 <br /> 0,1 mg/ml BSA), sau đó phá màng tế bào bằng  phút đến 180oC, tăng 5oC/ 1 phút đến 240oC <br /> sóng siêu âm trong 1,5 ml đệm FastAP. Dịch   giữ trong 10 phút. <br /> sau   khi   phá   màng   tế   bào   được   ly   tâm   5000 <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> vòng/phút   trong   5   phút.   Dịch   nổi   được   thu <br /> nhận   và   ủ   với   alkaline  phosphatase  (Thermo  Tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa <br /> Scientific)  ở 37oC trong 1 giờ. Phản  ứng được  CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI<br /> thực hiện trong ống thủy tinh (vial) nhỏ và kín <br /> Kết quả khuếch đại đoạn DNA chứa trình <br /> để   sản   phẩm   nerol   được   tạo   ra   trong   phản <br /> tự   mã  hóa  CPT1  có gắn  thêm  trình tự   nhận <br /> ứng thủy phân không bị thất thoát. <br /> biết của  enzym cắt giới hạn   NdeI  ở  đầu 5’ <br /> Phương pháp xác định thành phần các chất  hoặc  XhoI  ở  đầu 3’ bằng kỹ  thuật PCR cho <br /> dễ  bay hơi bằng kỹ  thuật sắc ký khí (Gas   thấy,   ở   giếng   1   xuất   hiện   một   vạch   DNA  <br /> Chromatography­GC) nằm   dưới   vạch   1000   bp   của   thang   DNA  <br /> Nerol   sinh   ra   từ   sự   thủy   phân   NPP   với  chuẩn, với kích thước ~ 837 bp tương đương <br /> alkaline phosphatase hoặc monoterpene sinh ra  với kích thước trình tự mã hóa CPT1 (hình 2).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả  phản  ứng PCR khuếch đại  Hình 3. Kết quả  sàng lọc dòng tế  bào E. coli <br /> đoạn trình tự  mã hóa CPT1. 1, thang chuẩn   TOP10/pACYCDuet­1­CPT1  bằng   PCR <br /> DNA 1kb; 2,3: sản phẩm PCR1 với cặp mồi  khuẩn lạc. 1, thang chuẩn DNA 1kb ; 2­4, sản <br /> NdeI­CPT1­F   và   CPT1­R;   4,5:   sản   phẩm  phẩm PCR khuẩn lạc của dòng tế  bào  E. coli <br /> PCR2 với cặp mồi CPT1­F và XhoI­CPT1­R TOP10 được biến nạp plasmid  pACYCDuet­<br /> 1­CPT1.<br /> <br /> Tạo dòng trình tự  mã hóa CPT1 vào vector  hợp phản  ứng nối được biến nạp vào tế  bào <br /> pACYCDuet­1 khả nạp E. coli TOP10. Kết quả sàng lọc dòng <br /> tế   bào  E.   coli  TOP10   mang   plasmid <br /> Đoạn CPT1 có hai đầu so le được chèn vào <br /> pACYCDuet­1­CPT1  được   thực   hiện  bằng <br /> vector   pACYCDuet­1   đã   được   cắt   mở   vòng <br /> phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi CPT1­<br /> với hai enzym cắt giới hạn NdeI và XhoI. Hỗn <br /> <br /> <br /> 227<br /> F  và  mồi  ngược  T7 Terminator  (hình 3)  cho  hợp   monoterpene   trong   môi   trường   nuôi <br /> thấy  ở  giếng 2, 3, và 4 xuất hiện một vạch   cấy <br /> DNA   có   kích   thước   tương   đương   với   kích <br /> Sau khi được nuôi cấy cảm ứng với IPTG,  <br /> thước dự  đoán là 948 bp, chứng tỏ khuẩn lạc <br /> dịch nuôi cấy tế  bào  E. coli  BL21(DE3)  biểu <br /> được sử  dụng thuộc dòng tế  bào vi khuẩn E.  <br /> hiện   plasmid   pACYCDuet­1­CPT1  được   ly <br /> coli TOP10 được biến nạp thành công plasmid <br /> tâm và phần tủa chứa tế  bào vi khuẩn được <br /> pACYCDuet­1­CPT1.<br /> thu nhận. Tế  bào vi khuẩn được   huyền phù <br /> Kết   quả   giải   trình   tự   gen  CPT1  trong  lại trong đệm Fast AP và được phá màng bằng <br /> plasmid  pACYCDuet­1­CPT1  (hình   4)   và   so  sóng siêu âm. Sau khi ly tâm, dịch nổi được thu <br /> sánh với trình tự gen CPT1 trong Genbank cho  nhận   và   được   ủ   với   alkaline   phosphatase   ở <br /> thấy trong quá trình tạo dòng gen  CPT1  vào  37oC trong 1 giờ. Kết quả  được mô tả  ở  hình <br /> vector  pACYCDuet­1  đã không xuất hiện đột  5 cho thấy,  ở sắc ký đồ b tương  ứng với dịch <br /> biến nào làm thay đổi trình tự gen CPT1. Như  chiết hexan của dịch nổi sau xử lý với enzym <br /> vậy, trình tự  mã hóa CPT1 từ  S. lycopersicum  alkaline   phosphatase  xuất   hiện   một   đỉnh <br /> đã được tạo dòng thành công vào vùng MCS1  “peak” trùng lắp với peak chất chuẩn nerol  ở <br /> của pACYCDuet­1. sắc ký đồ a. Điều này chứng tỏ khi thủy phân <br /> Tế  bào  E. coli  BL21(DE3) biểu hiện tái tổ  dịch nổi với alkaline phosphatase, nerol được <br /> hợp   enzym   CPT1   có   khả   năng   tổng   hợp  tạo   ra.   Nói   cách   khác,   có   sự   hiện   diện   của <br /> NPP và tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện  NPP trong dịch nổi được chuẩn bị từ tế bào E.  <br /> coli  BL21(DE3) biểu hiện tái tổ  hợp protein <br /> tái   tổ   hợp   hai   enzym   CPT1   và   PHS   tổng <br /> CPT1.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình   4.  Kết   quả   giải   trình   tự <br /> plasmid  pACYCDuet­1­CPT1 <br /> với   mồi   T7   Terminator.   Đoạn <br /> trình tự được in đậm là trình tự <br /> mã   hóa   CPT1   được   tạo   dòng <br /> vào   vector  pACYCDuet­1.   Mã <br /> khởi   đầu   ATG,   mã   kết   thúc <br /> TGA.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 228<br />  Hình   5.  Sắc   ký   đồ   mô   tả   sự <br /> hiện   diện   của   nerol   khi   thủy  <br /> phân   dịch   chiết   tế   bào   (cell <br /> lysate)  <br /> E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái <br /> tổ   hợp   CPT1  với   alkaline <br /> phosphatase<br /> a. Chất chuẩn nerol; b. Dịch chiết  <br /> tế  bào  E. coli  BL21(DE3)/pACYC <br /> Duet­1­CPT1  được   xử   lý   với <br /> alkaline phosphatase.<br /> <br /> <br /> <br /> Tế   bào  E.   coli  BL21(DE3)  mang   hai  cơ  chất để  tổng hợp  β­phellandrene (hình 6B, <br /> plasmid   pACYCDuet­1­CPT1  và   pEXP5­NT­ 7). Như  vậy, kết quả  thí nghiệm này cũng  đã <br /> TOPO­PHS được nuôi cấy và cảm ứng với 0,4  củng  cố  những  nhận  định  được  dự  đoán  từ <br /> mM IPTG ở 22oC trong 5­6 giờ.  Dịch nuôi cấy  kết quả của thí nghiệm được mô tả ở Hình 5,  <br /> tế  bào  E. coli  BL21(DE3) chỉ  biểu hiện PHS   cho thấy NPP là sản phẩm được  tạo ra bởi <br /> được sử dụng làm đối chứng âm. Kết quả cho  CPT1 tái tổ hợp.<br /> thấy   ở   sắc   ký   đồ   mô   tả   thành   phần <br /> monoterpene thoát ra từ  dịch chiết hexan của   KẾT LUẬN<br /> dịch nuôi cấy tế  bào  E. coli  BL21(DE3) biểu  Trong   nghiên   cứu   này,   chúng   tôi   đã   tạo <br /> hiện tái tổ  hợp hai enzym CPT1 và PHS (hình  dòng và biểu hiện cDNA mã hóa enzym  cis­<br /> 6B) xuất hiện một đỉnh “peak” trùng lắp với  prenyltransferase 1 (CPT1) phân lập được  từ <br /> chất   chuẩn   β­phellandrene   (hình   6A).   