Tạo dòng và biểu hiện phân đoạn của gen DFNB59 mã hóa cho pejvakin của người ở vi khuẩn Escherichia coli

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76<br /> <br /> TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PHÂN ĐOẠN CỦA GEN DFNB59 MÃ HÓA CHO<br /> PEJVAKIN CỦA NGƯỜI Ở VI KHUẨN Escherichia coli<br /> Nguyễn Thị Kim Cúc1*, Kazutada Watanabe2, Manabu Toyoshima2, Yasushi Shimoda2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Nha trang, *kimcuc03@gmail.com<br /> 2<br /> Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản<br /> <br /> TÓM TẮT: DFNB59 (Deafness, autosomal recessive 59) là một gen được xác định nằm trên nhiễm sắc<br /> thể 2q31.1-q31.3, đột biến trên gen này có liên quan đến tật điếc không có hội chứng ở người. DFNB59<br /> mã hóa cho pejvakin, một protein dài 352 amino acid. Pejvakin là protein có cùng nguồn gốc (paralog) với<br /> DFNA5, một protein thuộc họ gasdermin chưa rõ chức năng cũng liên quan đến tật điếc. Trong nghiên cứu<br /> này, plasmid tái tổ hợp pBluescript II SK mang gen mã hóa cho protein pejvakin của người (DFNB59)<br /> được sử dụng làm mạch khuôn cho việc khuếch đại phân đoạn gen f1DFNB59, phân đoạn gen này sau đó<br /> được tạo dòng vào plasmid pGEX-3X và biến nạp vào vi khuẩn vi khuẩn E. coli Top 10 để lưu giữ.<br /> Plasmid tái tổ hợp pGEX-3X mang f1DFNB59 từ các thể biến nạp E. coli Top 10 thành công sẽ được biến<br /> nạp vào vi khuẩn E. coli BL21 để tiến hành biểu hiện protein đích dung hợp với Glutathione-STransferase (GST). Protein đích dung hợp với GST sau đó được tiến hành tinh sạch bằng phương pháp sắc<br /> lý ái lực với Glutathione. Protein thu được sau tinh sạch (hơn 40 kDa) phù hợp để sử dụng làm protein<br /> kháng nguyên cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin.<br /> Từ khóa: Gen DFNB59, protein pejvakin, protein dung hợp, mất thính giác, tật điếc.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Khác với tật điếc có hội chứng (syndromic<br /> deafness), tật điếc không có hội chứng<br /> (nonsyndromic deafness) ở người liên quan đến<br /> việc mất thính giác mà không đi kèm với các<br /> biểu hiện bất thường khác [9, 11]. Phần lớn, tật<br /> điếc không có hội chứng được di truyền theo gen<br /> lặn có liên quan đến các đột biến của cả 2 alen<br /> trên một gen. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho<br /> thấy, hơn 10 gen và locus có thể gây ra các mức<br /> độ mất hoặc giảm thính giác khác nhau ở người.<br /> Trong đó, các đột biến trên gen DFNB59 (PJVK)<br /> được xác định là nguyên nhân gây ra sự mất<br /> thính giác có hoặc không có đi kèm bệnh thần<br /> kinh thính giác [6, 7, 11].<br /> Gen DFNB59 nằm trên nhiễm sắc thể<br /> 2q31.2, mã hóa cho protein pejvakin, một<br /> protein đóng vai trò trong dẫn truyền thần kinh<br /> [3]. Các đột biến trên gen này có thể gây ra sự<br /> mất thính giác ổn định hoặc tiến triển có hoặc<br /> không có kèm theo các rối loạn thần kinh thính<br /> giác (auditory neuropathy spectrum disorder)<br /> [1, 2, 3, 4, 5]. Gen DFNB59 gồm có 7 exon, dài<br /> 9,8 kb trong trình tự genome, và mã hóa cho<br /> một protein gồm 352 amino acid (khối lượng<br /> phân tử suy luận của protein này khoảng 39,9<br /> kDa; điểm đẳng điện là 9,31). Việc xác định<br /> 70<br /> <br /> DFNB59 như là gen gây ra bệnh thần kinh thính<br /> giác (auditory neuropathy) đã được chứng minh<br /> và khẳng định bằng việc tìm ra các đột biến<br /> DFNB59 trong các đối tượng khiếm thính từ các<br /> họ 312, 700, 705 và 710 ở Iran. Các đột biến<br /> được phát hiện trong các cá thể khiếm thính này<br /> thường là sự thay thế của amino acid trên<br /> pejvakin của người chẳng hạn: ở họ 705 tương<br /> ứng với việc thay thế của arginine 183 với<br /> tryptophan (547C-T; R183W), ở họ 312 tương<br /> ứng với sự thay thế threonine 54 với isoleucine<br /> (161C-T; T54I) [3].