Tạp chí khoa học: Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 phân lập tại Rừng Quốc gia Hoàng Liên

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 59-70<br /> <br /> c i m sinh h c và ti m năng ng d ng c a ch ng vi khu n Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 phân l p t i R ng Qu c gia Hoàng Liên<br /> Tr nh Thành Trung, Phan L c Dũng, Tr n Th L Quyên, Dương Văn H p, ào Th Lương*<br /> Vi n Vi sinh v t và Công ngh Sinh h c, i h c Qu c gia Hà N i, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hà N i, Vi t Nam<br /> Nh n ngày 01 tháng 3 năm 2013 Ch nh s a ngày 08 tháng 4 năm 2013; ch p nh n ăng ngày 07 tháng 5 năm 2013<br /> <br /> Tóm t t: Nhóm Bacillus subtilis là m t nhóm g m ít nh t 9 loài vi khu n có chung các c i m ki u hình và có tính tương ng o n gen 16S rRNA cao. nh danh các loài trong nhóm này òi h i ph i s d ng t h p nhi u k thu t phân lo i hi n i. T 315 ch ng vi khu n hi u khí sinh n i bào t phân l p t i Sa Pa, chúng tôi ã phân tích trình t gen 16S rRNA c a 63 ch ng vi khu n có c i m hình thái khu n l c khác nhau. Duy nh t ch ng SP 1901 ư c phân lo i vào nhóm vi xác minh k t qu trên, chúng tôi ti n hành phân tích trình t 6 gen gyrA, khu n B. subtilis. rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA. Phân tích trình t và xây d ng cây phát sinh ch ng lo i a gen, ch ng SP 1901 ư c nh danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Ch ng này có kh năng ng hóa và lên men nhi u ngu n ư ng, sinh trư ng t t nhi t 35 - 45oC, pH 5,0 9,0, n ng mu i NaCl 1,0 - 7,0%, có kh năng t n t i trong d ch d dày nhân t o, s n sinh nhi u lo i enzyme công nghi p như amylase, cellulose, xylanase, lipase, protease và phytase, sinh ch t kháng sinh kháng l i các vi khu n Staphylococcus aureus, Escherichia coli và n m gây b nh cây Fusarium oxysporum, sinh ch t kích thích sinh trư ng IAA. ây là m t báo cáo u tiên ng d ng phân lo i chính xác m t ch ng vi khu n trong nhóm B. k thu t phân tích trình t a gen subtilis phân l p trong h sinh thái t nhiên Vi t Nam n loài. V i nhi u c tính quý, ch ng SP 1901 có nhi u ti m năng ng d ng vào s n xu t các s n ph m thương m i ch t lư ng cao. T khóa: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, phân tích trình t a gen, enzyme ngo i bào.<br /> <br /> 1. M<br /> <br /> u∗<br /> <br /> Bacillus là m t trong nh ng vi sinh v t u tiên ư c phát hi n và mô t trong giai o n u c a ti n trình phát tri n ngành vi sinh v t h c cu i th k 19. ây là m t chi l n v i<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . T: 84-904302964. E-mail: luongdt@vnu.edu.vn<br /> <br /> g n 200 loài vi khu n hi u khí, hình que, có kh năng sinh n i bào t ch ng ch u các i u ki n b t thư ng c a môi trư ng s ng. Bacillus phân b r ng rãi trong các h sinh thái t nhiên: t trên c n n dư i nư c, t nư c ng t n nư c m n và t vùng ven b n áy các i Dương [1]. Bên c nh các loài vi khu n gây b nh cho con ngư i như B. anthracis và B. 59<br /> <br /> 60<br /> <br /> T.T. Trung và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 59-70<br /> <br /> cereus, nhi u loài vi khu n Bacillus, c bi t là nhóm B. subtilis, có ti m năng s n xu t các s n ph m thương m i ng d ng trong y h c, trong nông nghi p và trong công nghi p th c ph m. Vì l ó, Bacillus ã ư c quan tâm nghiên c u m ic p trong t bào như gi i mã trình t genome, nghiên c u cơ ch i u hòa và bi u hi n enzyme và protein, sàng l c các ch t ho t tính sinh h c t các s n ph m trao i ch t b c hai cũng như ng d ng các k thu t sinh h c hi n