Thu nhận enzyme cellulase và xylanase từ giá thể trồng nấm sau thu hoạch và thử nghiệm xử lý rơm rạ

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 84-90<br /> <br /> THU NHẬN ENZYME CELLULASE VÀ XYLANASE TỪ GIÁ THỂ TRỒNG NẤM<br /> SAU THU HOẠCH VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ RƠM RẠ<br /> Hoàng Quốc Khánh*, Ngô Đức Duy, Đào Thị Thu Hiền, Mai Kim Rí<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)hoangqk@gmail.com<br /> TÓM TẮT: Cellulase và xylanase thu nhận từ giá thể sau thu hoạch của các loại nấm bào ngư, linh chi,<br /> hầu thủ, và nấm rơm từ các trại trồng nấm ở miền Tây Nam bộ. Hoạt tính cellulase của nấm bào ngư trắng<br /> là 39,603 UI/g, bào ngư Nhật Bản 30,635 UI/g, bào ngư xám 16,707 UI/g, hầu thủ 86,151 UI/g, linh chi<br /> 84,682 UI/g, nấm rơm 0,754. Hoạt tính xylanase của nấm bào ngư trắng là 75,762 UI/g, bào ngư Nhật Bản<br /> 48,118 UI/g, bào ngư xám 29,032 UI/g, hầu thủ 52,778 UI/g, linh chi 69,899 UI/g, nấm rơm 3,226. Điều<br /> kiện pH và nhiệt độ tối ưu cho cellulase của hầu hết các mẫu nấm là trong khoảng pH 5,0-6,0 và 50oC60oC. Enzyme cellulase và xylanase thu nhận từ giá thể trồng nấm được ứng dụng để thủy phân rơm rạ tạo<br /> đường trong những điều kiện thủy phân tối ưu như sau: thời gian thủy phân 1 giờ, pH 5,0, nhiệt độ 50oC<br /> đối với nấm bào ngư và hầu thủ, nấm linh chi là 60oC; nồng độ rơm rạ ban đầu là 3%. Lượng đường thu<br /> được từ sự thủy phân rơm rạ của hệ enzyme cellulase và xylanase của nấm linh chi là 10,486 mg/ml, hầu<br /> thủ 10,117 mg/ml, bào ngư trắng 4,649 mg/ml, bào ngư Nhật 2,775 mg/ml, bào ngư xám 1,261 mg/ml.<br /> Từ khóa: bào ngư, enzyme cellulase, hầu thủ, linh chi, rơm rạ, xylanase.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Các loài nấm ăn được biết đến rất nhiều vì<br /> giá trị dinh dưỡng cao của chúng đối với con<br /> người. Trong quá trình sinh trưởng trên những<br /> giá thể có nguồn gốc lignocellulose, nấm ăn<br /> thường sản sinh ra hệ enzyme lignocellulase<br /> ngoại bào (cellulase, xylanase, lignin peroxidase,<br /> laccasse, manganase peroxidase...), có vai trò<br /> phân hủy các cấu trúc lignocellulose thành những<br /> cấu trúc đơn giản hơn như các phân tử đường<br /> glucose, xylose... dễ hấp thu làm nguồn dinh<br /> dưỡng. Vì vậy, từ những giá thể trồng nấm sau<br /> thu hoạch có chứa nhiều enzyme lignocellulase,<br /> người ta có thể thu nhận lại hệ enzyme này để sử<br /> dụng cho những mục đích khác, đồng thời<br /> enzyme lignocellulase từ nấm lớn cũng rất an<br /> toàn khi dùng trong công nghệ thực phẩm<br /> [1, 2].