<br /> Các nghiên cứu của Delmaghani et al.<br /> (2006) [3] về các mô hình chuỗi dự đoán của<br /> pejvakin cho thấy có sự tồn tại của tín hiệu định<br /> vị nhân (các amino acid từ vị trí 249-258), có sự<br /> hiện diện của motif liên kết với kẽm và tương<br /> tác với DNA (các amino acid ở vị trí 305-331).<br /> So sánh pejvakin với protein DFNA5 cho thấy,<br /> 32% giống và 54% tương đồng với protein<br /> DFNA5 trên một đoạn trình tự dài 250 amino<br /> acid. Bên cạnh đó, các tổ chức exon ở gen<br /> DFNB59 và gen DFNA5 hoàn toàn tương đồng<br /> với nhau. Vì thế, pejvakin và protein DFNA5 đã<br /> được xác định là có chung nguồn gốc và<br /> pejvakin là một thành viên của họ protein<br /> gasdermin DFNA5.<br /> <br /> Nguyen Thi Kim Cuc et al.<br /> <br /> Để sản xuất kháng thể đơn dòng kháng<br /> pejvakin phục vụ cho những nghiên cứu về tật<br /> điếc do đột biến gen DFNB59 và ứng dụng<br /> trong chẩn đoán bệnh, việc tạo dòng và biểu<br /> hiện toàn bộ trình tự gen mã hóa cho protein<br /> pejvakin (cDNA DFNB59) là rất cần thiết. Tuy<br /> nhiên, việc biểu hiện toàn bộ trình tự gen<br /> DFNB59 (full-length DFNB59) ở E. coli với<br /> các hệ thống vector biểu hiện gen như pETDEST42, pET-15b và pGEX-3X đã được thực<br /> hiện đều không thành công. Một trong những<br /> nguyên nhân được kể đến có thể do protein<br /> được biểu hiện gây độc với tế bào E. coli. Từ lý<br /> do trên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn<br /> một phân đoạn của gen DFNB59 (dài 362 bp<br /> tính từ vị trí nucleotide 150 đến nucleotide vị trí<br /> 512 của trình tự gen DFNB59, mã hóa cho<br /> protein khoảng 13 kDa) để tiến hành tạo dòng<br /> gen, đồng thời biểu hiện và tinh sạch protein<br /> đích dung hợp GST cho mục đích làm kháng<br /> nguyên trong sản xuất kháng thể đơn dòng<br /> kháng pejvakin.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Các chủng vi khuẩn E. coli Top 10 và BL21<br /> (Invitrogen) được sử dụng làm tế bào vật chủ<br /> cho tạo dòng và biểu hiện gen được nuôi cấy<br /> trong môi trường Luria Bertani (LB) (Merck).<br /> Các tế bào E. coli sau biến nạp sẽ được nuôi cấy<br /> trong môi trường LB có chứa ampicillin (100<br /> µg/ml), sau đó cấy trên đĩa thạch LB có chứa<br /> ampicillin (LB-Amp) và cảm ứng biểu hiện gen<br /> bằng 0,1 mM IPTG (isopropyl--D-thiogalacto-pyranoside).<br /> Plasmid tái tổ hợp pBluescript II<br /> SK/DFNB59 (cung cấp bởi Phòng thí nghiệm<br /> Neurobioengineering, Trường đại học Công<br /> nghệ Nagaoka, Niigata, Nhật bản) được sử dụng<br /> để thu nhận phân đoạn gen f1DFNB59; pGEX3X (BioLabs, Anh) được sử dụng cho việc biểu<br /> hiện gen. Các enzyme giới hạn EcoRI, BamHI,<br /> PstI, SacI, HindIII, NdeI (Toyobo, Nhật Bản)<br /> được sử dụng để mở vòng plasmid và kiểm tra<br /> vector tái tổ hợp.