Tiềm năng sinh Alginate lyase của các chủng vi khuẩn phân lập ở vùng biển Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khả năng sinh enzyme alginate lyase của các chủng vi khuẩn biển được sàng lọc bằng phương pháp đĩa thạch alginate nhuộm bởi gram’s iodine. Trong số 197 chủng vi khuẩn phân lập từ bọt biển, san hô mềm và rong biển, 56% chủng thể hiện hoạt tính phân cắt alginate từ rong Sargassum mcclurei.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiềm năng sinh Alginate lyase của các chủng vi khuẩn phân lập ở vùng biển Việt Nam

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2se1&2se2): 273–279 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2se1&2se2.14135 POTENTAL PRODUCE ALGINATE LYASE BY BACTERIA STRAINS ISOLATED FROM COASTAL REGIONS IN VIETNAM Nguyen Thi Thuan*, Tran Nguyen Ha Vy, Vo Thi Dieu Trang, Cao Thi Thuy Hang, Vo Mai Nhu Hieu, Nguyen Ngoc Linh, Nguyen Dinh Thuat, Tran Thi Thanh Van Nha Trang Institute of Technology Research and Application, VAST, Vietnam Received 6 August 2019, accepted 29 September 2019 ABSTRACT The ability to produce the alginate lyase enzyme of marine bacteria strains was screened by alginate agar plate stained with gram’s iodine. Among 197 strains of bacteria isolated from sponges, soft corals and seaweeds, 56% of strains showed alginate - cleavage activity on alginate from Sargassum mcclurei. Total of eleven active bacterial strains were selected to identify the characteristic of subspecies. The sequence comparision of 16S rRNA gene showed that nine strains belong to the genus Bacillus and two strains belong to the genus Fictibacillus. Keywords: Bacillus, alginate, alginate lyase, gram’s iodine, marine bacteria. Citation: Nguyen Thi Thuan, Tran Nguyen Ha Vy, Vo Thi Dieu Trang, Cao Thi Thuy Hang, Vo Mai Nhu Hieu, Nguyen Ngoc Linh, Nguyen Dinh Thuat, Tran Thi Thanh Van, 2019. Potental produce alginate lyase by bacteria strains isolated from coastal regions in Vietnam. Tap chi Sinh hoc, 41(2se1&2se2): 273–279. https://doi.org/10.15625/0866-7160/v41n2se1&2se2.14135. * Corresponding author email: nguyenthuan@nitra.vast.vn ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 273
TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2se1&2se2): 273–279 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2se1&2se2.14135 TIỀM NĂNG SINH ALGINATE LYASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM Nguyễn Thị Thuận*, Trần Nguyễn Hà Vy, Võ Thị Diệu Trang, Cao Thị Thúy Hằng, Võ Mai Nhƣ Hiếu, Nguyễn Ngọc Linh, Nguyễn Đình Thuất, Trần Thị Thanh Vân Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ngày nhận bài 6-8-2019, ngày chấp nhận 29-9-2019 TÓM TẮT Khả năng sinh enzyme alginate lyase của các chủng vi khuẩn biển được sàng lọc bằng phương pháp đĩa thạch alginate nhuộm bởi gram’s iodine. Trong số 197 chủng vi khuẩn phân lập từ bọt biển, san hô mềm và rong biển, 56% chủng thể hiện hoạt tính phân cắt alginate từ rong Sargassum mcclurei. 11 chủng vi khuẩn có hoạt tính cao nhất được chọn lọc để xác định đặc trưng phân loài. Kết quả so sánh trình tự gen 16S rRNA cho thấy có 9 chủng vi khuẩn biển thuộc chi Bacillus và 2 chủng vi khuẩn biển thuộc chi Fictibacillus. Từ khóa: Bacillus, alginate, alginate lyase, gram’s iodine, vi khuẩn biển. *Địa chỉ liên hệ email: nguyenthuan@nitra.vast.vn MỞ ĐẦU dược, nghiên cứu cấu trúc cũng như làm tăng Alginate là polysaccharide chủ yếu được hoạt tính sinh học của chúng (Chen et al., chiết xuất từ rong nâu (chiếm đến 40% khối 2017; Zhu et al., 2016). lượng rong khô), được cấu tạo từ β-D- Alginate oligosaccharide được