intTypePromotion=1
ADSENSE

Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà

Chia sẻ: NI NI | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

60
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong bài viết này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử dụng trong lĩnh vực y dược.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG<br /> TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)<br /> Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên,<br /> Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com<br /> TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo<br /> nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời<br /> gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường<br /> MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy,<br /> chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn<br /> Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả<br /> bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen.<br /> Từ khóa: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, in vitro, nuôi cấy.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Cây bạch hoa xà, có tên khoa học là<br /> Plumbago<br /> zeylanica<br /> L.,<br /> thuộc<br /> họ<br /> Plumbaginaceae, là một cây dược liệu có nguồn<br /> gốc từ vùng Tây Bắc châu Á [2], được phân bố<br /> ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như<br /> Úc, châu Á và châu Phi [19].<br /> Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà được<br /> sử dụng điều trị một số bệnh về da như bị vết<br /> thương, chàm, bệnh ghẻ, bệnh phong [1]. Nhiều<br /> nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và<br /> cành của cây được sử dụng như nguồn dược liệu.<br /> Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là<br /> plumbagin, một naphtoquinone màu vàng được<br /> sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750<br /> năm trước công nguyên dùng kháng ký sinh, bổ<br /> tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra,<br /> nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ<br /> cây này, bao gồm phenolic acids, tannins,<br /> anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn [13].<br /> Nhiều nghiên cứu cho thấy, plumbagin được<br /> chiết tách từ cây có khả năng kháng ung thư<br /> [12], kháng khuẩn [4, 5], kháng sốt rét [8], ức<br /> chế hoạt động phân chia tế bào [3], kháng đột<br /> biến, kháng côn trùng [8] và làm giảm<br /> cholesterol tổng số [12].<br /> Cây bạch hoa xà sinh trưởng chậm trong điều<br /> kiện tự nhiên, các rễ của cây dùng để thu nhận<br /> plumbagin cần nhiều năm mới cho hàm lượng<br /> hoạt chất cao [7]. Ở Việt Nam, do chưa có qui<br /> hoạch tổng thể vùng trồng thu nguyên liệu, vì<br /> <br /> vậy, việc khai thác rễ tự nhiên dùng làm nguồn<br /> dược liệu chế biến sản phẩm tiêu tốn nhiều thời<br /> gian, làm cạn kiệt lượng cây phân bố ngoài tự<br /> nhiên.<br /> Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết<br /> quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và<br /> bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch<br /> hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn<br /> Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô<br /> nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích<br /> dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ<br /> bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần<br /> đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản<br /> phẩm sử sụng trong lĩnh vực y dược.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) sinh<br /> trưởng trong điều kiện tự nhiên ở tỉnh Phú Yên<br /> được lấy mẫu đọan thân để khử trùng; sử dụng 2<br /> chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes<br /> ATCC (American Type Culture Collection)<br /> 15934 và ATCC 11325 [dạng hoang dại (wild<br /> type), đều chứa plasmid pRi mang các gen rol<br /> (root loci) như rolB và rolC trên vùng T-DNA]<br /> được cung cấp bởi Phòng Công nghệ gen, Viện<br /> Sinh học nhiệt đới.