Thành phần protein và độc tính của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> <br /> KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br /> <br /> THÀNH PHẦN PROTEIN VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN<br /> Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ MÚ CHẤM CAM<br /> (Epinephelus coioides) NUÔI THƯƠNG PHẨM TẠI KHÁNH HÒA<br /> PROTEIN PROFILE AND VIRULENCE OF Vibrio parahaemolyticus CAUSING<br /> THE ULCERATIVE DISEASE IN ORANGE- SPOTTED GROUPER<br /> (Epinephelus coioides) CULTURED IN KHANH HOA PROVINCE<br /> Nguyễn Thị Thanh Thùy1, Nguyễn Hữu Dũng2, Heidrun I.Wergeland3<br /> Ngày nhận bài: 17/02/2011; Ngày phản biện thông qua: 24/10/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) là một trong những loài cá mú có giá trị dinh dưỡng cao, lớn nhanh nên<br /> được nuôi rất phổ biến ở nhiều nước trong khu vực. Ở Việt Nam, loài này được nuôi chủ yếu ở Quảng Ninh, Hải Phòng,<br /> Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu. Tuy nhiên, cùng với việc mở rộng diện tích, tăng mật độ nuôi thì dịch bệnh bùng phát ngày<br /> càng mạnh mẽ. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 phân lập từ cá mú bệnh lở loét được phân tích thành phần protein<br /> và khảo sát độc tính đồng thời so sánh với chủng chuẩn V.parahaemolyticus ATCC17802. Kết quả phân tích thành phần<br /> protein bằng phương pháp SDS - PAGE cho thấy sự tương đồng giữa chủng nghiên cứu và chủng chuẩn. Ngoài ra, kết quả<br /> khảo sát độc tính bằng cảm nhiễm trên cá khỏe với nồng độ từ 102 đến 105 tế bào/mL cho thấy chủng V3 có độc lực cao hơn<br /> chủng A với giá trị LD50 là 1,78 x 103 tế bào/g thể trọng cá.<br /> Từ khóa: Cá mú chấm cam, Bệnh lở loét, Vibrio parahaemolyticus, SDS-PAGE<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Orange-spotted grouper is one of species which highly nutrition and grow fast becoming the most common cultured<br /> grouper in many countries in area. In Vietnam, grouper was mainly cultured at Quang Ninh, Phu Yen, Khanh Hoa, Vung<br /> Tau. However, as culture expanded, the industry has faced serious threats owing to a variety of disease problems. Bacteria<br /> Vibrio parahaemolyticus (V3 strain) which isolated from infected grouper with ulcerative disease was analyzed protein<br /> profile and virulence, compared those of type strain V. parahaemolyticus ATCC 17802 (A) at the same time. The result of<br /> analysis protein profile by SDS-PAGE showed quite similarly between both strains. A comparison 50% lethal dose (LD50)<br /> of V3 and A (type strain) was conducted by challenge test at concentration of bacteria from 102 to 105 cells/mL and the<br /> result showed V3 strain has high virulence with LD50 value as 1.78 x 103 cells/g fish.