<br /> PCR khuếch đại phân đoạn gen f1DFNB59<br /> Dựa vào trình tự gen của phân đoạn gen<br /> f1DFNB59 (dài 362 bp tính từ nucleotide ở vị<br /> trí 150 đến nucleotide ở vị trí 512 trên trình tự<br /> <br /> gen DFNB59 trong Ngân hàng Gen (NCBI), cặp<br /> mồi BamHI-NdeI/F (5’-GCGGATCC ATATGT<br /> TTGCTGCTGCTACCAAG -3’) và EcoRI/R<br /> (5’-CGGAATTCATTTGGTCACGACACCAA<br /> -3’) được thiết kế để dùng cho phản ứng PCR.<br /> Thành phần phản ứng PCR gồm: 10 µM cho<br /> mỗi loại mồi, 2 mM mỗi loại dNTP (dATP,<br /> dGTP, dCTP, dTTP), 10x KOD plus buffer, 25<br /> mM MgSO4, mạch khuôn pBluescript II<br /> SK/DFNB59, KOD plus polymerase (Roche,<br /> Appied science, Đức). PCR được thực hiện<br /> trong máy luân nhiệt (Thermal cycler) với 35<br /> chu kỳ: giai đoạn 1 nâng nhiệt đến 94oC trong<br /> 15 giây; giai đoạn 2 hạ nhiệt xuống 52oC trong<br /> 30 giây; giai đoạn 3 nâng nhiệt đến 68oC trong 1<br /> phút. Sản phẩm PCR được phân tích bằng<br /> phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.<br /> Phương pháp tạo dòng f1DFNB59 vào<br /> pGEX-3X ở E. coli Top 10<br /> Tất cả các thao tác với DNA sử dụng trong<br /> tạo dòng được thực hiện theo mô tả của<br /> Sambrook & Russell (2001) [10]. Đoạn gen<br /> f1DFNB59 sau khi được khuếch đại bằng<br /> phương pháp PCR và vector pGEX-3X được xử<br /> lý các enzyme giới hạn BamHI/EcoRI với Hbuffer và ủ ở 37oC trong 5 giờ. Sản phẩm sau<br /> khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ được điện di<br /> trên gel agarose và tinh sạch từ gel bằng bộ kit<br /> QIA quick Gel Extraction (Qiagen). Phản ứng<br /> nối f1DFNB59 vào pGEX-3X/BamHI/EcoRI<br /> được thực hiện bởi T4 DNA ligase (Toyobo,<br /> Nhật Bản) ở 16oC trong 1 giờ. Sản phẩm nối sau<br /> đó được biến nạp vào E. coli BL21 và trải trên<br /> môi trường thạch LB-Amp. Các khuẩn lạc được<br /> chọn lọc dựa trên kiểu hình kháng ampicillin và<br /> được kiểm tra bằng phương pháp cắt enzyme<br /> giới hạn (sử dụng 3 cặp enzyme BamHI/EcoRI,<br /> NdeI/EcoRV và HindIII/PstI) trên các plasmid<br /> thu được. Các tế bào E. coli Top 10 có mang<br /> plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 sẽ<br /> được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp<br /> theo.<br /> Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp từ<br /> các vi khuẩn E. coli được biến nạp<br /> Các thể biến nạp từ một khuẩn lạc đơn được<br /> nuôi cấy trong 5 ml môi trường LB-Amp ở<br /> 37oC trong 16 giờ. Các tế bào được thu bằng<br /> cách li tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút ở<br /> 71<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76<br /> <br /> nhiệt độ phòng, hòa cặn với 400 µl STET buffer<br /> (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM<br /> NaCl, và 5% Triton X-100 v/v). Thêm vào 40<br /> µl Lysozyme giữ trong 3 phút, đun sôi trong 1<br /> phút, làm lạnh, sau đó li tâm ở 15.000<br /> vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, thu<br /> dịch nổi và loại bỏ cặn. Thêm vào 350 µl<br /> Isopropanol, li tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10<br /> phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi và làm<br /> khô trong 5 phút. Thêm 400 µl Ethanol 70%, li<br /> tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt<br /> độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Làm khô cặn trong<br /> 15 phút và hòa tan trong 50 µl TE buffer (TrisEDTA buffer).