điều chế mannuronate (M) và α-L- guluronate (G). Các bằng các phương pháp vật lý, hóa học hoặc gốc uronate này sắp xếp thành các block khác enzyme. Trong đó phương pháp enzyme được nhau: poly β-D- mannuronate (poly M), poly ưu tiên sử dụng do tính đặc hiệu và hiệu suất α-L- guluronate G (poly G) và heteropolymer cao, thân thiện với môi trường. Alginate lyase (polyMG) (Lee et al., 2013). Alginate đặc biệt được phân lập từ các nguồn khác nhau như vi thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khuẩn biển, động vật biển và một số loại đã trong các lĩnh vực thực phẩm, hóa học, y được xác định đặc tính xúc tác (Chen et al., dược, nông nghiệp bởi trữ lượng lớn (hơn 2018). Dựa trên tính đặc hiệu cơ chất alginate 30.000 tấn/năm) (Hay et al., 2013) và các hoạt lyase được chia thành hai loại chính: enzyme tính sinh học đa dạng của polymer cũng như đặc hiệu block G (polyG lyase EC 4.2.2.11) oligosaccharide như chống oxy hóa, kích thích và enzyme đặc hiệu block M (polyM lyase EC tăng trưởng, kháng viêm,… (Falkeborg et al., 4.2.2.3) (Yagi et al., 2016). Hiện nay alginate 2014; Salachna et al., 2018; Zhou et al., lyase thương mại có giá thành cao và tính đặc 2015). Tuy nhiên, việc ứng dụng alginate trong y học còn nhiều hạn chế do khối lượng hiệu chỉ trên block G (Manns et al., 2016). phân tử lớn và độ nhớt cao. Do đó, nhiều nhà Theo các nghiên cứu đã được công bố, khoa học đã tập trung nghiên cứu điều chế alginate từ rong nâu Việt Nam có cấu trúc alginate trọng lượng phân tử thấp với mục phức tạp bao gồm block M, block G và một đích tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực y lượng nhỏ block MG (Thien et al., 2017). Tuy 274
Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn nhiên, việc nghiên cứu enzyme chuyển hóa nucleotide của gen 16S rRNA tinh sạch được alginate từ rong nâu Việt Nam vẫn còn ít giải bằng phương pháp Sanger trên hệ thống (Huỳnh Hoàng Như Khánh nnk., 2011). Do máy ABI 3130XL (313001R, Thermo Fisher đó việc tìm kiếm alginate lyase mới có hoạt Scientific, USA) tại Phòng xét nghiệm Công tính cao trên cơ chất alginate từ rong biển Việt ty TNHH DV và TM Nam Khoa (thành phố Nam là vấn đề cần thiết phải nghiên cứu. Hồ Chí Minh). Các trình tự được xử lí bằng Trong nghiên cứu này chúng tôi tìm kiếm các chương trình BLAST/NCBI và tiến hành nguồn sinh alginate lyase mới từ vi khuẩn so sánh trình tự gen của các chủng nghiên biển, xác định đặc trưng phân loài của các cứu với một số chủng khác từ Ngân hàng chủng có hoạt tính cao. gen thế giới (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 197 chủng vi khuẩn biển được phân lập từ Hoạt tính alginate lyase của vi sinh vật biển các nguồn khác nhau trong vùng biển Quảng Đến nay nhiều loại enzyme alginate lyase Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Nha Trang vào từ vi sinh vật biển, rong biển và động vật thân tháng 12 năm 2017. Trong đó có 129 chủng mềm biển đã được phân lập và xác định đặc được phân lập từ bọt biển, 48 chủng được tính. Trong nghiên cứu này chúng tôi tập phân lập từ san hô mềm và 19 chủng được trung nghiên cứu khả năng sinh alginate lyase phân lập từ rong biển. từ vi khuẩn biển. Việc sử dụng vi sinh vật có Sàng lọc hoạt tính alginate lyase của vi sinh khả năng sinh enzyme biến đổi polysaccharide vật biển bằng phƣơng pháp đĩa thạch có nhiều ưu điểm như: Vi sinh vật phát triển nhanh trong môi trường nuôi cấy chứa các Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập trên thành phần dinh dưỡng khác nhau, sản xuất môi trường MB (glucose 1 g/l; pepton 5 g/l; enzyme với số lượng và điều kiện ổn định, dễ yeast extract 1 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; dàng thao tác và có thể sử dụng lâu dài nếu MgSO4.7H2O 0,05 g/l; agar 18 g/l, nước biển được bảo quản tốt. So với phương pháp hóa 500ml, mước máy 500ml; pH= 7,0–7,5) được học thì việc sử dụng alginate lyase để điều cấy trên đĩa thạch chứa 0,5% alginate chiết từ chế alginate trọng lượng phân tử thấp có giá rong Sargassum mcclurei. Các mẫu thí thành đắt hơn nhưng với tính chất xúc tác đặc nghiệm được ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau đó, hiệu của enzyme, điều kiện xúc tác nhẹ nhàng tiến hành loại bỏ sinh khối vi khuẩn và đĩa sẽ giúp phản ứng được kiểm soát và tạo ra thạch được nhuộm bởi gram’s iodine. Chủng những sản phẩm có tính ứng dụng cao trong vi khuẩn được xác định là có hoạt tính lĩnh vực dược phẩm, y học. alginate lyase khi vùng nuôi cấy chúng không bị nhuộm màu bởi thuốc nhuộm mà tạo ra Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, có vùng trong suốt (Sawant et al., 2015). hơn 56% chủng vi khuẩn sàng lọc có khả năng phân cắt alginate từ rong S. mcclurei. Trong Xác định đặc trƣng phân loài đó, tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập từ rong biển Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được có tiềm năng sinh alginate cao nhất (hình 1). định danh bằng phương pháp so sánh trình tự Kết quả này tương tự với công bố trong những gen 16S rRNA. Sử dụng cặp mồi 533F: năm gần đây về hoạt tính alginate lyase từ vi 5’GTGCCAGCAGCCGCGGTAA3’ và khuẩn biển sống cộng sinh trên rong (Dong et 1496R: 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’ al., 2012; Wang et al., 2017). Dong và cộng (Rosete-Enríquez & Romero-López, 2017) để sự đã sàng lọc hoạt tính alginate lyase của 65 nhân gen mã hóa đoạn 16S rRNA của vi chủng vi khuẩn phân lập từ rong nâu thuộc chi khuẩn phân lập được. Sản phẩm của phản ứng Laminaria, trong đó 21 chủng (32,3%) có PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel hoạt hoạt tính cao (Dong et al., 2012). Wang agarose 2%, tinh sạch bằng bộ QIA quick et al. (2017) đã phân lập được 12 chủng vi PCR Purification Kit (Qiagen). Trình tự khuẩn sinh alginate lyase từ bề mặt rong nâu. 275
Nguyen Thi Luan et al. a) b) Hình 1. Khả năng sinh alginate lyase của các chủng vi khuẩn biển: a) Tỷ lệ chủng vi khuẩn có khả năng sinh alginate lyase; b) Đĩa thạch alginate nhuộm bởi gram’s iodine, vùng trong suốt thể hiện hoạt tính alginate lyase Dựa trên kết quả sàng lọc này, chúng tôi hiện hoạt tính phân cắt alginate mạnh nhất đã chọn được 11 chủng vi khuẩn biển thể (bảng 1). Bảng 1. Hoạt tính alginate lyase của của chủng vi khuẩn biển tuyển chọn Kí hiệu Hoạt tính alginate STT Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu chủng lyase (mm) Bọt biển Cồn Cỏ, Quảng Trị 1 AlgSm1 21 17 o16711’N; 107 o33806’E Bọt biển Cồn Cỏ, Quảng Trị 2 AlgSm2 12 17 o16711’N; 107 o33806’E Bọt biển Cồn Cỏ, Quảng Trị 3 AlgSm3 32 17 o16711’N; 107 o33806’E Bọt biển Cồn Cỏ, Quảng Trị 4 AlgSm4 17 17 o16711’N; 107 o33806’E San hô mềm Cồn Cỏ, Quảng Trị 5 AlgSm5 27 17 o16711’N; 107 o33806’E Bọt biển Cồn Cỏ, Quảng Trị 6 AlgSm6 12 17 o16711’N; 107 o33806’E Cù Lao Chàm, Quảng Nam 7 AlgSm7 San hô mềm 23 15o90300’N; 105o3972’E Bọt biển Lý Sơn, Quảng Ngãi 8 AlgSm8 21 15o36800’N; 109o11382’E Bọt biển Lý Sơn, Quảng Ngãi 9 AlgSm9 28 15o36800’N; 109o11382’E Bãi Tre, Nha Trang 10 AlgSm10 San hô mềm 22 12 o60670’N; 109 o33278’E Bọt biển Hòn Ngoại, Nha Trang 11 AlgSm11 20 12o00581’N; 109o32079’E 276
Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn Trong hầu hết các nghiên cứu alginate alginate thành nguồn carbon cho sự sinh lyase từ vi khuẩn biển, rong biển được chọn trưởng và phát triển của chúng. Như vậy, làm nguồn phân lập vi khuẩn (Dong et al., ngoài rong biển chúng tôi đã mở rộng thêm 2012). Trong nghiên cứu này của chúng tôi, nguồn phân lập vi sinh vật biển từ các các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải nguồn bọt biển và san hô mềm nhằm tìm alginate cao lại được phân lập từ bọt biển và kiếm các chủng vi khuẩn tiềm năng sinh san hô mềm. Do đó có thể thấy rằng các loài alginate lyase. vi khuẩn biển cộng sinh với bọt biển và san hô mềm đã giúp các sinh vật này phân giải Xác định đặc trƣng phân loài Bảng 2. Kết quả định danh của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn Đặc điểm Chủng Mã số trên Độ tương STT hình thái Chủng tương đồng phân lập GenBank đồng (%) khuẩn lạc 1 AlgSm1 Bacillus velezensisi CP021011.1 99 2 AlgSm2 Bacillus aquimaris KJ575042.1 99 3 AlgSm3 Bacillus indicus MG651110.1 100 4 AlgSm4 Bacillus aryabhattai NR 115953.1 100 5 AlgSm5 Fictibacillus macauensis MH169269.1 100 6 AlgSm6 Bacillus megaterium CP009920.1 100 7 AlgSm7 Fictibacillus macauensis MH169330.1 99 8 AlgSm8 Bacillus filamentosus CP026635.1 99 9 AlgSm9 Bacillus cereus NR 074540.1 100 10 AlgSm10 Bacillus aryabhattai NR 115953.1 100 11 AlgSm11 Bacillus velezensis CP011686.1 100 Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi 1.500kb được giải trình tự, phân tích và so trên môi trường phân lập MB, sau 24 h quan sánh với các trình tự các gen có trong ngân sát hình thái khuẩn lạc (bảng 2). Khuẩn lạc hàng GenBank qua công cụ Blast. Các chủng thuần được nhân sinh khối để tách chiết DNA vi khuẩn này có độ tương đồng cao từ 99 – tổng số và tiến hành PCR nhân bản đoạn 16S 100% so với một số chủng trong ngân hàng rRNA. Sản phẩm PCR sạch với kích thước GenBank (bảng 2). Kết quả định danh trong 277
Nguyen Thi Luan et al. bảng 2 cho thấy, 11 chủng vi khuẩn có tiềm patients following surgery. Frontiers in năng sinh alginate lyase đều có độ tương đồng Pharmacology, 8: 623. https://doi.org/ cao với các chủng đã công bố trên Genbank 10.3389/fphar.2017.00623 và hầu hết thuộc chi Bacillus, 2 chủng vi Chen, P., Zhu, Y., Men, Y., Zeng, Y., Sun, Y., khuẩn thuộc chi Fictibacillus. Khả năng sinh 2018. Purification and characterization of alginate lyase của vi khuẩn biển thuộc chi a novel alginate lyase from the marine Bacillus cũng đã được công bố bởi Wang và bacterium Bacillus sp. Alg07. Marine cộng sự (Wang et al., 2017). Tuy nhiên, trong hầu hết các nghiên cứu alginate lyase từ vi Drugs, 16(3): 86. https://doi.org/ khuẩn biển, rong biển được chọn làm nguồn 10.3390/md16030086 phân lập vi khuẩn thì các chủng vi khuẩn có Dong, S., Yang, J., Zhang, X. Y., Shi, M., hoạt tính alginate lyase đa dạng, thuộc các chi Song, X. Y., Chen, X. L., Zhang, Y. Z., Psychrobacter, Winogradskyella, 2012. Cultivable alginate lyase-excreting Psedoalteromonas, Psychromonas và bacteria associated with the arctic brown Polaribacte (Dong et al., 2012). Trong nghiên alga Laminaria. Marine Drugs, 10(11): cứu này của chúng tôi, các chủng vi khuẩn 2481–2491. https://doi.org/10.3390/ phân lập từ (bọt biển và san hô mềm) có khả md10112481 năng phân giải alginate chủ yếu thuộc chi Bacillus. Do đó có thể thấy rằng các loài vi Falkeborg, M., Cheong, L. Z., Gianfico, C., khuẩn thuộc chi Bacillus cộng sinh chặt chẽ Sztukiel, K. M., Kristensen, K., Glasius, với bọt biển và san hô mềm giúp các sinh vật M., Xu X., Guo, Z., 2014. Alginate này phân giải alginate thành nguồn carbon oligosaccharides: Enzymatic preparation cho sự sống của mình. and