Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 2/2013<br />
<br />
KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br />
<br />
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM THẺ<br />
CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) BẰNG ALCALASE THEO<br />
PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG<br />
OPTIMIZATION OF PROTEIN HYDROLYSIS FROM WHITE SHRIMP HEAD<br />
(Penaeus vannamei) BY ALCALASE ADOPTING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY<br />
Nguyễn Thị Ngọc Hoài1, Ngô Thị Hoài Dương2, Ngô Đăng Nghĩa3<br />
Ngày nhận bài: 25/12/2012; Ngày phản biện thông qua: 06/5/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Nghiên cứu thu hồi protein từ đầu tôm bằng enzyme nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu tôm, góp phần<br />
hạn chế thất thoát tài nguyên và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Thực hiện tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ đầu<br />
tôm bằng Alcalase theo phương pháp mặt đáp ứng, sử dụng mô hình composit. Tối ưu 3 nhân tố tỉ lệ alcalase (0,1-0,5%),<br />
nhiệt độ thủy phân (50-70oC), thời gian thủy phân (2-8 giờ), với hai hàm mục tiêu là hàm lượng protein hòa tan và nồng<br />
độ DPPH. bị khử. Kết quả thu được thông số tối ưu ở nồng độ Alcalase là 0,382%, nhiệt độ thủy phân là 62oC, thời gian<br />
thủy phân là 2 giờ. Dịch protein thu được có hàm lượng protein hòa tan là 2401,4±0,75mg/130ml, khả năng khử gốc tự do<br />
45,7±3,09 µM/mg protein hòa tan. Dịch protein thu được có chất lượng tốt, hàm lượng protein hòa tan cao, đặc biệt là<br />
có khả năng chống oxy hóa tốt, trong dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng có chứa hầu hết các loại axit amin<br />
không thay thế và chứa các loại acid béo không no nên có thể ứng dụng vào các mục đích như làm thực phẩm chức năng<br />
cho người.<br />
Từ khóa: đầu tôm, alcalase, chống oxy hóa<br />
<br />
ABSTRACT<br />
Study on recovery of protein from shrimp waste by enzyme aimed to improve the efficiency of using the raw<br />
material, to reduce the loss in processing and to limit the environment pollution. The process of hydrolysis of protein from<br />
the shrimp head by alcalase enzyme was optimized according to method of response surface, using composite model. Three<br />
factors chosen were alcalase:subtrate ratio (0.1-0.5%), hydrolysis temperature (50-700C), incubation time (2-4h) with the<br />
two response variables that were solube protein concentration and reduced DPPH concentration. The results shown that<br />
the optimal area was correspond to alcalase:subtrate ratio of 0.38%, temperature of 620C and incubation time of 2 hours,<br />
according to solube protein concentration of 2401.4 ± 0.75 mg/130ml hydrolysate and reducing ability of 45.7 ± 3.09mM/mg<br />
of solube protein. The product obtained had good quality, rich of solube protein, especially high antioxidant ability.<br />
Besides, with the essential amino acids and unsaturated fatty acids included, the protein hydrolysate could be used as<br />
functional food for human.<br />
Key word: shrimp head, alcalase, antioxidant<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Phế liệu tôm là những thành phần phế thải từ<br />
các cơ sở chế biến tôm bao gồm: đầu, vỏ và đuôi<br />
tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai<br />
quy cách hoặc tôm bị biến màu. Tùy thuộc vào loài<br />
<br />
và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể<br />
chiếm 60% khối lượng tôm nguyên liệu. Đối với tôm<br />
thẻ chân trắng Penaeus vannamei, lượng phế liệu<br />
đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9% khối lượng<br />
tôm nguyên liệu, như vậy tổng lượng phế liệu đầu<br />
<br />
Nguyễn Thị Ngọc Hoài: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang<br />
ThS. Ngô Thị Hoài Dương: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang<br />
3<br />
PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa: Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang<br />
1<br />
2<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 129<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
vỏ tôm thẻ chiếm 37% khối lượng tôm nguyên liệu.<br />
Theo Shahidi et al,1999, phế liệu tôm chiếm 35-40%<br />
so với lượng nguyên liệu ban đầu còn trong phần<br />
phế liệu thì đầu tôm chiếm 71,4%, vỏ chiếm 28,6%<br />
và có thể đặt ra vấn đề là chúng sẽ hư hỏng và gây<br />
vấn nạn về môi trường. Do đó việc giảm lượng phế<br />
liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng<br />
chúng chính là một phương cách giúp làm tăng lợi<br />
nhuận cho ngành thủy sản đồng thời làm giảm ô<br />
nhiễm môi trường.<br />
Trong phế liệu tôm có rất nhiều thành phần có<br />
giá trị như chitin, protein, astaxanthin và khoáng<br />
hữu cơ. Tuy nhiên, hiện nay lượng phế liệu này chủ<br />
yếu được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình<br />
sản xuất chitin. Các qui trình sản xuất chitin đang<br />
sử dụng là các qui trình hóa học và chỉ tập trung thu<br />
hồi chitin mà không thu hồi các thành phần có giá trị<br />
khác là protein. Do đó, việc nghiên cứu tối ưu hóa<br />
quá trình thủy phân đầu tôm bằng enzyme thương<br />
mại Alcalase là cần thiết, tận dụng được nguồn<br />
protein lớn vào một số ứng dụng hữu ích như làm<br />
thực phẩm chức năng cho con người, góp phần<br />
giảm thiểu ô nhiễm môi trường.<br />
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử<br />
dụng là phương pháp hàm đáp ứng bề mặt - thiết<br />
kế có cấu trúc tâm (RSM-CCD). Phương pháp bề<br />
mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê<br />
sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm<br />
để xác định và giải thích nhiều biến phương trình.<br />
RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải<br />
thích và một hay nhiều biến phản ứng. Người ta gọi<br />
là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu<br />
của một quá trình vật lý không gian - thời gian ngẫu<br />
nhiên cho những biến kích thích. Đặc tính được<br />
nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự<br />
chuyển đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng<br />
(hay còn gọi là chức năng chuyển đổi). Sự thay đổi<br />
giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay<br />
đổi chức năng của hàm mục tiêu. Những mô hình<br />
thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn<br />
các biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát<br />
và tính toán sai số. Những biến đầu vào Xi (i = 1,<br />
…,n) cũng được gọi là những biến cơ sở. Chúng<br />
được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê<br />
µj (j = 1,…,p) (chức năng phân phối độc lập hoặc<br />
tương quan, cơ hội chuẩn hóa…). Trong trường<br />
hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi<br />
theo không gian - thời gian. Việc điều chỉnh mục<br />
tiêu phải dựa trên một cơ sở của những số liệu thí<br />
nghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ mét<br />
