Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM<br /> QUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU<br /> Nguyễn Văn Hạnh<br /> Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt Nam<br /> Những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu<br /> pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế<br /> tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp các<br /> peptid có khả năng thấm qua màng tế bào (CPP) từ bộ gen người nhằm cung cấp công cụ mới tạo các<br /> protein tái tổ hợp có thể xuyên màng để ứng dụng trong sinh học và y học. Hai CPP mới được chọn từ vùng<br /> chuyển tín hiệu vào nhân của tác nhân phiên mã ở người. Chúng được thử chức năng vận chuyển vào tế<br /> bào Hela và Jurkat trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, những protein mới có hiệu quả vận chuyển<br /> tương tự đối TAT-EGFP mặc dù chúng có trình tự acid amin ngắn hơn. Các protein đi vào tế bào chất và<br /> nhân, từ đó giả thiết rằng các protein liên quan nội bào có thể ứng dụng cho mục đích trị liệu.<br /> Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TAT<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hướng quan trọng nhất của liệu pháp<br /> protein là tạo các protein có chức năng ngăn<br /> chặn sự kích hoạt các gen dẫn đến phát triển<br /> tế bào ung thư. Ngoài ra, protein cũng được<br /> định hướng để kích hoạt các gen sản xuất<br /> các sản phẩm cần thiết như insulin hay làm<br /> tác nhân đáp ứng trong các bệnh nhân thiếu<br /> hụt miễn dịch [1]. Hiện đã có một số thuốc là<br /> protein hay có nguồn gốc từ các protein đã<br /> được thương mại hóa và có mặt trên thị<br /> trường. Theo thông báo gần đây trong<br /> nghiên cứu “phân tích thị trường protein trị<br /> liệu toàn cầu”, thị trường này dự báo sẽ tăng<br /> trung bình 13% trong giai đoạn 2012 - 2014.<br /> Thông báo này cũng tiết lộ lĩnh vực kháng thể<br /> đơn dòng sẽ chiếm ưu thế nhất trong các loại<br /> thuốc. Ttuy nhiên các thuốc trong lĩnh vực<br /> protein cũng hứa hẹn tạo ra thị trường nhiều tỉ<br /> đô la [2].<br /> Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Công nghệ Sinh<br /> học - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.<br /> Email: nvhanh@ibt.ac.vn<br /> Ngày nhận: 27/11/2012<br /> Ngày được chấp thuận: 26/4/2013<br /> <br /> 8<br /> <br /> Các peptid có khả năng thấm qua màng tế<br /> bào (cell permeable peptides - CPP) bao gồm<br /> một nhóm các peptid có khả năng thấm qua<br /> màng sinh chất của tế bào sống [3]. Các<br /> nghiên cứu phát triển CPP được tiến hành<br /> sau khám phá ra cơ chế truyền nhiễm của HIV<br /> khi chúng dựa vào protein TAT để thâm nhập<br /> vào tế bào người [4]. Dựa vào phát hiện này,<br /> các CPP mới đã được phát triển là các peptid<br /> có chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin và<br /> leucin ở các loài sinh vật hay được tổng hợp<br /> nhân tạo [5]. Đánh giá chức năng của những<br /> CPP này thường dựa vào khả năng vận<br /> chuyển protein từ môi trường ngoài vào trong<br /> tế bào. Tuy nhiên, các peptid ngoài việc chúng<br /> có chức năng vận chuyển protein qua màng,<br /> chúng cũng là các yếu tố ngoại sinh nên<br /> thường gây độc cho các tế bào người. Do<br /> vây, để tăng khả năng ứng dụng trong y học<br /> do tránh được tính độc hại của các peotein<br /> ngoại lai, những peptid có nguồn gốc gần gũi<br /> hoặc tổng hợp từ DNA người sẽ là công cụ tốt<br /> để phát triển các thuốc theo định hướng<br /> protein trị liệu [6].