Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và nghiên cứu điều kiện lên men rượu vang khóm

Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ<br /> <br /> Tập 51, Phần B (2017): 7-15<br /> <br /> DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.073<br /> <br /> TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ NGHIÊN CỨU<br /> ĐIỀU KIỆN LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM<br /> Huỳnh Xuân Phong1, Danh Minh Lợi1, Nguyễn Ngọc Thạnh1, Lê Phan Đình Quí1, Bùi Hoàng<br /> Đăng Long1, Pornthap Thanonkeo2, Mamoru Yamada3 và Ngô Thị Phương Dung1<br /> 1<br /> <br /> Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ<br /> Khoa Công nghệ, Trường Đại học Khon Kaen, Khon Kaen, Thái Lan<br /> 3<br /> Khoa Nông nghiệp, Đại học Yamaguchi, Yamaguchi, Nhật Bản<br /> 2<br /> <br /> Thông tin chung:<br /> Ngày nhận bài: 04/12/2016<br /> Ngày nhận bài sửa: 17/03/2017<br /> <br /> Ngày duyệt đăng: 30/08/2017<br /> <br /> Title:<br /> Selection of thermotolerant<br /> yeasts and study on<br /> fermentation conditions for<br /> pineapple wine production<br /> Từ khóa:<br /> Khóm, lên men ethanol, nấm<br /> men chịu nhiệt, rượu vang<br /> khóm, S. cererevisiae<br /> Keywords:<br /> Ethanol fermentation,<br /> pineapple, pineapple wine,<br /> Saccharomyces cerevisiae,<br /> thermotolerant yeast<br /> <br /> ABSTRACT<br /> The objectives of this study were to select and to identify<br /> thermotolerant yeasts for their application in pineapple fermentation<br /> at high temperature, and to study the optimum conditions for<br /> pineapple wine production. Seven isolates of thermotolerant yeasts<br /> (Y8, Y32, Y34, Y54, Y80, and Y81) were selected based on their high<br /> fermentative capacity with the ethanol content produced ranging from<br /> 4.17% to 7.45% (v/v) at 37°C. The isolate Y8 was a target selected<br /> yeast strain as having the highest ethanol contents at 37oC and 40oC<br /> of 7.45% (v/v) and 4.18% (v/v), respectively. The strains of Y8, Y32,<br /> Y34, Y54, Y80, and Y81 were identified as Saccharomyces cerevisiae<br /> and YVN7 was recognized as Candida glabrata. The optimum<br /> fermentation conditions for pineapple wine production by S. cerevisiae<br /> Y8 at 37oC were as follows: 5 days of fermentation, 18.6°Brix of initial<br /> sugar and yeast inoculum density of 107cells/mL, with ethanol content<br /> of 10.03% (v/v) and fermentative yield of 80.85% were achieved.<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu của nghiên cứu là tuyển chọn và định danh các dòng nấm<br /> men có khả năng chịu nhiệt, chịu cồn và khảo sát các điều kiện lên<br /> men rượu vang khóm. Kết quả đã tuyển chọn được 7/23 dòng nấm<br /> men (Y8, Y32, YVN7, Y81, Y34, Y54 và Y80) có khả năng lên men tốt<br /> từ dịch khóm ở 37oC, hàm lượng ethanol sinh ra trong khoảng 4,177,45% (v/v). Bảy dòng này được định danh thuộc loài Saccharomyces<br /> cerevisiae (Y8, Y32, Y34, Y54, Y80 và Y81) và loài Candida glabrata<br /> (YVN7). Dòng nấm men S. cerevisiae Y8 được tuyển chọn do có khả<br /> năng lên men tốt nhất, với lượng ethanol sinh ra cao nhất ở 37oC và<br /> 40oC lần lượt là 7,45% (v/v) và 4,18 % (v/v). Điều kiện lên men rượu<br /> vang khóm thích hợp của dòng S. cerevisiae Y8 ở 37oC với thời gian<br /> lên men 5 ngày, hàm lượng đường 18,6°Brix và mật số nấm men 107 tế<br /> bào/mL, hàm lượng ethanol đạt 10,03% (v/v) với hiệu suất lên men đạt<br /> 80,85%.<br /> <br /> Trích dẫn: Huỳnh Xuân Phong, Danh Minh Lợi, Nguyễn Ngọc Thạnh, Lê Phan Đình Quí, Bùi Hoàng<br /> Đăng Long, Pornthap Thanonkeo, Mamoru Yamada và Ngô Thị Phương Dung, 2017. Tuyển<br /> chọn nấm men chịu nhiệt và nghiên cứu điều kiện lên men rượu vang khóm. Tạp chí Khoa học<br /> Trường Đại học Cần Thơ. 51b: 7-15.<br /> <br /> 7<br /> <br /> Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ<br /> <br /> Tập 51, Phần B (2017): 7-15<br /> <br /> ý nghĩa hết sức quan trọng nhằm nâng cao giá trị<br /> sử dụng của các loại trái cây và phù hợp với nhu<br /> cầu, thị hiếu của người tiêu dùng, đồng thời tạo ra<br /> ngành sản xuất mới góp phần tạo việc làm ổn định<br /> và tăng thu nhập làm cho người dân. Từ lâu trái<br /> cây đã được chế biến để tạo ra các sản phẩm khác<br /> nhau nhưng vẫn giữ được giá trị dinh dưỡng và<br /> cung cấp năng lượng cho con người như: làm mứt,<br /> trái cây sấy khô, dịch trái cây lên men để tạo ra các<br /> sản phẩm rượu, rượu vang trái cây,... Một số sản<br /> phẩm rượu vang trái cây đã được nghiên cứu như<br /> rượu vang nho (Heard và Fleet, 1988); cam (Selli<br /> et al., 2003), xoài (Akubor, 1996), dưa hấu (Ngô<br /> Thị Phương Dung và ctv., 2011),…<br /> <br /> 1 GIỚI THIỆU<br /> Nấm men có tiềm năng rất lớn trong việc lên<br /> men chuyển hóa đường thành ethanol (một thành<br /> phần quan trọng trong rượu vang nói riêng và sản<br /> phẩm lên men ethanol nói chung). Tuy nhiên, có<br /> nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men<br /> như nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, đặc biệt là nhiệt<br /> độ và hàm lượng ethanol (Keating et al., 2006). Do<br /> đó, đặc tính chịu nhiệt và chịu ethanol của nấm<br /> men rất quan trọng trong việc tổng hợp ethanol<br /> thông qua quá trình lên men được thực hiện bởi<br /> nấm men. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến<br /> sự lên men tạo ethanol của nấm men (Heard và<br /> Fleet, 1988). Hiện nay, hiệu ứng nhà kính đang làm<br /> cho trái đất ấm dần lên và nhiệt độ vẫn tiếp tục<br /> tăng dần trong tương lai (Isaac và Soden, 2000).<br /> Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ<br /> tăng khá cao vào mùa khô, nhiệt độ trung bình ở<br /> miền Nam có thể đến 33-35ºC, càng gây khó khăn<br /> trong việc sản xuất ethanol bằng nấm men. Hơn<br /> nữa, sử dụng nấm men chịu nhiệt độ cao có thể<br /> giúp cho quá trình lên men diễn ra nhanh, nguy cơ<br /> nhiễm vi sinh vật giảm, giảm nồng độ oxy, chất khí<br /> khác,… (Roehr, 2001) và giảm được chi phí đầu tư<br /> cho thiết bị làm mát mang lại lợi ích kinh tế<br /> (Limtong et al., 2007; Abdel-Banat et al., 2010).<br /> <br /> Khóm là loại trái cây có dịch quả rất giàu dinh<br /> dưỡng và rất tốt cho sức khỏe con người. Trong<br /> các năm qua, khóm đã trở thành một loại hoa quả<br /> có giá trị xuất khẩu cao, được nhiều thị trường<br /> trong và ngoài nước ưa chuộng nhất là thị trường<br /> các nước châu Âu, các nước thuộc vùng khí hậu ôn<br /> đới. Việt Nam là một trong những nước trồng<br /> khóm chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á và trên thế<br /> giới, sản lượng năm 2013 đạt đến 590.000 tấn/năm,<br /> chiếm 2,38% sản lượng khóm trên thế giới (FAO,<br /> 2014). Sản lượng khóm tăng trong những năm qua<br /> đã đặt ra những tiềm năng và thách thức mới cho<br /> ngành công nghiệp bảo quản và chế biến từ nguồn<br /> nguyên liệu quý báu này. Sản xuất rượu vang khóm<br /> nhằm đa dạng hóa sản phẩm cũng như tăng hiệu<br /> quả đối với loại cây trồng này, đặc biệt trong<br /> trường hợp vào mùa thu hoạch chính và chưa có<br /> đầu ra bền vững.<br /> <br /> Saccharomyces cerevisiae là chủng nấm men<br /> truyền thống được ứng dụng trong lên men rượu và<br /> được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men<br /> ethanol (Radecka et al., 2015). Hầu hết các chủng<br /> S. cerevisiae chịu được giá trị pH thấp, hàm lượng<br /> đường và nồng độ ethanol cao nhưng hiệu suất lên<br /> men ở nhiệt độ trên 35oC khá thấp (Nevoigt, 2008).<br /> Kluyveromyces marxianus có thể phát triển ở nhiệt<br /> độ 47oC, thậm chí là 52oC (Banat et al., 1992) và<br /> sản sinh ethanol ở nhiệt độ cao trên 40oC (Fonseca<br /> et al., 2008). Hơn nữa, K. marxianus còn có thuận<br /> lợi là tốc độ phát triển nhanh và khả năng sử dụng<br /> rộng rãi các cơ chất trong công nghiệp như đường<br /> mía, bắp, nước trái cây, rỉ đường,... (Nonklang et<br /> al., 2008). Chủng nấm men K. marxianus DMKU<br /> 3-1042 được phân lập từ đất trồng mía có khả năng<br /> lên men và chịu nhiệt đến 45oC (Limtong et al.,<br /> 2007) và được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về<br /> sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men<br /> của nấm cả về cơ chế sinh hóa và sinh học phân tử<br /> (Nonklang et al., 2008; Rodrussamee et al., 2011;<br /> Lertwattanasakul et al., 2015).<br /> <br /> Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tuyển chọn,<br /> định danh các chủng nấm men chịu nhiệt triển<br /> vọng có khả năng lên men ethanol từ dịch ép khóm<br /> và xác định các điều kiện lên men rượu vang khóm<br /> ở nhiệt độ cao.<br /> 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất<br /> Nguyên liệu: Khóm (giống Queen) chín được<br /> mua ở chợ Cái Răng, thành phố Cần Thơ.<br /> Hai mươi ba (23) dòng nấm men chịu nhiệt đã<br /> được phân lập từ nhiều nguồn nguyên liệu (ca cao,<br /> trái cây, mía và đất trồng mía, men rượu,…) và sơ<br /> tuyển dựa vào đặc tính chịu nhiệt, khả năng lên<br /> men ethanol được lưu trữ ở phòng thí nghiệm Công<br /> nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Cần<br /> Thơ (Ngo Thi Phuong Dung et al., 2015) và chủng<br /> Kluyveromyces marxianus DMKU 3-1042 (Trường<br /> Đại học Yamaguchi, Nhật Bản).