<br />
130 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
Số 2/2013<br />
cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra<br />
được các thông số Xk. Sự biểu diễn hình học của<br />
chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong,<br />
một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng được<br />
gọi là bề mặt đáp ứng.<br />
II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên vật liệu<br />
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)<br />
được chọn là đối tượng nghiên cứu. Đầu tôm được<br />
lấy từ nguyên liệu tôm thẻ chân trắng chế biến tại<br />
Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh<br />
Hòa. Nguyên liệu sau khi lấy được vận chuyển ngay<br />
bằng thùng xốp cách nhiệt có bảo quản nước đá,<br />
nhiệt độ < 50C về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu<br />
trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời<br />
gian 5 phút. Trong trường hợp chưa làm ngay thì<br />
rửa sạch, được bao gói và mang đi bảo quản đông<br />
ở điều kiện nhiệt độ -200C tại phòng thí nghiệm<br />
Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường.<br />
Chế phẩm enzyme protease Alcalase thương<br />
mại của hãng Novozyme, được chiết xuất từ<br />
Bacillus licheniformis. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất<br />
là 0÷100C, điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme<br />
Alcalase là AF 2,4 L, pH = 8, nhiệt độ: 50 ÷ 60oC<br />
(122 ÷ 140oF). Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại<br />
tinh khiết phân tích (PA).<br />
2. Phương pháp nghiên cứu<br />
Đầu tôm đã được bảo quản đông ở -200C, được<br />
rã đông qua đêm ở 40C, bổ sung thêm nước với tỷ lệ<br />
1:1, gia nhiệt ở 900C trong 15 phút, sau đó làm nguội<br />
nhanh và bổ sung enzyme, được đưa đi thủy phân,<br />
sau khi thủy phân xong, lấy mẫu ra bất hoạt enzym ở<br />
900C trong 10 phút. Tách lấy riêng phần dịch và bã,<br />
phần dịch thu được mang đi ly tâm ở 6000 vòng/phút,<br />
40C, 15 phút. Xác định hàm lượng protein hòa tan<br />
trong dịch thủy phân và khả năng khử gốc tự do của<br />
dịch thủy phân. Chọn được chế độ xử lý nguyên liệu<br />
thích hợp nhờ tối ưu hóa quá trình thủy phân đầu<br />
tôm theo mô hình Composit.<br />
- Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng<br />
phương pháp so màu: phương pháp Biuret theo<br />
Gornall và cộng sự (1948).<br />
- Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch<br />
thuỷ phân thu được bằng test kiểm tra khả năng<br />
kiểm soát gốc tự do DPPH theo quy trình của Huynh<br />
và cộng sự (2010).<br />
- Phân tích thành phần acid amin và acid béo<br />
theo phương pháp GC (gas chromatography).<br />
Thiết kế thí nghiệm: Bố trí thí nghiệm theo<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 2/2013<br />
<br />
phương pháp mặt đáp ứng (Central Composite Design (CCD)), bao gồm 20 thí nghiệm, trong đó có 8 thí nghiệm<br />
nhân tố, 6 thí nghiệm ở tâm, và 6 thí nghiệm xung quanh trục. Kết quả của 20 thí nghiệm này là giá trị trung bình<br />
của 3 lần lặp. Các giá trị biên và giá trị trung tâm của các biến độc lập được biểu diễn ở bảng 1.<br />
Bảng 1. Giá trị các yếu tố và mức yếu tố cho phân thích mặt đáp ứng<br />
Biến độc lập<br />
<br />
Mức yếu tố<br />
<br />
Tỉ lệ enzyme (%)(A)<br />
<br />
Nhiệt độ (oC)(B)<br />
<br />
Thời gian (giờ)(C)<br />
<br />
-1<br />
<br />
0,1<br />
<br />
50<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
+1<br />
<br />