<br /> Key words: Orange spotted-grouper, Ulcerative disease, Vibrio parahaemolyticus, SDS-PAGE<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) là<br /> một trong những loài cá mú có giá trị dinh dưỡng<br /> cao, lớn nhanh nên được nuôi rất phổ biến ở các<br /> nước Châu Á như Hồng Kông, Đài Loan, Malaysia,<br /> <br /> Indonesia, Philippines, Trung Quốc (Sadovy et al.,<br /> 2000). Ở Việt Nam, loài này cũng được nuôi rộng<br /> rãi khắp cả nước, tập trung chủ yếu ở Quảng Ninh,<br /> Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu. Tuy<br /> nhiên, cùng với việc mở rộng diện tích, tăng mật độ<br /> <br /> ThS. Nguyễn Thị Thanh Thùy: Nghiên cứu sinh ngành Nuôi trồng Thủy sản 2007 - Trường Đại học Nha Trang<br /> TS. Nguyễn Hữu Dũng: Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br /> 3<br /> GS.TS. Heidrun I.Wergeland: Trường Đại học Bergen, Nauy<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> 180 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> nuôi thì dịch bệnh bùng phát ngày càng mạnh mẽ.<br /> Tại Việt Nam, các đợt bệnh xảy ra trên cá mú đã làm<br /> tổn thất kinh tế lớn cho nhiều người nuôi đã được<br /> nhiều tác giả điều tra và nghiên cứu ( Đỗ Thị Hòa<br /> và cs., 2007; Nguyễn Thị Thanh Thùy và Nguyễn<br /> Hữu Dũng, 2008; Phan Thị Vân, 2006)<br /> Nhiều tác nhân khác nhau gây bệnh trên<br /> cá mú đã được báo cáo như do virus (Hegde và<br /> cs., 2002) do ký sinh trùng (Cruz-Lacierda và cs.,<br /> 2000 and 2001; Leong và cs., 1988) và bệnh do vi<br /> khuẩn (Ong, 1988; Saeed, 1995). Trong đó, bệnh<br /> do vi khuẩn Vibrio gây ra có ảnh hưởng nghiêm<br /> trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước và<br /> gây bệnh trên khoảng 48 loài cá biển (Austin and<br /> Austin, 1987). Tác nhân gây bệnh Vibriosis trên cá<br /> mú đã được xác định là Vibrio alginolyticus (Lee,<br /> 1995), V. carchariae (Yii, 1997) gây hội chứng<br /> đường ruột ở cá. Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu<br /> cũng phát hiện Vibrio gây bệnh xuất huyết, lở loét,<br /> mòn vây ở cá mú (Đỗ Thị Hòa và cs., 2007; Nguyễn<br /> Thị Thanh Thùy và Nguyễn Hữu Dũng, 2008; Phan<br /> Thị Vân, 2006). V. parahaemolyticus đã được phân<br /> lập từ các mẫu cá mú bệnh lở loét với tần số bắt<br /> gặp khá lớn (56%) và với một số kết quả nghiên cứu<br /> ban đầu đã xác định đây là một trong những loài vi<br /> khuẩn gây bệnh này cho cá mú ở Việt Nam (Nguyễn<br /> Thị Thanh Thùy và Nguyễn Hữu Dũng, 2008).<br /> Để có cơ sở khẳng định vai trò của loài vi khuẩn<br /> V. parahaemolyticus đối với bệnh trên cá mú và<br /> cung cấp những thông tin cần thiết sử dụng trong<br /> nghiên cứu chế tạo vaccine phòng ngừa bệnh,<br /> nghiên cứu này đã xác định thành phần protein và khả<br /> năng gây bệnh của V. parahaemolyticus trên cá mú.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu<br /> Vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 được phân<br /> lập từ gan, thận cá bị bệnh lở loét, cấy trên môi<br /> trường tryptic soy agar (TSA; Merck) bổ sung 2%<br /> NaCl và thiosulfate citrate bile salt sucrose agar<br /> (TCBS; Merck). Chọn những khuẩn lạc rời nuôi cấy<br /> thuần chủng trên môi trường tryptic soy broth (TSB,<br /> Difco) bổ sung 2% NaCl, lưu giữ chủng trong điều<br /> kiện đông băng ở nhiệt độ -700C. Chủng vi khuẩn<br /> đối chứng V. parahaemolyticus ATCC17802 (chủng<br /> A) mua từ ngân hàng chủng.