<br /> Hóa chất: yeast extract, malt extract, peptone,<br /> D-glucose, agar, ethanol, NaOH,… được mua từ<br /> các sản phẩm thương mại của Merck (Đức) và<br /> HiMedia Laboratories (Ấn Độ).<br /> <br /> Trái cây tươi không những là sản phẩm có giá<br /> trị dinh dưỡng cao mà còn là thực phẩm tươi phục<br /> vụ trực tiếp trong đời sống hằng ngày như cung cấp<br /> vitamin, acid hữu cơ, muối khoáng cho con người.<br /> Trái cây được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi, bên<br /> cạnh đó phát triển các sản phẩm từ trái cây cũng có<br /> 8<br /> <br /> Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ<br /> <br /> Tập 51, Phần B (2017): 7-15<br /> <br /> Môi trường YPD (yeast extract 0,5%; peptone<br /> 0,5%; D-glucose 2,0%) và môi trường YPD agar<br /> (môi trường YPD bổ sung 1,5 g/L agar) (Limtong<br /> et al., 2007).<br /> 2.2 Thử nghiệm khả năng lên men rượu<br /> vang khóm ở 37°C<br /> <br /> Nấm men được tăng sinh khối trong môi trường<br /> YDP đến khi mật số đạt 108 tế bào/mL. Ly tâm để<br /> thu sinh khối nấm men, mật số đạt 109 tế bào/mL.<br /> Pha loãng dịch nấm men với các mật số 109, 108 và<br /> 107 tế bào/mL (mật số nấm men sau khi chủng vào<br /> bình tam giác lần lượt đạt 107, 106 và 105 tb/mL).<br /> Thí nghiệm được tiến hành với 3 nhân tố: mật số<br /> giống chủng (105, 106 và 107 tb/mL), hàm lượng<br /> đường theo Brix (14,2; 18,6; 22,8°Brix) và thời<br /> gian lên men (5, 7 và 9 ngày). Nước ép khóm được<br /> thanh trùng bằng NaHSO3 (140 mg/L trong 2 giờ).<br /> Mỗi nghiệm thức lên men được thực hiện với 99<br /> mL nước ép khóm trong bình tam giác 250 mL ở<br /> 37oC. Các chỉ tiêu phân tích như pH, Brix, hàm<br /> lượng đường và ethanol sau khi lên men ở các mốc<br /> thời gian bố trí thử nghiệm.<br /> 2.6 Phân tích và xử lý kết quả<br /> <br /> Nấm men được tăng sinh khối trong 100 mL<br /> môi trường tăng sinh YPD đã được khử trùng ở<br /> 121oC trong 15 phút. Ủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt<br /> độ phòng (28-32oC) trong 24 giờ (mật số đạt 108 tế<br /> bào/mL). Nước ép khóm được thanh trùng bằng<br /> NaHSO3 (140 mg/L trong 2 giờ). Chủng 1 mL (mật<br /> số 108 tế bào/mL) các dòng nấm men và chủng K.<br /> marxianus vào 99 mL nước ép khóm trong bình<br /> tam giác 250 mL, đậy kín bằng water-lock và ủ ở<br /> nhiệt độ 37oC trong 5 ngày. Kiểm tra dịch lên men<br /> với các chỉ tiêu như pH, Brix, hàm lượng đường và<br /> hàm lượng ethanol để tính toán hiệu suất lên men.<br /> 2.3 Thử nghiệm khả năng lên men rượu<br /> vang khóm ở 40°C<br /> <br /> Giá trị pH được xác định bằng pH kế<br /> (Sartorius, PB-20, Đức), Brix được xác định bằng<br /> khúc xạ kế (Hand Refractometer, FG103/113,<br /> Euromex-Hà Lan), hàm lượng đường khử được<br /> phân tích thông qua phản ứng với acid<br /> dinitrosalicylic (phương pháp DNS, Bennett, 1971)<br /> và hàm lượng ethanol được xác định bằng phương<br /> pháp chưng cất (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn<br /> Thanh Hằng, 2005). Mật số tế bào được xác định<br /> bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm<br /> hồng cầu (Hemocytometer HBG German<br /> Chamber). Kết quả thí nghiệm được xử lý và vẽ<br /> biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2010<br /> (Microsoft Corporation, USA). Số liệu thí nghiệm<br /> được xử lý thống kê bằng chương trình<br /> Statgraphics Centurion XV ver 15.1.02 (Statpoint<br /> Technologies, Inc., USA).