Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai <br />
<br />
TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM CORYNESPORA<br />
CASSIICOLA GÂY BỆNH VÀNG RỤNG LÁ CÂY CAO SU<br />
Nguyễn Thị Bích Ngọc1, Ngô Vĩnh Viễn, Hà Viết Cường2, Phạm Thị Dung1,<br />
Lê Mai Nhất1, Ngô Thị Thanh Hường1, Nguyễn Nam Dương1, Đỗ Duy Hưng1<br />
(1Viện Bảo vệ thực vật,2Học viện Nông Nghiệp Việt Nam)<br />
TÓM TẮT<br />
Biện pháp sinh học đóng vai trò quan trọng trong phòng trừ tổng hợp bệnh hại cây trồng theo<br />
hướng thân thiện với môi trường nhằm hạn chế lạm dụng thuốc BVTV. Nghiên cứu này đã tuyển chọn<br />
một số tác nhân vi sinh vật có hiệu quả ức chế nấm C. casiicola gây bệnh vàng rụng lá trên cao su.<br />
Từ 50 mẫu đất và cây cao su thu từ Bình Phước, Đồng Nai, Phú Tho và Lai Châu đã chọn được 8<br />
dòng Trichoderma sp., 4 dòng vi khuẩn nội sinh. Trong điều kiện in vitro các dòng nấm Trichoderma<br />
tuyển chọn có hiệu quả ức chê sự phát triển của nấm C. casiicola từ 79,07 – 89,53%, dòng vi khuẩn<br />
nội sinh TS1 Bacillus amyloliquefaciens cho hiệu quả ức chế nấm cao nhất đạt 58,6%.<br />
Từ khóa: Vi khuẩn nội sinh, B. amyloliquefaciens, C.cassiicola<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐẾ<br />
Cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)<br />
là cây trồng có giá trị kinh tế cao, hiện đang<br />
được phát triển với quy mô lớn ở nhiều nơi trên<br />
thế giới trong đó có Việt Nam. Mủ và gỗ cao<br />
su là nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành<br />
công nghiệp hiện nay. Ngoài ra cây cao su còn<br />
có tác dụng bảo vệ môi trường sinh thái và cải<br />
thiện điều kiện kinh tế xã hội, tạo công ăn việc<br />
làm ổn định đặc biệt là các vùng miền núi.<br />
Trong những năm gần đây, bệnh vàng<br />
rụng lá cao su do nấm Corynespora cassiicola<br />
gây ra đã trở thành dịch hại nguy hiểm cho<br />
nhiều vườn cao su của nước ta, ảnh hưởng<br />
nghiêm trọng tới năng suất cây. Hiện nay bệnh<br />
càng trở nên nghiêm trọng cả về mức độ, phạm<br />
vi gây bệnh và số lượng các dòng vô tính (dvt)<br />
cao su cao sản nhiễm bệnh ngày càng tăng. Nấm<br />
có khả năng gây bệnh quanh năm ở mọi giai<br />
đoạn sinh trưởng của cây, không những gây<br />
bệnh trên lá mà còn gây bệnh trên cả cuống lá<br />
và chồi. Trên vườn kinh doanh, bệnh nặng có<br />
thể làm cho cây bị chết và giảm sản lượng mủ từ<br />
20 – 25% (Jacob, 2006). Ở nước ta, bệnh xuất<br />
hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại trại Thực<br />
nghiệm cao su Lai Khê thuộc Viện Nghiên cứu<br />
cao su Việt Nam. Vườn cao su nhiễm bệnh sẽ<br />
bị rụng lá nhiều đợt gây chậm sinh trưởng và<br />
đôi khi chết cây ở vườn cao su kiến thiết cơ bản<br />
và giảm sản lượng đối với vườn cây khai thác,<br />
nhiều hộ phải ngưng cạo hoàn toàn bởi nhiều<br />
vườn cây trụi lá, mủ cạo kém.<br />
<br />
Hiện nay nhiều nghiên cứu trên cao su<br />
tập trung vào chọn giống cây trồng kháng bệnh<br />
và sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh.<br />
Trong bối cảnh khi Việt Nam đã là một thành<br />
viên của tổ chức Thương mại Thế giới (WTO)<br />
thì việc sử dụng thuốc hóa học quá nhiều để<br />
phòng trừ bệnh gây ảnh hưởng lớn đến chất<br />