antioxidant property evaluation. Food Chemistry, 164: 185–194. https://doi.org/ KẾT LUẬN 10.1016/j.foodchem.2014.05.053 Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng Hay, I. D., Rehman, Z. U., Moradali, M. F., lọc được các chủng vi khuẩn biển có khả năng Wang, Y., Rehm, B. H. A., 2013. sinh alginate lyase trong đó có 9 chủng vi Microbial alginate production, khuẩn đã được định danh tên khoa học thuộc modification and its applications. chi Bacillus, 2 chủng vi khuẩn thuộc chi Fictibacillus. Kết quả này sẽ cung cấp những Microbial Biotechnology, 6(6): 637–650. chủng vi khuẩn biển tiềm năng để tiếp tục https://doi.org/10.1111/1751-7915.12076 nghiên cứu tách chiết, tinh sạch alginate lyase. Lee, K. Y., Mooney J. D., 2013. Alginate : Enzyme có nguồn gốc từ các chủng vi khuẩn properties and biomedical applications. này hứa hẹn có khả năng bẻ mạch alginate Prog Polym Sci., 37(1): 106–126. chiết xuất từ rong Việt Nam nhằm điều chế ra https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.20 những sản phẩm mới có tính ứng dụng cao. 11.06.003 Lời cảm ơn: Tập thể tác giả xin cảm ơn tài trợ Manns, D., Nyffenegger, C., Saake, B., kinh phí của Hợp phần nhánh số 3, thuộc dự Meyer, A. S., 2016. Impact of different án VAST.ĐA47.12/16-19 của Viện alginate lyases on combined cellulase- NC&UDCN Nha Trang, Viện HLKH&CN lyase saccharification of brown seaweed. Việt Nam và Nhiệm vụ KHCN cấp cơ sở năm RSC Advances, 6: 45392–45401. 2019, Phòng Hóa PTTKCN, Viện https://doi.org/10.1039/c6ra06669k NC&UDCNNT. Rosete-Enríquez, M., Romero-López, A. A., TÀI LIỆU THAM KHẢO 2017. Klebsiella Bacteria Isolated from Chen, J., Hu, Y., Zhang, L., Wang, Y., Wang, the Genital Chamber of Phyllophaga S., Zhang, Y., Guo H., Ji D., Wang, Y., obsoleta. Southwestern Entomologist, 2017. Alginate oligosaccharide DP5 42(4): 1003–1014. https://doi.org/ exhibits antitumor effects in osteosarcoma 10.3958/059.042.0419 278
Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn Salachna, P., Grzeszczuk, M., Meller, E., alginate lyase-excreting microorganisms Soból, M., 2018. Oligo-Alginate with low from the surface of brown algae. AMB molecular mass improves growth and Express, 7(1): 74. https://doi.org/10.1186/ physiological activity of eucomis s13568-017-0361-x autumnalis under salinity stress. Yagi, H., Fujise, A., Itabashi, N., Ohshiro, T., Molecules, 23(4): 812. https://doi.org/ 2016. Purification and characterization of 10.3390/molecules23040812 a novel alginate lyase from the marine Sawant, S. S., Salunke, B. K., Kim, B. S., bacterium Cobetia sp. NAP1 isolated from 2015. A rapid, sensitive, simple plate brown algae. Bioscience, Biotechnology assay for detection of microbial alginate and Biochemistry, 80(12): 2338–2346. lyase activity. Enzyme and Microbial https://doi.org/10.1080/09168451.2016.12 Technology, 77: 8–13. https://doi.org/ 10.1016/j.enzmictec.2015.05.003 32154 Thien, T. V., Kinh, C. D., Hoa, T. T., Khieu, Zhou, R., Shi, X., Gao, Y., Cai, N., Jiang, Z., D. Q., 2017. Characterization of alginate Xu, X. (2015). Anti-inflammatory activity prepared from brown seaweeds in Thua of guluronate oligosaccharides obtained Thien - Hue province, Vietnam. Asean by oxidative degradation from alginate in Journal on Science and Technology for lipopolysaccharide-activated murine Development, 25(2): 427–433. macrophage RAW 264.7 cells. Journal of https://doi.org/10.29037/ajstd.273 Agricultural and Food Chemistry, Wang, M., Chen, L., Zhang, Z., Wang, X., 63(1):160–168. https://doi.org/10.1021/ Qin, S., Yan, P., 2017. Screening of jf503548a 279