<br /> Phục hồi chủng: Vi khuẩn lấy từ tủ đông băng<br /> nuôi cấy tăng sinh trong 10ml môi trường TSB có<br /> 2% NaCl, ở nhiệt độ 300C sau 18 đến 24 giờ, tiếp<br /> tục cấy ria trên đĩa thạch TSA 2% NaCl, ủ ở 300C<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> sau 18 đến 24 giờ. Thu các khuẩn lạc rời để thực<br /> hiện các nghiên cứu.<br /> 2. Phương pháp điện di và nhuộm gel<br /> Thực hiện điện di bằng phương pháp Sodium<br /> dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis<br /> (SDS - PAGE) được cải tiến theo Laemmli (1970).<br /> Thành phần protein của chủng vi khuẩn phân lập<br /> từ cá mú và chủng đối chứng được tách trên gel<br /> acrylamid với 5µg protein mẫu mỗi giếng bản thạch<br /> có lớp stacking gel 5% (w/v) (gel cô) và resolving<br /> gel 12,6% (w/v) (gel tách) chạy trên bộ điện di<br /> Mini-Protein tetra cell (Bio-Rad) ở 200V trong 40<br /> phút. Nhuộm gel bằng phương pháp nhuộm bạc<br /> theo Switzer và cs. (1979).<br /> 3. Thí nghiệm xác định độc lực của<br /> V. parahaemolyticus trên cá mú<br /> Cá mú giống E.coioides khỏe mạnh mua từ trại<br /> sản xuất giống nhân tạo, nuôi giữ trong bể composit<br /> 2m3 chứa nước biển có độ mặn 33ppt, nhiệt độ<br /> 28 - 290C, sục khí và bơm lọc tuần hoàn liên tục. Cá<br /> được cho ăn bằng thức ăn viên NRD P16 (Inve) 2%<br /> thể trọng mỗi ngày, cá nuôi thuần trong bể composit<br /> 2 tuần trước khi thí nghiệm.<br /> Cá dùng cho thí nghiệm có khối lượng thân là<br /> 17 ± 1,54g. Ở thí nghiệm cho mỗi chủng vi khuẩn,<br /> cá được phân bố ngẫu nhiên vào 10 bể composit<br /> 300 lít chứa nước biển sục khí liên tục, mỗi bể chứa<br /> 6 con. Liều gây chết 50% (LD50) xác định bằng cách<br /> tiêm vào cơ 0,2mL/con cá dịch khuẩn nuôi sau 18<br /> giờ với nồng độ từ 102 đến 105 tế bào/g thể trọng<br /> (xác định mật độ bằng máy đo quang phổ Smartspec<br /> TM3000, Biorad, bước sóng 600nm). Thí nghiệm<br /> lặp lại 2 lần cho mỗi nồng độ, nhóm đối chứng tiêm<br /> 0,2mL/con bằng nước muối sinh lý tiệt trùng.<br /> Theo dõi các biểu hiện của cá sau khi tiêm,<br /> ghi chép dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ chết ở mỗi nghiệm<br /> thức thí nghiệm. Cá chết hoặc yếu được phân lập vi<br /> khuẩn ở gan, thận để đối chiếu với chủng vi khuẩn<br /> đưa vào. Thí nghiệm được theo dõi trong 10 ngày.<br /> Tỷ lệ LD50 được tính theo phương pháp của Reed<br /> và Muench (1938).<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Kết quả phân tích thành phần protein bằng<br /> phương pháp SDS-PAGE<br /> Điện di theo phương pháp của Laemmli (1970)<br /> có cải tiến, bản gel nhuộm bạc theo phương pháp<br /> của Switzer và cs (1979), sau 10 phút quan sát rõ<br /> các vạch protein thể hiện qua hình 1:<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 181<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Hình 1. Protein của V. parahaemolyticus chủng V3 (3) và<br /> ATCC17802 (2) với marker (1)<br /> <br /> Kết quả cho thấy thành phần protein của chủng<br /> V3 và chủng đối chứng A là tương tự nhau với các<br /> vạch protein có khối lượng phân tử lần lượt là 97.4,<br /> 74, 61, 55, 33, 23.8, 19.7, 16.3 và 14.4 kDa.