<br /> Việt Nam là nước nông nghiệp với nguồn<br /> phụ phế phẩm giàu chất xơ hết sức phong phú,<br /> nhất là nghề trồng lúa hàng năm thải ra ước<br /> chừng 40 triệu tấn rơm rạ. Trong rơm rạ,<br /> cellulose và hemicellulose là thành phần hữu cơ<br /> chiếm tỷ lệ rất cao và rất khó bị phân hủy bởi cấu<br /> trúc phức tạp của nó. Hai thành phần này nếu<br /> được thủy phân sẽ tạo thành những cấu trúc<br /> đường đơn có giá trị kinh tế và có thể ứng dụng<br /> trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tuy nhiên, việc<br /> phân hủy cellulose và hemicellulose bằng<br /> <br /> 84<br /> <br /> phương pháp vật lý và hóa học rất tốn kém và<br /> gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc<br /> xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng<br /> công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng enzym<br /> cellulase và xylanase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ<br /> có nhiều ưu điểm về mặt kỹ thuật, kinh tế và môi<br /> trường [3, 4].<br /> Từ vài thập kỷ gần đây, trên thế giới có rất<br /> nhiều nghiên cứu về các enzym thủy phân<br /> cellulose và hemicellulose, nhưng chủ yếu là<br /> enzym có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và<br /> vi khuẩn [8, 10]. Trong khi đó, hoạt tính enzym<br /> của ngành nấm lớn như thế nào so với enzym có<br /> nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn hay vi khuẩn<br /> hiện nay vẫn chưa được các nhà nghiên cứu đặc<br /> biệt quan tâm.<br /> Vì những lí do trên, nghiên cứu này được<br /> tiến hành nhằm thu nhận enzyme cellulase,<br /> xylanase từ giá thể trồng nấm sau thu hoạch và<br /> ứng dụng trong xử lý rơm rạ với hy vọng qua<br /> quá trình nghiên cứu và thực nghiệm chúng tôi<br /> sẽ thu được chế phẩm enzyme từ nấm ăn có<br /> hoạt tính cao, làm tăng giá trị kinh tế cho nghề<br /> trồng nấm, đồng thời tận dụng và xử lý nguồn<br /> phụ phẩm rơm rạ sẵn có của địa phương.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Rơm rạ được tiền xử lý bằng NaOH; giá thể<br /> <br /> Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Mai Kim Ri<br /> <br /> trồng nấm bào ngư trắng, bào ngư Nhật Bản,<br /> bào ngư xám, hầu thủ, linh chi và nấm rơm sau<br /> khi thu hoạch được lấy từ các trại trồng nấm ở<br /> các tỉnh Tiền Giang, An Giang, Đồng Tháp,<br /> Cần Thơ và tp. Hồ Chí Minh.<br /> Mẫu nấm được kí hiệu như sau: bào ngư<br /> trắng: BT; bào ngư Nhật Bản: BN; bào ngư xám:<br /> BX; hầu thủ: HT; linh chi: LC; nấm rơm: NR.<br /> Phương pháp<br /> Xác định hoạt tính cellulase và xylanase<br /> Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ<br /> chất CMC và xylan bởi cellulase và xylanase ở<br /> pH 5,0 và 40oC. Lượng đường khử sinh ra phản<br /> ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid<br /> (DNSA) cho dung dịch có màu vàng cam. Dung<br /> dịch màu này được xác định bằng phương pháp<br /> so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530<br /> nm. Lượng đường khử tạo ra được xác định từ<br /> đường chuẩn glucose và xylose được xây dựng<br /> trước [7].<br /> Đơn vị hoạt tính cellulase/xylanase (UI/g)<br /> được xác định như là lượng enzyme phân giải<br /> tạo ra lượng đường khử tương đương với 1 µg<br /> glucose/xylose trong một phút ở điều kiện pH 5,<br /> 40oC.<br /> Xác định hàm lượng protein<br /> Hút 1 ml mẫu vào trong ống nghiệm, tiếp theo<br /> thêm 2 ml thuốc thử coomassie, lắc đều. Đo độ<br /> hấp thu trên máy quang phổ Hewlett-Packard<br /> 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations<br /> ở bước sóng 595 nm [1].