Tìm hiểu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA

Chia sẻ: Danh Tuong Vi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

96
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại gây bệnh gan thận mủ cá tra (WT) và chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (PAM) được tiến hành trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) có khối lượng 10 - 12g/con để xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng PAM.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tìm hiểu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2012 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ĐỘT BIẾN GEN purA ASSESSMENT ON THE PATHOGENICITY OF AN EDWARDSIELLA ICTALURI purA MUTANT ON CATFISH (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) Trần Thị Bích Thủy1, Võ Thị Ngọc Trâm2, Nguyễn Thị Chi3, Võ Hoàng Ánh4,Võ Văn Nha5 Ngày nhận bài: 29/9/2011; Ngày phản biện thông qua: 13/4/2012; Ngày duyệt đăng: 12/9/2012 TÓM TẮT Thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại gây bệnh gan thận mủ cá tra (WT) và chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (PAM) được tiến hành trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) có khối lượng 10 - 12g/con để xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng PAM. Kết quả cho thấy, 100% cá tra được tiêm chủng WT đều bị chết với biểu hiện của bệnh gan thận mủ tương tự như những mô tả ngoài ao nuôi ở nồng độ tiêm 105CFU/cá, còn tất cả cá tra được tiêm chủng PAM ở nồng độ tiêm 105CFU/cá đều bình thường sau 15 ngày thí nghiệm, không có cá thể nào biểu hiện bệnh gan thận mủ. Liều gây chết 50% (LD50) của chủng PAM cao (>109CFU/con). Kết quả nghiên cứu chứng tỏ khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) yếu hơn nhiều so với chủng E. ictaluri hoang dại (WT) khi chưa bị đột biến gen purA. Chủng vi khuẩn này tiếp tục được nuôi cấy lưu giữ, sử dụng xác định khả năng sinh miễn dịch để làm nguyên liệu sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra sau này. Từ khóa: cá tra, Edwardsiella ictaluri, đột biến gen purA ABSTRACT Striped catﬁsh (Pangasianodon hypophthalmus) weighing about 10-12 grams were experimentally infected with the wild-type Edwardsiella ictaluri and purA mutant strain of E. ictaluri to determine their virulence. The result showed that all ﬁsh challenged with wild-type E. ictaluri were killed and displayed a symptom of white spots in the internal organ as those in naturally infected ﬁsh at an injected concentration of 105 CFU per ﬁsh, but all ﬁsh challenged with PAM were healthy without any clinical signs of disease at the same concentration after 15 days of exposure. By the injection, a 50% lethal dose (LD50) for PAM was higher than 109 CFU per ﬁsh. The results demonstrated that PAM strain was highly attenuated very much compared to wild-type E. ictaluri. Further, this strain continues to determine the immunization as primary material for production of live attenuated vaccine to prevent the disease symptom of white spots in the internal organ of striped catﬁsh. Keywords: Pangasianodon hypophthalmus, Edwardsiella ictaluri, purA mutant Trần Thị Bích Thủy: Lớp Cao học Nuôi trồng Thủy sản 2009 - Trường Đại học Nha Trang CN. Võ Thị Ngọc Trâm, 3KS. Nguyễn Thị Chi, 4CN. Võ Hoàng Ánh, 5TS. Võ Văn Nha: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III 1 2 TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 163 Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi rộng rãi, đặc biệt ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích nuôi và sản lượng ngày càng gia tăng. Để đạt được sản lượng cao, ngoài việc mở rộng diện tích, người nuôi cá tra đã không ngừng phát triển nhiều loài hình nuôi như nuôi ao, hầm, lồng bè với mật độ thâm canh rất cao. Chính vì vậy, môi trường bị ô nhiễm, làm xuất hiện nhiều loại bệnh, trong đó bệnh gan thận mủ đã gây thiệt hại lớn cho người nuôi, tỷ lệ cá mắc bệnh chết từ 10 - 90%, thậm chí lên đến 100% tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và kích thước cá nuôi. Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid (Từ Thanh Dung và cộng sự, 2004); Bactrime, Colistin, Florphenicol, Amoxicilin, Tetracyclin, Doxycyclin (Trương Ngọc Loan, 2007). Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá. Do vậy, việc phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vắc xin là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. Nghiên cứu này nhằm xác định độc lực của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA làm cơ sở cho việc sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu - Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại gây bệnh gan thận mủ cá tra (WT) và chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (PAM) được cung cấp từ đề tài cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III (Viện III) chủ trì. - Cá tra Pangasianodon hypophthalmus có khối lượng trung bình 10 g/con được nuôi tại khu thực nghiệm Viện III từ nguồn cá của Trung tâm Quốc gia giống Thủy sản nước ngọt Nam Bộ. 2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn Hình dạng, kích thước vi khuẩn E. ictaluri được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram, soi trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần; kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa bằng kít API 20E (Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh hóa truyền thống (KIA, Mannitol di động, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30‰). Định danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994). 164 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG Soá 3/2012 3. Phương pháp gây cảm nhiễm để xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của vi khuẩn E. ictaluri Thí nghiệm tiến hành trên hệ thống bể 100L, sục khí 24/24 giờ. Hệ thống thí nghiệm được tẩy trùng bằng chlorin 30ppm trước khi tiến hành và khi kết thúc; nước trong bể sau thí nghiệm có vi khuẩn gây bệnh được xử lý với thuốc tím 50ppm 1 ngày trước khi thải ra nguồn nước thải chung. Cá tra giống có khối lượng từ 10 - 12g/con khỏe mạnh được nuôi lớn và ổn định tại Viện III trước khi đưa vào thí nghiệm. Cá được bố trí ngẫu nhiên 30 cá/bể. Trước khi gây cảm nhiễm, chọn ngẫu nhiên 3 cá để kiểm tra ký sinh trùng và sự hiện diện của vi khuẩn. Chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm được phục hồi trên môi trường thạch BHIA (Brain Heart Infution Agar) và giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 280C, sau đó chọn một khuẩn lạc đơn tăng sinh trong môi trường BHI lỏng (Brain Heart Infusion Broth) 24 giờ, xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch BHIA của Koch. Dùng phương pháp tiêm vi khuẩn vào khoang bụng của cá thí nghiệm với liều tiêm 0,1 mL/cá ở các nồng độ 105(PAM.5), 106(PAM.6), 107(PAM.7), 108(PAM.8), 109(PAM.9) CFU/cá (chủng PAM) và 103(WT.3), 104(WT.4), 105(WT.5), 106(WT.6), 107(WT.7), 108(WT.8) CFU/cá (chủng WT). Lô đối chứng (ĐC) tiêm 0,1ml/cá nước muối sinh lí (0,85% NaCl). Thí nghiệm lặp lại 3 lần theo không gian, được theo dõi trong 2 tuần. Theo dõi và ghi nhận biểu hiện của cá trong suốt quá trình thí nghiệm: xác định thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh do vi khuẩn gây ra; thời gian cá chết; mổ khám nghiệm để đánh giá mức độ bệnh lý của cá; thu mẫu cắt lát mô gan, thận và lách cá theo Coolidge và Howard (1979) để đánh giá mức độ của bệnh trên tế bào mô, từ đó so sánh với lô đối chứng để đánh giá độc lực của chủng vi khuẩn đột biến (PAM), đồng thời tái phân lập và định danh lại vi khuẩn từ gan, thận và lách cá yếu để khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri. 4. Phương pháp xác định liều gây chết 50% (LD50): Theo phương pháp Reed-Muench (1938) III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Một vài đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA 1.1. Đặc điểm hình thái Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn E.ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) cũng như E. ictaluri Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2012 (gram âm), kích thước 1 x 2-4µm (hình 1C) tương tự hình dạng chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (WT) (hình 1D). Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự như những mô tả về hình thái chủng E. ictaluri thu được từ cá tra bị bệnh gan thận mủ (chủng hoang dại) của Từ Thanh Dung và cộng sự (2004). Điều này chứng tỏ vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA có kiểu hình ổn định, không thay đổi sau khi bị đột biến và có khả năng nuôi cấy và lưu giữ. hoang dại (WT) đều phát triển chậm. Cụ thể, ở nhiệt độ 280C, sau 48 giờ nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên mặt đĩa thạch có kích thước đường kính khoảng 1mm, màu trắng hơi đục, dạng tròn trơn, hơi lồi, rìa có dạng không đồng nhất (hình 1A, B). Khi nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA có dạng hình que ngắn, không có nhân, đơn hoặc chuỗi ngắn, bắt màu hồng với thuốc nhuộm Gram A 1mm B C D Hình 1. Khuẩn lạc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (A, B) trên môi trường BHIA C-vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA. D-vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (chưa đột biến) động yếu, cho phản ứng oxydase âm tính, catalase dương, lysin dương, âm tính với các loại đường ngoại trừ Glucose,… đều tương đồng với chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (WT) và của khóa phân loại Bergey’s (1994). Điều này khẳng định chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) cũng cho các đặc điểm sinh lý, sinh hóa không khác gì so với chủng E. ictaluri hoang dại (WT). 1.2. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri (PAM, WT) được kiểm tra bằng phương pháp truyền thống và dùng kít API 20E. Kết quả thu được được thể hiện ở Bảng 1 Kết quả từ bảng 1 cho thấy các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) như: Gram âm, kỵ khí tùy tiện, di Bảng 1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri (PAM, WT) Đặc điểm Chất nền E. ictaluri (PAM) E. ictaluri (WT) E. ictaluri theo Bergey’s Que Que Que - - - Hình dạng Gram Di động Yếu Yếu Oxidase Oxidase - - - Catalase Catalase + + + +/+ +/+ +/+ O/F ONPG Orthonitrophenyl - - - ADH Arginin - - - LDC Lysin + + + ODC Ornithin - - V CIT Sodium citrat - - - H2S Sodium thisulfat - - - URE Urê - - - TDA Tryptophan - - - IND Indol - - - VP Sodium piruvac - - - A 1mm B TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 165 Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2012 GEL Gelatin - - - GLU Glucose + + + Hơi - - V Khử Nitrate Gas Nitrate + + + MAN Manitol - - - INO Inositol - - - SOR Sorbitol - - - RHA Rhamnose - - - SAC Sacrose - - - MEL Melibiose - - - AMY Amygdalin - - - ARA Arabinose - - - Lactose - - - 0;5;10;15;20;25 NaCl + + 30 NaCl - - Lactose Độ muối (‰) +: dương tính; -: âm tính; V: biến đổi (có chủng âm tính, chủng dương tính) 2. Khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra và LD50 của vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA Kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng PAM và WT bằng cách tiêm vào xoang bụng của cá tra khỏe (khối lượng 10 - 12g/con) được thể hiện ở hình 2. với nồng độ cao: 1,4 x 109CFU/cá (tương đương 1,4 x 1010CFU/ml), tỉ lệ chết tích lũy của cá tra cao nhất chỉ đạt 18,9% vào ngày thứ 5 sau khi tiêm. Liều gây chết 50% (LD50) của chủng vi khuẩn PAM cao (>109CFU/con) trong khi đó LD50 của chủng vi khuẩn WT là 103,14CFU/con. Kết quả của Nguyễn Mạnh Thắng (2007), Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự (2009) khi nghiên cứu về liều gây chết của cá tra sau khi tiêm chủng E. ictaluri cho thấy, liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5x104 tế bào/0,2ml/ cá (Nguyễn Mạnh Thắng, 2007);