<br /> 2. Kết quả thí nghiệm xác định độc lực của<br /> V. parahaemolyticus<br /> Thí nghiệm xác định độc lưc của vi khuẩn Vibrio<br /> <br /> LD50= 1,58 x 104cfu/g<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> paraheamolyticus V3 so sánh với chủng đối chứng<br /> A. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 2<br /> cho thấy quá trình xuất hiện bệnh ở các chủng thí<br /> nghiệm cũng tương tự nhau. Sau khi tiêm, cá vẫn<br /> bơi lội bình thường. Dấu hiệu bệnh lý xuất hiện đầu<br /> tiên ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn cao 105 tb/g<br /> sau 23 - 24 giờ tiêm, sau đó các dấu hiệu bệnh lý<br /> cũng lần lượt xuất hiện ở các nồng độ tiêm còn lại.<br /> Cá có biểu hiện bơi bất thường, không định hướng,<br /> vết tiêm sưng đỏ và ngày càng sưng to, lở loét dần<br /> ra xung quanh. Cá chết rải rác trong 3 ngày đầu<br /> và chết nhanh sau 4 - 6 ngày tiêm với tỷ lệ chết<br /> tích lũy đến 90% (chủng A) và 91,7% (chủng V3).<br /> Cá ở nhóm đối chứng vẫn khỏe mạnh bình thường<br /> trong suốt thời gian thí nghiệm. Giải phẫu cá bệnh<br /> từ các lô tiêm vi khuẩn cho thấy gan bầm tím, thận<br /> nhợt nhạt, cơ xuất huyết, lở loét giống với các triệu<br /> chứng bệnh tự nhiên, phân lập lại vi khuẩn đều thấy<br /> có mặt chủng vi khuẩn tiêm vào. Giá trị LD50 của<br /> chủng V3 là thấp nhất với 1,78 x 103 tb/g thể trọng,<br /> trong khi LD50 chủng A là 1,58 x 104 tb/g thể trọng.<br /> <br /> b. LD50= 1,78 x 103cfu/g<br /> <br /> Hình 2. Độc lực của V. parahaemolyticus chủng V3(a) và A (b) trên cá mú<br /> <br /> 3. Thảo luận<br /> Vi khuẩn Vibrio có mặt khắp nơi trong môi<br /> trường nước và là một phần của hệ vi sinh vật vùng<br /> nước lợ, mặn. Chúng là tác nhân gây bệnh cho nhiều<br /> động vật sống trong nước (Austin và Austin, 1987).<br /> Vibrio alginolyticus, V. harveyi và V. carchariae<br /> đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh đường ruột<br /> của nhiều loài cá biển (Balebona và cs., 1998;<br /> Lee, 1995; Liu và cs., 2004ª and 2004b; Saeed,<br /> 1995; Yii và cs, 1997) nhưng có rất ít báo cáo<br /> V. parahaemolyticus gây bệnh cho cá biển, đặc<br /> biệt là trên cá mú, mặc dù chúng là tác nhân gây<br /> nhiều bệnh cho các đối tượng khác như bào ngư<br /> (Cai và cs., 2007; Liu và cs., 2000), tôm (Haldari và<br /> cs., 2007; Khuntia và cs., 2008), hầu (Lee và cs.,<br /> 2008). Tuy nhiên, chúng tôi phân lập được vi khuẩn<br /> V. parahaemolyticus (V3) từ thận cá mú chấm cam bị<br /> <br /> 182 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> bệnh lở loét. Bằng phương pháp SDS-PAGE trong<br /> điều kiện sốc nhiệt ở 950C trong 5 phút, thành phần<br /> protein của chủng V3 và chủng chuẩn đều tương<br /> tự nhau với khối lượng phân tử lần lượt là 97,4;<br /> 74; 61; 55; 33; 23,8; 19,7; 16,3 và 14,4 kDa. Kết<br /> quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Wong<br /> và Chen (2003) trên protein màng ngoài vi khuẩn<br /> V. parahaemolyticus, sau khi sốc nhiệt ở nhiệt độ<br /> 37 và 420C trong 1-2 giờ quan sát rõ các vạch protein có khối lượng phân tử 33; 55 và 61 kDa. Đây<br /> cũng là các protein đặc trưng cho loài vi khuẩn này<br /> và có tính kháng nguyên cao cần được nghiên cứu<br /> sâu hơn làm cơ sở chọn lựa kháng nguyên cho sản<br /> xuất vaccine tiểu phần chống lại bệnh Vibriosis ở<br /> cá biển. Ngoài ra, kết quả tiêm cảm nhiễm vi khuẩn<br /> để xác định độc lực cho thấy chủng V3 có giá trị<br /> LD50 là 1,78 x 103 tb/g thể trọng cá. Cá có dấu hiệu<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> bệnh lý trong thí nghiệm cũng giống với các dấu<br /> hiệu cá bệnh tự nhiên và khi đem phân lập lại vi<br /> khuẩn trên các mẫu cá yếu thấy sự có mặt của vi<br /> khuẩn này. Vì vậy, dựa theo tiêu chí xác định khả<br /> năng gây bệnh do vi khuẩn của Santos và cs (1988)<br /> có thể khẳng định chủng V3 có độc lực cao và là tác<br /> nhân gây bệnh lở loét ở cá mú. So sánh khả năng<br /> gây bệnh của vi khuẩn V. parahaemolyticus trên<br /> các loài cá khác cũng cho thấy sự sai khác nhau rất<br /> nhiều. Theo nghiên cứu của Li và cs (1999) cho thấy<br /> V. parahaemolyticus gây chết hàng loạt cá hồng<br /> bạc, Sparus sarba, ở nồng độ 108 tb/ml với các biểu<br /> hiện xuất huyết và lở loét. Hiện tượng này cũng bắt<br /> gặp ở cá sole, Solea senegalensis, (Zorrilla và cs.,<br /> 2003) và cá Iberian toothcarp, Aphanius iberus,<br /> (Alcaide và cs., 1999) ở Tây Ban Nha với giá trị<br /> LD50 lần lượt là 105 và 106 tb/cá. Tuy nhiên, kết quả<br /> nghiên cứu của chúng tôi, giá trị LD50 thấp hơn rất<br /> nhiều so với các kết quả trên. Sự sai khác này là do<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> các chủng khác nhau được phân lập từ các ký chủ<br /> và điều kiện sống khác nhau. Kết quả nghiên cứu<br /> cũng là cơ sở để chọn lựa chủng vi khuẩn để làm<br /> kháng nguyên cho nghiên cứu vaccine sau này.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> Vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 phân lập trên<br /> cá mú chấm cam bệnh lở loét có các đặc điểm<br /> sinh lý, sinh hóa và thành phần protein tương tự<br /> như chủng đối chứng ATCC 17802. Ngoài ra, chủng<br /> V3 có tính độc cao trên cá mú chấm cam trong cảm<br /> nhiễm nhân tạo với giá trị LD50 là 1,78 x 103 tế bào/g<br /> thể trọng cá.<br /> Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 cần<br /> được nghiên cứu sâu hơn về các thành phần<br /> protein chiếm ưu thế và protein có tính kháng<br /> nguyên cao để có căn cứ chọn lựa kháng nguyên<br /> sinh miễn dịch cao cho sản xuất vaccine tiểu phần<br /> trên cá mú.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ và Nguyễn Thị Thùy Giang, 2007. Nghiên cứu bệnh mòn vây, cụt đuôi ở cá mú<br /> Epinephelus spp nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, số 01/2008.<br /> 2. Phan Thị Vân, 2006. Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến đối với cá mú, cá giò nuôi và đề xuất các giải pháp phòng trị.<br /> Báo cáo đề tài, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Bộ Thủy sản, Hà Nội.<br /> Tiếng Anh<br /> 3. Alcaide,E., Amaro,C., Todoli,R., Oltra,R., 1999. Isolation and characterization of Vibrio parahaemolyticus causing infection<br /> in Iberian toothcarp Aphanius iberus. Dis Aquat Org. No.35: 77-80.