Tinh sạch protein: Tài liệu hướng dẫn chi tiết

Tinh sch protein

I. Gii thiu chung

S tinh sch ca protein rt quan trng vì t protein tinh sch chúng ta có th xác nh

ưc trình t acid amin, mi liên h v tin hóa gia các protein trong nhng cá th khác

nhau và kho sát các chc nng sinh hóa ca các protein ó. Hơn th na, vic tinh th

hóa protein ch có th thc hin vi nhng protein tinh sch và t nhng tinh th ó

chúng ta s bit ưc cu trúc bc 4 cng như các ơn v chc nng ca protein thông

qua d liu chiu x tia X.

Vì vy, quá trình tinh sch protein không ngng ưc ci tin  t ưc  tinh sch

cao nht nhưng nhìn chung mt quá trình tinh sch protein cng cn i qua các bưc cn

bn sau:

1. Nhn bit protein mc tiêu

2. Ly trích protein t t bào

3. Thu nhn protein mc tiêu da trên  hoà tan, kích thưc, in tích, và liên kt ái lc

4. Phân tách protein bng in di trên gel

5. Xác nh trng lưng và khi lưng ca protein

II. Nhn bit protein mc tiêu

Kt qu ca s tinh sch là mt mu protein ch cha úng mt loi phân t, ây là mt

loi protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mu protein này ch là mt phân on chim 1%

vt liu ban u, vn có th là dch nuôi cy t bào hay mt cơ quan riêng bit ly ca

thc vt hay ng vt. ! xác nh ưc protein mc tiêu t h"n hp protein, nhà sinh

hóa cn thc hin mt th nghim da vào #c tính ca protein ó. Nu protein mc tiêu

là mt enzyme thì th nghim s ưc thc hin da trên hot tính ca enzyme ó. C

th như vi enzyme lactate dehydrogenase, mt enzyme có vai trò trong vic sn xut

nng lưng t glucose cng như t$ng hp glucose t lactate,  xác nh enzyme này thì

da trên phn ng ca nó trong t bào

Sau ó, da vào kh nng hp th ánh sáng mnh bưc sóng 340nm ca Nicotinamide

adenine dinucleotide (NADH), ta có th o ưc lưng ánh sáng ưc hp th bưc

sóng 340nm trong mt ơn v th%i gian  xác nh hot tính ca enzyme lactate

dehydrogenase. Trên thc t vic tìm ra mt th nghim hiu qu thư%ng rt khó, nhưng

nu có ưc mt cách th nghim càng #c hiu thì quá trình tinh sch càng hiu qu.

Tuy nhiên,  ch&c ch&n quá trình tinh sch hot ng tt, chúng ta còn cn mt thông s

là lưng protein có trong h"n hp ưc th nghim. Hin nay có rt nhiu phương pháp

phát hin nhanh và chính xác n'ng  protein. Da vào 2 thông s thc nghim là hot

tính enzyme và n'ng  protein, ta có th xác nh hot tính riêng ca enzyme tc là t l

hot tính enzyme vi hàm lưng protein có trong mu th nghim. Hot tính riêng càng

cao thì quá trình tinh sch càng hiu qu hay nói cách khác, mc tiêu ca vic tinh sch là

làm tng ti a hot tính riêng.

III. Ly trích protein t t bào

Khi ã tìm ra th nghim phù hp và chn ưc ngu'n protein, chúng ta cn phân on

dch t bào thành nhiu phn và xác nh xem phn nào cha nhiu protein mc tiêu. Quá

trình tìm phân on mc tiêu ưc phát trin bng s mày mò qua tng thí nghim. Bưc

u tiên là phá v( màng t bào, to thành h"n hp 'ng cht. Sau ó phân on h"n hp

bng ly tâm, dch n$i cha phân t có trng lưng thp, nhng phân t có trng lưng

cao hơn l&ng xung áy ng ly tâm. Dch n$i li ưc ly tâm ln na vi lc mnh hơn

 to c#n và dch n$i mi. Tin trình này, ưc gi là ly tâm phân on, s to ưc

nhiu phân on khác nhau vi t trng gim dn, m"i phân on này cha hàng trm

phân t protein khác nhau, s ưc tinh sch sau khi ã qua th nghim hot tính. Thông

thư%ng, mt phân on có hot tính cao s là ngu'n vt liu cho các k) thut tinh sch

hiu qu.

IV. Thu nhn protein mc tiêu da trên  hoà tan, kích thưc, in tích, và liên

kt ái lc

Hàng ngàn protein ã ưc tinh sch dng có hot tính da trên nhng #c tính cn bn

như  hòa tan, kích thưc, in tích và liên kt ái lc. Thông thư%ng, mt h"n hp

protein s tri qua nhiu giai on phân tách, m"i giai on da trên mt #c tính nht

nh,  cui cùng là mt protein tinh sch. * m"i bưc phân tách, th nghim xác nh

hot tính và xác nh n'ng  protein u ưc thc hin. Lưng áng k protein tinh

sch, khong vài miligram, có th giúp ta bit ưc cu trúc không gian ba chiu và cơ

ch phn ng ca nó. Vì vy, sn lưng toàn phn là mt im quan trng ca quá trình

tinh sch. Các k) thut tinh sch thư%ng dùng: ta bng mui, màng bán dn, s&c ký.