<br /> Hàm lượng protein (µg/ml) trong mẫu được<br /> xác định từ đường chuẩn albumin.<br /> Khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình<br /> thủy phân rơm rạ<br /> Bố trí thí nghiệm<br /> Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính cellulase,<br /> xylanase thu nhận được từ các giá thể trồng nấm<br /> Thu nhận cellulase và xylanase thô từ giá<br /> thể trồng nấm sau thu hoạch, tiếp theo đem kết<br /> tủa với cồn 99% để loại bỏ tạp chất và thu nhận<br /> lại enzyme dạng bán tinh, sau đó đem xác định<br /> hoạt tính cellulase và xylanase, và hàm lượng<br /> protein của mẫu.<br /> Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến<br /> hoạt tính của cellulase và xylanase thí nghiệm<br /> <br /> Thu nhận enzyme thô của mẫu lần lượt với<br /> các loại đệm có pH khác nhau: 2,2; 3; 4; 5; 6; 7;<br /> 8 và xác định hoạt tính cellulase và xylanase.<br /> Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ<br /> đến hoạt tính của cellulase và xylanase thí<br /> nghiệm<br /> Dựa trên pH tối ưu được chọn ở thí nghiệm<br /> 2 cho phản ứng để xác định hoạt tính cellulase<br /> và xylanase ở nhiệt độ: 40oC; 45oC; 50oC; 55oC;<br /> 60oC; 70oC.<br /> Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời<br /> gian đến khả năng đường hóa rơm rạ đã qua<br /> xử lý của enzyme thí nghiệm<br /> Cho 2 g rơm rạ đã xử lý bằng NaOH phản<br /> ứng với 50 ml dịch enzyme thô, ủ trên máy lắc<br /> với nhiệt độ 40 oC và xác định hàm lượng<br /> đường khử được giải phóng trong phản ứng<br /> theo thời gian 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ,<br /> 8 giờ và 24 giờ.<br /> Thí nghiệm 5: Khảo sát pH và nhiệt độ tối ưu<br /> cho khả năng thủy phân rơm rạ đã qua xử lý<br /> của enzyme thí nghiệm.<br /> Dựa vào kết quả thí nghiệm 2, 3 và 4 để<br /> thiết lập các điều kiện (thời gian, pH, nhiệt độ)<br /> cho quá trình thủy phân.<br /> Cân 0,2 g rơm rạ đã xử lý cùng với 5 ml<br /> dịch enzyme thô với pH vừa thiết lập, ủ trên<br /> máy lắc ở nhiệt độ vừa thiết lập, thời gian thủy<br /> phân được chọn ở thí nghiệm 2. Xác định hàm<br /> lượng đường khử.<br /> Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nồng<br /> độ rơm rạ đến khả năng thủy phân của enzyme<br /> thí nghiệm<br /> Rơm rạ với những hàm lượng khác nhau:<br /> 0,05 g; 0,1 g, 0,15 g; 0,2 g; 0,25 g; 0,3 g lần<br /> lượt được ủ với 5 ml enzyme thí nghiệm ở pH,<br /> nhiệt độ, thời gian thích hợp. Xác định lượng<br /> đường khử được giải phóng.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Xác định hoạt tính cellulase và xylanase của<br /> mẫu nấm<br /> Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành<br /> thu nhận enzyme cellulase và xylanase từ các<br /> giá thể trồng nấm, sau đó xác định hoạt tính<br /> enzyme và hàm lượng protein. Kết quả thu được<br /> trình bày ở bảng 1.