<br /> Phương pháp<br /> Khử trùng mẫu cấy<br /> <br /> 161<br /> <br /> Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) chứa chồi<br /> ngủ được rửa dưới vòi nước máy trong 10-15<br /> phút, sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt bằng<br /> nước xà phòng loãng và rửa lại bằng nước cất<br /> vô trùng. Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng<br /> dung dịch javel thương mại nồng độ 10% (v/v)<br /> trong thời gian 20 phút. Mẫu được rửa lại bằng<br /> nước khử ion vô trùng, loại bỏ phần mô chết<br /> trắng và cấy mẫu lên môi trường MS<br /> (Murashige và Skoog, 1962) [10] đặc.<br /> Khảo sát sự tăng sinh chồi nách<br /> Các đoạn thân mang chồi nách 4 tuần tuổi<br /> (chồi cao khoảng 0,5 cm) được nuôi cấy trên<br /> môi trường MS có bổ sung BA 1,0-2,5 mg/L và<br /> IBA 0,1-0,5 mg/L. pH môi trường được điều<br /> chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ<br /> 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 30 phút.<br /> Các mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng<br /> 10 h/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2oC.<br /> Khảo sát phát triển cây<br /> Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm là những<br /> chồi in vitro có chiều cao khoảng 1,5 cm,<br /> được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ<br /> sung IBA nồng độ 0,1-0,35 mg/L, pH 5,8;<br /> điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện<br /> nuôi như trên.<br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định<br /> Nghiên cứu này nhằm mục đích tạo nguồn<br /> nguyên liệu rễ bất định dùng nuôi cấy so sánh<br /> với rễ tơ.<br /> Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) và lá cây in<br /> vitro (có cuống) được nuôi cấy trên môi trường<br /> MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật<br /> NAA (0,1-1,5 mg/L) và IBA (0,1-1,5 mg/L). pH<br /> 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều<br /> kiện nuôi như trên.<br /> Khảo sát khả năng tạo rễ tơ<br /> Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC<br /> 15834 và ATCC 11325 bảo quản ở -80oC được<br /> hoạt hoá bởi quá trình nuôi trải trên môi trường<br /> LB (đặc) trong 2 ngày ở 25o C và điều kiện tối.<br /> Vi khuẩn, qua cấy chuyển vào môi trường lỏng<br /> LB và nuôi lắc 280 vòng/phút ở 25oC trong 24<br /> giờ, được dùng để xử lý chuyển gen tạo rễ tơ.<br /> Mẫu lá (có cuống) của cây in vitro được gây<br /> nhiễm (infection) trong 15 phút với từng chủng<br /> <br /> 162<br /> <br /> vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nói trên<br /> (hai lô thí nghiệm khác nhau). Thấm khô nhẹ<br /> dịch vi khuẩn thừa ở mẫu lá và nuôi chung (cocultivation) mô với vi khuẩn trong 3 ngày. Sau<br /> nuôi chung, tiến hành rửa loại bỏ vi khuẩn<br /> bằng kháng sinh cefotaxime (500 g/ml). Mẫu<br /> sau khi rửa được nuôi trên môi trường MS<br /> đặc có bổ sung cefotaxime (nồng độ như trên).<br /> Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2-4 tuần nuôi ở<br /> 25oC và điều kiện tối, ghi nhận hình thái mẫu rễ<br /> tơ và tách dòng nuôi cấy rễ tơ trong môi trường<br /> MS lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh<br /> trưởng sau khi rễ phát triển đạt chiều dài khoảng<br /> 1 cm.<br /> Xử lý thống kê<br /> Các thí nghiệm được thiết kế theo thể thức<br /> hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lặp<br /> lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm<br /> Statgraphics Centurion XV theo phương pháp<br /> Duncan multiple Range Test (Duncan, 1995) ở<br /> mức ý nghĩa 5%.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Khảo sát sự tăng sinh chồi nách<br /> Cytokinin là nhóm các chất điều hòa sinh<br /> trưởng thực vật, có một trong các hoạt tính sinh<br /> lý là kích thích sự phát triển chồi nách. Đặc biệt,<br /> khi tương tác với auxin ở nồng độ thích hợp,<br /> cytokinin sẽ thúc đẩy phân chia tế bào ở mô<br /> phân sinh đỉnh, nâng cao tỷ lệ tạo chồi, tạo số<br /> lượng chồi hình thành nhiều hơn so với không<br /> bổ sung hai nhóm chất này.