<br /> Phương pháp biểu hiện protein đích dung<br /> hợp GST ở E. coli<br /> Các plasmid tái tổ hợp pGEX3X/f1DFNB59 tách chiết từ các tế bào E. coli<br /> Top 10 đã được khẳng định mang pGEX3X/f1DFNB59 được biến nạp vào tế bào E. coli<br /> BL21 và trải trên môi trường thạch LB-Amp.<br /> Các khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên kiểu hình<br /> kháng ampicillin. Các tế bào E. coli BL21 có<br /> mang plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59<br /> sẽ được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ<br /> sung<br /> ampicillin<br /> (100<br /> µg/ml)<br /> và<br /> chloramphenicol (30 µg/ml) ở 37oC trong 16<br /> giờ, sau đó 50 µl dịch nuôi cấy sang 5 ml môi<br /> trường LB-Amp ở 37oC trong 3 giờ. Sự biểu<br /> hiện gen được cảm ứng bằng cách thêm<br /> isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside<br /> (IPTG)<br /> đến nồng độ cuối cùng đạt 0,1 mM. Tế bào vi<br /> khuẩn sau đó được phá vỡ bằng phương pháp<br /> sonication để kiểm tra khả năng biểu hiện gen<br /> và tính hòa tan của protein dung hợp bằng<br /> phương pháp SDS-PAGE.<br /> Phương pháp tinh sạch protein dung hợp<br /> GST (Glutathione S-transferase)<br /> Protein dung hợp GST được tinh sạch bằng<br /> phương pháp sắc ký cột Glutathione Sepharose<br /> 4B (GE Healthcare) theo hướng dẫn của nhà sản<br /> xuất. Dịch protein (lọc qua màng 0,45 µm) được<br /> gắn vào cột sepharose ở 4oC trong 2 giờ. Sau đó<br /> li tâm ở 1.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ<br /> dịch nổi. Tiến hành rửa cột bằng PBS<br /> (Phosphate Buffered Saline) lạnh 4 lần ở 4oC<br /> trong 3 phút và li tâm loại PBS ở 1.000<br /> vòng/phút trong 5 phút. Thu 5 phân đoạn<br /> 72<br /> <br /> protein bằng phương pháp rửa giải (elution) với<br /> 1 ml Glutathione Elution buffer tương ứng với 5<br /> lần rửa giải. Các cột sepharose sau khi sử dụng<br /> được rửa sạch và bảo quản trong ethanol 20% ở<br /> 4oC để sử dụng cho các lần tinh sạch sau.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Kết quả tạo dòng E. coli Top 10 mang<br /> plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59<br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen<br /> f1DFNB59 trên gel agarose. Thang chuẩn DNA<br /> (M), đối chứng âm (giếng 1), sản phẩm PCR<br /> (giếng 2)<br /> Để tách phân đoạn gen f1DFNB59, đoạn<br /> gen 362 bp được khuếch đại từ plasmid tái tổ<br /> hợp pBluescript II SK/DFNB59 bằng phương<br /> pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu BamHI-NdeI/F<br /> và EcoRI/R đã được thiết kế có chứa các vị trí<br /> cắt của enzyme giới hạn tương ứng BamHI và<br /> EcoRI. Kết quả của phản ứng PCR thu được<br /> băng sản phẩm có kích thước khoảng 362 bp<br /> tương ứng với kích thước của f1DFNB59 (giếng<br /> 2, hình 1). Sản phẩm PCR f1DFNB59 và vector<br /> pGEX-3X được xử lý enzyme cắt giới hạn<br /> BamHI và EcoRI trước khi tiến hành phản ứng<br /> nối bởi T4-DNA ligase. Sản phẩm nối sau đó<br /> được biến nạp vào E. coli Top 10 và trải trên đĩa<br /> thạch LB-Amp để chọn các khuẩn lạc mang<br /> vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59. Plasmid<br /> tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 được tách chiết<br /> và kiểm tra bằng phương pháp cắt enzyme giới<br /> hạn.<br /> <br /> Nguyen Thi Kim Cuc et al.