lượng, sức khỏe của người sản xuất và tiêu<br />
dùng, làm tăng dư lượng thuốc trong sản phẩm.<br />
Vì vậy việc ưu tiên áp dụng các biện pháp canh<br />
tác và sinh học trong quản lý chúng có ý nghĩa<br />
to lớn trong việc đáp ứng các yêu cầu trong sản<br />
xuất nông sản hàng hóa an toàn phục vụ nội địa<br />
và xuất khẩu ở nước ta.<br />
Bài báo này cung cấp các kết quả tuyển<br />
chọn các vi sinh vật (vsv) có tiềm năng đối<br />
kháng với nấm bệnh vàng rụng lá cao su, nhằm<br />
phục vụ cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm<br />
sinh học phòng trừ bệnh trên đồng ruộng.<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
2.1. Vật liệu nghiên cứu<br />
- Nấm C. cassiicola được phân lập và<br />
làm thuần từ giống cao su RRIV 4 bị nhiễm<br />
bệnh.<br />
- Nguồn VSV có ích được thu thập và<br />
phân lập từ mẫu đất, mẫu lá, thân của các<br />
giống: Cao su thực sinh, DK4, PB 260, GT1,<br />
RRIV 4, RIMM 600, LH từ các vườn cao su<br />
khỏe trong vùng dịch bệnh tại Bình Phước,<br />
Đồng Nai, Phú Thọ và Lai Châu.<br />
<br />
941<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM <br />
<br />
- Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Viện<br />
BVTV, năm 2014 – 2015.<br />
2.2. Phương pháp nghiên cứu<br />
- Thu thập mẫu đất: Mẫu đất được xử lý<br />
trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt<br />
độ phòng 2-3 ngày, sau đó sang qua rây để loại<br />
bỏ tạp chất, cho vào túi để phân lập VSV.<br />
- Phân lập nấm đối kháng: Các mẫu đất<br />
và rễ vùng rễ của cao su thu thập trên đồng<br />
ruộng. Mẫu rễ được rửa sạch dưới vòi nước và<br />
khử trùng bề mặt bằng cồn 95o trong 30 giây<br />
sau đó rửa bằng cồn 75o trong 2 phút, cuối<br />
cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng<br />
và cấy vào môi trường WA và PDA. Mẫu đất<br />
được pha loãng và cấy trên môi trường TME<br />
và PDA. Các mẫu cấy được ủ ở 28oC sau đó<br />
được tách thuần trên môi trường PDA.<br />
<br />
qua cồn 70º trong 1 phút, hypochloride 1%<br />
trong 4 phút, cồn 70º trong 30s và rửa lại qua 3<br />
lần nước vô trùng. Nghiễn mẫu trong cối sứ<br />
cùng với 5ml nước đã khử trùng, sau đó hút<br />
100 µl vào đĩa petri có chứa môi trường 10%<br />
TSA 1,5 g/l Tripton, 0,5 g/l pepton, 1,5g/l<br />
NaCl, 15g/l agar, pH 7.3) ở 28oC trong 15<br />
ngày. Mẫu mẫu nhắc lại 3 lần, kiểm tra quan<br />
sát và mô tả khuẩn lạc trên môi trường. Tiến<br />
hành tách dòng cho đến khi được isolate thuần<br />
trên môi trường King’B để tiếp tục đưa vào thử<br />
khả năng đối kháng.<br />
<br />
- Phân lập vi khuẩn đối kháng: Theo<br />
Chung et al., 2011; Araujo et al., 2002<br />
<br />
- Khả năng đối kháng của nấm<br />
Trichoderma sp. với nấm C. cassiicola: được<br />
đánh giá theo phương pháp của Viện Bảo vệ<br />
thực vật: theo phương pháp cấy đối xứng 2<br />
bên: Trên đĩa môi trường PDA, cấy điểm nấm<br />
bệnh C. cassiicola cách mép đĩa 3cm, đồng<br />
thời cấy điểm nấm đối kháng qua tâm đĩa petri.<br />
Ủ ở nhiệt độ phòng.<br />
<br />
Mẫu lá, thân cây được rửa sạch dưới vòi<br />
nước máy. Cắt nhỏ mẫu rồi tiến hành khử trùng<br />
<br />
+ Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm,<br />
