Tạp chí khoa học: Khả năng tích lũy photpho và tạo biofilm của chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập tại Việt Nam

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 43-50<br /> <br /> Kh năng tích lũy photpho và t o biofilm c a ch ng Bacillus licheniformis A4.2 phân l p t i Vi t Nam<br /> Nguy n Quang Huy*, Ngô Th Kim Toán<br /> Khoa Sinh h c, Trư ng i h c Khoa h c T nhiên, HQGHN, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hà N i, Vi t Nam<br /> Nh n ngày 05 tháng 11 năm 2013 Ch nh s a ngày 19 tháng 11 năm 2013; ch p nh n ăng ngày 11 tháng 2 năm 2014<br /> <br /> Tóm t t: Màng sinh h c (Biofilm) là c u trúc t p h p c a vi sinh v t và có vai trò quan tr ng trong chu trình dinh dư ng trên c n và dư i nư c. Nghiên c u màng sinh h c ng d ng trong x lý nư c th i là m t trong nh ng nghiên c u m i hi n nay giúp gi m ô nhi m c bi t là ô nhi m nư c th i có ch a các h p ch t photpho. T các m u nư c th i thu th p t m t s a i m Thanh Hóa, Hà N i chúng tôi ã phân l p ư c 21 ch ng vi sinh v t có kh năng hình thành màng sinh h c. Trong s các ch ng phân l p, ch ng A4.2 ngoài kh năng hình thành màng sinh h c còn có ho t tính phân gi i photpho trong môi trư ng nuôi c y. K t qu phân tích v hình thái, c i m sinh lý hóa sinh và so sánh trình t o n gen 16S rRNA cho th y ch ng A4.2 tương ng 99,9% (1411/1413bp) v i Bacillus licheniformis_X68416. Ch ng A4.2 sau 7 ngày nuôi c y ã chuy n hóa hoàn toàn lư ng photpho trong môi trư ng tương ương 6 mg/l. Khi tăng hàm lư ng photpho lên 18 mg/l ch ng A4.2 ã chuy n hóa ư c 39,32% lư ng photpho b sung sau 7 ngày nuôi c y. T khóa: Màng sinh h c, tích lũy photpho, Bacillus licheniformis.<br /> <br /> 1. M<br /> <br /> u∗<br /> <br /> Màng sinh h c (biofilm) là m t d ng s ng t n t i ph bi n trong t nhiên c a vi sinh v t. Vi c hình thành biofilm em l i nhi u l i ích cho b n thân vi sinh v t như giúp t bào t n t i và ch ng ch u ư c nh ng i u ki n b t l i, t n d ng ư c ngu n dinh dư ng c a môi trư ng thông qua m i quan h h p tác gi a các loài<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . T: 84-4-38582178. E-mail: huynq17@gmail.com<br /> <br /> trong biofilm [1-3]. Theo nghiên c u c a Kokare và c ng s trong t nhiên t n t i nhi u ch ng vi khu n có ho t tính t o biofilm bao g m các vi khu n Gram dương (Streptococcus sp., Bacillus subtilis…) và vi khu n Gram âm (Escheriachia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera…). Vi sinh v t t o biofilm hi n ang ư c nghiên c u, ng d ng trong các lĩnh v c y h c, công nghi p và c bi t trong x lý nư c th i. T i Vi t Nam, k t qu nghiên c u c a Nguy n Quang Huy và c ng s cũng như Tr n Thúy H ng ã phân l p m t s nhóm vi 43<br /> <br /> 44<br /> <br /> N.Q. Huy, N.T.K. Toán /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 43-50<br /> <br /> sinh v t có ho t tính t o biofilm t các ngu n nư c, t th i ô nhi m [4,5]. Lê Th Nhi Công và c ng s ã phân l p các nhóm vi khu n t o biofilm t nư c bi n ng th i có ho t tính chuy n hóa các ch t c h i là hydrocarbon thơm a vòng như naphthalene, anthracene, pyrene [6]. Các h p ch t ch a photpho trong t nhiên thư ng khó phân gi i [7]. Các ngu n nư c th i chăn nuôi, biogas...thư ng có hàm lư ng photpho cao. Theo tiêu chu n Vi t Nam v nư c th i, hàm lư ng photpho trong nư c th i vư t quá 6 mg/l có th d n n hi n tư ng phú dư ng (dư th a các ch t dinh dư ng), gây tác ng tr c ti p n ng v t, th c v t và gây nh hư ng n môi trư ng sinh thái. Vi c x lý nư c th i giàu photpho thư ng khó th c hi n b ng còn ư ng sinh h c do trong t nhiên s lư ng loài vi sinh v t phân gi i chuy n hóa photpho không nhi u. M t s ch ng vi sinh v t phân l p trong t nhiên có kh năng tích lũy phosphate cao thu c các chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus,…[8,9]. K t qu nghiên c u c a Bao và c ng s v kh năng thu nh n tích lũy photpho c a các chi vi khu n cho th y sau 20 gi vi khu n thu c chi Pseudomonas có kh năng thu nh n 14,34 mg/l khi ti n hành i u ki n y m khí, chi Enterobacteriaceae có kh năng thu nh n 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là 6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23 mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l i u ki n hi u khí [8]. S tích lũy phosphate cung c p ngu n năng lư ng cho vi sinh v t phát tri n. Trong cơ th vi sinh v t, photpho tích lũy d ng ch y u là phosphate. Phosphate chi m n 12% tr ng lư ng t bào i v i vi khu n có ho t tính tích lũyphotphate, trong khi vi khu n không tích lũy photphate ch có kho ng 1-3%. Vi c nghiên c u các ch ng vi sinh v t có ho t tính t o biofilm ng th i có ho t tính phân gi i chuy n hóa h p ch t ch a photpho r t có ý nghĩ trong<br /> <br /> vi c nâng cao vi c x lý nư c th i áp d ng phương pháp sinh h c. Hi n nay t i Vi t Nam chưa có công trình nào c p n vi c các vi sinh v t có ho t tính t o biofilm ng th i có kh năng tích lũy photpho. Trong bài báo này chúng tôi trình bày các k t qu nghiên c u bư c u v phân l p các ch ng vi sinh v t có kh năng tích lũy photpho làm cơ s ng d ng trong vi c t o s n ph m giúp làm gi m ô nhi m nư c có hàm lư ng h p ch t photpho cao.<br /> <br /> 2. Nguyên li u và phương pháp nghiên c u Các m u nư c th i ư c thu th p t i m t s a i m có ch a hàm lư ng photpho cao như nư c th i b biogas t Vĩnh L c - Thanh Hóa, khu t p trung nư c th i c a làng V n Phúc - Hà ông - Hà N i. Các m u sau khi ư c thu th p s ư c b o qu n l nh sau ó v n chuy n v phòng thí nghi m phân tích trong ngày. Môi trư ng nuôi c y Môi trư ng nghiên c u ư c s d ng là môi trư ng khoáng acetae (AMM) v i thành ph n: CH3COONa: 3,68 g; Na2HPO4: 28,73 mg; NH4Cl: 57,27 mg; MgSO4: 131,82 mg; K2SO4: 26,74 mg; CaCl2. 2H2O: 17,2 mg; HEPES: 12 g; dung d ch khoáng vi lư ng: 2 ml; th ch: 15 g; nư c c t: 1 lít. Thành ph n dung d ch khoáng vi lư ng ư c s d ng bao g m: EDTA: 50 g; FeSO4. 7H2O: 5 g; CuSO4. 5H2O: 1,6 g; MnCl2. 4H2O: 5 g; (NH4)6Mo7O24. 4H2O: 1,1 g; H3BO3: 50 mg; KI: 10 mg; CoCl2. 6H2O: 50 mg; nư c c t: 1 lít [9]. ánh giá kh năng t o màng sinh h c ánh giá s hình thành màng sinh h c theo phương pháp nhu m v i tím k t tinh. M t t<br /> <br /> N.Q. Huy, N.T.K. Toán /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 43-50<br /> <br /> 45<br /> <br /> bào trong biofilm ư c xác nh b ng cách o h p th bư c sóng 570 nm [10]. M t t bào trong môi trư ng ư c ánh giá b ng cách o h p th bư c sóng 620nm. Phương pháp nghiên c u nh hư ng c a các y u t môi trư ng n s phát tri n và t o biofilm: Các ch ng vi sinh v t có ho t tính t o màng biofilm sau khi ư c phân l p ư c nuôi c y các nhi t , pH khác nhau trong 24 gi , sau ó ư c quan sát, ánh giá kh năng hình thành màng biofilm b ng cách o h p th ánh sáng bư c sóng 570 nm. Phân lo i ch ng vi sinh v t nghiên c u d a kit th API và trình t gen 16 S rARN Phương pháp phân lo i vi sinh v t ư c ti n hành b ng quan sát hình thái khu n l c, t bào qua kính hi n vi i n t và kính hi n vi quang h c, k t h p v i phân tích các c i m sinh lý sinh hóa (kit API, BioMérieus, Pháp). Gi i trình t gen 16S rARN ư c th c hi n trên máy gi i trình t gen t ng ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) t i Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c, HQG HN. K t qu gi i trình t ư c so sánh v i trình t 16S rARN các loài ã có trong ngân hàng gen qu c t . nh kính hi n vi i n t ư c ch p t i Trung tâm Khoa h c V t li u, Trư ng H Khoa h c T nhiên. ánh giá kh năng tích lũy photpho ánh giá kh năng tích lũy photpho c a vi sinh v t thông qua hàm lư ng phosphate còn l i<br /> B ng 1. a i m thu m u Nư c th i t b biogas t i Vĩnh L c – Thanh Hóa. Nư c th i khu t p trung rác th i V n Phúc – Hà ông – Hà N i.<br /> <br /> trong môi trư ng. Hàm lư ng phosphate ư c ánh giá d a trên nguyên t c t o ph c gi a g c phosphate, amonium molypdat và kali antimon tatrat thành m t ph c ch t màu xanh m và ư c o bư c sóng 710 nm [11].<br /> <br /> 3. K t qu và th o lu n 3.1. Phân l p các ch ng có kh năng t o màng sinh h c T các m u nư c th i t b x lý biogas cũng như nư c th i t i khu v c nuôi tôm trên môi trư ng AMM chúng tôi ã phân l p ư c 21 ch ng vi sinh v t (b ng 1). Các ch ng vi sinh v t phân l p có c i m chung có màu tr ng c, hơi vàng, hay h ng, hình thái khu n l c tròn, m t s khu n l c có vi n xung quanh. B ng phương pháp nhu m v i tím k t tinh bư c u chúng tôi ã ánh giá ư c kh năng hình thành biofilm c a 21 ch ng vi khu n phân l p. K t qu cho th y m t s ch ng vi khu n phân l p có kh năng hình thành biofilm, trong ó các ch ng A4.2, A5.1, A5.2 và A5.3 có kh năng hình thành màng sinh h c t t nh t so v i các ch ng còn l i. Giá tr OD t i bư c sóng 570 nm c a các ch ng A4.2, A5.1, A5.2 và A5.3 tương ng là 2,42; 5,13; 2,01 và 2,14 trong khi các ch ng phân l p khác còn l i u th p hơn 2,0 (Hình 1).<br /> <br /> c i m và s lư ng ch ng vi sinh v t phân l p S lư ng ch ng phân l p 13 ch ng 8 ch ng Ký hi u Các ch ng t A1.1 n A1.8; Các ch ng A2.1 và A2.2 và các ch ng t A3.1 n A3.3. Các ch ng t A4.1 n A4.3; Các ch ng t A5.1 n A5.5.<br /> <br /> 46<br /> <br /> N.Q. Huy, N.T.K. Toán /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 43-50<br /> <br /> Hình 1. Kh năng t o biofilm c a m t s ch ng vi sinh v t phân l p.