<br /> ApaLI 18<br /> SspI 164<br /> <br /> Csp45I 654<br /> HpaI 4517<br /> EcoRV 4461<br /> <br /> BamHI 934<br /> NdeI 939<br /> <br /> 1<br /> <br /> ApaI 4220<br /> f1DFNB59<br /> <br /> HindIII 1279<br /> EcoRI 1306<br /> <br /> ApaLI 3993<br /> <br /> 5314 bp<br /> f1DFNB59-pGEX-3X.070112.nuc<br /> <br /> BspHI 1564<br /> BspHI 1669<br /> SspI 1702<br /> ApaLI 1837<br /> <br /> ApaLI 3083<br /> <br /> PstI 2263<br /> BspHI 2677<br /> <br /> Hình 2. Sơ đồ cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ<br /> hợp pGEX-3X/f1DFNB59 (pGEX-3X mang phân<br /> đoạn gen f1DFNB59)<br /> Dựa trên bản đồ cắt enzyme giới hạn của<br /> pGEX-3X/f1DFNB59 (hình 2), hai phản ứng<br /> cắt enzyme giới hạn tương ứng với việc sử dụng<br /> hai cặp enzyme PstI/HindIII và NdeI/EcoRV<br /> được chọn để kiểm tra sự chèn của f1DFNB59<br /> trong vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59<br /> (hình 3). Các enzyme giới hạn này đều cắt 1<br /> điểm duy nhất trên vector tái tổ hợp pGEX3X/f1DFNB59 và mỗi cặp enzyme được chọn<br /> đều có 1 điểm cắt trên vector và 1 điểm cắt trên<br /> đoạn chèn f1DFNB59.<br /> Kết quả của phản ứng cắt pGEX3X/f1DFNB59 bởi PstI/HindIII (cắt ở vị trí<br /> nucleotide 2263 và vị trí nucleotide 1279) cho<br /> ra 2 băng sản phẩm với kích thước tương ứng là<br /> 984 bp và 4330 bp (giếng 1, hình 3). Với phản<br /> ứng cắt pGEX-3X/f1DFNB59 bởi NdeI/EcoRV<br /> (cắt ở vị trí nucleotide 939 và vị trí nucleotide<br /> 4461) cũng cho ra 2 băng sản phẩm với kích<br /> thước tương ứng là 3.522 bp và 1.792 bp (giếng<br /> 2, hình 3). Các kết quả này cho thấy phân đoạn<br /> gen f1DFNB59 đã được chèn đúng trong vector<br /> tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 của các thể<br /> biến nạp được kiểm tra.<br /> Kết quả biểu hiện protein dung hợp GST ở vi<br /> khuẩn E. coli BL21<br /> Việc biểu hiện toàn bộ cDNA DFNB59<br /> (full-length DFNB59, 1.059 bp) ở vi khuẩn E.<br /> coli BL21 với các hệ thống vector biểu hiện<br /> <br /> Hình 3. Kiểm tra pGEX-3X/f1DFNB59<br /> bằng enzyme cắt giới hạn. Thang chuẩn<br /> DNA (M), pGEX-3X/f1DFNB59 cắt bởi<br /> PstI và HindIII (giếng 1), pGEX3X/f1DFNB59 cắt bởi NdeI và EcoRV<br /> (giếng 2)<br /> <br /> pET-DEST42, pET-15b và pGEX-3X đã được<br /> tiến hành nhưng đều không thành công. Một<br /> trong các nguyên nhân được phân tích có thể do<br /> protein được biểu hiện (pejvakin) là protein độc<br /> đối với vi khuẩn E. coli. Chính vì vậy, trong<br /> nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành biểu<br /> hiện một phân đoạn của gen DFNB59 thay vì<br /> biểu hiện toàn bộ trình tự DFNB59. Việc biểu<br /> hiện một phân đoạn protein của pejvakin vẫn<br /> đảm bảo được mục đích của việc sử dụng<br /> protein đích làm kháng nguyên cho việc sản<br /> xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin.<br /> Bên cạnh đó, hệ thống vector dung hợp<br /> pGEX-3X ngoài việc làm tăng cường sự biểu<br /> hiện và tính tan của protein dung hợp, còn giúp<br /> cho quá trình tinh sạch các protein dung hợp<br /> được dễ dàng hơn, đồng thời làm tăng khối<br /> lượng phân tử của các protein đích, từ đó làm<br /> tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các<br /> protein dung hợp được sử dụng làm kháng<br /> nguyên. Vì vậy, vector pGEX-3X được lựa<br /> chọn để biểu hiện protein đích được mã hóa bởi<br /> phân đoạn gen f1DFNB59 có đuôi dung hợp<br /> GST ở vi khuẩn E. coli BL21.