<br /> 4. Austin,B., Austin,D.A., 1987. Vibrios. In: Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish, pp. 263-287.<br /> Chichester, England, Ellis Horwood Limited.<br /> 5. Balebona,M.C., Andreu,M.J., Bordas,M.A., Zorrilla,I., Morinigo,M.A., Borrego,J.J., 1998. Pathogenicity of Vibrio<br /> alginolyticus for cultured gilt-head sea bream (Sparus aurata). Appl. Environ. Microbiol. No. 64: 4269-4275.<br /> 6. Cai,J.P., Li,J., Thompson,K.D., Li,C.X., Han,H.C., 2007. Isolation and characterization of pathogenic Vibrio<br /> parahaemolyticus from diseased post-larvae of abalone Haliotis diversicolor supertexta. Journal of Basic Microbiology. No.<br /> 47: 84-86.<br /> 7. Cruz-Lacierda,E.R., Lester,R.J.G., Eusebio,P.S., Marcial,H.S., Pedrajas,S.A., 2001. Occurrence and histopathogenesis<br /> of a didymozoid trematode (Gonapodasmius epinepheli) in pond-reared orange-spotted grouper, Epinephelus coioides.<br /> Aquaculture. No. 201: 211-217.<br /> 8. Cruz-Lacierda,E.R., Toledo,J.D., Tan-Fermin,J.D., Burreson,E.M., 2000. Marine leech (Zeylanicobdella arugamensis)<br /> infestation in cultured orange-spotted grouper, Epinephelus coioides. Aquaculture. No 185: 191-196.<br /> 9. Haldari,S., Chatterjee,S., Asakura,M., Viayakumaran,M., Yamasak,S., 2007. Isolation of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio<br /> cholerae (Non-O1 and 0139) from moribund shrimp (Penaeus monodon) and experimental challenge study against post<br /> larvae and juveniles. Annals of Microbiology. No 57: 55-60.<br /> 10. Hegde,A., Chen,C.L., Qin,Q.W., Lam,T.J., Sin,Y.M., 2002. Characterization, pathogenicity and neutralization studies of a<br /> nervous necrosis virus isolated from grouper, Epinephelus tauvina, in Singapore. Aquaculture. No 213: 55-72.<br /> 11. Khuntia,C.P., Das,B.K., Samantaray,B.R., Samal,S.K., Mishra,B.K., 2008. Characterization and pathogenicity studies of<br /> Vibrio parahaemolyticus isolated from diseased freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii . Aquaculture Research. No<br /> 39: 301-310.<br /> 12. Laemmli,U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. No 227:<br /> 680-685.<br /> 1.<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 183<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 4/2012<br /> <br /> 13. Lee,J.K., Jung,D.W., Eom,S.Y., Oh,S.W., Kim,Y.J., Kwak,H.S., Kim,Y.H., 2008. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus in<br /> oysters from Korean retail outlets. Food Control. No 19: 990-994.<br /> 14. Lee,K.K., 1995. Pathogenesis Studies on Vibrio alginolyticus in the Grouper, Epinephelus malabaricus, Bloch-Et-Schneider.<br /> Microbial Pathogenesis. No 19: 39-48.<br /> 15. Leong,T.S., Wong,S.Y., 1988. A comparative study of the parasite fauna of wild and cultured grouper (Epinephelus<br /> malabaricus Bloch et Schneider) in Malaysia. Aquaculture. No 68: 203-207.<br /> 16. Li,J., Yie,J., Foo,R.W.T., Ling,J.M.L., Xu,H.S., Woo,N.Y.S., 1999. Antibiotic resistance and plasmid profiles of vibrio<br /> isolates from cultured silver sea bream, Sparus sarba. Marine Pollution Bulletin. No 39 : 245-249.