i trong phân lo i vi sinh v t c p loài và dư i loài [2-6]. H th ng phân lo i Bacillus d a trên phân tích trình t o n gen 16S rRNA b t u t nh ng năm 1990 [7]. Theo ó, B. subtilis Cohn 1872 và nh ng loài có quan h g n gũi như B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. coagulans, B. anthracis, B. cereus và B. thuringensis ư c x p vào phân nhóm th nh t (hay còn g i là nhóm “Bacillus sensu tricto”) trong t ng s 5 phân nhóm (hay còn g i là nhóm “Bacillus sensu lato”). Hơn 20 năm qua, nhi u loài vi khu n có quan h g n gũi v i B. subtilis ã ư c phân l p và mô t . Chúng bao g m ít nh t 9 loài là B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. subtilis. Phương pháp phân lo i truy n th ng d a trên hình thái t bào, bào t cũng như các c tính sinh hóa không có kh năng phân tách các loài này. Hơn n a, h u h t các loài này u có m c tương ng o n gen 16S rRNA r t cao (l n hơn 99%) m c dù k t qu lai DNADNA c a t ng loài v i B. subtilis nh hơn 70%. Vì v y, 9 loài vi khu n Bacillus này thư ng ư c ch nh theo m t thu t ng chung g i là nhóm B. subtilis. Nhi u loài trong nhóm này ã ư c phân tách thành các loài ph , ví d như B. subtilis ư c chia thành B. subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii, B. subtilis<br /> <br /> subsp. inaquosorum; B. amyloliquefaciens ư c chia thành B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [8-10]. Bên c nh vi c phân lo i d a trên trình t gen 16S rRNA, m t s gen khác như DNA gyrase subunit A (gyrA), DNA gyrase subunit B (gyrB) và two-component sensor histidine kinase (CheA) ã ư c s d ng phân lo i các loài trong nhóm B. subtilis [11-13]. G n ây, xây d ng cây phát sinh ch ng lo i trên trình t a gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA) ã ư c ng d ng trong phân lo i các loài ho c dư i loài B. subtilis [9, 14]. Trong nghiên c u này, chúng tôi ti n hành l a ch n ch ng vi khu n thu c nhóm B. subtilis phân l p t m u t Sa Pa [15] và ng d ng k thu t phân tích trình t a gen phân lo i chính xác n loài.<br /> <br /> 2. V t li u và phương pháp * M u t, môi trư ng nuôi c y và phương pháp phân l p vi khu n Vào tháng 11 năm 2010, chúng tôi ti n hành l y 19 m u t t i r ng Qu c gia Hoàng Liên và các ru ng canh tác nông nghi p lân c n. Phương pháp l y m u, b o qu n, v n chuy n m u và phân l p vi khu n ư c mô t chi ti t trong báo cáo c a Trung và c ng s (2011) [15]. * Th kh năng lên men và ngu n ư ng ng hóa các<br /> <br /> Kh năng lên men và ng hóa các lo i ư ng khác nhau ư c th nghi m theo hư ng d n c a kit API 50 CHB (Biomerieux, Pháp). * Xác nh kh năng sinh enzyme ngo i bào Ho t tính c a 19 lo i enzyme ư c th trên thanh API ZYM (Biomerieux, Pháp) theo<br /> <br /> T.T. Trung và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 59-70<br /> <br /> 61<br /> <br /> hư ng d n c a nhà s n xu t. Ngoài ra, ho t tính amylase, cellulose, xylanase, lipase, protease và phytase ư c th theo phương pháp khu ch tán trên b n th ch ch a 0,1% cơ ch t tương ng là tinh b t tan, CMC, xylan, tributyrin, cazein và phytic axit. * Kh năng sinh ch t kháng sinh theo phương pháp khu ch tán trên th ch Ch ng vi khu n ho t hóa ư c c y v ch trên môi trư ng th ch TSA (Becton Dickinson). Sau 30 gi nuôi c y 28oC, th i th ch nuôi c y vi khu n ư c c b ng ng kim lo i (Ø 6 mm) và ư c chuy n sang môi trư ng NA ã c y s n các vi khu n ki m nh là S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella sp., Shigella sp. và môi trư ng Czapeck ã c y s n n m ki m nh là F. oxysporum. Sau 24 gi nuôi c y i v i vi