Tỷ lệ ức chế (%) theo Vincent (1947)<br />
<br />
Hiệu quả ức chế (%)<br />
<br />
=<br />
<br />
(Dc – Dt)<br />
× 100<br />
Dc<br />
<br />
Dc: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng; Dt: Đường kính tản nấm ở công thức xử lý<br />
- Khả năng đối kháng của vi khuẩn có<br />
ích với nấm C. cassiicola: theo Chung et al.,<br />
2011 và tiêu chuẩn ngành (10TCN: 867-2006).<br />
Nấm C. cassiicola được chuẩn bị ở mật độ 106<br />
bào tử/ml. Cấy nấm ở giữa đĩa. Dịch vi khuẩn<br />
được chuẩn bị ở 108 cfu/ml sau đó cấy ở 3<br />
điểm đều nhau quanh đĩa petri. Mỗi loại nhắc<br />
lại 3 lần, và công thức đối chứng (chỉ cấy nấm<br />
Corynespora cassicola). Để trong tủ định ôn<br />
30ºC, đo đường kính vòng vô nấm. Đo đường<br />
kính tản nấm và hiệu quả ức chế nấm theo<br />
phương pháp của Chung và cộng sự (2011) và<br />
tiêu chuẩn ngành (10TCN: 867-2006).<br />
- Phương pháp hóa sinh xác định đặc tính<br />
sinh hóa của các vsv có tiềm năng đối kháng:<br />
Theo phương pháp của Đại học Quốc gia,<br />
2000.<br />
- Phương pháp phân loại, định danh vsv<br />
có tiềm năng đối kháng<br />
<br />
942 <br />
<br />
- Tính toán số liệu: Số liệu thí nghiệm<br />
được thu thập và xử lý bằng excel, sử dụng<br />
phần mềm IRRISTAT 4.0.<br />
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
3.1. Thu thập và phân lập nấm đối kháng<br />
Trichoderma sp.<br />
Hầu hết các mẫu đất đem phân lập đều<br />
thấy sự hiện diện của nấm Trichoderma sp. Đã<br />
thu thập được 92 chủng Trichoderma ký hiệu<br />
từ Tr1 đến Tr92. Trong đó 80/92 chủng nấm<br />
thể hiện hoạt tính đối kháng với nấm C.<br />
cassiicola, trong đó có 8 chủng nấm có mức<br />
đối kháng cao chiếm tỷ lệ 8,7%, 23 chủng thể<br />
hiện mức đối kháng trung bình chiếm 25,0%,<br />
mức đối kháng yếu có số lượng khá cao là 41<br />
chủng, chiếm tỷ lệ 44,6% và không đối kháng<br />
là 20 chủng (21,7%).<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai <br />
<br />
Bảng 1. Nguồn nấm Trichoderma sp. có triển vọng đã thu thập được<br />
STT<br />
1<br />
2<br />
3<br />
<br />
Ký hiệu nguồn<br />
TR4<br />
TR54<br />
TR80<br />
<br />
Xuất xứ nguồn nấm đối kháng cao<br />
Đất trồng cao su giống RRIV4 ở Đồng Xoài – Bình Phước<br />
Đất trồng cao su giống PB 260 ở Nông trường Tân Lợi – Bình Phước<br />
Đất trồng cao su giống LH90/952 ở Đồng Xoài – Bình Phước<br />
<br />
4<br />
<br />
TR75<br />
<br />
Đất trồng cao su giống DK4 ở Đồng Xoài – Bình Phước<br />
<br />
5<br />
<br />
TR61<br />
<br />
Vườn trồng cao su giống GT 1 ở Xìn Hồ - Lai Châu<br />
<br />
6<br />
<br />
TR13<br />
<br />
Vườn trồng cao su giống GT 1 ở Xìn Hồ - Lai Châu<br />
<br />
7<br />
8<br />
<br />
TR16<br />
TR34<br />
<br />
Vườn trồng cao su giống IR 1 ở Xìn Hồ - Lai Châu<br />
Vườn trồng cao su giống RRIM 600 ở Phú Thọ<br />
<br />
8 chủng nấm đối kháng Trichoderma<br />
có hoạt tính đối kháng mạnh được tiếp tục<br />
tuyển chọn và 2 chủng nấm Trichoderma<br />
hazzianum và Trichoderma viride đang được<br />
sử dụng trong sản xuất chế phẩm tại Bộ môn<br />
Bệnh cây đánh giá hiệu lực ức chế nấm C.<br />
<br />
cassiicola. Kết quả bảng 2 cho thấy, các chủng<br />
Trichoderma được tuyển chọn có hiệu lực ức<br />