<br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thử<br /> nghiệm khả năng vận chuyển protein của các<br /> peptid có nguồn gốc từ các đoạn gen chuyển<br /> tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear localling<br /> signal) ở người thay thế cho các peptid có<br /> nguốc gốc từ virus hay các vi sinh vật khác để<br /> ứng dụng tạo protein trị liệu trong tương lai.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Chuẩn bị protein tái tổ hợp<br /> Protein EGFP tái tổ hợp được tổng hợp và<br /> tinh sạch theo phương pháp của Choi và cộng<br /> sự [7]. Trình tự DNA của TAT và các CPP<br /> khác được nhân lên cùng với gen EGFP (hình<br /> 1) trong vector pET28a(+), biểu hiện trong<br /> E. coli BL21 (hình 2).<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ cấu tạo thành phần các<br /> protein trong nghiên cứu<br /> <br /> Protein được hoạt hóa tổng hợp bằng<br /> IPTG (500 µM), tinh sạch bằng phương pháp<br /> sử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi 6<br /> Histidin trong vector pET28a (+). Sau khi tinh<br /> sạch, protein được khử muối bằng cột PD10<br /> (Qiagen), trong môi trường PBS 20% glycerol.<br /> Protein được định lượng, chia nhỏ và bảo<br /> quản ở -20oC cho tới khi sử dụng.<br /> 2. Đánh giá khả năng vận chuyển protein trên tế bào Jurket<br /> Phương pháp thử nghiệm chức năng<br /> xuyên màng của protein được thực hiện theo<br /> Gomez và cộng sự [3]. Tế bào lympho T (tế<br /> bào Jurkat, RIKEN) được nuôi trong môi<br /> trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50<br /> IU/ml penicillin và 50 µg/ml streptomycin. Thu<br /> toàn bộ tế bào sau 2 ngày nuôi, ly tâm 3000<br /> v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bào<br /> vào mỗi đĩa nuôi 6 giếng. Protein thử nghiệm<br /> được bổ sung vào các đĩa nuôi đạt nồng độ<br /> 5 mM. Nuôi tế bào trong vòng 1 giờ ở 37oC,<br /> độ ẩm bão hòa, 5% CO2. Thu mẫu tế bào đã<br /> xử lý, rửa 2 lần bằng PBS trước khi đo độ<br /> phát xạ huỳnh quang bằng máy FACS<br /> (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).<br /> 3. Đánh giá khả năng vận chuyển<br /> protein trên tế bào Hela<br /> <br /> Hình 2. Sơ đồ vector biểu hiện các<br /> protein<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> Phương pháp thử nghiệm chức năng<br /> xuyên màng của protein được thực hiện theo<br /> Choi và cộng sự [3]. Tế bào Hela được nuôi<br /> trong môi trường D-MEM (Dulbecco’s<br /> modified Eagle’s medium), bổ sung 10% huyết<br /> thanh bò, trên các phiến kính tròn trong đĩa<br /> nuôi 4 giếng. Sau 2 ngày nuôi, tế bào mọc<br /> chiếm khoảng 60% diện tích phiến kính sẽ tiến<br /> hành thí nghiệm. Quá trình thí nghiệm được<br /> tiến hành theo bước sau: 1) hút toàn bộ môi<br /> trường nuôi cũ, thay bằng 500 ml môi trường<br /> nuôi mới chứa 5 mM protein, nuôi trong 1 giờ<br /> trong tủ nuôi 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2.<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2) hút toàn bộ môi trường, rửa 2 lần bằng 500<br /> ml dung dịch PBS, sau đó thêm 500 ml hóa<br /> chất nhuộm nhân Hoechst pha loãng theo tỷ lệ<br /> 1/4000 trong PBS. Tế bào được nhuộm trong<br /> 30 phút; 3) Tế bào được rửa 2 lần bằng 500<br /> <br /> ml dung dịch PBS, sau đó cố định bằng<br /> formaldehyd 10% trong 15 phút. 4) rửa tấm<br /> phiến kính 2 lần bằng nước cất và đặt lên lam<br /> kính để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh<br /> quang (Olympus, Nhật Bản).<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh điện di gen SDS các sản phẩm protein sau tinh sạch<br /> Khối lượng EGFP (30,55 kDa); TAT-EGFP (30,1 kDa); CPP2-EGFP (29,85 kDa); CPP3EGFP (31,48kDa).