o khu n 37 C và 72 gi nuôi i v i n m 28oC, ho t tính kháng sinh ư c xác nh d a trên s xu t hi n vòng c ch xung quanh th i th ch. * Kh năng sinh ch t kích thích sinh trư ng IAA Ch ng vi khu n ho t hóa ư c c y vào bình tam giác 100 ml ch a 25 ml môi trư ng d ch th NA có b sung v i L-tryptophan (Merck, c) n ng cu i là 5 mM. Sau 48 gi nuôi l c 180 v/p 37oC, d ch nuôi vi khu n ư c ly tâm 8,000 v/p trong 10 phút lo i b t bào. Kh năng sinh ch t kích thích sinh trư ng indole-3-acetic acid (IAA) ư c xác nh như mô t c a Gutierrez và c ng s , 2009 [16]. * Phân tích trình t a gen Ph n ng PCR khu ch i và gi i trình t 6 o n gen gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein<br /> <br /> groEL (groEL) và 16S rRNA ư c th c hi n v i các c p m i theo mô t c a Rooney và c ng s (2009) [9]. Trình t 6 gen này ư c ăng t i trên ngân hàng gen NCBI v i mã hi u c a các trình t l n lư t là JX403999, JX404000, JX404001, JX404002, JX404003 và JX404004. * Xây d ng cây phát sinh ch ng lo i Trình t a gen c a ch ng vi khu n nghiên c u có chi u dài 5.547 bp ư c k t n i theo th t o n 928 bp c a gen gyrA, o n 964 bp c a gen rpoB, o n 875 bp c a gen purH, o n 777 bp c a gen polC, o n 835 bp c a gen groEL và o n 1,168 bp c a gen 16S rRNA. Trình t a gen c a các loài quan h g n gũi trong nghiên c u c a Kobo và c ng s (2011) [14] ư c t i v t ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cây phát sinh ch ng lo i ư c xây d ng theo phương pháp Neighbor joining s d ng phép toán Tamura Nei v i l p l i 1,000 l n trên ph n m m MEGA phiên b n 5.05.<br /> <br /> 3. K t qu * Phân l p vi khu n và l a ch n ch ng vi khu n nghiên c u 315 ch ng vi khu n hi u khí sinh n i bào t ư c phân l p t 10 m u t r ng Hoàng Liên và 9 m u t nông nghi p xung quanh r ng t i huy n Sa Pa, Lào Cai. D a vào m u s c, kích thư c và hình thái b m t khu n l c, 63 (20%) ch ng vi khu n ã ư c l a ch n và phân lo i d a trên phương pháp phân tích trình t gen 16S rRNA [15]. Trong s này, 41 (65%) ch ng ư c phân lo i vào chi Bacillus d a trên cơ s d li u Eztaxon-e c p nh t n ngày 16/05/2012. l a ch n các ch ng thu c nhóm B. subtilis, chúng tôi ti n hành xây d ng cây phát sinh ch ng lo i d a trên trình t gen 16S<br /> <br /> 62<br /> <br /> T.T. Trung và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 59-70<br /> <br /> rRNA. Cùng v i 9 loài trong nhóm B. subtilis [1], ch duy nh t ch ng SP 1901 có quan h g n gũi v i các loài trong nhóm B. subtilis (Hình 1). Trên cơ s d li u NCBI, trình t o n 16S rDNA c a ch ng SP 1901 tương ng v i 90 trình t c a các loài thu c nhóm B. subtilis, 47 trình t c a loài B. amyloliquefaciens, 21 trình t c a loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, 10 trình t trong h gen c a ch ng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946 và B. amyloliquefaciens FZB42 và 43 trình t c a loài B. subtilis. Trên cơ s d li u EzTaxon-e, trình t o n 16S rDNA c a ch ng SP 1901 tương ng cao nh t v i loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 là 99,93%; loài B. methylotrophicus là 99,79%; loài B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 là 99,72%; B. vallismortis DSM 11031 là 99,65%; B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM 7 là 99,65% và v i B. siamensis PD-A10 là 99,51%. Ch s tương ng o n 16S rDNA c a ch ng SP 1901 giao ng t 99,51 97,73% i v i các loài B. tequilensis 10b, B. subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28, B. subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049, B. mojavensis IFO 