chế từ 79,07 – 89,53% trong đó chủng nấm<br />
Trichoderma hazianum của Bộ môn Bệnh cây<br />
có hiệu quả ức chế 100%,<br />
<br />
Bảng 2. Khả năng đối kháng của các chủng nấm đối kháng với nấm C. cassiicola (2014-2015)<br />
Chủng nấm đối kháng<br />
<br />
Trichoderma viride<br />
<br />
Đường kính tản nấm C. cassiicola bị Hiệu quả ức chế (%)<br />
ức chế (mm) sau 8 ngày<br />
0,0<br />
100,00<br />
17,7<br />
79,89<br />
<br />
TR4<br />
<br />
9,1<br />
<br />
89,65<br />
<br />
TR54<br />
<br />
17,2<br />
<br />
80,45<br />
<br />
TR80<br />
<br />
15,2<br />
<br />
82,72<br />
<br />
TR75<br />
<br />
9,0<br />
<br />
89,77<br />
<br />
TR61<br />
<br />
11,2<br />
<br />
87,27<br />
<br />
TR13<br />
<br />
10,3<br />
<br />
88,29<br />
<br />
TR16<br />
<br />
13,1<br />
<br />
85,11<br />
<br />
TR34<br />
<br />
18,4<br />
<br />
79,09<br />
<br />
Đối chứng<br />
<br />
88,0<br />
<br />
00,00<br />
<br />
Trichoderma hazianum<br />
<br />
Qua theo dõi cho thấy sau 2 ngày cấy<br />
truyền cả 2 loại nấm đối kháng và nấm bệnh<br />
đều phát triển lan nhanh trên môi trường, giữa<br />
vùng nấm gây bệnh và nấm đối kháng hình<br />
thành một đường gianh giới rõ. Từ ngày thứ 4<br />
sau khi cấy trở đi, riêng nấm Trichoderma ký<br />
sinh sợi nấm Corynespora làm cho nấm này<br />
teo dần và chết hoàn toàn. Kết quả ở bảng chỉ<br />
<br />
ra sau 8 ngày vùng nấm gây bệnh có đường<br />
kính tản nấm là 0,0 – 18,4 cm. Ở công thức đối<br />
chứng (không có nấm đối kháng) nấm C.<br />
cassiicola sinh trưởng và phát triển tốt sau 8<br />
ngày đã đạt đường kính tối đa. Các dòng<br />
Trichoderma cho hiệu quả ức chế nấm cao từ<br />
79,07-100% trong điều kiện invitro.<br />
<br />
943<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM <br />
<br />
A<br />
B<br />
C<br />
Hình1: Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Corynespora cassiicola<br />
(A: T. hazianum; B: T. viride; C: Trichoderma sp.)<br />
3.2. Phân lập vi khuẩn đối kháng<br />
Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ 4<br />
giống cao su trồng phổ biến tại Bình Phước đã<br />
thu được 52 chủng vi khuẩn đối kháng trong đó<br />
51,92% được phân lập từ phần thân, 34,61%<br />
được phân lập từ phần cuống lá và 13,46%<br />
<br />
chủng được phân lập từ lá (bảng 3). Trong đó 4<br />
chủng có khả năng đối kháng mạnh (đường<br />
kính vô nấm (ĐKVN)≥20mm) chiếm 7,7%; 19<br />
chủng có khả năng đối kháng trung bình chiếm<br />
36,5%; 8 chủng có khả năng đối kháng yếu<br />
chiếm 15,4%, còn lại là không đối kháng.<br />
<br />
Bảng 3. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ các giống cao su trồng tại Bình Phước (Viện BVTV, 2015)<br />
Giống cao<br />
su<br />
Cây thực<br />
sinh<br />
<br />
RRIV 4<br />
<br />
ĐK 4<br />
<br />
Lai hoa<br />
Tổng<br />
<br />
Khả năng đối kháng<br />
+++<br />
++<br />
2<br />
2<br />
<br />
Bộ phận<br />
<br />
Số chủng<br />
phân lập được<br />
<br />
Thân<br />
<br />
9<br />
<br />
Cuống<br />
<br />
5<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
Lá<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
Thân<br />
<br />
8<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
1<br />
<br />