<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Kết quả tổng hợp các protein tái tổ hợp được trình bày trong hình 3. Kết quả cho thấy, các<br /> protein có độ tinh sạch cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa (CPP3EGFP). Hai CPP-EGFP mới có kích thước protein tương tự với TAT-EGFP. Kết quả hấp thụ<br /> protein vào trong tế bào Jurkat đánh giá bằng máy flow cytometric được thể hiện trong hình 4.<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> Hình 4. So sánh khả năng vận chuyển protein của peptid mới với TAT<br /> trong vận chuyển protein vào tế bào jurkat<br /> <br /> a) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP2 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.<br /> b) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP3 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.<br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Với hàm lượng protein 5 mM, ủ trong vòng<br /> 1 giờ biểu hiện phát quang của lô xử lý bằng<br /> EGFP là tương đương với lô đối chứng không<br /> xử lý trong khi ở lô xử lý CPP2-EGFP và<br /> CPP3-EGFP có mức độ biểu hiện tương tự<br /> với TAT-EGFP.<br /> Kết quả hấp thụ protein vào trong tế bào<br /> Hela được thể hiện trong hình 5. Hình ảnh<br /> <br /> hiển vi cho thấy, hàm lượng protein mới được<br /> hấp thụ vào tế bào là tương đồng với TATEGFP. Các protein CPP-EGFP mới thấm vào<br /> cả tế bào chất và nhân của tế bào. Trong hầu<br /> hết các lô thí nghiệm xử lý 100% tế bào có<br /> hấp thụ protein. Thời gian protein vận chuyển<br /> vào đến nhân tế bào giao động từ 15 đến<br /> 30 phút.<br /> <br /> Hình 5. Protein biểu hiện trong tế bào Hela<br /> Với bước sóng ánh sáng chuyên dụng cho Hoechst tất cả các lô xử lý đều cho ánh sáng như<br /> nhau trong khi bước sóng cho ánh sáng phù hợp EGFP chỉ có các lô tế bào xử lý CPP - EGFP có<br /> phát quang tương tự TAT - EGFP.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Cơ chế vận chuyển qua màng của các<br /> peptid đã được nghiên cứu trong suốt thập kỷ<br /> qua. Mục tiêu của hướng nghiên cứu này là<br /> khẳng định khả năng ứng dụng trong trị liệu, vì<br /> trong quá trình xử lý cần tránh những tổn<br /> thương tới các tế bào khỏe mạnh. Gần đây,<br /> những nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ các<br /> con đường vận chuyển qua màng của các<br /> CPP [1]. Từ những kết quả này, những CPP<br /> có khả năng kết hợp với protein trị bệnh mà<br /> có đặc tính phù hợp với từng loại tế bào sẽ<br /> được nghiên cứu phát triển. Các nghiên cứu<br /> đã cho thấy, các đoạn peptid ngắn thuộc đoạn<br /> gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear<br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> localization signal) trên các protein có hoạt<br /> động dẫn truyền protein qua màng sinh chất<br /> của tế bào sống [7]. Các protein tái tổ hợp<br /> thường được thiết kế để có thể vận chuyển<br /> được EGFP từ môi trường nuôi vào trong các<br /> tế bào, với cấu trúc gắn đầu cuối N của peptid<br /> với đầu cuối C của EGFP (hình 1) [8]. Trong<br /> nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào đánh<br /> giá khả năng vận chuyển protein của các<br /> peptid được khảo sát thông qua kết quả hình<br /> ảnh thu được của đích đến protein EGFP. Kết<br /> quả đã cho thấy các protein sau khoảng thời<br /> gian nhất định đã khu trú tại vùng nhân của tế<br /> bào (hình 5).