<br /> Khi không bổ sung/bổ sung ít cytokinin,<br /> chồi tăng trưởng chủ yếu theo chiều cao, không<br /> được kích thích tạo nhiều chồi bên. Không phải<br /> nồng độ cytokinin và auxin cao quyết định sự<br /> tạo chồi mà chính tỷ lệ thích hợp giữa cytokinin<br /> và auxin đã làm tăng khả năng tạo chồi (hình 1;<br /> bảng 1). Nồng độ BA 1,5 mg/L kết hợp IBA 0,1<br /> mg/L là tổ hợp tạo chồi tốt nhất trong các<br /> nghiệm thức (4,76 chồi/mẫu) và kết quả nhận<br /> được ở nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp<br /> với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002)<br /> [18], qua nghiên cứu khả năng tạo chồi trực tiếp<br /> từ chồi bên cây bạch hoa xà với số chồi trung<br /> bình là 3,5 trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L<br /> BA và 0,1 mg/L IBA.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> A. Nghiệm thức đối chứng<br /> sau 4 tuần nuôi cấy<br /> <br /> B. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA<br /> sau 4 tuần nuôi cấy<br /> <br /> h<br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> a<br /> <br /> g<br /> e<br /> <br /> f<br /> <br /> C. MS +1,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> <br /> l<br /> <br /> m<br /> <br /> i<br /> j<br /> <br /> D. MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> <br /> r<br /> <br /> n<br /> q<br /> <br /> k<br /> <br /> o<br /> <br /> E. MS + 2,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> <br /> p<br /> <br /> s<br /> t<br /> <br /> F. MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA<br /> <br /> Hình 1. Tạo chồi bạch hoa xà từ chồi bên trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy<br /> A. Đối chứng; B. Môi trường MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA; C. Môi trường MS +1,0 mg/L BA + (0,10,5) mg/L IBA; D. Môi trường MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA; E. Môi trường MS + 2,0 mg/L BA +<br /> (0,1-0,5) mg/L IBA; F. Môi trường MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA. Các chữ cái a, b, c, d,... trên hình 1<br /> tương ứng môi trường A1, A2, A3,... ở bảng 1.<br /> <br /> 163<br /> <br /> Bui Dinh Thach et al.<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA và IBA đến khả<br /> năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây bạch hoa xà<br /> Môi<br /> trường<br /> <br /> Ký<br /> hiệu<br /> <br /> BA<br /> (mg/L)<br /> <br /> IBA<br /> (mg/L)<br /> <br /> Tỷ lệ tạo chồi<br /> (%)<br /> <br /> Số chồi trung<br /> bình/mẫu<br /> <br /> O<br /> A1<br /> A2<br /> A3<br /> A4<br /> A5<br /> B1<br /> B2<br /> B3<br /> B4<br /> B5<br /> C1<br /> C2<br /> C3<br /> C4<br /> C5<br /> D1<br /> D2<br /> D3<br /> D4<br /> D5<br /> <br /> a<br /> b<br /> c<br /> d<br /> e<br /> f<br /> g<br /> h<br /> i<br /> j<br /> k<br /> l<br /> m<br /> n<br /> o<br /> p<br /> q<br /> r<br /> s<br /> t<br /> <br /> 0<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 1,5<br /> 1,5<br /> 1,5<br /> 1,5<br /> 1,5<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 2,0<br /> 2,5<br /> 2,5<br /> 2,5<br /> 2,5<br /> 2,5<br /> <br /> 0<br /> 0,1<br /> 0,2<br /> 0,3<br /> 0,4<br /> 0,5<br /> 0,1<br /> 0,2<br /> 0,3<br /> 0,4<br /> 0,5<br /> 0,1<br /> 0,2<br /> 0,3<br /> 0,4<br /> 0,5<br /> 0,1<br /> 0,2<br /> 0,3<br /> 0,4<br /> 0,5<br /> <br /> 100<br /> 88,89<br /> 77,78<br /> 83,33<br /> 77,78<br /> 55,56<br /> 100<br /> 88,89<br /> 88,89<br /> 100<br /> 77,78<br /> 100<br /> 88,89<br /> 77,78<br /> 100<br /> 77,78<br /> 88,89<br /> 88,89<br /> 88,89<br /> 66,67<br /> 66,67<br /> <br /> 1,00<br /> 4,45<br /> 4,00<br /> 2,67<br /> 3,56<br /> 3,78<br /> 4,67<br /> 4,33<br /> 1,89<br /> 2,44<br /> 3,78<br /> 2,44<br /> 1,89<br /> 1,33<br /> 2,78<br /> 3,56<br /> 1,44<br /> 1,22<br /> 2,44<br /> 1,78<br /> 2,11<br /> <br /> Chiều cao trung<br /> bình của chồi<br /> (cm)<br /> 5,33 a<br /> 1,56 b<br /> 1,47 bc<br /> 1,59 b<br /> 1,31 bcd<br /> 1,12 bcde<br /> 1,40 bcd<br /> 1,45 bcd<br /> 0,69 de<br /> 0,73 cde<br /> 0,88 bcde<br /> 1,33 bcd<br /> 1,07 bcde<br /> 0,84 bcde<br /> 1,11 bcde<br /> 1,27 bcde<br /> 1,05 bcde<br /> 0,69 de<br /> 1,28 bcde<br /> 0,52 e<br /> 0,71 cde<br /> <br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c, ...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức thống kê, α = 0,05.