Trong  cà chua S. lycopersicum trong tế bào E. coli và <br /> khi   đó,   ở   sắc   ký   đồ   mô   tả   thành   phần  dòng tế  bào này có khả  năng tổng hợp NPP. <br /> monoterpene thoát ra từ  dịch chiết hexan của   Khi   tái   tổ   hợp   và   biểu   hiện   đồng   thời   hai  <br /> dịch   nuôi   cấy  tế   bào  E.   coli  BL21(DE3)   chỉ  enzym CPT1 và PHS trong tế  bào  E. coli, cơ <br /> biểu hiện enzym PHS (hình 6C) không có sự  chất NPP được tổng hợp bởi CPT1 đã được <br /> hiện diện của đỉnh “peak” này. Enzym PHS là  sử  dụng  hiệu quả  bởi   monoterpene  synthase  <br /> một   monoterpene   synthase   chủ   yếu  sử   dụng  PHS   cho   sự   sinh   tổng   hợp   monoterpene  de  <br /> NPP làm cơ  chất để  tổng hợp  β­phellandrene  novo (hình 7).<br /> [5].   Sự   vắng   mặt   của   β­phellandrene   trong  <br /> dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế  bào  E.  Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi <br /> coli  BL21(DE3)   chỉ   biểu   hiện   enzym   PHS   Đại   học   Quốc   gia   Thành  phố   Hồ   Chí   Minh <br /> (hình 6C) đã chứng minh một cách gián tiếp  (ĐHQG­HCM) trong khuôn khổ  đề  tài mã số <br /> khi không có sự  biểu hiện của enzym CPT1  C2014­18­21.   Nhóm   nghiên   cứu   chân   thành <br /> trong tế  bào, tế  bào E. coli BL21(DE3) không  cảm  ơn PTN Phân tích trung tâm Trường Đại <br /> tổng hợp hoặc chỉ  tổng hợp một lượng nhỏ  học   Khoa   học   Tự   nhiên   Tp.HCM   đã   hỗ   trợ <br /> không đáng kể  cơ  chất NPP của enzym PHS.  phân tích mẫu bằng kỹ thuật sắc ký khí.<br /> Ngược lại,  ở  tế  bào E. coli  BL21(DE3)  được <br /> biến nạp hai plasmid pACYCDuet­1­CPT1  và <br /> pEXP5­NT­TOPO­PHS,   enzym   CPT1   có   khả <br /> năng sử dụng cơ chất nội sinh IPP và DMAPP <br /> có   trong   tế   bào   chủ   để   tổng   hợp   NPP   và <br /> enzym PHS đã sử  dụng NPP được tạo ra làm  <br /> <br /> 229<br />  Hình 6.  Sắc ký đồ  mô tả  kết quả  phân tích <br /> thành phần monoterpene trong dịch chiết hexan  <br /> bằng kỹ thuật sắc ký khí<br /> A: Chất chuẩn β­phellandrene; B: Dịch chiết hexan  <br /> của dịch nuôi cấy tế  bào  E. coli  BL21(DE3) biểu <br /> hiện đồng thời CPT1 và PHS; C: Dịch chiết hexan  <br /> của  dịch  nuôi  cấy tế  bào   E. coli  BL21(DE3) chỉ <br /> biểu hiện PHS.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7.  Con đường sinh tổng <br /> hợp   monoterpene   từ   NPP <br /> trong   tế   bào  E.   coli <br /> BL21(DE3)   được   biến   nạp <br /> vector   mang   trình   tự   mã   hóa <br /> CPT1   (pACYCDuet­1­CPT1) <br /> và vector mang trình tự mã hóa <br /> PHS (pEXP5­NT­TOPO­PHS)<br /> G3P: glyceraldehyde­3­phosphate; <br /> DXP:   1­deoxy­D­xylulose   5­<br /> phosphate;   MEP,   2­C­methyl­D­<br /> erythritol   4­phosphate;   IPP, <br /> isopentenyl   pyrophosphate; <br /> DMAPP,   dimethylallyl <br /> pyrophosphate;   NPP,   neryl <br /> pyrophosphate;   CPT1:  cis­<br /> prenyltransferase   1;   PHS, <br /> phellandrene synthase. <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Last R., Schuurink R., Pichersky E., 2011. <br /> 1. Connolly J. D., Hill R. A, 1991. Dictionary  The tomato (Solanum lycopersicum) terpene <br /> of terpenoids. Chapman and Hall, London.  synthase   gene   family.   