<br /> <br /> Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên<br /> với các dòng nấm men được tuyển chọn từ kết quả<br /> lên men ở 37°C. Thử nghiệm được thực hiện ở<br /> 40°C và lặp lại 3 lần. Nước ép khóm và dịch sinh<br /> khối nấm men được chuẩn bị và thực hiện tương tự<br /> như thử nghiệm ở 37°C với các dòng nấm men đã<br /> được tuyển chọn. Ủ lắc 150 vòng/phút trong 5 ngày<br /> lên men ở nhiệt độ 40°C trong tủ ủ lắc (Incucell<br /> 111, Đức).<br /> 2.4 Định danh các chủng nấm men chịu<br /> nhiệt được tuyển chọn<br /> Các dòng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn<br /> được tăng sinh trong 10 mL môi trường YPD ở<br /> 37°C trong 24 giờ. Nấm men được trích DNA và<br /> khuếch đại trình tự vùng D1/D2 trên 26S rDNA<br /> bằng phản ứng PCR với cặp mồi NL-1<br /> (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)<br /> và NL-4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGAC GG-3’)<br /> (O’Donnell, 1993). Sản phẩm PCR được giải trình<br /> tự bằng hệ thống giải trình tự ABI PRISM 3100<br /> (Applied Biosystems, USA). Dựa trên trình tự 26S<br /> rDNA để phân tích và so sánh với trình tự các<br /> chủng nấm men trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Xây<br /> dựng cây phả hệ dựa trên trình tự đoạn gene 26S<br /> rDNA bằng cách so sánh multiple aligment theo<br /> chương trình CLUSTAL X (Thompson et al.,<br /> 1997) và thiết lập theo phương pháp neigborjoining trong chương trình MEGA 6 (Tamura et<br /> al., 2013) với chỉ số bootstrap 1.000 lần lặp lại.<br /> 2.5 Khảo sát điều kiện lên men rượu vang<br /> khóm bằng nấm men chịu nhiệt<br /> <br /> 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1 Khả năng lên men rượu vang khóm ở<br /> 37°C<br /> Kết quả khả năng lên men của 23 dòng nấm<br /> men chịu nhiệt và chủng K. marxianus DMKU 31042 (đối chứng) trong môi trường dịch khóm với<br /> pH 4,5, hàm lượng đường ở 20oBrix được thể hiện<br /> ở Bảng 1. Sau 5 ngày lên men, pH và Brix của dịch<br /> khóm giảm, pH kết thúc lên men trong khoảng<br /> 3,75-4,24 (pH ban đầu là 4,5) và Brix ở mức 10,016,5% (Brix ban đầu là 20%). Hàm lượng ethanol<br /> dao động khá lớn giữa các dòng nấm men, trong<br /> khoảng 1,71-7,40% (v/v). Hiệu suất lên men dao<br /> động trong khoảng 30,82-74,56%, tương ứng với<br /> lượng đường tiêu thụ 83,41-178,03 g. Dòng nấm<br /> men Y8 (được phân lập từ ca cao) có khả năng với<br /> hàm lượng ethanol đạt cao nhất là 7,45% (v/v),<br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%,<br /> so với các chủng còn lại, tiếp đến là dòng Y32 với<br /> hàm lượng ethanol đạt 7,01% (v/v). Hiệu suất lên<br /> <br /> Sử dụng 1 dòng nấm men có khả năng lên men<br /> mạnh nhất từ thử nghiệm lên men ở 37°C và 40°C.