<br /> <br /> 3.2. Kh năng tích lũy phân gi i phosphat c a các ch ng t o biofilm Kh năng s d ng photpho c a các ch ng có ho t tính t o biofilm phân l p ư c ánh giá thông qua hàm lư ng phosphate ư c tích lũy trong vi sinh v t d n n vi c gi m hàm lư ng c a h p ch t này trong môi trư ng nuôi c y. K t qu nghiên c u cho th y, c 5 ch ng vi sinh v t có ho t tính t o biofilm tuy n ch n u có kh năng tích lũy photpho nhanh và m nh. V i hàm lư ng photpho là 6 mg/l trong môi trư ng nuôi c y, c 4 ch ng A5.1, A5.2, A5.3 và 4.2 sau 7 ngày nuôi c y ã không còn phát hi n<br /> <br /> ư c phosphate còn trong môi trư ng (hình 2A). Chúng tôi ã ti p t c b sung và tăng hàm lư ng photpho trong môi trư ng nuôi c y lên g p 3 l n m c 18 mg/l. T i n ng này k t qu nghiên c u cho th y ch ng A4.2 có kh năng s d ng phosphate t t nh t so v i các ch ng còn l i. Lư ng phosphate trong d ch nuôi c a ch ng A4.2 gi m i 39,32% sau 7 ngày trong khi v i các ch ng A5.1, A5.2, A5.3 lư ng gi m tương ng là 29,88%, 20,77% và 17,94% (hình 2B). ây là nh ng k t qu u tiên trình bày v kh năng tích lũy phosphate t các ch ng vi sinh v t t o biofilm phân l p Vi t Nam.<br /> <br /> N.Q. Huy, N.T.K. Toán /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 1 (2014) 43-50<br /> <br /> 47<br /> <br /> (A)<br /> <br /> (B)<br /> <br /> Hình 2. Kh năng tích lũy phosphate c a 4 ch ng vi sinh v t trên môi trư ng AMM. A: v i hàm lư ng phosphate 6 mg/l; B: v i hàm lư ng phosphate 18mg/l.<br /> <br /> 3.3. c i m sinh h c, phân lo i và nh hư ng c a m t s y u t môi trư ng n s sinh trư ng t o màng biofilm c a ch ng A4.2 Hình thái khu n l c c a ch ng A4.2 phân l p trên môi trư ng AMM có hình tròn, nhăn, màu tr ng c, có các vi n tia xung quanh lan toàn b m t th ch (hình 3A). K t qu nhu m Gram và quan sát dư i kính hi n vi quang h c cho th y t bào ch ng A4.2 là Gram (+) có hình que, d ng chu i (Hình 3B). Khi quan sát dư i kính hi n vi i n t quét các t bào hình que c a A4.2 liên k t ch t ch v i nhau qua m ng lư i ngo i bào, m t c u trúc i n hình c a biofilm (Hình 3C). Trên k t qu phân tích v hình thái t bào và nhu m Gram có th k t lu n bư c u ch ng A4.2 thu c chi Bacillus.<br /> B ng 2. Các y u t môi trư ng nh hư ng<br /> <br /> Hình 3. Hình thái ch ng t bào ch ng A4.2 trên môi trư ng AMM (A), qua kính hi n vi quang h c ×1000 l n (B) và qua kính hi n vi i n t quét ×10.000 l n (C).<br /> <br /> Nhi t và pH là m t trong nh ng y u t có nh hư ng n kh năng hình thành màng sinh h c cũng như ho t tính tích lu photpho c a các ch ng vi sinh v t và cũng là m t c i m sinh lý hóa sinh phân lo i. K t qu thí nghi m ánh giá kh năng hình thành màng sinh h c c a ch ng A4.2 các i u ki n pH và nhi t khác nhau ư c trình bày b ng 2.<br /> n s phát tri n và t o biofilm c a ch ng A4.2 ng pH 4 5 6 7 8 9 pH Kh năng hình thành biofilm (OD 570 nm) 0,037 ± 0,0068 0,020 ± 0,0004 1,006 ± 0,1448 1,795 ± 0,0335 1,065 ± 0,1374 0,170 ± 0,0034<br /> <br /> Nhi t (oC) 25 30 37 45 50 55<br /> <br /> Y u t môi trư Nhi t Kh năng hình thành biofilm (OD 570 nm) 0,932 ± 0,0145 1,245 ± 0,0464 1,290 ± 0,0054 1,511 ± 0,0302 2,370 ± 0,0145 0,458 ± 0,0042<br /> <br />