<br /> Việc phát triển các CPP mới nhằm ứng<br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> dụng cho hướng protein trị liệu đã được<br /> nhiều phòng thí nghiêm trên thế giới theo<br /> đuổi. Từ việc thay đổi một vài acid amin trong<br /> trình tự của TAT để tăng tính thấm vào loại tế<br /> bào chuyên biệt [9] hay tạo các CPP tổng hợp<br /> có trình tự toàn arginin [10]. Đáng chú ý, việc<br /> xác định của một nhóm protein trên đó có một<br /> vùng khả năng đảm nhiệm chức năng vượt<br /> qua các màng tế bào một cách thụ động đã<br /> dẫn đến hướng nghiên cứu trong lĩnh vực<br /> đánh giá tính chất thâm nhập vào màng tế bào<br /> của protein [11]. Các CPP mới ngoài việc xác<br /> định có khả năng chuyển qua màng còn phát<br /> triển để đến những loại tế bào hay cơ quan<br /> nhất định [12]. Trong nghiên cứu này của<br /> chúng tôi, tuy khả năng vận chuyển của peptid<br /> mới không cao hơn so với TAT nhưng ưu thế<br /> của peptid mới là đều có nguồn gốc từ DNA<br /> người nên sẽ có khả năng ứng dụng cao hơn<br /> do hạn chế được tính độc và tính kháng miễn<br /> dịch đối với protein lạ của cơ thể.<br /> <br /> V. KẾT LUẬN<br /> Nghiên cứu này đã tổng hợp được các<br /> peptid mới có nguồn gốc từ người và có<br /> khả năng vận chuyển qua màng tế bào.<br /> Việc phát triển gắn các peptid này với các<br /> protein định hướng chữa bệnh sẽ được<br /> tiếp tục thực hiện trong các nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O.,<br /> (2008). Cell-penetrating peptides as delivery<br /> vehicles for biology and medicine. Org.<br /> Biomol. Chem. 6, 2242 - 2255.<br /> 2. Szlachcic A., Zakrzewska M., Otlewski<br /> J., (2011). Longer action means better drug:<br /> Tuning up protein therapeutics. Biotech. Adv.<br /> 29, 436 - 441.<br /> 3. Gomez J.A., Chen J., Ngo J., et al. (2010).<br /> <br /> 12<br /> <br /> Cell-Penetrating Penta-Peptides (CPP5s):<br /> Measurement of Cell Entry and ProteinTransduction<br /> 3594 - 3613.<br /> <br /> Activity.<br /> <br /> Pharmaceuticals<br /> <br /> 3,<br /> <br /> 4. Frankel A.D., Pabo C.O (1988). Cellular<br /> uptake of the tat protein from human<br /> immunodeficiency virus. Cell 55 (6), 1189 - 1193.<br /> 5. Torchilin V.P., (2008). Tat peptidemediated<br /> intracellular<br /> delivery<br /> of<br /> pharmaceutical nanocarriers. Adv. Drug Del.<br /> Rev. 60, 548 – 558.<br /> 6. Torchilin V.P., (2011). Tumor delivery of<br /> macromolecular drugs based on the EPR<br /> effect. Adv. Drug Del. Rev. 63, 131 – 135.<br /> 7. Choi J.M., Ahn M.H., Chae W.J., et al.<br /> (2006). Intranasal delivery of the cytoplasmic<br /> domain of CTLA-4 using a novel protein<br /> transduction<br /> domain<br /> prevents<br /> allergic<br /> inflammation. Nat. med. 12 (5), 574 - 579.<br /> 8. Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F.,<br /> (2004). Transducible TAT-HA fusogenic<br /> peptide enhances escape of TAT-fusion<br /> proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat.<br /> Med. 10 (3), 310 - 315.<br /> 9. Lea N.C., Buggins A.G.S., Orr S.J., et<br /> al. (2003). High efficiency protein transduction<br /> of quiescent and proliferating primary<br /> hematopoietic cells. J. Biochem. Biophys.<br /> Methods 55, 251 - 258.<br /> 10. Fuchs S.M., Raines R.T., (2005).<br /> Polyarginine as a multifunctional fusion tag.<br /> Protein Sci. 14, 1538 - 1544.<br /> 11. Wadia J.S., Dowdy S.F., (2005).<br /> Transmembrane delivery of protein and<br /> peptide drugs by TAT-mediated transduction<br /> in the treatment of cancer. Adv. Drug Del.<br /> Rev. 57, 579 – 596.<br /> 12. Foerg C., Merkle H.P., (2008). On the<br /> biomedical promise of cell penetrating<br /> peptides: limits versus prospects. J. Pharm.<br /> Sci. 97 (1), 144 - 162.<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br />