TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br />
<br />
THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AMPHOTERICIN B<br />
TRONG THUỐC TIÊM ĐÔNG HÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B<br />
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br />
Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Thái Sơn**; Phạm Thị Minh Huệ***<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B (AmB) trong thuốc tiêm đông<br />
khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu<br />
chuẩn hóa chất lượng sản phẩm. Đối tượng và phương pháp: thuốc tiêm đông khô liposome AmB<br />
được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội. Tiến hành phân tích AmB<br />
bằng phương pháp HPLC với cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), detector PDA,<br />
bước sóng 407 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, pha động: acetonitrile - natri<br />
acetat 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích). Kết quả: phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu,<br />
tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và có khoảng xác định từ 15 - 25<br />
µg/ml. Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô liposome<br />
AmB là 50,07 ± 0,51 mg/lọ (100,15 ± 1,02% so với hàm lượng ghi trên nhãn). Kết luận: phương<br />
pháp định lượng đảm bảo các yêu cầu và có thể sử dụng để định lượng AmB trong thuốc tiêm<br />
đông khô liposome AmB.<br />
* Từ khóa: Amphotericin B; Liposome; Thuốc tiêm đông khô; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br />
<br />
Validation of an Analytical Assay Method for Amphotericin B in<br />
Amphotericin B Liposomal Lyophilized Powder for Injection by High<br />
Performance Liquid Chromatography<br />
Summary<br />
Objectives: To validate the analytical assay method for amphotericin B in amphotericin B liposomal<br />
lyophilized powder for injection by high performance liquid chromatography (HPLC) aiming to<br />
standardize the quality of the products. Participants and methodology: Amphotericin B liposomal<br />
lyophilized powder for injection produced by Department of Pharmaceutics, Hanoi University of<br />
Pharmacy is analyzed using the HPLC system with the column Phenomenex C18 (250 x 4.6 mm,<br />
5 µm), detector PDA, the wave length of 407 nm, the water flow speed of 1.0 ml/min, injection<br />
volume of 10 µl, a mixture of acetonitrile - natri actetate 10 mM pH 4.0 (gradient volume) as mobile<br />
phase. Results: The method ensures the specificity, compatibility, linearity, propriety, accuracy<br />
and is approximately determined from 15 µg/ml to 25 µg/ml. As a result, the amount of amphotericin<br />
B measured in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection is 50.07 ± 0.51 (mg/vial)<br />
* Học viện Quân y<br />
** Bệnh viện Quân y 103<br />
*** Đại học Dược Hà Nội<br />
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/02/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 01/03/2016<br />
<br />
13<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br />
(100.15 ± 1.02% of the amount written on the label). Conclusion: The method meets all the<br />
requirements and can be used to measure the amount of amphotericin B in amphotericin B<br />
liposomal lyophilized powder for injection.<br />
* Key words: Amphotericin B; Liposome; Lyophilized powder for injection; High performance<br />
liquid chromatography.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Amphotericin B là một kháng sinh chống<br />
nấm, phổ rộng, đã được sử dụng từ rất<br />
lâu chủ yếu dưới dạng tiêm tĩnh mạch<br />
trong trường hợp nhi m nấm hệ thống.<br />
Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là<br />
không tan trong nước, nên sinh khả dụng<br />
không cao và gây nhiều tác dụng phụ,<br />
đặc biệt gây độc cho thận [1, 3]. Việc<br />
nghiên cứu đưa hoạt chất AmB vào hệ<br />
mang thuốc liposome để cải thiện sinh<br />
khả dụng và làm giảm độc tính trên thận<br />
của AmB là vấn đề có ý nghĩa khoa học<br />
và thực ti n cao. Thuốc tiêm đông khô<br />
liposome AmB đã được bào chế thành<br />
công ở quy mô 30 lọ/mẻ với các chỉ tiêu<br />
vật lý đạt yêu cầu của hệ mang thuốc nano.<br />
Việc nghiên cứu định lượng AmB trong<br />
thuốc tiêm đông khô liposome AmB là rất<br />
quan trọng, góp phần xây dựng công thức<br />