Cuống<br />
<br />
7<br />
<br />
0<br />
<br />
5<br />
<br />
1<br />
<br />
Lá<br />
<br />
3<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
Thân<br />
<br />
6<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
3<br />
<br />
Cuống<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
Lá<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
Thân<br />
<br />
4<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
Cuống<br />
<br />
4<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
Lá<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
52<br />
<br />
4<br />
<br />
19<br />
<br />
8<br />
<br />
+<br />
0<br />
<br />
Ghi chú:+++ đối kháng mạnh (ĐKVN ≥ 20mm); ++ đối kháng trung bình (ĐKVN 6 - 19mm); + đối<br />
kháng yếu ĐKVN 0 - 5mm)<br />
<br />
4 chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng<br />
đối kháng mạnh ký hiệu TS1, TS2, G2.8, LH<br />
và các chủng vi khuẩn B. subtilis, xạ khuẩn<br />
Steptomycetes ký hiệu P9.1; B 5.3; A 2.1; P<br />
12.12 được phân lập từ các cây trồng khác như<br />
hồ tiêu, cà phê dùng trong sản xuất chế phẩm<br />
ở Bộ môn Bệnh cây được đưa vào đánh giá khả<br />
năng đối kháng với nấm C. cassiicola<br />
<br />
944 <br />
<br />
Kết quả trong bảng cho thấy, 4 dòng vi<br />
khuẩn tuyển chọn có đường kính vòng vô nấm<br />
biến động trong khoảng 20,01 – 22,80mm.<br />
Trong đó dòng TS1 mức độ đối kháng cao nhất<br />
vòng vô nấm đạt 22,80mm, hiệu quả ức chế đạt<br />
58,01%. Sau đó là các dòng G2.8, LH và TS2<br />
vòng vô nấm đạt 20,09 – 21,00mm, hiệu quả<br />
ức chế 46,27 – 54,58. 2. Dòng vi khuẩn và xạ<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai <br />
<br />
khuẩn lấy từ bộ môn bệnh cây có dòng P9.1 B.<br />
subtilis cho đường kính tản nấm 20,11mm,<br />
hiệu quả ức chế 48,09%. Các dòng B 5.3; A<br />
<br />
2.1; P 12.12 cho hiệu quả ức chế kém từ 27,86<br />
– 35,11% (bảng 4).<br />
<br />
Bảng 4. Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm C. cassiicola trong điều<br />
kiện invitro (Viện BVTV, 2015)<br />
Hiệu quả<br />
Giống Đường kính vòng Mức độ Đường kính tản<br />
nấm (mm)<br />
ức chế (%)<br />
VSV<br />
vô nấm (mm)<br />
kháng<br />
36,7<br />
58,01 a<br />
1 TS1<br />
VK<br />
22,80 a<br />
+++<br />
48,7<br />
46,27 e<br />
2 TS2<br />
VK<br />
20,09 b<br />
+++<br />
42,7<br />
51,14 b<br />
3 LH<br />
VK<br />
20,58 b<br />
+++<br />
39,7<br />
54,58 b<br />
4 G 2.8<br />
VK<br />
21,00 ab<br />
+++<br />
45,3<br />
48,09c<br />
5 P 9.1 B. subtilis<br />
VK<br />
20,11 b<br />
+++<br />
56,3<br />
34,50 g<br />
6 B 5.3 B. subtilis<br />
VK<br />
17,33 c<br />
++<br />
63,0<br />
27,86 f<br />
7 A 2.1 Acomycetes<br />
XK<br />
9,22 d<br />
+<br />
56,7<br />
35,11 g<br />
8 P 12.12 Ascomycetes<br />
XK<br />
8,17 d<br />
+<br />
87,3<br />
0,00<br />
9 Đối chứng<br />
0,00<br />
1,2<br />
1,8<br />
CV%<br />
5,0<br />
Ghi chú:+++ đối kháng mạnh (ĐKVN ≥ 20mm); ++ đối kháng trung bình (ĐKVN 6 - 19mm);+ đối<br />
kháng yếu ĐKVN 0 - 5mm)<br />
TT<br />
<br />
KH<br />
nguồn<br />
<br />
Hình 2. Khả năng đối kháng của xạ khuẩn, vi khuẩn đối với nấm Corynespora cassiicola<br />
<br />
945<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