<br /> <br /> Khảo sát sự phát triển cây<br /> Các chồi phát triển tốt được cắt ngang và<br /> cấy thẳng đứng trên môi trường MS có bổ sung<br /> IBA với các nồng độ khác nhau (bảng 2) để<br /> đánh giá khả năng tạo rễ. Kết quả cho thấy, ở tất<br /> cả các chồi rễ đều phát triển trên môi trường<br /> MS có bổ sung IBA sau 2 tuần nuôi cấy. Môi<br /> trường E1 (0,1 mg/L IBA) là môi trường thích<br /> <br /> c<br /> b<br /> a<br /> <br /> hợp cho sự phát triển cây với số rễ trung bình<br /> 11,33; chiều dài rễ trung bình 2,27 và số lá<br /> trung bình 6,67 (bảng 2). Kết quả này cũng phù<br /> hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al.<br /> (2002), Wei et al. (2006) [18, 20] qua nghiên<br /> cứu khả năng tạo rễ từ chồi cây Bạch hoa xà<br /> trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA - tốt<br /> nhất cho sự tạo rễ và tăng trưởng cây.<br /> <br /> d<br /> <br /> e<br /> <br /> f<br /> g<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển cây sau 2 tuần nuôi cấy<br /> Các chữ cái a, b, c,... trên hình 2 tương ứng với các môi trường E0, E1, E3 ở bảng 2.<br /> <br /> 164<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên sự phát triển cây bạch hoa xà từ<br /> chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy<br /> Môi<br /> trường<br /> E0<br /> E1<br /> E2<br /> E3<br /> E4<br /> E5<br /> E6<br /> <br /> Ký<br /> hiệu<br /> a<br /> b<br /> c<br /> d<br /> e<br /> f<br /> g<br /> <br /> Nồng độ<br /> IBA(mg/L)<br /> 0,00<br /> 0,10<br /> 0,15<br /> 0,20<br /> 0,25<br /> 0,30<br /> 0,35<br /> <br /> Tỷ lệ tạo<br /> rễ (%)<br /> 100<br /> 100<br /> 100<br /> 100<br /> 100<br /> 100<br /> 100<br /> <br /> Số rễ trung<br /> bình/mẫu<br /> 4,33 d<br /> 11,33 ab<br /> 13,00 a(*)<br /> 9,00 bc<br /> 10,33 ab<br /> 12,67 a<br /> 5,67 cd<br /> <br /> Chiều dài<br /> rễ (cm)<br /> 2,93 a<br /> 2,27 a<br /> 1,30 b<br /> 1,13 b<br /> 1,07 b<br /> 0,97 b<br /> 0,67 b<br /> <br /> Số lá trung<br /> bình/mẫu<br /> 4,00<br /> 6,67<br /> 6,33<br /> 5,33<br /> 5,00<br /> 5,67<br /> 4,67<br /> <br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.<br /> <br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định<br /> Kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo rễ bất định<br /> từ lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ<br /> <br /> sung nồng độ khác nhau của các chất điều hòa<br /> sinh trưởng IBA và NAA được trình bày ở<br /> bảng 3.<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng IBA và NAA đến khả năng tạo rễ bất định từ lá<br /> và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy<br /> Hàm lượng (mg/L)<br /> Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (g TLT)<br /> IBA<br /> NAA<br /> Lá<br /> Đoạn thân<br /> 0<br /> 0,0<br /> 1,210 j<br /> 0,4300i<br /> b<br /> 0<br /> 0,1<br /> 2,610<br /> 0,6800 h<br /> bc<br /> 0<br /> 0,5<br /> 2,500<br /> 0,8200 gh<br /> gh<br /> 0<br /> 1,0<br /> 1,810<br /> 1,130f<br /> 0<br /> 1,5<br /> 1,700hi<br /> 1,220ef<br /> i<br /> 0,1<br /> 0,0<br /> 1,600<br /> 1,25 ef<br /> ef<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 2,000<br /> 1,780a(*)<br /> de<br /> 0,1<br /> 0,5<br /> 2,110<br /> 1,550bc<br /> d<br /> 0,1<br /> 1,0<br /> 2,190<br /> 0,8500g<br /> c<br /> 0,1<br /> 1,5<br /> 2,400<br /> 1,670ab<br /> hi<br /> 0,5<br /> 0,0<br /> 1,720<br /> 1,450cd<br /> a(*)<br /> 0,5<br /> 0,1<br /> 1,230ef<br /> 3,020<br /> hi<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 1,710<br /> 0,7700gh<br /> gh<br /> 0,5<br /> 1,0<br /> 1,830<br /> 1,120f<br /> gh<br /> 0,5<br /> 1,5<br /> 1,830<br /> 1,250ef<br /> 1,0<br /> 0,0<br /> 1,830gh<br /> 0,8800g<br /> de<br /> 1,0<br /> 0,1<br /> 2,120<br /> 0,7700gh<br /> d<br /> 1,0<br /> 0,5<br /> 2,200<br /> 1,500c<br /> c<br /> 1,0<br /> 1,0<br /> 2,400<br /> 1,170ef<br /> b<br /> 1,0<br /> 1,5<br /> 2,580<br /> 0,8500g<br /> fg<br /> 1,5<br /> 0,0<br /> 1,870<br /> 0,7700gh<br /> c<br /> 1,5<br /> 0,1<br /> 2,380<br /> 1,300de<br /> gh<br /> 1,5<br /> 0,5<br /> 1,750<br /> 1,220ef<br /> j<br /> 1,5<br /> 1,0<br /> 1,310<br /> 1,120f<br /> j<br /> 1,5<br /> 1,5<br /> 1,240<br /> 1,180ef<br /> Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.<br /> <br /> 165<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2