<br /> 9<br /> <br /> Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ<br /> <br /> Tập 51, Phần B (2017): 7-15<br /> <br /> men của chủng Y8 là 74,56% (v/v) khác biệt có ý<br /> nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% so với hầu hết<br /> các dòng nấm men còn lại (trừ dòng Y32, Y34 và<br /> Y80 có hiệu suất là 61,9%, 60,55% và 59,77%).<br /> Ngoài ra, các chủng nấm men có khả năng lên men<br /> <br /> khá tốt như dòng YVN7, Y81, Y34, Y54 và Y80<br /> với hàm lượng ethanol sinh ra tương đối cao lần<br /> lượt là 6,06%; 5,11%; 5,11%; 4,60% và 4,37%<br /> (v/v) với hiệu suất lên men tương ứng 56,62%;<br /> 51,30%; 55,57% và 59,77%.<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả sau lên men của các dòng nấm men trong dịch khóm ở 37oC<br /> Chủng<br /> nấm men<br /> Y8<br /> Y29<br /> Y31<br /> Y32<br /> Y33<br /> Y34<br /> Y35<br /> Y37<br /> Y38<br /> Y39<br /> Y42<br /> Y47<br /> Y53<br /> Y54<br /> Y80<br /> Y81<br /> Y88<br /> Y104<br /> YVN3<br /> YVN7<br /> YVN8<br /> YVN12<br /> YVN30<br /> K.marxianus<br /> CV (%)<br /> <br /> pH sau<br /> lên men<br /> 4,01<br /> 4,12<br /> 4,10<br /> 4,08<br /> 4,09<br /> 4,11<br /> 4,13<br /> 4,14<br /> 4,08<br /> 4,09<br /> 4,06<br /> 4,14<br /> 4,14<br /> 3,75<br /> 4,09<br /> 4,02<br /> 4,11<br /> 4,04<br /> 4,12<br /> 4,24<br /> 4,09<br /> 4,12<br /> 4,16<br /> 3,94<br /> <br /> Brix sau<br /> lên men<br /> 10,00<br /> 15,57<br /> 15,37<br /> 11,87<br /> 15,47<br /> 14,00<br /> 15,53<br /> 15,73<br /> 15,43<br /> 15,33<br /> 15,53<br /> 15,70<br /> 15,47<br /> 14,40<br /> 14,20<br /> 12,63<br /> 15,47<br /> 15,50<br /> 15,57<br /> 12,07<br /> 17,07<br /> 17,97<br /> 16,50<br /> 11,83<br /> <br /> Ethanol<br /> (% v/v)<br /> 7,45a 1<br /> 3,07fg<br /> 3,37efg<br /> 7,01ab<br /> 2,99g<br /> 5,11cd<br /> 3,21fg<br /> 2,96g<br /> 3,45efg<br /> 3,28fg<br /> 3,25fg<br /> 3,23fg<br /> 3,31fg<br /> 4,60de<br /> 4,37def<br /> 5,11cd<br /> 3,10fg<br /> 3,27fg<br /> 3,37efg<br /> 6,06bc<br /> 3,55efg<br /> 1,71h<br /> 2,95g<br /> 6,60ab<br /> 16,67<br /> <br /> Đường sử dụng<br /> (g/L)<br /> 154,48<br /> 96,86<br /> 130,07<br /> 178,03<br /> 119,12<br /> 130,42<br /> 112,56<br /> 115,75<br /> 130,50<br /> 95,91<br /> 105,14<br /> 119,98<br /> 125,24<br /> 128,43<br /> 112,99<br /> 153,88<br /> 138,27<br /> 116,10<br /> 126,11<br /> 164,49<br /> 100,57<br /> 86,77<br /> 83,41<br /> 174,93<br /> <br /> Hiệu suất<br /> lên men (%)<br /> 74,56a<br /> 51,74bcdefg<br /> 40,97defgh<br /> 61,90ab<br /> 39,42fgh<br /> 60,55abc<br /> 44,21bcdefgh<br /> 39,40fgh<br /> 41,10defgh<br /> 56,16bcdef<br /> 47,95bcdefgh<br /> 41,51defgh<br /> 40,71efgh<br /> 55,57bcdef<br /> 59,77abcd<br /> 51,30bcdefg<br /> 34,62gh<br /> 43,48bcdefgh<br /> 41,89cdefgh<br /> 56,62bcdef<br /> 55,14bcdef<br /> 30,82j<br /> 56,94bcdef<br /> 58,32abcde<br /> 19,21<br /> <br /> 1<br /> <br /> Giá trị trung bình của 3 lần lặp lại, trong cùng một cột các chữ số mũ giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống<br /> kê 5% (p