15718, Brevibacterium halotolerans DSM 8802, B. atrophaeus JCM 9070, B. licheniformis ATCC 14580, B. aerius 24K và B. sonorensis NRRL B-23154. * Phân lo i ch ng vi khu n SP 1901 d a trên phân tích trình t a gen xác nh n l i k t qu phân tích trên cơ s d li u NCBI và EzTaxon-e, chúng tôi ti n hành phân tích trình t 5 gen khác là gyrA, rpoB, purH, polC và groEL. K t h p v i trình t gen 16S rRNA, chúng tôi ti n hành xây d ng cây phân lo i cho ch ng SP 1901 cùng v i các loài trong nhóm B. subtilis ã công b [9, 10, 14]. K t qu phân tích cho th y, ch ng SP 1901 ư c x p vào nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum và phân tách rõ ràng v i<br /> <br /> nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens cũng như nh ng loài khác trong nhóm B. subtilis (Hình 3). V i k t qu thu ư c, chúng tôi k t lu n ch ng SP 1901 là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. * 1901 c i m sinh h c c a ch ng vi khu n SP<br /> <br /> Ch ng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 là vi khu n hi u khí, hình que, kích thư c t bào (3,2 - 3,9) × (0,9 - 1,0) µm, ng riêng r ho c x p ôi. Ch ng SP 1901 có kh năng sinh n i bào t hình tr , thư ng n m l ch v m t phía t bào nhưng không làm bi n d ng hình que c trưng c a t bào. Trên môi trư ng nuôi c y th ch NA, khu n l c d ng tròn, có màu tr ng s a. B m t khu n l c khô, l i và s n sùi. Mép khu n l c có d ng hình răng cưa. Khu n l c bám ch c vào th ch sau 2 ngày nuôi c y. Ch ng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 có kh năng ng hóa t t 19 lo i ư ng là glycerol, D - glucose, D fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, methyl - αD - glucopyranoside, N acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D - cellobiose, D - maltose, sucrose, D trehalose, amidon (tinh b t), glycogen và gentiobiose; ng hóa y u L - arabinose, D ribose, D - xylose, D - lactose và potassium 2 ketogluconate; lên men 24 lo i ư ng trên t ng s 49 lo i ư ng th nghi m t o thành axit là glycerol, L - arabinose, D - ribose, D xylose, D - glucose, D - fructose, inositol, D mannitol, D - sorbitol, methyl - αD glucopyranoside, N - acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D cellobiose, D - maltose, D - lactose, sucrose, D - trehalose, D -raffinose, amidon (tinh b t), glycogen và gentiobiose.<br /> <br /> T.T. Trung và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 59-70<br /> <br /> 63<br /> <br /> Ch ng SP 1901 sinh trư ng t t trong gi i nhi t 20oC - 55oC v i kho ng nhi t t i ưu o o là 35 C - 45 C; pH 5,0 - 9,0 v i pH t i ưu là 7,0; và n ng NaCl 1,0 - 7,0%. Ch ng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 có kh năng sinh trư ng t t trên môi trư ng có ch a 1% ox-bile nhưng y u trên môi trư ng có ch a ox-bile t 3% tr lên. T bào c a ch ng SP 1901 có th t n t i trong d ch d d y nhân t o pH 2,0 và pH 3,0 sau khi x lý 3 gi 37oC.<br /> <br /> Trên môi trư ng th ch ch a 0,1% cơ ch t, ch ng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 có kh năng sinh các lo i enzyme ngo i bào như amylase, cellulose, lipase, phytase, protease và xylanase (Hình 2). Trên thanh th API ZYM, ch ng SP 1901 có kh năng sinh esterase (C 4), esterase lipase (C 8), lipase (C 14), acid phosphatase, naphthol-ASBI-phosphohydrolase và α-glucosidase.<br /> <br /> Hình 1. Cây phát sinh ch ng lo i c a 37 ch ng vi khu n Bacillus phân l p t i Sa Pa và 9 loài thu c nhóm Bacillus subtilis d a trên phân tích trình t 16S rDNA. Mũi tên ch v trí phân lo i c a ch ng SP 1901.<br /> <br />