0,5<br />
<br />
70<br />
<br />
8<br />
<br />
Các yếu tố cố định: Tỷ lệ nước/ nguyên liệu= 1/1, pH tự nhiên = 6,5<br />
Hàm mục tiêu: Hàm lượng protein hòa tan (mg protein hòa tan/ 130ml dịch) (Y1) càng cao càng tốt, tìm giá<br />
trị cực đại cho Y1<br />
Nồng độ DPPH bị khử (µM/ mg protein hòa tan) (Y2) càng nhiều càng tốt, tìm giá trị cực đại cho Y2, A, B, C<br />
là biến thực.<br />
Kết quả thu được ở Bảng 2 được xử lý bằng phần mềm Design Expert 7.01 (DX7), thu được mặt đáp ứng<br />
của các biến độc lập.<br />
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br />
Kết quả thủy phân đầu tôm bằng Alcalase khi thực hiện thí nghiệm theo thiết kế RSM-CCD được thể hiện<br />
ở bảng 2, kết quả này được nhập vào phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành phân tích thu được mô hình<br />
hồi quy.<br />
Bảng 2. Kết quả thí nghiệm theo quy hoạch bậc hai composite<br />
N<br />
<br />
Tỉ lệ enzyme (%)<br />
<br />
Nhiệt độ<br />
(oC)<br />
<br />
Thời gian<br />
(giờ)<br />
<br />
Hàm lượng protein hòa tan(mg/130ml<br />
dịch thủy phân)<br />
<br />
Nồng độ DPPD bị khử<br />
(µM/mg protein hòa tan)<br />
<br />
1<br />
<br />
0,1<br />
<br />
50<br />
<br />
2<br />
<br />
1779,52<br />
<br />
36,77141<br />
<br />
2<br />
<br />
0,5<br />
<br />
50<br />
<br />
2<br />
<br />
2043,053<br />
<br />
40,46754<br />
<br />
3<br />
<br />
0,1<br />
<br />
70<br />
<br />
2<br />
<br />
2160,828<br />
<br />
40,97218<br />
<br />
4<br />
<br />
0,5<br />
<br />
70<br />
<br />
2<br />
<br />
2019,116<br />
<br />
44,2455<br />
<br />
5<br />
<br />
0,1<br />
<br />
50<br />
<br />
8<br />
<br />
1658,287<br />
<br />
35,6765<br />
<br />
6<br />
<br />
0,5<br />
<br />
50<br />
<br />
8<br />
<br />
2061,043<br />
<br />
40,4495<br />
<br />
7<br />
<br />
0,1<br />
<br />
70<br />
<br />
8<br />
<br />
1944,834<br />
<br />
36,6672<br />
<br />
8<br />
<br />
0,5<br />
<br />
70<br />
<br />
8<br />
<br />
2047,932<br />
<br />
39,1086<br />
<br />
9<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2412,454<br />
<br />
42,6634<br />
<br />
10<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2455,766<br />
<br />
40,8816<br />
<br />
11<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2465,075<br />
<br />
42,1588<br />
<br />
12<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2611,056<br />
<br />
40,3549<br />
<br />
13<br />
<br />
0,04<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
1805,1<br />
<br />
26,3319<br />
<br />
14<br />
<br />
0,56<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2317,842<br />
<br />
34,3788<br />
<br />
15<br />
<br />
0,3<br />
<br />
46,84<br />
<br />
5<br />
<br />
2135,515<br />
<br />
21,9675<br />
<br />
16<br />
<br />
0,3<br />
<br />
73,16<br />
<br />
5<br />
<br />
2326,128<br />
<br />
25,78636<br />
<br />
17<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
1,05<br />
<br />
2758,93<br />
<br />
36,0591<br />
<br />
18<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
8,95<br />
<br />
2736,98<br />
<br />
33,28773<br />
<br />
19<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2597,343<br />
<br />
33,7869<br />
<br />
20<br />
<br />
0,3<br />
<br />
60<br />
<br />
5<br />
<br />
2703,524<br />
<br />
31,1505<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 131<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
1. Ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ enzyme, nhiệt độ<br />
và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein<br />