IV.1 Ta bng mui

* n'ng  mui cao, phn ln protein s gim tính hòa tan, hin tưng này gi là ta

bng mui (salting out). M"i loi protein s kt ta mt n'ng  mui nht nh. Vì

vy, hin tưng ta b i mui có th ưc dùng  phân on protein. Ví d như

fibrinogen ta n'ng  mui ammonium sulfate 0.8 M trong khi phi n n'ng  2.4

M, albumin mi kt ta. Hin tưng này ưc s dng  tng n'ng  ca mt dung

dch protein loãng cha các phân on có hot tính ca các bưc tinh sch trưc. Nu cn

thit, lưng mui có th ưc loi b+ bng s th,m tách

IV.2 S thm tách

Protein có th ưc phân tách bng s th,m tách thông qua màng bán dn, ch-ng hn

màng cellulose vi nhiu l". Nhng phân t có cu trc không gian nht nh ln hơn

dư%ng kính ca l" s b gi li bên trong túi th,m tách, trong khi ó, nhng phân t nh+

hơn và các ion s i qua các l" ó ra ngoài túi. K) thut này dùng  loi b+ mui hay

tách nhng phân t nh+, nhưng vi k) thut này không phân bit ưc các loi protein

vi nhau.

IV.3 Sc ký

S&c ký là mt phương pháp phân tách quan trng nht trong sinh hc phân t vì nó thích

hp vi nhiu loi hp cht và sn ph,m tinh sch có th ưc s dng ngay cho vic

nh lưng và nh danh.

Mt h s&c ký g'm pha t.nh, pha ng và mu cn phân tách. Trong ó, tùy vào loi mu

cn phân tách ta có th la chn loi s&c ký cng như nguyên liu cho pha c nh và pha

di ng.

Trong tinh sch protein, có bn phương pháp ưc ng dng nhiu nht là s&c ký lc gel

da vào kích thưc ca phân t (size exclusion chromagraphy), s&c ký trao $i ion da

vào in tích ca phân t (ion exchange chromagraphy), s&c ký ái lc da vào ái lc ca

phân t vi mt loi phân t khác (affinity chromagraphy) và s&c ký l+ng cao áp da vào

kích thưc ca phân t nhưng có  phân gii cao nh% vào áp sut (high pressure liquid

chromagraphy).

IV.3.1 Sc ký lc gel

Phương pháp này tt hơn các phương pháp trên vì nó da vào kích thưc phân t. Mu s

ưc np vào u mt ct cha nhiu ht có l" làm t polymer không tan nhưng có tính

hydrate hóa cao như dextran, agarose (nhng dng cabohydrate) hay polyacrylamide.

Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là nhng loi gel ph$ bin trên th trư%ng có s/n nhng

ht có l" vi ư%ng kính chu,n là 100µm (0.1mm). Nhng phân t nh+ có th c bên

trong ln gia các ht, trong khi ó nhng phân t ln hơn ch có th bên ngoài các ht.

Vì vy, nhng phân t có kích thưc ln trong ct s chy nhanh hơn và ra ngoài trưc .

Phân t có kích thưc trung bình, có th thnh thong vào ưc bên trong ht s r%i kh+i

ct v trí gia; còn nhng phân t nh+ s phi i qua on ư%ng dài hơn, quanh co nên

s ra sau cùng.

IV.3.2 Sc ký trao i ion

Ti bt k0 mt im pH nào tr im -ng in, các protein u có mang mt in tích

tương ng vi im pH ó. Da vào in tích thc ca chúng ti mt im pH nht nh,

ta có th phân tách h"n hp protein. Phương pháp này gi là phương pháp s&c ký trao $i

ion. Trong phương pháp này, pha t.nh là nhng ht mang s/n mt in tích nht nh,

nhng ht này s tương tác vi các phân t (protein) mang in tích trái du vi chúng.

C th, nu ht mang in âm (như ct carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tin

trình ưc gi là s&c ký trao $i ion dương, thì s tương tác vi nhng phân t mang in

tích dương. Ngưc li, nu ht mang in tích dương (như ct diethylaminoethyl-

cellulose (DEAE-cellulose)), gi là s&c ký trao $i ion âm, thì tương tác vi phân t

mang in tích âm. Vì th, nhng protein cùng du vi ct s chy ra kh+i ct trong khi

nhng protein trái du b gi li ct. ! phóng thích nhng protein này, ta tng n'ng 

ion ca pha ng, nhng ion này s th phân t protein tương tác vi các ht mang in

tích. Ví d, trong s&c ký trao $i ion dương, ta thêm mui natri clorua hay mui khác

trong dung dch tách gii b i vì ion natri s tranh bám vào ct vi các protein có in tích

dương, do ó, nhng protein mang in tích dương ưc phóng thích ra ngoài ct ln

lưt theo  ln v in tích.

Hình 1: minh ha sc ký trao i ion

Hình 2: minh ha c ch gia protein trong h sc ký trao i ion

(a) Nhng ht mang in tích dưng s trao i ion âm vi dung dch m. Protein

tích in âm cng ion dưng tưng tác vi nó

(b) Khi protein gn vi ht, protein thay th nhng ion âm tưng tác vi ht cng như

ht thay th nhng ion dưng tưng tác vi protein

IV.3.3 Sc ký ái lc

!ây là mt phương pháp rt hiu qu và ưc ng dng rng rãi trong vic tinh sch

protein. K) thut này da trên ái lc cao ca nhiu protein vi nhng nhóm hóa hc

chuyên bit. Ví d, concanavalin A, mt loi protein thc vt, có th ưc tinh sch khi

cho qua ct mang nhng phân t glucose bng liên kt cng hóa tr. Concanavalin A g&n

vào ct b i vì nó có ái lc cao vi glucose, trong khi ó nhng protein khác thì không.

Concanavalin A có th ưc tách gii kh+i ct khi ta cho thêm dung dch glucose m

#c vào. Phân t ư%ng trong dung dch s g&n vi Concanavalin A thay th nhng phân

t glucose ni vi ct.

Tài liệu: Tinh sạch protein

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi