Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của cao chiết diếp cá houttuynia cordata

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Qua khảo sát sàng lọc các cây có tác dụng chống oxy hóa với 3 phân đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo độ phân cực của các chất có trong cây trong nghiên cứu cho thấy kết quả cao methanol của cây diếp cá có tác dụng chống oxy hóa mạnh trên mô hình sàng lọc tác dụng chống oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của cao chiết diếp cá houttuynia cordata

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN EX VIVO CỦA CAO CHIẾT DIẾP CÁ HOUTTUYNIA CORDATA Nguyễn Thị Phương Hạnh*, Võ Văn Giàu*, Huỳnh Ngọc Thụy* TÓM TẮT: Giới thiệu: Qua khảo sát sàng lọc các cây có tác dụng chống oxy hóa với 3 phân đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo độ phân cực của các chất có trong cây trong nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả cao methanol của cây diếp cá có tác dụng chống oxy hóa mạnh trên mô hình sàng lọc tác dụng chống oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)(3). Do đó cao methanol của cây diếp cá được dùng để kiểm tra tác dụng bảo vệ gan ex vivo, nếu cao này có tác dụng sẽ được tiếp tục thử nghiệm trên mô hình in vivo.Việc sàng lọc tác dụng làm hạ men gan, bảo vệ tế bào gan sẽ được triển khai trên dòng tế bào gan chuột tách ra và nuôi cấy theo PP Kiso(2) sau đó bị gây độc bằng CCl4. Đánh giá mức độ thương tổn tế bào gan và đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết ở các nồng độ khác nhau qua kết quả đo hoạt lực men gan. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sử dụng mô hình tách tế bào gan chuột của Kiso(2) đã có thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Tế bào đơn sau khi tách được ủ phục hồi với thời gian 2 h trong môi trường EMEM có bổ sung một số chất cần thiết cho tế bào, sau đó gây độc tế bào bằng CCl4 1,5% trong thời gian 45‘ làm tăng cao hoạt độ của enzym ALT trong môi trường. Tiến hành thử nghiệm tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao chiết methanol từ cây diếp cá (Houytuynia cordata) trên mô hình gây tổn thương tế bào gan bằng carbon tetrachlorid (CCl4) (ex vivo) với các tế bào mới tách và nuôi cấy. Kết quả: Kết quả thử nghiệm cho thấy các nồng độ khác nhau của cao chiết methanol lá diếp cá đều có tác dụng hạ men gan, bảo vệ tế bào. Kết luận: Từ các kết quả thu được sơ bộ kết luận cao chiết methanol của lá diếp cá có tác dụng quả trong việc làm hạ men gan khi tế bào gan bị gây nhiễm độc CCl4. Từ khóa: tế bào gan, diếp cá, CCl4, tác dụng bảo vệ gan. ABSTRACT HEPATOPROTECTIVE ACTIVITIES OF HOUTTUYNIA CORDATA EXTRACT ON CARBON TETRACHLORIDE INDUCED HEPATOTOXICITY EX VIVO Nguyen Thi Phuong Hanh, Vo Van Giau, Huynh Ngoc Thuy * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 622 - 627 Introduction. Houttuynia cordata Thunb. is a medicinal herb that generally be used in Vietnamese traditional medicine. Many studies have shown that flavonoids exhibited a wide range of biological or physiological effects including anti-inflammatory, anti-allergic, and anti-cancer activities. However, no reports to be discussed about the relationship between the levels of H. cordata flavonoids and its biological characteristics. Method: In our present study, the hepatoprotective activities of the Houttuynia cordata extracts with different solvents were performed on carbon tetrachloride (CCl4) induced cytotoxicity model modified by Kiso procedure. Suspension of isolated mouse hepatocytes was incubated in EMEM medium under a 95% O2 and 5% CO2, 37 oC in 2h before the addition of 1.5% CCl4 and incubated in 45 min. CCl4 administration significantly * ĐH Ton Duc Thang; * BM. Dược liệu – Khoa Dược - ĐH Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS. Huỳnh Ngọc Thụy ĐT: 0902373986 Email: huynhthuyth@gmail.com 622 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học increased serum alanine aminotransferase (ALT) activity, a biochemical marker of hepatocyte injury, in medium. Results:the methanol extract of Houttuynia cordata have reduced the level of ALT and protected mice liver cells at a concentration of 0.05 mg/ml. Conclusion: the methanol extract of Houttuynia cordata have reduced the level of ALT and protected mice liver cells. Key words: hepatocyte, Houttuynia cordata, CCl4, hepatoprotective activity. nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả cao ĐẶT VẤN ĐỀ methanol của cây diếp cá có tác dụng chống oxy Bệnh gan là một trong những vấn đề thường hóa mạnh trên mô hình sàng lọc tác dụng chống gặp trong cộng đồng. Có nhiều loại bệnh gan oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)(3) trong đó bệnh thường gặp là những tổn thương và tác dụng chống oxy hóa thì có liên quan đến gan gây ra bệnh viêm gan dẫn đến xơ gan và việc phòng ngừa và chữa trị nhiều loại bệnh tật ung thư gan cuối cùng là gây tử vong với trong đó có tác dụng chữa bệnh viêm gan. Do đó nguyên nhân chủ yếu là do virút và nhiễm độc. cao methanol của cây diếp cá được dùng để Phần lớn các chất gây độc cho gan chủ yếu do kiểm tra tác dụng bảo vệ gan ex vivo, nếu cao superoxid hóa lipid và các thương tổn khác do này có tác dụng sẽ được tiếp tục thử nghiệm stress oxy hóa(1). trên mô hình in vivo. Hiện nay các phương pháp thử nghiệm in Việc sàng lọc tác dụng làm hạ men gan, bảo vitro được dùng phổ biến để sàng lọc ban đầu vệ tế bào gan sẽ được triển khai trên dòng tế bào các cao chiết, phân đoạn chiết của dược liệu hoặc gan chuột tách ra và nuôi cấy theo phương pháp của các chất tinh khiết vì các phương pháp này Kiso(2) sau đó bị gây độc bằng CCl4. CCl4 là một có thể sàng lọc được một lượng lớn mẫu trong chất độc được sử dụng phổ biến trong mô hình thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử thử nghiệm gây tổn thương gan in vitro và in vivo. dụng nhỏ và kết quả có độ lặp lại cao. Phương Chất này gây nên sự xơ hóa gan và làm thay đổi pháp sàng lọc in vitro có nhiều mô hình khác các chỉ số sinh hóa của gan với các triệu chứng nhau được sử dụng trên thế giới. Trong nghiên tương tự với viêm gan do virút cấp tính(3,4). Khi tế cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách tế bào bị tổn thương các enzym transaminsase như bào đơn từ gan thú vật thử nghiệm(2) nhưng có ALT, AST tiết ra môi trường làm cho hoạt độ ALT những khảo sát thay đổi trong bước tiến hành đo được trong môi trường tăng. Đánh giá mức độ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thương tổn tế bào gan và đánh giá hoạt tính bảo của chúng tôi. Sử dụng các tế bào đơn tách và vệ gan của cao chiết ở các nồng độ khác nhau qua nuôi cấy được, tiến hành sàng lọc tác dụng làm kết quả đo hoạt lực men gan. hạ men gan trên mô hình tế bào gan bị nhiễm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP độc bởi carbon tetrachlorid (CCl4), đối tượng thử nghiệm là cây diếp cá (Houttuynia cordata Hóa chất Blume), một dược liệu được sử dụng phổ biến Type I collagenase (Gibco), dimethyl chỉ với tác dụng cầm máu, trị trĩ, tác dụng bảo sulfoxide (DMSO) và trypan blue (Merck), vệ gan của dược liệu này thì vẫn chưa được chú Phosphate Buffered Saline (PBS; Oxoid); ý. Albumin huyết thanh bò, Môi trường Eagle's Cây diếp cá có tác dụng trị bệnh trĩ, kháng minimal essential medium (E’MEM), huyết khuẩn. Gần đây, trong việc tìm kiếm, sàng lọc thanh bào thai bò, dexamethasone, insulin các cây có tác dụng chống oxy hóa với 3 phân (Sigma). Kit thử alanine aminotransferase (ALT) đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo của Diagnosticum Zrt. Các hóa chất khác đạt độ phân cực của các chất có trong cây trong tiêu chuẩn cho thí nghiệm phân tích. Chuyên Đề Dược Khoa 623 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Đối tượng nghiên cứu Cây diếp cá được thu mua ở Bình dương, thành phố Hồ Chí Minh. Bộ phận dùng là phần trên mặt đất. Mẫu được xác định bằng việc khảo sát đặc điểm hình thái thực vật học dựa trên quan sát cây tươi. Dược liệu được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khô, xay nhỏ làm nguyên liệu cho chiết xuất. Chuột nhắt trắng (chủng Swiss albino) 20 – 25 g được mua từ viện Vacxin và sinh phẩm Y tế Nha Trang, được nuôi tại phòng thí nghiệm Dược lý – Khoa Dược – trường ĐH Y Dược TP. HCM. Khảo sát nồng độ CCl4 và thời gian ủ tế bào thích hợp Tiến hành thăm dò nồng độ CCl4 tối thiểu có thể dùng gây độc tế bào, phóng thích enzym gan đủ để khảo sát sự thay đổi của enzym trong quá trình thử nghiệm. Pha CCl4 với 1% DMSO và nước cất để có dãy nồng độ CCl4 1,0%; 1,5% và 2,0%. Chọn nồng độ CCl4 thích hợp để sử dụng cho thử nghiệm. Thăm dò thời gian ủ tế bào với CCl4 thích hợp, dò tìm thời điểm hoạt độ men gan tăng cao nhất bằng cách tiến hành ủ tế bào trong thời Phương pháp nghiên cứu gian 90 phút, trong thời gian ủ, cứ mỗi 15 phút Chuẩn bị mẫu thử hút dịch nuôi cấy đi đo hoạt lực enzym ALT trên 50 g dược liệu ngâm trong dichloromethan 24 tiếng sau đó đun hồi lưu cách thủy ở nhiệt độ 40 oC trong 3 giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến khi giọt dịch chiết không để lại cắn. Gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi để thu cao dichloromethan. Bã dược liệu được loại sạch dung môi và tiếp tục chiết bằng cách đun hồi lưu cách thủy bã dược liệu với dung môi methanol ở 60 oC trong 3 giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến khi giọt dịch chiết không để lại cắn, gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi để thu được cao methanol. tất cả mẫu. Chọn thời điểm mà hoạt lực enzym cao nhất để làm thí nghiệm. Thử nghiệm sàng lọc tác dụng làm hạ men gan của cao chiết diếp cá trên mô hình tế bào gan chuột nhiễm độc CCl4 Tế bào gan chuột sau khi tách được ủ phục hồi trong 2h ở điều kiện nêu trên, sau đó tiến hành gây độc tế bào bằng CCl4 và bổ sung cao chiết diếp cá (mẫu thử) vào các ống đựng tế bào sao cho nồng độ cuối cùng của mẫu thử trong ống đựng tế bào đạt các nồng độ mong muốn Tách tế bào gan khác nhau để kiểm tra hoạt độ men gan ALT. Theo phương pháp của Kiso và cộng sự (1983)(2). Tiến hành khảo sát phương pháp với một số thay đổi cho phù hợp điều kiện của phòng thí nghiệm tại chỗ. Tiến hành song song các thử nghiệm là mẫu Tế bào đơn sau khi tách đáp ứng được mật độ tế bào tối thiểu (>105 tế bào/ml) sẽ được hòa trong môi trường E’MEM bổ sung huyết thanh bào thai bò (10%), dexamethasone (10-6 M), insulin (10-8 M), gentamicin (50 µg/L) rồi chia đều vào các ống (vial) 0,5 ml và ủ ở điều kiện 95% O2 và 5% CO2, 37 0C trong 2 giờ để tế bào phục hồi sau quá trình tách. nhiều lần (N=10) với n =6 cho mỗi lần thử 624 chứng trắng không gây độc và mẫu gây độc nhưng không dùng thuốc thử nghiệm để đánh giá so sánh kết quả. Các thử nghiệm được lặp lại nghiệm. (N=số chuột sử dụng tách tế bào gan; n=số ống tế bào sử dụng cho mỗi mẫu)w Đánh giá kết quả Đo hoạt tính của men gan ALT theo hướng dẫn cách đo của nhà sản xuất (Diagnosticum). Kết quả được đánh giá theo chương trình phân tích thống kê dữ liệu của phần mềm Exel. Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chuẩn hóa quy trình tách và nuôi cấy tế bào Tiến hành tách tế bào gan chuột theo phương pháp tách tế bào gan chuột của Kiso và cộng sự(3), tuy nhiên việc bơm rửa gan bằng đường tĩnh mạch chủ trên không thực hiện được và bơm rửa gan bằng dung dịch có bổ sung collagenase cũng không thể thực hiện do phải sử dụng lượng khá lớn collagenase. Chúng tôi đã tiến hành thăm dò thay đổi một số bước thực hiện cho phù hợp với điều kiện có được trong phòng thí nghiệm hiện tại và rút ra qui trình cụ thể như sau: Chuột khi đạt đến trọng lượng yêu cầu (20 – 25g) sẽ được gây mê bằng ether và mở ổ bụng để bộc lộ các cơ quan bên trong, các cơ quan của hệ tiêu hóa như dạ dày, ruột được kéo sang một bên để có thể quan sát tĩnh mạch cửa gan. Dùng kim cong có chỉ luồn qua tĩnh mạch chủ và cột cố định tĩnh mạch chủ phía trên ngực. Cắt tĩnh mạch chủ dưới tại vị trí tĩnh mạch dưới thận để tạo đường thoát dịch cho việc bơm rửa gan. Đâm kim luồn vào trong tĩnh mạch cửa gan, dùng chỉ cột cố định ống luồn với tĩnh mạch cửa. Bơm PBS vào ống luồn tĩnh mạch để rửa gan. Rửa cho đến khi gan chuyển sang màu vàng nhạt hoặc cho đến khi dung dịch PBS chảy ra từ tĩnh mạch thân dưới không còn màu đỏ. Gan sau khi được rửa sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được giữ trong dung dịch PBS có chứa kháng sinh rồi nhanh chóng chuyển vào tủ cấy vô trùng. Tại đây gan sẽ được rửa lại bằng PBS không có chứa kháng sinh. Gan được ngâm ngập trong dung dịch collagenase 0,075%, lắc 100 vòng/phút bằng máy lắc trong 5 phút ở 37oC. Dùng 2 kẹp nhẹ nhàng vuốt từng lá gan phân tán các tế bào (luôn luôn giữ các lá gan chìm trong dung dịch collagenase 0,075%). Kết quả đạt được sau quá trình này là tạo hỗn dịch trắng đục. Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Hỗn dịch này được tiếp tục lắc trong 10 phút (100 vòng/phút) ở 37oC trong dung dịch collagenase. Cốc đựng hỗn dịch được để tủ lạnh 15 phút. Lọc qua gạc-cotton vô trùng. Sau đó thu lấy dịch chứa tế bào đơn, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 37 oC. Thu lấy cặn tế bào. Rửa cặn tế bào bằng dung dịch PBS không có chứa kháng sinh để loại bỏ collagenase. Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 37 0C thu lấy cặn tế bào. Quá trình này lặp lại từ 3 – 5 lần nếu còn hồng cầu. (Rửa – lọc – ly tâm) Xác định mật độ tế bào và tỷ lệ sống chết bằng cách nhuộm tế bào bằng trypan blue 0.4%. Sau khi nhuộm tế bào bằng trypan blue, đếm tế bào chết, ghi nhận tế bào sống trên buồng đếm Neubauer. Kết quả cho thấy tế bào gan với tỉ lệ sống cao được trình bày trong bảng 1. Thêm môi trường nuôi EMEM có bổ sung 10% huyết thanh bê, 10-7 M insulin, 1% DMSO vào trong tế bào. Ủ tế bào 2 giờ trong tủ ủ ở điều kiện 37 oC, 5% CO2/95% O2. Tế bào tách được sẽ tiếp tục được sử dụng nghiên cứu theo các hướng khác nhau. Việc chuẩn hóa quá trình phân lập và tách tế bào gan đã được thay đổi một số bước như sau: Bỏ qua giai đoạn truyền men collagenase vào buồng gan thay vào đó là ngâm hẳn buồng gan trong một thể tích dung dịch men Collagenase nhất định trong thời gian nhất định. Kết hợp thời gian ngâm buồng gan trong dung dịch men và thời gian lắc tiếp xúc men với tế bào gan, giảm thời gian tách tế bào. So sánh với qui trình của Kiso, qui trình này có những ưu điểm sau: Do bỏ qua giai đoạn truyền collagenase liên tục vào buồng gan, tiến hành ngâm thẳng buồng gan và tế bào gan sau khi đã được phân tán vào dung dịch men collagenase nên. - Giảm đáng kể lượng collagenase sử dụng mà vẫn bảo đảm sự tiếp xúc của men với các tế bào gan đã phân tán trong thời gian nhất định. - Giảm đáng kể chi phí cho thử nghiệm. 625 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 - Đơn giản hóa qui trình như: bỏ qua giai đoạn cột rửa tĩnh mạch cửa trên (phức tạp, khó thực hiện và kéo dài thời gian tách tế bào). - Thời gian thực hiện nhanh từ 10-15 phút (thay vì 30-45 phút) nên hạn chế tỷ lệ tế bào gan bị chết. Collagenase là enzym thuỷ phân các liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc trưng cho vùng xoắn của collagen. Theo quy trình Kiso2, việc truyền thẳng trực tiếp collagenase vào buồng gan chỉ là một giai đoạn rất ngắn, nhưng gây tốn kém men mà sau đó vẫn phải cho tiếp xúc men với tế bào gan đã được phân tán, chúng tôi gộp giai đoạn nhưng vẫn bảo đảm hiệu quả tách được tế bào gan thể hiện qua kết quả thử nghiệm. Các thử nghiệm cho thấy kết quả có tính lặp lại, mật độ tế bào tách cao và ổn định. Nhận xét bước rửa gan là rất quan trọng. Nếu rửa gan không kỹ thì hồng cầu còn nhiều dẫn đến việc phải lặp lại nhiều lần giai đoạn rửa gan, điều này dẫn đến tỉ lệ tế bào gan chết cao, mật độ tế bào sống thấp. Bảng 1. Kết quả tách tế bào đơn bằng enzym collagenase type I Lần thực hiện Mật độ tế bào Số tế bào sống Tỷ lệ (%) (tế bào/ml) (tế bào/ml) 5 Lần 1 79,7.10 77,8.105 97.6 Lần 2 88,1.105 83,6.105 94.9 Lần 3 59,3.105 54,6.105 92.1 Trung bình 75,7.105 71,9.105 94.8 Khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 và thời gian thích hợp ủ tế bào với CCl4 Kết quả khảo sát việc sử dụng các nồng độ CCl4 khác nhau (1,0; 1,5; 2,0%) và tìm thời gian ủ thích hợp trong khoảng thời gian 90 phút được trình bày trong hình 1. Kết quả cho thấy ở nồng độ 1,0 và 1,5%, lượng men gan tiết ra môi trường tăng theo thời gian ủ từ 15 đến 45 phút và giảm dần ở thời gian 75 phút và 90 phút trong khi ở nồng độ 2,0 % CCl4, hoạt độ men gan tăng dần trong khoảng 15-30 phút và giảm dần trong khoảng 45-90 phút. Hoạt độ men gan đo được cao nhất và ổn định nhất là ở nồng độ CCl4 1,5% với thời gian 45 phút. 626 ALT 500 (IU/L) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 CCl4 1,0% CCl4 1,5% CCl4 2,0% 20 40 60 80 100 Thời gian ủ CCl4 (phút) Hình 1. Ảnh hưởng của nồng độ CCl4 và thời gian ủ đến sự thay đổi men gan của môi trường nuôi tế bào Với kết quả 3 ở trên, chọn nồng độ gây độc của CCl4 là 1,5% và thời gian gây độc tế bào là 45 phút làm thông số để thực hiện thí nghiệm sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình ex vivo Sàng lọc tác dụng hạ men gan trên mô hình tế bào gan chuột bị nhiễm độc CCl4 Tác dụng bảo vệ gan của cao methanol chiết từ cây diếp cá được trình bày trong hình 2. 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Kết quả hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết H.cordata UI/l Nghiên cứu Y học Lô trắng Lô độc Lô thử 1 Lô thử 2 Lô thử 3 Lô thử 4 Lô chứng trắng: tế bào chưa bị nhiễm độc; Lô chứng độc: tế bào bị gây độc bởi CCl4; Lô 1,2,3,4: lô thử nghiệm có dùng thuốc sau khi gây độc thứ tự ở các nồng độ 0,05; 0,1; 0,25 và 0,5 mg/ml Hình 2.Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của cao chiết cây diếp cá ở các nồng độ khác nhau Lô độc cho kết quả hoạt độ men gan là 644 ± 23 UI/l, tăng 14,67 lần so với nhóm chứng trắng (tế bào trước khi ủ CCl4) là 361.6 UI khi ủ tế bào gan ở nồng độ 1,5% CCl4 trong khoảng thời gian 45 phút. Kết quả cho thấy lô thử ở các nồng độ khác nhau của cây diếp cá (0,05; 0,1; 0,25 và 0,5 mg/ml) đều có tác dụng làm hạ men gan, bảo vệ Chuyên Đề Dược Khoa