<br /> 17. Lin,C.C., Lin,J.H.-Y., Chen,M.S., Yang,H.L., 2007. An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity<br /> in larvae of grouper (Epinephelus coioides). Aquaculture. No 268: 265-273.<br /> 18. Liu,P.C., Chen,Y.C., Huang,C.Y., Lee,K.K., 2000. Virulence of Vibrio parahaemolyticus isolated from cultured small<br /> abalone, Haliotis diversicolor supertexta, with withering syndrome. Letters in Applied Microbiology. No 31: 433-437.<br /> 19. Liu,P.C., Lin,J.Y., Chuang,W.H., Lee,K.K., 2004a. Isolation and characterization of pathogenic Vibrio harveyi (V-carchariae)<br /> from the farmed marine cobia fish Rachycentron canadum L. with gastroenteritis syndrome. World Journal of Microbiology<br /> & Biotechnology. No 20: 495-499.<br /> 20. Liu,P.C., Lin,J.Y., Hsiao,P.T., Lee,K.K., 2004b. Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from<br /> diseased, cobia Rachycentron canadum. Journal of Basic Microbiology. No 44: 23-28.<br /> 21. Nguyễn Thị Thanh Thùy và Nguyễn Hữu Dũng, 2008. Ulcerative disease in cultured grouper in Khanh Hoa province, Viet<br /> Nam. Aquaculture Asia Pacific. No 4: 27-29.<br /> 22. Ong,B., 1988. Characteristics of bacteria isolated from diseased groupers, Epinephelus salmoides. Aquaculture. No 73: 7-17.<br /> 23. Reed,L.J., Muench,H., 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. No<br /> 27: 493-497.<br /> 24. Sadovy, Y., 2000. Regional survey of fry/fingerling supply and current practices for grouper mariculture: evaluating current<br /> status and long term prospects for grouper mariculture in Southeast Asia. University of Hong Kong, Hong Kong SAR, China,<br /> 120 pp.<br /> 25. Saeed,M.O., 1995. Association of Vibrio harveyi with mortalities in cultured marine fish in Kuwait. Aquaculture. No 136:<br /> 21-29.<br /> 26. Santos,Y., Toranzo,A.E., Barja,J.L., Nieto,T.P., Villa,T.G., 1988. Virulence properties and enterotoxin production of<br /> Aeromonas strains isolated from fish. Infect. Immun. No 56: 3285-3293.<br /> 27. Switzer,R.C., Merril,C.R., Shifrin,S., 1979. Highly Sensitive Silver Stain for Detecting Proteins and Peptides in<br /> Polyacrylamide Gels. Analytical Biochemistry. No 98: 231-237.<br /> 28. Wong H.C., Y.C. Chen, 2003. Analysis of the envelope proteins of heat-shocked Vibrio parahaenolyticus cells by<br /> immunoblotting and biotin-labeling method. Microbiol and Immunology. No 47: 313-319.<br /> 29. Yii,K.C., Yang,T.I., Lee,K.K., 1997. Isolation and characterization of Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis<br /> in the groupers, Epinephelus coioides. Current Microbiology. No 35: 109-115.<br /> 30. Zorrilla,I., Arijo,S., Chabrillon,M., Diaz,P., Martinez-Manzanares,E., Balebona,M.C., Igo,M.A., 2003. Vibrio species<br /> isolated from diseased farmed sole, Solea senegalensis (Kaup), and evaluation of the potential virulence role of their<br /> extracellular products. Journal of Fish Diseases. No 26: 103-108.<br /> <br /> 184 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br />