bào chế, cũng như tiêu chuẩn hóa chất<br />
lượng sản phẩm. Để định lượng AmB, có<br />
thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp<br />
phụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) hay xác<br />
định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương<br />
pháp thử vi sinh vật [2]. Tuy nhiên, các<br />
phương pháp này hoặc có độ chính xác<br />
không cao hoặc yêu cầu điều kiện thí<br />
nghiệm rất nghiêm ngặt. Vì vậy, trong bài<br />
báo này chúng tôi: Thông báo kết quả<br />
thẩm định phương pháp định lượng AmB<br />
trong thuốc tiêm đông khô liposome AmB<br />
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br />
<br />
14<br />
<br />
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG<br />
PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên liệu và thiết bị.<br />
- Thuốc tiêm đông khô liposome AmB<br />
được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường<br />
Đại học Dược Hà Nội, số lô NC 0315, hạn<br />
sử dụng 03 - 2017.<br />
- Hóa chất: acetonitril, methanol, axít<br />
acetic, natri acetat trihydrat, nước cất pha<br />
tiêm đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn<br />
AmB (Dr. Ehrenstorfer, Đức, 95%); các hóa<br />
chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br />
phân tích.<br />
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br />
Water e2695 (Mỹ) gồm hệ bơm 4 kênh<br />
dung môi, autosampler, detector PDA, cột<br />
phenomenex C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).<br />
- Dụng cụ: cân phân tích Mettler toledo<br />
(độ chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ<br />
phân tích khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.<br />
2. Phƣơ g pháp ghi<br />
<br />
cứu.<br />
<br />
- Điều kiện sắc ký:<br />
+ Cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm;<br />
5 µm).<br />
+ Detector UV tại bước sóng: 407 nm.<br />
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.<br />
+ Thể tích tiêm: 10 µl.<br />
+ Pha động: acetonitrile - natri acetat<br />
10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích)<br />
[4, 5].<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br />
Thời gian<br />
(phút)<br />
<br />
Tốc độ<br />
dòng<br />
(ml/phút)<br />
<br />
% đệm<br />
natri<br />
acetat<br />
<br />
%<br />
acetonitril<br />
<br />
0,01<br />
<br />
1,00<br />
<br />
70,0<br />
<br />
30,0<br />
<br />
Tính hàm lượng (%) AmB trong chế phẩm<br />
theo công thức:<br />
St * ft * mc * HLc<br />
<br />
4,00<br />
<br />
1,00<br />
<br />
40,0<br />
<br />
60,0<br />
<br />
8,00<br />
<br />
1,00<br />
<br />
20,0<br />
<br />
80,0<br />
<br />
9,00<br />
<br />
1,00<br />
<br />
60,0<br />
<br />
40,0<br />
<br />
* Dung dịch natri acetat 10 mM pH 4,0:<br />
cân chính xác 0,2014 g natri acetat trihydrat<br />
và 0,5111 g axít acetic bằng hòa tan trong<br />
1.000 ml nước cất. Điều chỉnh dung dịch về<br />
pH 4 (nếu cần), lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br />
- Phương pháp xử lý mẫu:<br />
+ Mẫu chuẩn: cân chính xác 10,0 mg<br />
AmB chuẩn hòa tan trong bình định mức<br />
100 ml bằng methanol. Hút chính xác 2 ml<br />
dung dịch trên cho vào bình định mức<br />
10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch,<br />
lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br />
+ Mẫu thử: lấy 1 lọ chế phẩm thêm<br />
10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, lắc<br />
đều để thu được hỗn dịch liposome. Chuyển<br />
sang bình định mức 250 ml, thêm 50 ml<br />
hỗn hợp dung môi methanol-cloroform<br />
(3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng đến vạch, lắc<br />
đều. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho<br />
vào bình định mức 10 ml, thêm methanol<br />
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng<br />
lọc 0,45 µm.<br />
+ Mẫu trắng (placebo): lấy 1 lọ placebo<br />
thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm,<br />
lắc đều. Chuyển sang bình định mức 250 ml,<br />
thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanolcloroform (3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng<br />
đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 1 ml dung<br />
dịch trên cho vào bình định mức 10 ml,<br />
thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.<br />
Lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br />
<br />
H (%) =<br />
<br />
x 100%<br />
Sc * fc * Mn<br />
<br />
Trong đó:<br />
H (%): hàm lượng % AmB trong chế<br />
phẩm.<br />
St, Sc: diện tích píc của mẫu thử và<br />
mẫu chuẩn.<br />
ft, fc: hệ số pha loãng của mẫu thử,<br />
mẫu chuẩn.<br />
mc: khối lượng chất chuẩn (mg).<br />
HLc: hàm lượng tinh khiết của chất<br />
chuẩn (%).<br />
Mn: hàm lượng hoạt chất ghi trên nhãn<br />
(mg).<br />
- Thẩm định phương pháp: với các tiêu<br />
chí về tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ<br />
thống, tuyến tính, độ đúng, độ chính xác<br />
và khoảng xác định [4].<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
. Tí h đặc hiệu.<br />
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử<br />
và mẫu trắng. Sắc ký đồ của các mẫu<br />
trên được thể hiện ở hình 1, hình 2 và<br />
hình 3. Kết quả trên sắc ký đồ (SKĐ) cho<br />
thấy: mẫu thử cho píc của AmB có thời<br />
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của<br />
píc AmB trong mẫu chuẩn. Píc của AmB<br />
trong mẫu thử cân đối, tách hoàn toàn<br />
khỏi píc tạp. Hệ số chồng phổ UV của píc<br />
AmB thu được trong SKĐ của dung dịch<br />
thử và phổ UV của píc tương ứng trong<br />
SKĐ của dung dịch chuẩn xấp xỉ bằng 1<br />
(hệ số chồng phổ = 0,9999). Đồng thời,<br />
mẫu trắng không thấy xuất hiện píc có<br />
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu<br />
của AmB trong mẫu chuẩn và mẫu thử.<br />
<br />
15<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br />
Diện tích píc<br />
(mAU.s)<br />
<br />
Thời gian<br />
(phút)<br />
<br />
Hình 1: SKĐ của mẫu trắng.<br />
Diện tích píc<br />
(mAU.s)<br />
<br />
Thời gian<br />
(phút)<br />
<br />
Hình 2: SKĐ của mẫu chuẩn AmB.<br />
Diện tích píc<br />
(mAU.s)<br />
<br />
Thời gian<br />
(phút)<br />
<br />
Hình 3: SKĐ của AmB trong mẫu thử.<br />
16<br />
<br />
Thời gian<br />
(phút)<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br />
<br />
2. Tính thích hợp.<br />
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml vào<br />
hệ thống sắc ký.<br />
Bảng 1: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br />
Stt<br />
<br />
Thời gia<br />
<br />
ƣu của píc (s)<br />
<br />
Diện tích píc (mAU.s) Hệ số đối xứng<br />
<br />
Số đĩa ý thu ết<br />
<br />
1.<br />
<br />
5,606<br />
<br />
1309969<br />
<br />
1,18<br />
<br />
45987<br />
<br />
2.<br />
<br />
5,588<br />
<br />
1309678<br />
<br />
1,21<br />
<br />
44845<br />
<br />
3.<br />
<br />
5,594<br />
<br />
1309601<br />
<br />
1,18<br />
<br />
42653<br />
<br />
4.<br />
<br />
5,582<br />
<br />
1296938<br />
<br />
1,19<br />
<br />
44628<br />
<br />
5.<br />
<br />
5,589<br />
<br />
1299925<br />
<br />
1,21<br />
<br />
43620<br />
<br />
6.<br />
<br />
5,591<br />
<br />
1301446<br />
<br />
1,20<br />
<br />
43413<br />
<br />
Trung bình<br />
<br />
5,592<br />
<br />
1304593<br />
<br />
1,20<br />
<br />
44191<br />
<br />
RSD %<br />
<br />
0,14<br />
<br />
0,45<br />
<br />
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc của các mẫu chuẩn AmB<br />
lần lượt là 0,14% và 0,45%. Hệ số đối xứng của píc AmB là 1,20 (đạt yêu cầu < 2),<br />
số đĩa lý thuyết là 44141 (đạt yêu cầu không dưới 1000). Như vậy, phương pháp phân<br />
tích hoàn toàn phù hợp với hệ thống sắc ký.<br />
3. Tính tuyến tính.<br />
Pha 1 dãy các dung dịch AmB chuẩn trong pha động có nồng độ từ 10 - 40 µg/ml.<br />
Tiến hành sắc ký các dung dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu.<br />
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng AmB.<br />
Stt<br />
<br />
Nồ g độ AmB (µg/ml)<br />
<br />
Diện tích píc (mAU.s)<br />
<br />
1<br />
<br />
10<br />
<br />
535148<br />
<br />
2<br />
<br />
15<br />
<br />
793702<br />
<br />
3<br />
<br />
20<br />
<br />
1055328<br />
<br />
4<br />
<br />
25<br />
<br />
1309969<br />
<br />
5<br />
<br />
30<br />
<br />
1583122<br />
<br />
6<br />
<br />
35<br />
<br />
1863179<br />
<br />
7<br />
<br />
40<br />
<br />
2104649<br />
<br />
Phương trình hồi quy: y = 52680x + 3719. Hệ số tương quan (r): 0,999<br />
Hệ số góc:<br />
<br />
52680<br />
<br />
Hệ số chắn:<br />
<br />
3719<br />
<br />
%Y:<br />
<br />
0,352<br />
<br />
17<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