<br /> Việc biểu hiện gen được tiến hành bằng việc<br /> bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối<br /> cùng là 0,1 mM trong dịch huyền phù vi khuẩn<br /> E. coli BL21 mang pGEX-3X/f1DFNB59. Các<br /> mẫu huyền dịch vi khuẩn được thu ở các thời<br /> 73<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76<br /> <br /> điểm trước khi cảm ứng IPTG và sau khi cảm<br /> ứng IPTG 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ để khảo sát khả<br /> năng biểu hiện gen. Đồng thời tính tan của<br /> protein sau khi biểu hiện cũng được kiểm tra<br /> trong các mẫu dịch nổi và cặn tế bào bằng<br /> phương pháp SDS-PAGE (hình 4).<br /> <br /> Hình 4. Kết quả SDS-PAGE của các protein ở<br /> vi khuẩn E. coli BL21/pGEX-3X-f1DFNB59<br /> sau khi cảm ứng IPTG. Thang chuẩn protein<br /> (M), E. coli BL21/pGEX-3X-f1DFNB59 không<br /> được cảm ứng IPTG (giếng 1), E. coli<br /> BL21/pGEX-3X-f1DFNB59 được cảm ứng<br /> IPTG sau 1 giờ (giếng 2), sau 2 giờ (giếng 3),<br /> sau 3 giờ (giếng 4), protein ở dịch nổi (giếng 5),<br /> protein ở cặn tế bào (giếng 6).<br /> Khối lượng phân tử suy luận của protein<br /> đích được mã hóa bởi phân đoạn gen<br /> f1DFNB59 khoảng 14,5 kDa. Protein đích sau<br /> khi biểu hiện được dung hợp với GST (26 kDa)<br /> có khối lượng phân tử khoảng hơn 40 kDa. Kết<br /> quả phân tích SDS-PAGE trên hình 4 cho thấy,<br /> protein đích dung hợp GST (ở tất cả các giếng)<br /> đã được biểu hiện với băng protein có kích<br /> thước khoảng hơn 40 kDa, kích thước này hoàn<br /> toàn phù hợp với kích thước dự đoán của<br /> protein đích. Bên cạnh đó việc cảm ứng biểu<br /> hiện bằng IPTG cũng cho thấy lượng protein<br /> được tổng hợp tăng dần từ mẫu không cảm ứng<br /> (giếng 1) đến mẫu cảm ứng (giếng 2) và tăng<br /> dần theo thời gian sau khi cảm ứng (giếng 2-4).<br /> Kết quả kiểm tra tính tan của protein được biểu<br /> hiện cho thấy lượng protein đích tập trung chủ<br /> yếu trong dịch nổi sau khi phá vỡ tế bào (giếng<br /> 74<br /> <br /> 5), trong khi ở cặn tế bào có lượng protein đích<br /> không đáng kể (giếng 6). Điều này chứng tỏ<br /> protein đích đã được biểu hiện và có tính tan tốt,<br /> đặc điểm này rất thuận lợi cho việc tách chiết và<br /> tinh sạch protein.<br /> Kết quả tinh sạch protein đích dung hợp<br /> GST<br /> <br /> Hình 5. SDS-PAGE của protein dung hợp GST<br /> tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực<br /> (Glutathione Sepharose 4B). Thang chuẩn<br /> protein (M), mẫu trước khi tinh sạch (giếng 1),<br /> mẫu sau khi gắn (binding) vào cột (giếng 2),<br /> mẫu sau khi rửa cột (giếng 3), các phân đoạn (15) của dịch protein sau khi rửa giải tương ứng<br /> với các giếng 4-8.<br /> Việc sử dụng đuôi Glutathione-S-transferase<br /> (GST) ái lực dựa trên ái lực mạnh của GST với<br /> các hạt gel được bao bọc bởi glutathione đã<br /> được mô tả bởi Smith & Johnson (1988) [12].<br /> GST là một họ của các protein cytosolic với đa<br /> chức năng ở các sinh vật eukaryote. Các dạng<br /> đồng đẳng của GST thường không tìm thấy ở vi<br /> khuẩn, vì vậy, các protein nội bào của vi khuẩn<br /> không cạnh tranh vị trí gắn với protein dung<br /> hợp GST trong cột tinh sạch [12].<br /> Để đánh giá khả năng tinh sạch protein đích<br /> dung hợp GST bằng phương pháp sắc ký ái lực<br /> Glutathione, các mẫu trước và sau khi gắn vào<br /> cột tinh sạch và các phân đoạn protein tinh sạch<br /> sau khi rửa giải được kiểm tra bằng phương<br /> pháp SDS-PAGE. Kết quả tinh sạch trên hình 5<br /> <br />