hòa tan<br />
Hàm hồi quy:<br />
Hàm lượng protein hòa tan = 2590,47+113,61A+<br />
76,91B−88,11*A*B−338,80A2 −233,03B2(1)<br />
Phương trình (1) có p< 0,001 cho thấy mô hình<br />
tương thích với thực nghiệm. Có R2=96,32% có<br />
nghĩa là nó áp dụng đúng 96,32% trường hợp thực<br />
nghiệm, mô hình này phản ánh quan hệ giữa các<br />
biến số ở mức độ tin cậy là 99% vì giá trị p của<br />
<br />
Số 2/2013<br />
phương trình < 0,0001. Giá trị p của các biến cũng<br />
nhỏ pA= 0,0014, pB= 0,013, pA*B= 0,0162, p của A2,<br />
B2 < 0,0001. Như vậy sự có mặt của các yếu tố tỉ<br />
lệ enzyme A, nhiệt độ B, A*B. A2, B2 đều có ý nghĩa.<br />
Khi xem xét phân tích đơn giản hơn với các biến<br />
số bậc một và hai nhưng vắng mặt tương tác giữa<br />
chúng, kết quả cũng thu được các phương trình hồi<br />
qui không tương thích thực nghiệm. Vì vậy phương<br />
trình được chấp nhận. Thu được đồ thị biểu diễn sự<br />
biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi<br />
của tỷ lệ enzyme và nhiệt độ thủy phân như sau:<br />
<br />
Hình 1. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi của tỉ lệ Alcalase<br />
và nhiệt độ thủy phân<br />
<br />
Nhìn vào phương trình hồi qui (1) có thể thấy<br />
rằng đây là mặt elliptic paraboloic với đỉnh quay lên<br />
nên có giá trị cực đại. Vì các số liệu thực nghiệm sử<br />
dụng thiết lập phương trình của mặt cong này cho<br />
thấy rằng, nếu tăng tỉ lệ enzyme, tăng nhiệt độ thì<br />
hàm lượng protein hòa tan sẽ tăng dần, đạt cực đại,<br />
sau đó giảm xuống, nên chắc chắn mặt đáp ứng<br />
của (1) sẽ có điểm cực đại, đó cũng chính là điểm<br />
tối ưu mà chúng ta đang quan tâm. Nhìn vào giá trị<br />
các hệ số của phương trình hồi quy ta dễ nhận ra<br />
một điều là hệ số của A2, B2 là lớn hơn so với các hệ<br />
số khác và mang dấu âm thể hiện ảnh hưởng đáng<br />
kể của chúng đến quá trình thủy phân. Hệ số của tỉ<br />
lệ enzyme và nhiệt độ thủy phân mang dấu dương<br />
chứng tỏ việc tăng tỉ lệ enzyme hoặc nhiệt độ thủy<br />
phân thì hàm lượng protein hòa tan thu được là tỷ<br />
lệ thuận. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là hệ số của<br />
A*B mang dấu âm, điều này có nghĩa là, khi tăng<br />
hoặc giảm đồng thời tỉ lệ enzyme và nhiệt độ thủy<br />
phân thì tương tác giữa hai yếu tố này tỷ lệ nghịch<br />
với hàm lượng protein hòa tan tạo thành. Trên cơ<br />
sở số liệu thực nghiệm, khi tăng tỉ lệ enzyme thì<br />
hàm lượng protein hòa tan tạo thành sẽ tăng, tuy<br />
nhiên mức độ tăng của hàm lượng protein tạo thành<br />
chậm dần khi tỉ lệ enzyme tăng lên cao, hệ số tỷ lệ<br />
giữa hàm lượng protein hòa tan và tỉ lệ enzyme A<br />
chỉ thỏa mãn trong khoảng ta đã chọn. Khi tăng A, B<br />
<br />
132 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
đến một mức nào đó, hàm lượng protein hòa tan sẽ<br />
không tăng nữa mặc dù điều kiện thủy phân không<br />
thay đổi.<br />
Phần mềm đã đề nghị cho ta điểm tối ưu cho<br />
hàm mục tiêu như hình 1, hàm lượng protein hòa<br />
tan có giá trị cao nhất ở tỉ lệ enzyme trong khoảng<br />
0,25 - 0,4%, nhiệt độ thủy phân trong khoảng<br />
58 - 650C, thời gian thủy phân khoảng 2 giờ.<br />
2. Ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ enzyme, nhiệt độ<br />
và thời gian thủy phân đến khả năng khử gốc<br />
tự do<br />
Hàm hồi quy:<br />
Khả năng khử gốc tự do<br />
DPPH (Y2) = 364,59+21,61A +11,04*B −12,39*C −<br />
10,41*B*C − 42,71B2 + 19,62C2(2)<br />
Phương trình (2) có p