<br /> 85<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 84-90<br /> <br /> Bảng 1. Hoạt tính cellulase và xylanase của các mẫu<br /> Mẫu<br /> cellulase (UI/g)<br /> xylanase (UI/g)<br /> BT1<br /> 32,74<br /> 13,94<br /> BT2<br /> 25,64<br /> 43,01<br /> BT3<br /> 39,60<br /> 75,76<br /> BT4<br /> 16,47<br /> 20,03<br /> BN1<br /> 30,64<br /> 48,19<br /> BN2<br /> 13,33<br /> 21,06<br /> BX1<br /> 16,71<br /> 29,03<br /> BX2<br /> 10,12<br /> 10,48<br /> HT<br /> 86,15<br /> 52,78<br /> LC1<br /> 84,68<br /> 69,89<br /> LC2<br /> 48,69<br /> 54,93<br /> NR<br /> 0,75<br /> 3,23<br /> Kết quả ở bảng 1 cho thấy, so với các loại<br /> nấm bào ngư và nấm rơm, nấm hầu thủ và linh<br /> chi có hoạt tính cellulase và xylanase cao hơn.<br /> Nấm rơm cho hoạt tính enzyme rất thấp.<br /> Xét kết quả hoạt tính enzyme theo từng<br /> giống nấm thì đã có sự khác biệt giữa các mẫu<br /> chung một loài, như mẫu LC1 có hoạt lực<br /> cellulase cao hơn LC2, mẫu BT3 hoạt lực<br /> cellulase cao hơn BT1, BT2, BT4, mẫu BN1<br /> cao hơn BN2 và mẫu BX1 cao hơn BX2.<br /> Nguyên nhân có thể là do nguồn gốc các mẫu<br /> thu làm thí nghiệm chưa có sự đồng đều cũng<br /> có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, do đó<br /> <br /> Protein (mg/g)<br /> 0,27<br /> 0,20<br /> 0,34<br /> 0,18<br /> 0,27<br /> 0,20<br /> 0,20<br /> 0,16<br /> 0,23<br /> 0,34<br /> 0,30<br /> 0,20<br /> <br /> các mẫu cùng một giống vẫn có sự khác biệt<br /> về hoạt tính enzyme.<br /> Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn 5 mẫu<br /> đại diện BT3, BN1, BX1, LC1, HT để tiến<br /> hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.<br /> Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase và<br /> xylanase thí nghiệm<br /> Trong phản ứng enzyme, pH là một trong<br /> những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt<br /> tính của enzyme. Kết quả thí nghiệm khảo sát<br /> ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được<br /> trình bày ở hình 1 và 2.<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính<br /> cellulase thí nghiệm<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính<br /> xylanase thí nghiệm<br /> <br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy, cellulase của 5<br /> mẫu thí nghiệm đều cho hoạt tính cao nhất ở pH<br /> 5,0. Trong khoảng pH 3,0-5,0, hoạt tính của các<br /> mẫu bắt đầu tăng dần nhưng từ pH 6,0-8,0 giảm<br /> dần. Điều này chứng tỏ pH 5,0 là thích hợp cho<br /> cellulase có nguồn gốc từ các loài nấm lớn.<br /> <br /> Kết quả ở hình 2 cho thấy, hoạt tính<br /> xylanase của BT3, BN1, BX1 cao nhất ở<br /> pH 5,0. Hoạt lực xylanase HT, LC1 cao nhất ở<br /> pH 6,0.<br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của<br /> cellulase và xylanase<br /> <br /> 86<br /> <br /> Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Mai Kim Ri<br /> <br /> Dựa trên pH tối ưu của từng loại nấm, phản ứng<br /> enzyme được thực hiện ở những nhiệt độ khác<br /> nhau và kết quả thí nghiệm thu được trình bày ở<br /> hình 3 và 4.<br /> Kết quả ở hình 3 và hình 4 cho thấy, ở<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính<br /> cellulase thí nghiệm<br /> <br /> khoảng nhiệt độ 40 oC đến 50 oC hoạt tính<br /> cellulase và xylanase của các mẫu nấm tăng<br /> dần, hầu hết đạt giá trị cực đại khi nhiệt độ đến<br /> 50 oC. Riêng mẫu BX1 cho hoạt tính cellulase<br /> cao nhất ở 45 oC, và HT có hoạt tính xylanase<br /> cao nhất ở 60 oC.<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính<br /> xylanase thí nghiệm<br /> <br /> Bảng 2. Lượng đường khử trước và sau thủy phân của các mẫu thí nghiệm<br /> Mẫu<br /> ĐC<br /> BT3<br /> BN1<br /> BX1<br /> HT<br /> LC1<br /> <br /> Nồng độ đường trong dịch thủy phân rơm rạ (mg/ml)<br /> 0 giờ<br /> 0,00<br /> 4,65<br /> 4,09<br /> 3,61<br /> 3,63<br /> 6,32<br /> <br /> 1 giờ<br /> 0,03<br /> 9,27<br /> 7,27<br /> 6,57<br /> 12,24<br /> 11,78<br /> <br /> 2 giờ<br /> 0,05<br /> 9,19<br /> 6,64<br /> 6,03<br /> 11,68<br /> 11,70<br /> <br /> 4 giờ<br /> 0,05<br /> 9,08<br /> 6,78<br /> 6,00<br /> 11,62<br /> 11,59<br /> <br /> 6 giờ<br /> 0,06<br /> 6,96<br /> 6,45<br /> 5,97<br /> 10,49<br /> 11,70<br /> <br /> 8 giờ<br /> 0,07<br /> 6,78<br /> 5,90<br /> 5,92<br /> 10,35<br /> 8,95<br /> <br /> 24 giờ<br /> 0,05<br /> 6,68<br /> 5,80<br /> 5,84<br /> 10,27<br /> 9,51<br /> <br /> ĐC: đối chứng.<br /> <br /> Hình 5. Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rơm rạ<br /> 87<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 84-90<br /> <br /> Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy<br /> phân rơm rạ đã qua xử lý của enzyme thí<br /> nghiệm<br /> Thí nghiệm này được tiến hành với các<br /> mẫu BT3, BN1, BX1, LC1, HT, phương pháp<br /> tiến hành theo mục thí nghiệm 4. Kết quả thí<br /> nghiệm được trình bày ở bảng 2.<br /> Kết quả hình 5 cho thấy, thời gian 1 giờ<br /> thủy phân cho lượng đường khử là cao nhất,<br /> thời gian thủy phân càng kéo dài thì lượng<br /> đường khử càng có xu hướng giảm. Điều này<br /> có thể do lượng đường sinh ra ở 1 giờ đầu đã<br /> ức chế hoạt lực cellulase và xylanase, do đó<br /> <br /> thủy phân ở thời gian 2, 4, 6, 8, 24 giờ là<br /> không tối ưu.<br /> Thời gian 1 giờ là tối ưu để thủy phân rơm<br /> rạ của enzyme thí nghiệm.<br /> Khảo sát pH và nhiệt độ thích hợp cho quá<br /> trình thủy phân rơm rạ đã qua xử lý của<br /> enzyme thí nghiệm<br /> Dựa vào kết quả của thí nghiệm 2, 3 và 4,<br /> chúng tôi tiến hành thủy phân rơm rạ trong<br /> 1 giờ, với khoảng pH là 5,0; 5,5; 6,0 và khoảng<br /> nhiệt độ là 50oC; 55 oC; 60 oC. Xác định hàm<br /> lượng đường khử sinh ra trong quá trình thủy<br /> phân. Kết quả được trình bày ở hình 6, 7 và 8.<br /> <br /> Hình 6. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên khả năng thủy phân rơm rạ của HT và BT3<br /> <br /> Hình 7. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên khả năng thủy phân rơm rạ của BN1 và BX1<br /> <br /> Hình 8. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ<br /> lên khả năng thủy phân rơm rạ của LC1<br /> 88<br /> <br /> Hình 9. Ảnh hưởng của nồng độ rơm rạ<br /> lên khả năng thủy phân của enzyme thí nghiệm<br /> <br />