Plant   Physiology, <br /> 157(2): 770­789.<br /> 2. Falara   V.,   Akhtar     T.,   Nguyen   T.   T.   H., <br /> Spyropoulou   E.,   Bleeker   P.,   Schauvinhold  3. Lombard J., Moreira D., 2011. Origins and <br /> I., Matsuba Y., Bonini M., Schilmiller A.,  early evolution of the mevalonate pathway <br /> of   isoprenoid   biosynthesis   in   the   three <br /> <br /> <br /> 230<br />  domains   of   life.  Molecular   Biology   and  5. 50 Plant Genomes. The Plant Genome, Vol <br /> Evolution. 28 (1): 87­99 6, Issue 2.<br /> 4. Michael T. P., Jackson S., 2013. The First 6. Schilmiller   A.L.,   Schauvinhold   I.,   Larson <br /> M., Xu R., Charbonneau A.L., Schmidt A., <br /> Wilkerson C., Last R., Pichersky E., 2009. <br /> Monoterpenes in the glandular trichomes of <br /> tomato   are   synthesized   via   a   neryl <br /> diphosphate   intermediate   rather   than <br /> geranyl   diphosphate.   Proceedings   of   the <br /> National Academy of Sciences, 106:10865­<br /> 10870. <br /> 7. Walker   A., Taylor   J., Rowe   D., Summers <br /> D., 2008. A method for generating sticky­<br /> end   PCR   products   which   facilitates <br /> unidirectional   cloning   and   the   one­step <br /> assembly   of   complex   DNA   constructs. <br /> Plasmid, 59(3):155­162.<br /> <br /> HETEROLOGOUS EXPRESSION OF CIS­PRENYLTRANSFERASE 1 FOR <br /> PRODUCTION OF NERYL PYROPHOSPHATE IN Escherichia coli<br /> <br /> La Ngoc Thuy Van1, Le Thi Kim Lan1, Khuat Le Uyen Vy1, <br /> Dinh Minh Hiep2, Eran Pichersky3, Nguyen Thi Hong Thuong1<br /> VNUHCM, University of Science <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> Management Board of Agricultural Hi­tech Park, HCMC<br /> 3<br /> University of Michigan, Ann Arbor, USA<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Neryl   pyrophosphate   (NPP),   also   known   as   neryl   diphosphate   (NDP),   is   the  cis  isomer   of   genaryl <br /> pyrophosphate (GPP). Previously, it has been shown that monoterpene synthases found in plants use GPP as a <br /> substrate for the synthesis of monoterpenes and monoterpenoids. However, in 2009, Schilmiller identified a <br /> new monoterpene synthase gene for phellandrene synthase (PHS) that is expressed in glandular trichomes of <br /> the cultivated tomato Solanum lycopersicum and uses NPP as a substrate to produce β­phellandrene as a main  <br /> product. An mRNA for a  cis­prenyltransferase (cis­prenyltransferase 1, CPT1) was also identified in these <br /> glands. It encodes an enzyme that uses DMAPP and IPP to produce NPP. E. coli has the ability to synthesize <br /> GPP but not NPP. In this study, we cloned and expressed CPT1 in E. coli for production of NPP followed by <br /> coupling with a monoterpene synthase such as PHS, which specifically uses NPP as a substrate to produce  β­<br /> phelandrene. Further metabolic engineering of the pathway and  in situ  product recovery would make this <br /> engineered E. coli a potential production platform for many valuable monoterpenes and their derivatives.<br /> Keywords: cis­prenyltransferase, neryl pyrophosphate, monoterpene synthase.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 231<br />